CN115197937B - 一种样本释放剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复配的样本释放剂及其制备方法和应用，该释放剂的释放速度快，避免繁杂的提取流程，通过简单的释放，可以在5‑15min释放不同的样本、同时可以进行灭活，提高样本检测效率。而且还具有检测灵敏度高，对弱阳性样本有响应；同时对样本有较好的保存作用，保存时间长；对多种样本的兼容性好等特点。

Description

一种样本释放剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物试剂领域，具体涉及一种样本释放剂及其制备方法和应用。

背景技术

核酸提取技术是分子生物学研究的基础，现已广泛应用于病原微生物检测、环境微生物检测、食品安全检测等领域。传统的核酸提取方法包括物理方法、化学方法和生物方法等，其中物理方法包括煮沸法、磁珠法、超声波法等；化学方法包括表面活性剂、碱裂解法等；生物方法主要包括酶法等。目前，提取核酸时使用的释放剂存在的主要问题在于细胞裂解不完全，造成核酸释放不彻底，所得核酸(尤其是RNA)不稳定，受温度、酶等因素易降解；另外由于细胞内蛋白含量较高，且含有大量可能干扰核酸检测的物质，造成提取试剂与检测体系经常不能很好匹配，因此还需要采用传统方法经过多步骤、采用多种不同试剂等繁琐的技术手段来去除聚合酶链式反应(PCR)的抑制剂。

目前使用的核酸提取方法主要包括以下四种：(1)传统煮沸法：将碱性裂解液直接与含病原液体混合，高温裂解，离心获取核酸；(2)浓缩煮沸法：先用多聚糖浓缩沉淀病原，然后加碱性裂解液高温裂解，离心获取核酸；(3)离心柱法：采用硅胶膜或玻璃纤维膜吸附、纯化、洗脱获取核酸；(4)磁珠法：采用硅粉或聚乙二烯包被的磁珠吸附、然后进行纯化和洗脱获取核酸。

采用上述第(1)和(2)种方法提取时需要多次换管离心等步聚，样本处理时间长，得率偏低；离心柱法虽然好于第(1)和(2)种方法，但步聚仍繁多，提取效率低；磁珠法提取步聚简单，回收率高，易于自动化提取，但产品价格十分昂贵，目前应用并不广泛。

样本释放剂可以通过破坏细胞膜和细胞器膜，释放细胞中各类待检物质，如核酸，为核酸提取带来了便利。但现有的样本释放剂存在容易漏检、检出灵敏度低、准确性均不高、检测成本高、速度慢等不足，因此开发新的样本释放剂意义重大。

发明内容

为改善上述技术问题，本发明提供了一种样本释放剂，以样本释放剂的总体积计，包括：浓度为0.01-10％(w/v)的表面活性剂、浓度为0-5M的辅助盐、浓度为0.01-500mM的pH调节剂、浓度为0.01-20％(w/v)的促进剂、浓度为0.01-5M的稳定剂和浓度为0.01-3％(w/v)的抑菌剂。

根据本发明的实施方案，所述表面活性剂选自莎梵婷、四丁基氟化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、皂角粉、Morwet EFW(烷基萘磺酸盐)、十二烷基肌氨酸钠(N-月桂酰肌氨酸钠)、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基醇醚磷酸酯钾、椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、十六烷基三甲基溴化铵、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、Brij-58、曲拉通X-100中的至少一种；优选为十二烷基肌氨酸钠、莎梵婷、月桂酰胺丙基甜菜碱中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述样本释放剂中表面活性剂的浓度为0.01-10％(w/v)，例如浓度为0.01-8％(w/v)、0.05-5％(w/v)、0.1-2.5％(w/v)；示例性地，浓度为1％(w/v)。

根据本发明的实施方案，所述辅助盐可以选自钠盐或钾盐，例如选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、氟化钠、氟化氢钾、氟化铯、氯化钠、氯化钾和溴化钠等中的至少一种；优选地，所述辅助盐选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、氟化钠、氯化钠或溴化钠；更优选选自氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述样本释放剂中辅助盐的浓度为0-5M，例如浓度为30-200mM，2-4M；示例性地，浓度为150mM。

根据本发明的实施方案，所述pH调节剂可以选自三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、吗啉乙酸钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、氢氧化钠等中的至少一种；优选为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述样本释放剂中pH调节剂的浓度为0.01-500mM，例如浓度为10-200mM；示例性地，其浓度为50mM。

根据本发明的实施方案，所述促进剂选自二甲基亚砜、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、冠醚(如：18-冠-6)、甘露醇、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、十四醇、十六醇、十八醇、聚乙烯吡咯烷酮(K＝10-20)、糖原、线性聚丙烯酰胺、N-正烷基苯丙异噻酮唑酮等中的至少一种；优选为二甲基亚砜、聚乙二醇8000、甲酰胺、十六醇中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述样本释放剂中促进剂的浓度为0.01-20％(w/v)，例如浓度为1-10％(w/v)；示例性地，其浓度为10％(w/v)。

根据本发明的实施方案，所述稳定剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素、明胶、蔗糖脂肪酸酯、轻质白油中的至少一种；优选为异硫氰酸胍、轻质白油中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述样本释放剂中稳定剂的浓度为0.01-5M，例如浓度为10-20mM、0.5-4M；示例性地，浓度为0.5M。

根据本发明的实施方案，所述抑菌剂选自叠氮化钠、山梨醇、山梨酸钾、苯氧乙醇、多菌清、百菌灵等中的至少一种；优选为叠氮化钠、山梨酸钾、苯氧乙醇、多菌清中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述样本释放剂中抑菌剂的浓度为0.01-3％(w/v)，例如浓度为0.1-1％(w/v)；示例性地，浓度为0.3％(w/v)。

根据本发明示例性的实施方案，以样本释放剂总体积计，所述样本释放剂由浓度为50mM pH＝8的Tris-HCl、150mM NaCl、0.5M异硫氰酸胍(GuSCN)、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠(SLS)、1％(w/v)莎梵婷、10％(v/v)DMSO、0.5M轻质白油和0.3％(w/v)叠氮化钠和余量的无菌水组成。

根据本发明示例性的实施方案，以样本释放剂总体积计，所述样本释放剂由浓度为50mM乙酸钠、150mM碳酸氢钠、0.5M尿素、1％(w/v)吐温-20、1％(w/v)月桂酰胺丙基甜菜碱、5％(w/v)聚乙二醇8000、2％(v/v)轻质白油和0.2％(w/v)山梨酸钾和余量的无菌水组成。

根据本发明示例性的实施方案，以样本释放剂总体积计，所述样本释放剂由浓度为50mM磷酸氢二钠、50mM磷酸二氢钠、150mM氯化钠、0.5M盐酸胍、1％(w/v)曲拉通X-100、1％(w/v)月桂酰胺丙基甜菜碱、10％(v/v)甲酰胺、0.5M异硫氰酸胍和0.2％(w/v)苯氧乙醇和余量的无菌水组成。

根据本发明示例性的实施方案，以样本释放剂总体积计，所述样本释放剂由浓度为50mM柠檬酸钠、150mM氯化钾、0.5M尿素、1％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵、1％(w/v)月桂酰胺丙基甜菜碱、10％(w/v)十六醇、2％(v/v)轻质白油和0.2％(w/v)多菌清和余量的无菌水组成。

本发明还提供所述样本释放剂的制备方法，包括将表面活性剂、辅助盐、pH调节剂、促进剂、稳定剂和抑菌剂进行混合的步骤。

本发明还提供所述样本释放剂在核酸释放中的应用。

本发明还提供一种核酸释放方法，包括以下步骤：将样本加入到所述样本释放剂中，然后振荡混匀，室温放置，吸取上清即可获得释放的核酸。

根据本发明的实施方案，所述样本可以为细菌、上皮细胞、全血(血细胞)或病毒。

有益效果

本发明提供了一种复配的样本释放剂及其制备方法和应用，该释放剂的释放速度快，避免繁杂的提取流程，通过简单的释放，可以在5-15min释放不同的样本、同时可以进行灭活，提高样本检测效率。而且还具有检测灵敏度高，对弱阳性样本有响应；同时对样本有较好的保存作用，保存时间长；对多种样本的兼容性好等特点。

附图说明

图1为实施例1中释放剂和对照组的样本释放情况对比图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

以下所述对照释放剂为圣湘生物释放剂；提取试剂为磁珠法核酸提取试剂，购自达安生物技术有限公司。

实施例1释放速度测试

按照下表配制样本释放剂，配方1：

组分	浓度
		Tris-HCl(pH＝8)	50mM
NaCl(氯化钠)	150mM
		GuSCN(异硫氰酸胍)	0.5M
SLS(N-月桂酰肌氨酸钠)	1％(w/v)
		莎梵婷	1％(w/v)
DMSO(二甲基亚砜)	10％(v/v)
		轻质白油	0.5M
叠氮化钠	0.3％(w/v)
		无菌水	余量

将口腔拭子样本直接浸入释放剂中，去除尾部，上下颠倒混匀30s后，室温静置，分别在0、1、2、5、10、30min取样在显微镜(放大倍数：16X 40)下观测上皮细胞状态。同时利用生理盐水、对照释放剂、灭活型样本保存液作为对照完成上述测试。

结果显示：

1)生理盐水上皮细胞的状态不会随时间发生变化；

2)本发明报道的释放剂在2min时间内即完成90％左右的上皮细胞的样本释放，同时伴随细胞膜等膜组织的破坏达到对样品中的细菌、病原微生物、病毒等的灭活，而对照释放剂需要到30min才能完成90％的释放；

3)灭活型样本保存液细胞状态发生变化，但是细胞膜仍然完整，见图1。

实施例2新冠COVID-19假病毒样本释放

将鼻咽拭子样本直接浸入到实施例1中配制的释放剂中，去除尾部，并向其中分别添加新冠COVID-19假病毒，添加后终浓度为200-10⁴copies/mL，上下颠倒混匀30s后，室温静置10min，再次上下颠倒混匀30s，瞬时离心后，取上清加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。同时利用对照释放剂完成上述测试，并将结果与核酸提取纯化试剂结果进行对比。

结果显示：

1)根据本发明的释放剂测试结果与核酸提取试剂相当，对弱阳性样本仍然有响应；

2)对照释放剂虽然对于常规样品的检测数据较好，但是对弱阳性样本仍然有漏检的情况。

实施例3新冠COVID-19假病毒样本保存时间测试

将鼻咽拭子拭子头样本直接浸入到实施例1中配制的释放剂中，去除尾部，并向其中分别添加新冠COVID-19假病毒，添加后终浓度为10³copies/mL，上下颠倒混匀30s后，室温静置10min，再次上下颠倒混匀30s，瞬时离心后，分别在第0、1、2、4、7、14天，取上清加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。同时利用对照释放剂完成上述测试后进行对比。

结果显示：根据本发明的释放剂测试结果对样本有较好的保存作用

实施例4非洲猪瘟释放(全血样本、棉拭子样本、环境样本)

将含有非洲猪瘟病毒的质控品的样本分别与200μL实施例1中配制的释放剂混合，其中猪全血样本(表中A系列样本)取200μL，棉拭子(表中B系列样本)取200μL，环境样本(表中C系列样本)10000r/min离心，去掉上清加入200μL释放剂上下颠倒混匀30s后，室温静置10min，再次上下颠倒混匀30s，瞬时离心后，取上清加入荧光定量PCR试剂中进行定量扩增。同时利用对照释放剂完成上述测试，并将结果与核酸提取纯化试剂结果进行对比。

结果显示：

1)根据本发明的释放剂测试结果与核酸提取试剂相当，并且对所有样本都能兼容；

2)对照释放剂对于常规样品的检测数据中，对全血样本和环境样本存在漏检的情况。

实施例5释放剂相同功能配方

本发明经过大量实验与探索，最终得到多种样本释放剂配方，释放功能效果一致，保存功能接近。类似于实施例1，通过按照下述表格替换对应组分获得下述根据本发明的样本释放剂配方2～4：

样本释放剂配方2：

组分	浓度
		乙酸钠	50mM
碳酸氢钠	150mM
		尿素	0.5M
吐温-20	1％(w/v)
		月桂酰胺丙基甜菜碱	1％(w/v)
聚乙二醇8000	5％(w/v)
		轻质白油	2％(v/v)
山梨酸钾	0.2％(w/v)
		无菌水	余量

样本释放剂配方3：

样本释放剂配方4

组分	浓度
		柠檬酸钠	50mM
氯化钾	150mM
		尿素	0.5M
十六烷基三甲基溴化铵	1％(w/v)
		月桂酰胺丙基甜菜碱	1％(w/v)
十六醇	10％(w/v)
		轻质白油	2％(v/v)
多菌清	0.2％(w/v)
		无菌水	余量

根据实施例2进行采样操作，利用本发明的样本释放剂配方1(实施例1)、配方2、配方3、配方4完成在新冠COVID-19假病毒样本释放，完成荧光定量PCR测试，并将结果与核酸提取纯化结果进行对比。

结果显示，样本释放剂4种配方并无明显差异，未出现漏检情况，均能满足实际检测的需要。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1. 一种样本释放剂，以样本释放剂的总体积计，由浓度为1 % (w/v)的莎梵婷、浓度为1 % (w/v)的N-月桂酰肌氨酸钠、浓度为150 mM的氯化钠、浓度为50 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、体积百分数浓度为10%的二甲基亚砜、浓度为0.5 M的异硫氰酸胍、浓度为0.5 M的轻质白油、浓度为0.3% (w/v)的叠氮化钠和余量的无菌水组成。

2.权利要求1所述样本释放剂的制备方法，包括将莎梵婷、N-月桂酰肌氨酸钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、二甲基亚砜、异硫氰酸胍、轻质白油、叠氮化钠和无菌水进行混合的步骤。

3.权利要求1所述样本释放剂在核酸释放中的应用。

4.一种核酸释放方法，包括以下步骤：将样本加入到权利要求1所述样本释放剂中，然后振荡混匀，室温放置，吸取上清获得释放的核酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本为细菌、上皮细胞、血细胞或病毒。