CN115197328B - 一种可清除体内免疫球蛋白A的重组融合蛋白酶及其制备方法和在治疗IgA肾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白及其在治疗IgA肾病及其它IgA复合物沉积介导的相关疾病中的应用，所述的重组融合蛋白结构中包含人类共生菌蛋白酶AK183活性区域和人免疫球蛋白片段；所述的人免疫球蛋白片段位于所述蛋白酶AK183活性区域的N端。本发明还提供制备所述重组融合蛋白的方法。本发明的重组融合蛋白通过将天然AK183蛋白酶重组融合人免疫球蛋白片段，具有血浆半衰期延长、可有效清除循环及肾脏IgA复合物，及极大程度降低蛋白酶对人体存在免疫原性的副作用等综合优势，适合用于特异性治疗IgA肾病及其它IgA复合物沉积介导的相关疾病。

Description

一种可清除体内免疫球蛋白A的重组融合蛋白酶及其制备方 法和在治疗IgA肾病中的应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白重组合成领域，具体涉及一种人工合成的具有蛋白酶活性的多肽，及其合成方法，和利用该多肽的药物酶学活性来治疗IgA肾病及其它由多聚IgA复合物引起的疾病的方法。

背景技术

IgA肾病是目前世界上最常见的原发性肾小球疾病之一，尤其在东亚地区可占肾穿刺活检诊断原发性肾小球肾炎的40％-50％,30％-40％以上的患者在发病20～30年后进展至终末期肾病—尿毒症^1,2，给患者和社会带来沉重的负担。目前针对IgA肾病尚缺乏特异性的治疗。临床上多用RAS阻断剂为基础的支持治疗，以减缓肾功能恶化。对于支持治疗无效的患者予以联合激素免疫抑制剂治疗。但激素免疫抑制剂的使用长期疗效不佳且给患者带来严重的副作用^3,4。

近年来药物研究的重点在于开发有效及低副作用的治疗药物。主要方向包括研发降低及特异性清除肾脏IgA沉积的药物。其中包括系统性降低免疫反应及IgA产生的治疗，以及减轻IgA诱导的补体活化。IgA肾病由循环IgA1复合物在肾小球沉积导致，人体及其病原或共生微生物均具备清除IgA的生物机制。IgA1由两条重链和两条轻链组成。Fab和Fc段之间存在一个铰链区(HR)⁶，是微生物切割IgA1的作用位点。多种病原及共生微生物均具备此类蛋白酶用于对抗人体免疫。其中AK183为来源于人体肠道共生菌梭状芽胞杆菌(Clostridium)的IgA蛋白酶。此项发明旨在利用人体对此共生菌的优良耐受性来开发一种基于其AK183蛋白酶的药物，并通过重组融合蛋白技术来进一步优化药物半衰期以有效清除循环IgA及其肾脏沉积。此融合蛋白药物可望具备低免疫原性、高特异性和长效性的特点，用于快速控制进展性IgA肾病以稳定肾功能。

发明内容

鉴于上述背景，本发明期望利用生物重组技术的方法来改造共生菌来源的IgA酶，以达到优良的药理活性及药代动力学特性，以及用于特异性治疗IgA肾病(包括原发和继发性IgA肾病)及广泛的由致病性多聚IgA复合物沉积引起的疾病的方法。

本发明的一方面目的在于：提供一种可清除致病性IgA1复合物的融合蛋白酶，以实现蛋白酶的超长血液药物半衰期，从而延长体内清除致病性IgA1复合物的药效。

本发明的另一个目的是提供利用重组融合蛋白治疗IgA肾病(包括原发和继发性IgA肾病)，以及广泛的由致病性多聚IgA复合物引起的疾病的方法。

本发明的再一个目的是提供制备所述可清除致病性IgA1复合物的融合蛋白酶的方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

首先，本发明第一个方面提供一种重组融合蛋白，其结构中包含人类共生菌蛋白酶AK183活性区域和人免疫球蛋白片段；所述的人免疫球蛋白片段位于所述蛋白酶AK183活性区域的N端，所述的人免疫球蛋白片段的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示序列有至少90％相同，优选有至少95％相同，最优选100％相同；所述的蛋白酶AK183活性区域来自与SEQ IDNo.2所示序列有至少90％相同的氨基酸序列，优选有至少95％相同，最优选100％相同。本发明所述的重组融合蛋白命名为“Fc-AK183”。本发明所述的重组融合蛋白中，所述的AK183活性区域部分可以提供药物活性中心以降解IgA，所述的人免疫球蛋白片段可增强药物与人体兼容性以及延长药物半衰期。

在本发明的提出过程中，为确定野生AK183酶活性片段的区域(蛋白酶AK183活性区域)，我们首先构建了一系列截短的AK183片段。通过对所述一系列截短的AK183片段进行体外酶活性验证，我们发现了C段的非活性调节区域对酶活性的抑制作用，以及野生型AK183前体蛋白酶需要完成C端自切后成熟。由此，我们将所述的人免疫球蛋白片段接载到所述蛋白酶AK183活性区域的氨基端，使得目标重组融合蛋白Fc-AK83在经历其从前体到成熟的过程中始终可以保留人免疫球蛋白融合片段。

本发明最优选的重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

鉴于IgA肾病的病因由循环多聚IgA复合物在肾小球系膜区慢性沉积导致，多聚IgA复合物还可以引起多种不同临床表现的疾病，造成不同器官受累，广而言之，凡此类IgA复合物沉积介导的相关疾病无论是否累及肾脏都可以作为本发明药物的适应证。因此，本发明的第二个方面提供一种利用基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白治疗由IgA复合物沉积介导的相关疾病的方法；即，将基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白用于制备治疗IgA复合物沉积介导的相关疾病的药物；所述的基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白结构中包含人类共生菌蛋白酶AK183活性区域和人免疫球蛋白片段；所述的人免疫球蛋白片段位于所述蛋白酶AK183活性区域的N端，所述的人免疫球蛋白片段的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示序列有至少90％相同，优选有至少95％相同，最优选100％相同；所述的蛋白酶AK183活性区域来自与SEQ ID No.2所示序列有至少90％相同的氨基酸序列，优选有至少95％相同，最优选100％相同；最优选的所述重组融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

进而我们研发团队运用体外实验及体内动物模型验证了以本发明所述重组融合蛋白作为新型试验药物在疾病模型中的药效。在我们的体外药物验证中Fc-AK183可以切割多种疾病中患者来源的IgA，比如不同临床病理表现的IgA肾病、紫癜性肾炎或川崎病患者的样本。因此本发明优选的应用中，所述的IgA复合物沉积介导的相关疾病可以包括：IgA肾病、IgA血管炎肾损害(或过敏性紫癜性肾炎)或其它继发IgA肾病，或其他IgA复合物引起的疾病如川崎病、IgA类风湿因子阳性的类风湿性关节炎、IgA型抗GBM病或IgA型ANCA相关血管炎。

本发明所述的应用中，基于治疗关键在于清除组织(肾脏)或循环中的多聚IgA复合物，我们应用免疫球蛋白来源的融合片段实现长效血液循环半衰期，以达到系统性清除病理沉积的药效，因此优选的方案中，所述的基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白被制备成液体制剂，用于向患有所述IgA复合物沉积介导的相关疾病的哺乳动物给药；进一步优选被制备成注射剂，并通过静脉注射或者输液途径给药。

本发明所述的应用中，所述的哺乳动物可以是人或其他哺乳动物(例如可用于药物试验的转基因哺乳动物模型)。

我们研发团队曾运用多种人源化小鼠模型来验证Fc-AK183的药效及获取药代动力学参数。我们的实验结果提示，当所述的哺乳动物是用于药物试验的动物模型时，所述的动物模型可以是被动人IgA注射鼠模型、人IgA1转基因鼠模型或灵长类动物模型，且所述的静脉注射给药方案包括：以5-10mg/kg的剂量每5-10天注射一次；优选以5mg/kg的剂量每5天注射一次。

由于我们使用的免疫球蛋白片段是来源于人的序列，其与人类相关受体(FcRn)具有最佳匹配，既往资料提示此类融合药物在人体半衰期明显长于小鼠。由此我们推测当所述的哺乳动物是人时，给药间隔可以长于小鼠。预计人的静脉注射给药方案约为：5-10mg/kg的剂量每10-15天注射一次；优选以10-15mg/kg的剂量作为起始注射剂量，后改为5-10mg/kg维持剂量每10天注射一次。根据我们的实验药代动力学数据，此给药方案可获得数周内血液循环IgA的彻底清除；期间肾脏故有IgA的沉积可得到充分的清除，使得肾小球损伤得以部分修复，从而实现肾脏从进展性损伤期转为平稳修复期。

第三方面，本发明提供一种重组融合蛋白基因表达载体，它是由运载体和目的基因重组融合构成的质粒，其中，所述的目的基因是重组融合基因，包括编码人免疫球蛋白片段(人IgG铰链区CH2及CH3)的基因序列和编码蛋白酶AK183活性区域的基因序列；所述的编码人免疫球蛋白片段的基因序列，其核苷酸序列与SEQ ID No.3所示序列有至少90％相同，优选有至少95％相同，最优选100％相同；所述的编码蛋白酶AK183活性区域的基因序列来自与SEQ ID No.4所示序列有至少90％相同，更优选有至少95％相同，最优选100％相同。

本发明优选的重组融合蛋白基因表达载体中，所述的运载体是适用于原核表达系统的运载体，进一步优选与大肠杆菌表达系统匹配的运载体，更优选带纯化标签的运载体，最优选pET30a质粒。

本发明最优选的一种实施方式中，所述的重组融合蛋白基因表达载体是由运载体和目的基因重组融合构成的质粒，其中，所述的运载体是大肠杆菌表达载体pET30a质粒；所述的目的基因是重组融合基因，自其5'端起顺序包括编码人免疫球蛋白片段的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，和编码含蛋白酶AK183活性区域的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

第四方面，本发明提供构建重组融合蛋白基因表达载体的方法，包括：选择表达系统，并根据含蛋白酶AK183活性区域的氨基酸序列和人免疫球蛋白片段的氨基酸序列分别合成适用于所述表达系统表达的两个cDNA序列，将所述两个cDNA序列作为目的基因，分别与所述表达系统进行DNA重组，获得两种重组质粒，最后将所述的两种重组质粒中的目的基因在同一个重组质粒中重组融合，所述的重组融合中，将所述人免疫球蛋白片段的cDNA序列插入所述蛋白酶AK183活性区域的cDNA序列的5'端，得到所述的重组融合蛋白基因表达载体；所述的人免疫球蛋白片段的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示序列有至少90％相同，优选有至少95％相同，最优选100％相同。

本发明优选的一种实施方式中，所述构建重组融合蛋白基因表达载体的方法，包括以下步骤：

(I)基于来自人体肠道中天然共生梭状芽孢杆菌的蛋白酶AK183活性区域的氨基酸序列，经密码子优化，合成适用于大肠杆菌表达的cDNA序列I'，基于与SEQ ID No.1所示序列有至少90％相同的人免疫球蛋白片段的氨基酸序列，经密码子优化，合成适用于大肠杆菌表达的cDNA序列II'；

(II)以(I)所得的cDNA序列I'为目的基因，将其与大肠杆菌进行DNA重组，得到亚克隆质粒I'；以(I)所得的cDNA序列II'为目的基因，将其与大肠杆菌进行DNA重组，得到亚克隆质粒II'；

(III)切割(II)所得的亚克隆质粒II'，得到带有粘性末端的cDNA序列II'片段；切割(II)所得的亚克隆质粒I'，使cDNA序列I'上游形成带有粘性末端的缺口；

(IV)将(III)所得的cDNA序列II'片段和切割后的亚克隆质粒I'进行DNA重组，所述的DNA重组中，所述的cDNA序列II'插入所述cDNA序列I'的5’端，得到所述的重组融合蛋白基因表达载体。

本发明进一步优选的方案中，步骤(I)中所述的cDNA序列II'是在基于SEQ IDNo.1所示序列的密码子前加碱基防止移码且片段后加GGGGGGGS连接肽的片段，以保护蛋白酶的活性不受融合IgG Fc片段影响。

本发明进一步优选的方案中，在所述步骤(IV)中，所述的将(III)所得的cDNA序列II'片段和切割后的亚克隆质粒I'进行DNA重组中，所述cDNA序列II'片段的N端融合所述亚克隆质粒I'的载体附带的His标签。

第五方面，本发明还提供所述重组融合蛋白的表达及纯化方法，包括：将本发明第三方面所述的重组融合蛋白基因表达载体转染入大肠杆菌(BL21-DE3)感受态细胞，在诱导剂诱导下进行蛋白表达，得到所述的重组融合蛋白；所述的诱导剂优选浓度为0.1-0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPGT)；所述的蛋白表达温度优选15-18℃；所述的蛋白表达时间优选20-30小时；完成表达后按照常规方法处理大肠杆菌胞体超声碎裂后高速离心并保留上清，然后采用亲和层析及分子筛纯化得到所述重组融合蛋白。

本发明进一步优选的表达纯化方法中，所述的诱导剂为浓度0.3mM的IPGT；所述的蛋白表达温度为16-18℃；所述的蛋白表达时间为24小时。

本发明进一步优选的表达纯化方法中，所述的亲和层析及分子筛纯化是在4摄氏度进行，并使用包含0.8mM EDTA的缓冲液最大限度保护蛋白酶活性。最后所得纯化蛋白冻存于中性磷酸盐缓冲液中。

第六方面，本发明还提供包含本发明第一方面所述重组融合蛋白的药物组合物。

综上所述，本发明所述的重组融合蛋白的构建策略目的在于获得药物学优势的最大发挥：细菌来源的强效IgA水解酶(AK183)作为药效核心部分，并结合人免疫球蛋白片段的长效生物药理优势，以达到最佳的治疗效果。与现有技术中的天然AK183蛋白酶相比，本发明的重组融合蛋白在以下几方面具有药效的改良：

1.血浆半衰期延长

本发明所述的重组融合蛋白，作为经过与所述人免疫球蛋白片段融合后的基于AK183的蛋白酶，与既往天然蛋白酶AK183相比，在小鼠体内具有足够长的血浆半衰期(详见实验例1)。

2.有效切除循环及肾脏IgA复合物

由于药物体内循环半衰期显著延长，清除循环IgA复合物及肾脏IgA沉积的药效明显增强。体外实验证明本发明所述的融合蛋白酶可有效切割IgA肾病患者、紫癜肾炎患者及川崎病患者血液来源多聚IgA1复合物(效果参考图15、16及17详见实施例部分的具体说明)。通过针对两种不同的人源化IgA小鼠模型的试验治疗，本发明的重组融合蛋白酶不仅可以清除小鼠循环中人IgA，还可以清除已经沉积在肾小球的IgA1复合物(实验例2)。

3.无针对AK183蛋白酶的中和抗体产生

为极大程度的降低多次给药后人体对异源性蛋白序列的免疫抗性反应，我们特异选择人类肠道共生菌来源的IgA蛋白酶。现有技术中报道的大部分具有IgA蛋白酶活性的细菌为致病菌，包括脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟球菌等。此类病原微生物利用切割人IgA铰链区的功能来抵抗宿主的免疫保护。我们注意到少数人类肠道共生菌在其进化中也获得了对抗宿主IgA介导的免疫反应，从而获得共生的能力。同时人类也对其共生菌以及其分泌蛋白具有高度耐受性。由此，我们特异性的选择肠道梭状芽孢杆菌来源的IgA蛋白酶AK183作为药物模板。

经小鼠的动物实验初步验证，本发明所述的重组融合蛋白酶经反复注射后，小鼠体内未产生明显影响AK183蛋白酶活性的中和抗体(实验例3)，因此本发明所述的重组融合蛋白酶反复注射入体内后仍具有AK183蛋白酶活性，仍旧有快速清除IgA1复合物的效果。

总之，本发明的重组融合蛋白适合用于制备特异性治疗IgA肾病的药物，其适应证可包括IgA肾病慢性进展型的诱导缓解治疗，以及临床快速进展快型患者如新月体性IgA肾病病情快速控制治疗。通过使用本发明所述重组融合蛋白制备的药物，可及时有效地降低循环IgA复合物，从而改善疾病预后。除此之外，本发明的重组融合蛋白还可以用于治疗过敏性紫癜、川崎病、IgA为主要致病性抗体的ANCA相关性血管炎、抗肾小球基底膜病及IgA1重链骨髓瘤，有望代替血浆置换快速高效清除致病性IgA抗体，改善患者生存及疾病预后。

附图说明

图1A体现了实施例1中在人免疫球蛋白片段前加碱基防止移码，并且加GGGGGGS作为linker的结构。

图1B和图1C体现了实施例1中限制性内切酶切割的位置。

图2是实施例1所述的重组融合蛋白基因表达载体的构建流程示意图。

图3是天然蛋白酶AK183的功能区结构示意图。

图4是实施例2所述大肠杆菌菌体表达的重组融合蛋白的功能区结构示意图。

图5.是实施例2所述的Superdex S200分子筛纯化后的洗脱曲线。

图6.是实施例2所述的Superdex S200分子筛纯化后蛋白峰F1、F2和F3的免疫印迹图。

图7体现的是实施例2所述的纯化得到的蛋白峰F1、F2和F3，以及其体外活性验证。

图8体现的是实施例2所述纯化得到的蛋白峰F1在体外以不同比例加入纯化的IgA肾病患者循环来源多聚IgA1样本后的酶切活性。

图9体现的是实施例2所述的纯化得到的蛋白峰F1在血清环境中切割IgA1的活性。

图10是实施例3所述方法构建的融合蛋白的功能区域结构示意图。

图11是对比例1所述方法构建的融合蛋白的功能区域结构示意图。

图12体现了对比例1所述方法构建的融合蛋白在表达后人免疫球蛋白片段被自切。

图13是实验例1中以5mg/kg的剂量给小鼠注射融合蛋白酶后小鼠血清中融合蛋白酶浓度随时间变化的曲线图。

图14是来自Lechner等的研究(J Am Soc Nephrol.2016Sep；27(9):2622-9)的天然IgA蛋白酶在小鼠血浆中的浓度随时间变化的曲线图。

图15体现了实施例2制备的融合蛋白酶在体外对来自9例IgA肾病患者血浆纯化的多聚IgA1的酶切活性。

图16体现了实施例2制备的融合蛋白酶在体外对来自4例紫癜肾炎患者血浆纯化的多聚IgA1的酶切活性。

图17体现了实施例2制备的融合蛋白酶在体外对来自1例川崎病患儿血浆纯化的IgA1的酶切活性。

图18实施例3中所述融合蛋白酶在体外于血清环境中对IgA肾病患者及健康对照IgA1的酶切活性。

图19体现了实验例1所述的被动人IgA1小鼠模型，以及不同途径给药后快速有效地清除IgA1的药效。。

图20体现了实验例1所述免疫印迹方法检测融合蛋白酶在被动IgA1小鼠模型中的疗效。

图21是实验例2中所述将融合蛋白酶静脉注射给野生BALB/C小鼠后，融合蛋白酶在体内代谢而浓度降低不同时间点对被动注射的人IgA1的酶切能力,提示蛋白酶在体内的长效切除IgA1的能力。

图22是实验例2中所述无Fc标签的AK183蛋白酶在小鼠体内24小时后无酶切活性。

图23是实验例1所述被动IgA1小鼠模型注射融合蛋白酶后体重变化曲线图。

图24是实验例1所述人源化IgA1-α1KI^+/WT小鼠模型注射融合蛋白酶后循环IgA1水平1小时内迅速降低至检测不到且持续5-7天。

图25是实验例1所述人源化IgA1-α1KI^+/WT小鼠模型静脉注射融合蛋白酶后体重变化曲线图。

图26是被动人IgA在小鼠肾脏沉积模型的建立。

图27体现了实验例3中与未注射融合蛋白酶小鼠相比，给药组的融合蛋白酶可清除被动人IgA1肾脏沉积小鼠模型中肾小球沉积的IgA1，酶切后hIgA1的Fc片段通过肾小球滤过被肾小管重吸收。

图28体现了实验例3中注射重组融合蛋白酶后饲养在普通环境中的人源化IgA1-α1KI^+/WT小鼠肾脏慢性累积沉积的IgA1能够被蛋白酶清除。

图29体现了注射重组融合蛋白酶后不影响人源化IgA1-α1KI^+/WT小鼠肠道粘膜分泌型IgA的免疫屏障作用。

图30是实验例3中所述融合蛋白酶注射后小鼠30天时体内无明显针对AK183的抗体产生。

图31是实验例3中所述中所述融合蛋白酶注射后小鼠30天时与未注射对照小鼠相比血清中识别AK183的抗体滴度无明显差异。

图32是实验例3中所述融合蛋白酶注射后小鼠30天时血清在体外与融合蛋白酶孵育后对融合蛋白酶的酶切活性无显著影响。

图33是实验例3中所述融合蛋白酶注射后小鼠在第23天后再次静脉给同等剂量融合蛋白酶后仍能较快清除被动注射入小鼠体内的人IgA1。

图34是实验例3中所述人源化IgA1-α1KI^+/WT小鼠模型静脉注射融合蛋白酶30天后再次静脉注射等剂量融合蛋白酶循环IgA1水平仍迅速降低且7天后仍低于基线水平。

具体实施方式

以下将以列举实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细阐述，但本发明的范围并不限于所列举的实施例。

实施例1.构建融合蛋白表达质粒

如图2所示，构建融合蛋白表达质粒步骤如下：

①亚克隆质粒构建

选择来自肠道中天然共生梭状芽孢杆菌的AK183蛋白酶作为待融合的天然酶，其基因结构如图3所示，包含信号肽蛋白酶活性区及跨膜锚定区。根据前期研究证实(图11，图12)，AK183的自切位点位于其氨基酸序列的C端跨膜锚定区下游。

通过NCBI数据库搜索得到天然AK183蛋白酶氨基酸序列(如SEQ ID No.2所示)及人免疫球蛋白的氨基酸序列，通过密码子优化，得到适用于大肠杆菌表达的对应cDNA序列，两端加不同限制性内切酶，人免疫球蛋白片段密码子前加碱基防止移码，后加GGGGGGS作为linker(如图1A所示)，使融合蛋白的生物学活性得到最大保护。合成以上cDNA序列(如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示，其中，如图1B和图1C所示，下划线所示为限制性内切酶酶切位点)，分别用DNA连接酶链接cDNA片段入PET30a质粒载体，得到亚克隆PET30a-AK183及载有SEQ ID No.3的质粒。

②融合蛋白质粒构建

用限制性内切酶切割载有SEQ ID No.3的质粒，并回收SEQ ID No.3按图1B所示位置被切割后的片段I，相同限制性内切酶切割PET30a-AK183质粒(切割位置参见图1C)，形成可拼接的粘性末端，DNA连接酶链接片段I入AK183序列中远离其自切位点和活性中心的上游(N端)，形成重组融合载体，同时N端融合载体附带的His标签，便于后期蛋白质纯化。His标签在PET30a质粒Enterokinase前，后期可用Enterokinase切除纯化后蛋白酶的His标签，避免其对蛋白酶活性影响。

实施例2.重组融合蛋白的表达纯化

1)大肠杆菌表达重组融合蛋白酶条件

将实施例1得到的重组融合载体转染入BL21-DE3大肠杆菌感受态细胞，在16℃、0.3mM的IPGT诱导下经24小时表达可得到表达了重组融合蛋白的菌体，菌体中表达的重组融合蛋白基因结构如图4所示。

2)重组融合蛋白分离纯化

收集1)所得菌体加入高盐溶液(500mM氯化钠，20mM磷酸二氢钠，30mM咪唑，0.8mMEDTA)溶菌酶并超声裂解DNA后，带有His标签的重组融合蛋白酶经Ni柱亲和层析及Superdex S200分子筛纯化后得到四个蛋白峰F1、F2、F3和F4(图5)，经鉴定F1蛋白峰的为完整表达(图6)。将F1、F2和F3三个蛋白峰加入同一IgA肾病患者的血清样本中37℃过夜，Jacalin纯化IgA1后进行Western blot验证，发现F1及F2蛋白峰在IgA肾病患者血清样本中有酶切IgA1活性，(图7)，且F1蛋白峰在体外具有更高的蛋白酶活性，与底物IgA1的质量比为1:100时仍能很好地切割IgA1(图8)，进一步实验发现F1蛋白峰中的重组融合蛋白可在37℃下很短的时间内(1hr)高效切割人血清样本中的IgA1(图9)。由上述检测结果可知，本实施例所得的F1蛋白峰完整表达了重组融合蛋白，其单链分子量大约为150kDa，二聚体为～300KD，且表达的重组融合蛋白具有高效的体外酶活性。

实施例3

选择真核表达系统HEK293细胞，构建适合HEK293细胞的融合蛋白表达载体，选择人IL-2的信号肽，以与实施例1相同的人免疫球蛋白片段和AK183构建融合蛋白，将人免疫球蛋白片段融合在AK183蛋白的N端，形成质粒转染HEK293细胞进行表达和分离纯化，从细胞培养液及胞体中可得到完整表达的重组融合蛋白(基因结构如图10所示)。

对比例1.

参考实施例3所述的构建方法，选择HEK293为表达系统构建表达质粒(基因结构如图11所示)，与实施例3中融合蛋白结构区别在于：DNA连接酶链接所述人免疫球蛋白片段入AK183天然酶序列的C端(跨膜锚定区下游)，形成重组融合载体。

纯化后发现，由于AK183的成熟存在C端自切，导致位于融合蛋白C端的人免疫球蛋白片段被自切掉(参见图12)。

实验例1.重组融合蛋白的体内药代动力学

以野生BALB/c小鼠评估实施例2制备的重组融合蛋白酶在体内的药代动力学。

分别尾静脉注射5mg/kg体重的带有His标签的重组融合蛋白酶给3只野生BALB/c小鼠，静脉注射后5min、1.5h、4h、1d、2d、3d、4d、6d、8d、11d收集尾静脉血浆。用ELISA方法以抗His tag单克隆抗体为包板抗体，HRP标记抗人IgG Fc做为检测抗体检测不同时间点血浆中重组融合蛋白酶浓度，以2Distribution phase分布相计算药代动力相关参数。检测及计算结果如图13所示，以5mg/kg体重的剂量静脉注射本发明的重组融合蛋白酶给小鼠第11天后，仍能够在血浆中检测到重组融合蛋白酶，AUC(曲线下面积)93063，半衰期62.5小时。相比之下，Lechner等的研究(J Am Soc Nephrol.2016Sep；27(9):2622-9)，以10mg/kg体重的剂量给小鼠注射天然AK183蛋白酶24小时后，小鼠血浆中已完全检测不到AK183蛋白酶(见图14)。可见本发明实施例2制备的重组融合蛋白酶重组融合蛋白酶具有显著延长的半衰期，并可维持稳定的活性。

实验例2.重组融合蛋白酶体内外功能验证

按照以下方法验证实施例2制备的重组融合蛋白酶在体外的活性：

本实验利用来自临床经肾穿刺活检证实为原发性IgA肾病患者的血浆或血浆纯化的IgA复合物进行。所述的IgA肾病诊断标准参照KIDIGO指南定义为肾穿刺病理以IgA在肾小球系膜区和或毛细血管袢沉积为主，伴或不伴补体C3沉积，临床表现为血尿和或不同程度蛋白尿以及肾功能损伤。

图15应用确诊患有IgA肾病的9位患者(编号分别为PT.1、PT.3、PT.6、PT.7、PT.9、PT.12、PT.19、PT.22和PT.26，其中PT.1、PT.3、PT.6、PT.9为新月体IgA肾病患者)的血浆纯化多聚IgA复合物进行体外重组融合蛋白酶活性检测，纯化后多聚IgA编号及患者临床及病理资料见表1。

表1.IgA肾病患者肾穿时的临床病例资料

以上述表1对应编号的多聚IgA复合物样本作为实验组，将实施例2制备的重组融合蛋白酶分别加入9个纯化得到的多聚IgA复合物样本中；以不加入重组融合蛋白酶的编号为PT.1的多聚IgA复合物样本为对照组；所有实验组与对照组样本37℃过夜，免疫印迹检抗人IgAalpha链抗体检测IgA1重链片段大小来验证上述各实验组中加入的重组融合蛋白酶活性。结果如图15所示，实施例2的重组融合蛋白酶可在37℃过夜条件下100％切割从IgA肾病患者循环中纯化的多聚IgA1复合物，切除后的IgA1复合物与对照组中的复合物相比，IgA1重链被切分为可被抗人IgA alpha抗体识别的分子量更小的Fc片段。

图16应用确诊患有紫癜肾炎的4位患者(编号分别为HSPN1、HSPN2、HSPN3及HSPN4)的血浆纯化多聚IgA复合物进行体外重组融合蛋白酶活性检测，纯化后多聚编号及患者临床及病理资料见表2。

表2.紫癜肾炎患者临床病例资料

图16以上述表2对应编号的多聚IgA复合物样本作为实验组，将实施例2制备的重组融合蛋白酶分别加入4个纯化得到的多聚IgA复合物样本中；以不加入重组融合蛋白酶的编号为HSPN.1的多聚IgA复合物样本为对照组；所有实验组与对照组样本37℃过夜，免疫印迹检抗人IgAalpha链抗体检测IgA1重链片段大小来验证上述各实验组中加入的重组融合蛋白酶活性。结果如图16所示，实施例2的重组融合蛋白酶可在37℃过夜条件下100％切割从紫癜肾炎患者循环中纯化的多聚IgA1复合物，切除后的IgA1复合物与对照组中的复合物相比，IgA1重链被切分为可被抗人IgA alpha抗体识别的分子量更小的Fc片段。

图17应用1例确诊患有川崎病的患儿血浆纯化的IgA1为实验组底物，实施例2制备的重组融合蛋白酶，以不加入重组融合蛋白酶的相同多聚IgA复合物样本为对照组；实验组与对照组样本37℃过夜后行免疫印迹检测，结果发现该融合蛋白酶可显著切除川崎病患儿循环中IgA1。

为了进一步验证本发明的重组融合蛋白酶在血清环境中的酶切活性，在体外将实施例2制备的重组融合蛋白酶与人IgA1以1:50质量比例加入不同IgA肾病患者和健康人(上述编号为PT.3和PT.6的IgA肾病患者和编号为HC.1、HC.2的健康人)的血清中，以不加入重组融合融合蛋白酶的编号为PT.3的血清样本为对照组；所有实验组与对照组样本37℃过夜，免疫印迹检测IgA1重链片段大小来验证上述各实验组中加入的重组融合蛋白酶活性。结果如图18所示，实施例2的重组融合蛋白酶可在体外37℃过夜条件下于血清环境中100％切割IgA肾病患者和健康人循环中的多聚IgA1复合物，切除后的IgA1复合物与对照组中的复合物相比，IgA1重链被切分为可被抗人IgAalpha抗体识别的分子量更小的IgA-Fc片段。

按照以下方法验证实施例2制备的重组融合蛋白酶在人源化小鼠模型体内的活性：

实施例2得到的重组融合蛋白酶体内蛋白酶活性分别在被动人IgA注射野生型BALB/c小鼠模型及人源化IgA1 alpha链敲入(α1KI-Tg)C57BL/6小鼠模型中验证。

所有野生型被动模型BALB/c小鼠随机分为给药A组(静脉给药)、给药B组(腹腔给药)和对照组，每组3只。被动模型的验证方案A为：先给给药A组的和对照组的BALB/c小鼠尾静脉注射人25mg/kg的人IgA1，使其血中人IgA1水平迅速升高，得到被动人IgA注射野生型BALB/c小鼠模型。5分钟后，将实施例2制备的重组融合蛋白酶以5mg/kg体重的剂量经尾静脉注射给给药A组小鼠，对照组尾静脉注射PBS。分别在注射后3min、15min、45min、75min、105min和135min剪尾收集血浆，收集EP管提前加入EDTA抗凝，避免体外酶切反应继续进行。

为了证明腹腔给药依然可以很好吸收入血，被动模型的验证方案B为：将实施例2制备的重组融合蛋白酶经腹腔注射给给药B组的BALB/c小鼠，既往经验约2小时左右腹腔注射重组融合蛋白血液浓度可达到高峰，故1.5小时后尾静脉注射人25mg/kg IgA1，注射后3min、30min、90min、150min剪尾收集血浆，收集EP管提前加入EDTA抗凝，避免体外酶切反应继续进行。

用ELISA方法以抗人IgA Fc抗体包板，HRP标记的抗人Ig Fab抗体为检测抗体，检测上述各验证方案中不同时间点收集到的血浆样本中完整IgA的浓度(血浆稀释液中加入5mM EDTA防止实验过程中血中重组融合蛋白酶继续酶切hIgA1)，结果为图19所示，被动注射人IgA1的所有鼠模型初始血IgA1浓度类似于人血IgA1浓度，且在小鼠体内代谢较慢，PBS对照组在2.25h时循环中人IgA1浓度较初始3分钟时下降35％(反应非蛋白酶介导的异源IgA在小鼠体内的自然清除)，提示该被动模型可用于体内重组融合蛋白酶活性检测。与PBS治疗组相比，尾静脉给药(图19A)及腹腔注射给药重组融合蛋白酶(图19B)均能在小鼠体内快速清除被动注射的人IgA1，且从3分钟开始静脉重组融合蛋白酶给药组血IgA水平就明显低于PBS对照组，给药组1.75小时血中仅剩余～5％完整人IgA1，静脉注射给药方式可使重组融合蛋白酶血药浓度迅速达到峰值而能更快清除血中人IgA1。

用Jacalin beads纯化上述给药A组在不同时间点收集的血浆中人IgA1(血浆6μl加入100μl含有5mM EDTA的PBS)，通过免疫印迹方法用抗人IgA alpha抗体检测收集到的人IgA1重链片段。结果如图20A所示，与上述ELISA结果一致，实施例2的重组融合蛋白酶静脉给药A组在3分钟时血浆中IgA1Fc(分子量～65KD)片段明显减少，部分IgA1 Fc片段被切割为更小分子量的Fd片段(理论分子量27KD，还原状态可见位于～37KD蛋白条带)，给药A组1.75小时未见IgA1 Fc条带。图20B为图20A中人IgA1 Fc完整条带灰度定量结果。结果证实重组Fc-AK183在小鼠体内切割IgA1的药效显著。

此外，为了检测本发明的重组融合蛋白酶在体内的药物活性衰减的过程，我们在0点给12只野生BALB/c小鼠以5mg/kg剂量尾静脉注射实施例2制备的重组融合蛋白酶，之后，实验分为4组，每组3只小鼠，分别在注射重组融合蛋白酶后第1、3、7、10天尾静脉注射25mg/kg人IgA1，每组在注射之后收集第0.05h、0.5h、1.5h、3h、5h、7h血浆，同时设置PBS及人IgA1静脉注射对照组小鼠3只(图21A)。采用ELISA方法检测血浆中完整人IgA1(具体方法同实验例1所述)，结果相比于PBS对照治疗组，分别以每只小鼠3分钟时血IgA水平为基线100％，小鼠血中人IgA1水平随时间下降率曲线作为酶活性评估，接受实施例2重组融合蛋白酶静脉注射的实验组小鼠在第1、3、7、10天注射人IgA1后IgA1浓度下降速率在7小时内均较PBS组下降速率快，且第1天较第3天、7天、10天下降更快，提示融合蛋白酶的酶切活性在体内会随着时间延长而缓慢减低(如图21B)。

为了更加明确地验证本发明重组融合蛋白可以长时间发挥作用，采用常规方法通过大肠杆菌重组表达无Fc标签的重组AK183蛋白酶作为对照蛋白酶，给BALB/c小鼠静脉注射等剂量5mg/kg的上述对照蛋白酶，1天后同样尾静脉注射25mg/kg人IgA1，之后收集第0.05h、0.5h、1.5h、3h血浆，采用ELISA方法进行人IgA1浓度检测。与实施例2的重组融合蛋白酶相比，人IgA1随时间变化的浓度曲线显示对照蛋白酶组未有明显加快IgA1降解趋势，且与PBS组IgA1代谢曲线重合(图22)。提示上述对照蛋白酶在小鼠体内1天后已被代谢清除无蛋白酶活性，与Lechner等的研究结果一致。

对以上给药A组和给药B组中注射过实施例2重组融合蛋白酶的6只被动IgA1小鼠模型在注射后10天内每天测量体重，均未发现有体重下降趋势(如图23所示)，且小鼠行为及反应正常，提示本发明重组融合蛋白酶的注射不会对该小鼠产生体重降低等不良影响。

为了解决被动IgA1小鼠模型循环中无稳定水平的IgA1，进而采用人源化IgA1转基因动物模型小鼠(IgA1-α1KI^+/WT小鼠模型)(图24A)。该杂合子表达稳定水平的人IgA1及小鼠IgA(见免疫印迹图24C中Baseline基线时间点)。在此实验中小鼠IgA因无铰链区序列无法被Fc-AK183酶切，因此作为药物特异性切割人源IgA1的对照。静脉注射实施例2的重组融合蛋白酶5mg/kg给3只IgA1-α1KI^+/WT小鼠，分别在注射前、注射后0.05h、2h、4h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h及336h收集尾静脉EDTA抗凝血浆(如图24B)，用抗人IgA1alpha抗体免疫印迹方法检测各时间点血浆中完整IgA-H(IgA重链)水平，用抗小鼠IgA抗体免疫印迹方法检测以上时间点小鼠血浆IgA水平。结果显示，注射实施例2的重组融合蛋白酶后，循环IgA1水平1小时内迅速降低至无明显条带且持续5-7天，后缓慢升高，14天后回升至基线水平，期间小鼠IgA水平无显著变化(图24C)。图24D为对24A中三只小鼠不同时间点人IgA免疫印迹条带的半定量分析。同时此三只小鼠观察14天体重无明显下降(图25)。由此揭示了以本发明重组融合蛋白酶给药被动IgA1小鼠模型时，5mg/kg的剂量每5-7天注射一次的给药方案是有效的。

此外我们分别建立了被动IgA1沉积小鼠模型及普通环境饲养IgA1-α1KI^+/WT小鼠导致肾脏IgA1沉积模型来研究本发明重组融合蛋白酶对肾脏沉积的IgA1的药物清除能力。被动IgA1沉积模型的研究方案参见图26所示。前期研究发现以～25mg/kg剂量单次注射人IgA1后2.5小时左右免疫荧光染色可见肾小球有明显IgA1沉积，主要在毛细血管袢及系膜区，此沉积方式类似于人IgA肾病中肾脏IgA1沉积(图26)。本实验中每间隔1小时给BABL/c小鼠尾静脉注射25mg/kg人IgA1，共注射两次，(方案如图27A所示)，PBS对照治疗组末次IgA1注射2.5小时后OCT包埋的冰冻肾脏组织4μm切片用抗人IgA1 Fc FITC标记抗体进行免疫荧光用染色，发现明显IgA1仅沉积于肾小球系膜区及部分毛细血管袢，证明模型建立成功(参见图27B左下、右下)。而与PBS对照治疗组相比，末次IgA1注射1小时后尾静脉注射5mg/kg剂量的实施例2重组融合蛋白酶，在体内反应1.5小时后发现肾小球均无IgA1沉积(参见图27B左上)，而肾小管上皮细胞内可见IgA1阳性信号(参见图27B右上)，提示肾脏沉积的IgA1可被实施例2的重组融合蛋白酶在1.5小时内快速酶切，并且酶切后IgA1-Fc片段由于分子量低于肾脏机械滤过屏障，可被滤过清除进而被肾小管上皮细胞代谢。

此外在普通环境饲养IgA1-α1KI^+/WT小鼠，出现转基因人IgA1在肾脏沉积。为了更确切的验证此Fc-AK183对肾脏沉积IgA1清除的疗效，同只小鼠的两个肾脏分别在给药前后取摘。在先摘除一侧肾脏后静脉注射5mg/kg本发明实施例2的重组融合蛋白酶，3.5小时之后摘除对侧肾脏(图28A)。之后用FITC标记抗人IgA抗体进行免疫荧光染色来检测肾脏IgA1沉积。结果发现给药前摘取的肾脏在肾小球系膜区有明显人IgA沉积(2+～3+)。而给药后2小时摘取的对侧肾脏IgA1显著减弱(+-～-)(参见图28B)，继而证明Fc-AK183对慢性累积性IgA1沉积的清除疗效。同时，在对小肠组织的染色中发现小肠分泌型IgA1仍然呈强阳性(参见图29)，提示发明的注射用重组蛋白酶对于血管外粘膜IgA1无清除作用。可以推断此药物不会影响由分泌型IgA1介导的的肠道粘膜防御屏障。

实验例3.重组融合蛋白中和抗体检测及对其活性的影响作用

为了检验在多次注射后该重组融合蛋白酶Fc-AK183的抗原反应，我们实施了间隔性注射该药物方案，以验证：1.小鼠是否有产生抗AK183抗体，2.该抗体是否抑制蛋白酶活性。

收集BALB/c小鼠以5mg/kg剂量静脉注射实施例2的重组融合蛋白酶后第30天的血清，用ELISA方法分别以2.5μg/ml的AK183及重组融合蛋白酶为包板抗原，设置等浓度BSA包板的下孔，1％BSA封闭后，小鼠血清梯度稀释(1:10、1:100、1:500、1:1000、1:10000)孵育，HRP标记的抗小鼠IgG作为检测抗体，检测针对AK183及重组融合蛋白酶的抗体。结果如图30所示，实施例2的重组融合蛋白酶Fc-AK183治疗后第30天的小鼠血清中有识别完整重组融合蛋白酶Fc-AK83的高滴度抗体，而无显著的识别AK183的抗体，提示较AK183抗原性相比，Fc片段抗原性更强。4只未接受AK183注射的野生BALB/c为阴性对照组，与AK183治疗过的小鼠同时再次用ELISA的方法检测针对AK183及人IgG1Fc的抗体，结果为图31所示，与未干预组相比，从不同角度验证实施例2的重组融合蛋白酶Fc-AK83治疗组有很低滴度的识别AK183抗体及高滴度识别人Fc抗体。

进一步，我们在体外检测针对重组蛋白酶的抗体是否会影响蛋白酶的活性。首先在体外将5μg的实施例2的重组融合蛋白酶加入不同体积的上述第30天抗血清(20ul，10ul，2ul)，37℃反应1小时，之后加入10μg人IgA1 37℃过夜酶切。采用免疫印迹方法用抗人IgA1Fc抗体检测重组融合蛋白酶与可识别Fc的血清抗体反应后在体外是否依然有酶切人IgA1的活性。结果如图32所示，人IgA1均很好地被酶切为IgA-Fc片段，提示针对融合蛋白酶IgG1Fc的中和抗体在体外全血清条件下不影响重组融合蛋白酶的酶活性。

中和抗体是否会影响重组融合蛋白酶在体内活性的实验设计如下所述，接受5mg/kg的实施例2的重组融合蛋白酶静脉注射的3只小鼠，在给药后第23天再次静脉注射5mg/kg的实施例2的重组融合蛋白酶，1小时后尾静脉注射20mg/kg的人IgA1，收集注射IgA1后第0.05h、0.25h、0.75h、1.25h、1.75h和2.25h血浆，用实验例1中ELISA方法检测血浆中人IgA1浓度，用实验例1中初次注射实施例2的重组融合蛋白酶组及PBS组为对照组。结果如图33所示，23天后再次注射实施例2的重组融合蛋白酶给小鼠，让其在体内与中和抗体反应后依然有较强的切割IgA1的活性。提示针对中和抗体在体内不影响重组融合蛋白酶的酶活性。

同时对3只实验例2中接受实施例2的重组融合蛋白酶Fc-AK83静脉注射的人源化IgA1-α1KI^+/WT小鼠在注射后第30天再次接受同等剂量5mg/kg的实施例2的重组融合蛋白酶Fc-AK183静脉治疗，收集给药前、给药后3min、4小时、24小时、72小时、120小时血浆，用实验例2中免疫印迹方法检测给药后不同时间点血浆人IgA及小鼠IgA水平。结果如图34所示，再次给药后IgA1-α1^KI+/WT小鼠水平在4小时内迅速降低，并维持24小时免疫印迹检测低限水平，第3天时血人IgA有所升高，但仍明显低于给药前基线水平(约为基线50％水平)，并维持该水平平稳至第7天，而小鼠IgA给药前后保持稳定水平。提示IgA1-α1^KI+/WT小鼠对初次注射重组蛋白酶后产生的抗体对再次给药的体内活性影响不大。

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<130> LP0484

<140> 2021103854437

<141> 2021-04-10

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 230

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 1

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1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

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50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

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225 230

<210> 2

<211> 1174

<212> PRT

<213> 梭状芽胞杆菌(Clostridium)

<400> 2

Gly Ser Ser Lys Pro Asp Ile Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Met Gly

1 5 10 15

Val Tyr Asn Asn Ala Ser Ile Leu Trp Arg Cys Val Ser Ile Asp Asn

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Asn Lys Gly Ile Val Asp Gly Asp Ala Asn Ser Asp Leu Leu Tyr Tyr

145 150 155 160

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165 170 175

Thr Thr Thr Glu Lys Val Phe Leu Leu Asp Val Lys Gln Ala Asn Ala

180 185 190

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Gly Ser Ala Pro Asn Lys Gln Glu Asp Asp Tyr Thr Ile Ser Glu Pro

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485 490 495

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545 550 555 560

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610 615 620

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Asn Arg Asn Asp Arg Leu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Ser Arg Phe Asn

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755 760 765

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Ile Gln Tyr Lys Phe Glu Asp Gly Ser Glu Ile Pro Asn Thr Ala Gly

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820 825 830

Pro Ile Val Ser Asp Gly Thr Val Val Thr Tyr Tyr Tyr Lys Asn Lys

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850 855 860

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1010 1015 1020

Tyr Thr Ala Val Ser Gly Ser Thr Val Leu Thr Leu Lys Ala Ser Tyr

1025 1030 1035 1040

Leu Gly Thr Leu Thr Asp Gly Ser His Thr Ile Thr Phe Val Tyr Thr

1045 1050 1055

Asp Gly Glu Ala Asn Ala Asn Leu Thr Val Arg Thr Ala Gly Ser Gly

1060 1065 1070

His Ile His Asp Tyr Gly Thr Glu Trp Lys Ser Asn Ala Asp Asn His

1075 1080 1085

Trp His Glu Cys Asn Cys Gly Asp Lys Lys Asp Glu Ala Ala His Ser

1090 1095 1100

Phe Lys Trp Val Val Asp Lys Glu Ala Thr Ala Thr Lys Lys Gly Ser

1105 1110 1115 1120

Lys His Glu Glu Cys Lys Ile Cys Gly Tyr Lys Arg Ser Ala Val Glu

1125 1130 1135

Ile Pro Ala Thr Gly Thr Ser Thr Ala Pro Thr Asp Thr Thr Lys Pro

1140 1145 1150

Asn Asp Thr Thr Lys Pro Gly Asn Thr Asn Gly Ser Glu Lys Ser Pro

1155 1160 1165

Gln Thr Gly Asp Asn Ser

1170

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atccatggga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60

aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120

tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg 180

tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240

aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300

ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg 360

agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420

catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480

atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540

ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600

acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660

acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaaggtggc ggtggcggcg 720

<210> 4

<211> 3534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccagca aaccggacat caaagtgggc gactacgtga aaatgggtgt gtataataac 60

gcaagcatcc tgtggcgctg tgtgagcatc gacaacaatg gcccgctgat gctggccgat 120

aaaattgttg acacgctggc gtatgatgct aaaaccaacg acaattcgaa cagcaaatct 180

catagtcgtt cctacaaacg cgatgactac ggcagcaact attggaaaga tagtaatatg 240

cgctcctggc tgaactcaac cgcggccgag ggtaaagtgg attggctgtg cggcaatccg 300

ccgaaagacg gttacgtcag cggcgtgggt gcatataatg aaaaagctgg ttttctgaac 360

gcgttctcaa aatcggaaat tgcagctatg aaaacggtga cccagcgtag cctggtttct 420

catccggaat ataataaagg cattgttgat ggtgacgcga actcggatct gctgtattac 480

accgacatca gcgaagcagt ggctaactac gatagctctt attttgaaac cacgaccgaa 540

aaagttttcc tgctggatgt caaacaggcg aacgccgtct ggaaaaatct gaaaggctat 600

tacgtggctt acaacaatga tggtatggca tggccgtatt ggctgcgtac cccggtgacg 660

gattgtaatc atgacatgcg ctatattagt tcctcaggcc aggttggtcg ttacgctccg 720

tggtattctg atctgggcgt ccgtccggcg ttttacctgg acagtgaata tttcgtgacg 780

accagcggct ctggtagtca gtcgagcccg tacattggtt ccgcgccgaa caaacaagaa 840

gatgactata ccatctcaga accggcggaa gatgccaacc cggactggaa tgtttcgacg 900

gaacagagca ttcaactgac cctgggcccg tggtactcga atgatggtaa atatagcaac 960

ccgaccattc cggtgtatac catccagaaa acgcgctcgg ataccgaaaa catggtggtt 1020

gtcgtgtgcg gcgaaggtta taccaaatca cagcaaggca aatttatcaa tgatgttaaa 1080

cgtctgtggc aggacgctat gaaatatgaa ccgtaccgta gctatgcgga tcgctttaat 1140

gtgtatgcac tgtgtacggc ttccgaatca accttcgata acggcggttc tacctttttc 1200

gatgtgatcg ttgacaaata caactctccg gttatcagta acaatctgca tggcagtcag 1260

tggaaaaatc acatttttga acgctgcatc ggtccggaat tcattgaaaa aatccatgat 1320

gcccacatta agaaaaaatg tgacccgaac accatcccgt cgggtagcga atacgaaccg 1380

tattactatg tgcatgatta tattgcacag tttgctatgg ttgtcaatac caaatccgac 1440

ttcggcggtg catataacaa tcgcgaatac ggctttcact atttcatctc tccgagtgat 1500

tcctaccgtg cctctaaaac ctttgcacat gaattcggcc acggtctgct gggcctgggt 1560

gatgaatact cgaatggtta tctgctggat gacaaagaac tgaaaagcct gaacctgtct 1620

agtgtggaag atccggaaaa aattaaatgg cgtcagctgc tgggctttcg caatacgtac 1680

acctgccgta acgcgtatgg ttctaaaatg ctggtttcct catacgaatg tatcatgcgc 1740

gataccaact atcaattttg cgaagtctgt cgcctgcagg gcttcaaacg tatgagccaa 1800

ctggttaaag atgtcgacct gtatgtggcc acgccggaag ttaaagaata caccggtgca 1860

tatagtaaac cgtccgattt tacggacctg gaaacctcga gctactacaa ctacacctac 1920

aaccgtaacg atcgcctgct gagtggcaac tcaaaatcgc gtttcaatac gaacatgaat 1980

ggcaagaaaa ttgaactgcg caccgttatt cagaacatca gcgataaaaa cgcccgtcaa 2040

ctgaaattca aaatgtggat caaacattca gatggctcgg tggcaaccga ctctagtggt 2100

aacccgctgc agaccgtcca aacgtttgat attccggtgt ggaacgacaa agccaatttc 2160

tggccgctgg gcgcactgga tcacatcaaa tccgacttta attcaggtct gaaaagctgc 2220

tctctgattt atcagatccc gtctgatgct caactgaaaa gtggcgacac cgtggcgttc 2280

caggttctgg atgaaaacgg taatgtgctg gcggatgaca acacggaaac ccagcgctac 2340

acgaccgttt ctatccaata caaattcgaa gatggcagtg aaatcccgaa tacggcgggc 2400

ggtaccttca ccgttccgta tggtaccaaa ctggatctga cgccggccaa aaccctgtac 2460

gattacgaat tcatcaaagt tgacggcctg aataaaccga tcgtcagcga tggtaccgtg 2520

gttacgtact actacaaaaa caaaaacgaa gaacatacgc acaacctgac cctggtggcg 2580

gccaaagcag ctacctgtac gaccgcgggc aatagcgcct attacacctg cgatggttgt 2640

gacaaatggt ttgcagatgc taccggctcc gtggaaatta ccgacaaaac gtcagttaaa 2700

atcccggctc cgggtcatac cgccggtacg gaatggaaaa gcgatgacac gaaccattgg 2760

cacgaatgca ccgtcgcagg ctgtggtgtg attatcgaaa gcacgaaatc tgcgcacacc 2820

gccggcgaat ggattgtgga taccccggca acggcaacga ccgccggtac gaaacataaa 2880

gaatgcaccg tctgtcaccg tgtgctggaa acccagccga tcccgagcac gggtaccgaa 2940

ctgaaaatta tcgccggtga taaccaaatc tacaacaaag caagtggctc cgatgtcacg 3000

atcacctgca acggtgactt tgccaaattc accggcatta aagtggatgg tagcgtcgtg 3060

gactcctcaa attacaccgc cgtttcaggc tcgaccgtcc tgacgctgaa agcatcctat 3120

ctgggcacgc tgaccgatgg ttcacatacg attaccttcg tttacaccga cggtgaagca 3180

aacgctaatc tgaccgtccg cacggctggc tctggtcata tccacgatta tggcaccgaa 3240

tggaaaagta acgcggacaa tcattggcac gaatgcaatt gtggtgataa aaaagacgaa 3300

gcggcccatt cctttaaatg ggttgtcgat aaagaagcga cggccaccaa aaaaggctca 3360

aaacacgaag aatgcaaaat ctgtggttac aaacgttcgg ccgtggaaat cccggcaacg 3420

ggtaccagca cggcaccgac cgatacgacc aaaccgaacg acacgacgaa accgggtaat 3480

acgaatggct ccgaaaaatc tccgcaaacg ggcgacaata gttaatgaaa gctt 3534

<210> 5

<211> 1412

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Ser Lys Pro Asp Ile Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Met Gly Val Tyr

245 250 255

Asn Asn Ala Ser Ile Leu Trp Arg Cys Val Ser Ile Asp Asn Asn Gly

260 265 270

Pro Leu Met Leu Ala Asp Lys Ile Val Asp Thr Leu Ala Tyr Asp Ala

275 280 285

Lys Thr Asn Asp Asn Ser Asn Ser Lys Ser His Ser Arg Ser Tyr Lys

290 295 300

Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Asn Tyr Trp Lys Asp Ser Asn Met Arg Ser

305 310 315 320

Trp Leu Asn Ser Thr Ala Ala Glu Gly Lys Val Asp Trp Leu Cys Gly

325 330 335

Asn Pro Pro Lys Asp Gly Tyr Val Ser Gly Val Gly Ala Tyr Asn Glu

340 345 350

Lys Ala Gly Phe Leu Asn Ala Phe Ser Lys Ser Glu Ile Ala Ala Met

355 360 365

Lys Thr Val Thr Gln Arg Ser Leu Val Ser His Pro Glu Tyr Asn Lys

370 375 380

Gly Ile Val Asp Gly Asp Ala Asn Ser Asp Leu Leu Tyr Tyr Thr Asp

385 390 395 400

Ile Ser Glu Ala Val Ala Asn Tyr Asp Ser Ser Tyr Phe Glu Thr Thr

405 410 415

Thr Glu Lys Val Phe Leu Leu Asp Val Lys Gln Ala Asn Ala Val Trp

420 425 430

Lys Asn Leu Lys Gly Tyr Tyr Val Ala Tyr Asn Asn Asp Gly Met Ala

435 440 445

Trp Pro Tyr Trp Leu Arg Thr Pro Val Thr Asp Cys Asn His Asp Met

450 455 460

Arg Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gln Val Gly Arg Tyr Ala Pro Trp Tyr

465 470 475 480

Ser Asp Leu Gly Val Arg Pro Ala Phe Tyr Leu Asp Ser Glu Tyr Phe

485 490 495

Val Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ser Ser Pro Tyr Ile Gly Ser

500 505 510

Ala Pro Asn Lys Gln Glu Asp Asp Tyr Thr Ile Ser Glu Pro Ala Glu

515 520 525

Asp Ala Asn Pro Asp Trp Asn Val Ser Thr Glu Gln Ser Ile Gln Leu

530 535 540

Thr Leu Gly Pro Trp Tyr Ser Asn Asp Gly Lys Tyr Ser Asn Pro Thr

545 550 555 560

Ile Pro Val Tyr Thr Ile Gln Lys Thr Arg Ser Asp Thr Glu Asn Met

565 570 575

Val Val Val Val Cys Gly Glu Gly Tyr Thr Lys Ser Gln Gln Gly Lys

580 585 590

Phe Ile Asn Asp Val Lys Arg Leu Trp Gln Asp Ala Met Lys Tyr Glu

595 600 605

Pro Tyr Arg Ser Tyr Ala Asp Arg Phe Asn Val Tyr Ala Leu Cys Thr

610 615 620

Ala Ser Glu Ser Thr Phe Asp Asn Gly Gly Ser Thr Phe Phe Asp Val

625 630 635 640

Ile Val Asp Lys Tyr Asn Ser Pro Val Ile Ser Asn Asn Leu His Gly

645 650 655

Ser Gln Trp Lys Asn His Ile Phe Glu Arg Cys Ile Gly Pro Glu Phe

660 665 670

Ile Glu Lys Ile His Asp Ala His Ile Lys Lys Lys Cys Asp Pro Asn

675 680 685

Thr Ile Pro Ser Gly Ser Glu Tyr Glu Pro Tyr Tyr Tyr Val His Asp

690 695 700

Tyr Ile Ala Gln Phe Ala Met Val Val Asn Thr Lys Ser Asp Phe Gly

705 710 715 720

Gly Ala Tyr Asn Asn Arg Glu Tyr Gly Phe His Tyr Phe Ile Ser Pro

725 730 735

Ser Asp Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Thr Phe Ala His Glu Phe Gly His

740 745 750

Gly Leu Leu Gly Leu Gly Asp Glu Tyr Ser Asn Gly Tyr Leu Leu Asp

755 760 765

Asp Lys Glu Leu Lys Ser Leu Asn Leu Ser Ser Val Glu Asp Pro Glu

770 775 780

Lys Ile Lys Trp Arg Gln Leu Leu Gly Phe Arg Asn Thr Tyr Thr Cys

785 790 795 800

Arg Asn Ala Tyr Gly Ser Lys Met Leu Val Ser Ser Tyr Glu Cys Ile

805 810 815

Met Arg Asp Thr Asn Tyr Gln Phe Cys Glu Val Cys Arg Leu Gln Gly

820 825 830

Phe Lys Arg Met Ser Gln Leu Val Lys Asp Val Asp Leu Tyr Val Ala

835 840 845

Thr Pro Glu Val Lys Glu Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Ser Asp

850 855 860

Phe Thr Asp Leu Glu Thr Ser Ser Tyr Tyr Asn Tyr Thr Tyr Asn Arg

865 870 875 880

Asn Asp Arg Leu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Ser Arg Phe Asn Thr Asn

885 890 895

Met Asn Gly Lys Lys Ile Glu Leu Arg Thr Val Ile Gln Asn Ile Ser

900 905 910

Asp Lys Asn Ala Arg Gln Leu Lys Phe Lys Met Trp Ile Lys His Ser

915 920 925

Asp Gly Ser Val Ala Thr Asp Ser Ser Gly Asn Pro Leu Gln Thr Val

930 935 940

Gln Thr Phe Asp Ile Pro Val Trp Asn Asp Lys Ala Asn Phe Trp Pro

945 950 955 960

Leu Gly Ala Leu Asp His Ile Lys Ser Asp Phe Asn Ser Gly Leu Lys

965 970 975

Ser Cys Ser Leu Ile Tyr Gln Ile Pro Ser Asp Ala Gln Leu Lys Ser

980 985 990

Gly Asp Thr Val Ala Phe Gln Val Leu Asp Glu Asn Gly Asn Val Leu

995 1000 1005

Ala Asp Asp Asn Thr Glu Thr Gln Arg Tyr Thr Thr Val Ser Ile Gln

1010 1015 1020

Tyr Lys Phe Glu Asp Gly Ser Glu Ile Pro Asn Thr Ala Gly Gly Thr

1025 1030 1035 1040

Phe Thr Val Pro Tyr Gly Thr Lys Leu Asp Leu Thr Pro Ala Lys Thr

1045 1050 1055

Leu Tyr Asp Tyr Glu Phe Ile Lys Val Asp Gly Leu Asn Lys Pro Ile

1060 1065 1070

Val Ser Asp Gly Thr Val Val Thr Tyr Tyr Tyr Lys Asn Lys Asn Glu

1075 1080 1085

Glu His Thr His Asn Leu Thr Leu Val Ala Ala Lys Ala Ala Thr Cys

1090 1095 1100

Thr Thr Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Thr Cys Asp Gly Cys Asp Lys

1105 1110 1115 1120

Trp Phe Ala Asp Ala Thr Gly Ser Val Glu Ile Thr Asp Lys Thr Ser

1125 1130 1135

Val Lys Ile Pro Ala Pro Gly His Thr Ala Gly Thr Glu Trp Lys Ser

1140 1145 1150

Asp Asp Thr Asn His Trp His Glu Cys Thr Val Ala Gly Cys Gly Val

1155 1160 1165

Ile Ile Glu Ser Thr Lys Ser Ala His Thr Ala Gly Glu Trp Ile Val

1170 1175 1180

Asp Thr Pro Ala Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Lys His Lys Glu Cys

1185 1190 1195 1200

Thr Val Cys His Arg Val Leu Glu Thr Gln Pro Ile Pro Ser Thr Gly

1205 1210 1215

Thr Glu Leu Lys Ile Ile Ala Gly Asp Asn Gln Ile Tyr Asn Lys Ala

1220 1225 1230

Ser Gly Ser Asp Val Thr Ile Thr Cys Asn Gly Asp Phe Ala Lys Phe

1235 1240 1245

Thr Gly Ile Lys Val Asp Gly Ser Val Val Asp Ser Ser Asn Tyr Thr

1250 1255 1260

Ala Val Ser Gly Ser Thr Val Leu Thr Leu Lys Ala Ser Tyr Leu Gly

1265 1270 1275 1280

Thr Leu Thr Asp Gly Ser His Thr Ile Thr Phe Val Tyr Thr Asp Gly

1285 1290 1295

Glu Ala Asn Ala Asn Leu Thr Val Arg Thr Ala Gly Ser Gly His Ile

1300 1305 1310

His Asp Tyr Gly Thr Glu Trp Lys Ser Asn Ala Asp Asn His Trp His

1315 1320 1325

Glu Cys Asn Cys Gly Asp Lys Lys Asp Glu Ala Ala His Ser Phe Lys

1330 1335 1340

Trp Val Val Asp Lys Glu Ala Thr Ala Thr Lys Lys Gly Ser Lys His

1345 1350 1355 1360

Glu Glu Cys Lys Ile Cys Gly Tyr Lys Arg Ser Ala Val Glu Ile Pro

1365 1370 1375

Ala Thr Gly Thr Ser Thr Ala Pro Thr Asp Thr Thr Lys Pro Asn Asp

1380 1385 1390

Thr Thr Lys Pro Gly Asn Thr Asn Gly Ser Glu Lys Ser Pro Gln Thr

1395 1400 1405

Gly Asp Asn Ser

1410

Claims (17)

1.基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白在制备治疗IgA复合物沉积介导的相关疾病的药物中的应用，其特征在于：所述的IgA复合物沉积介导的相关疾病是IgA肾病、过敏性紫癜性肾炎或川崎病；所述重组融合蛋白氨基酸序列如SEQID No.5所示。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白被制备成液体制剂，用于向患有所述IgA复合物沉积介导的相关疾病的哺乳动物给药。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的液体制剂是注射剂，所述的给药是通过静脉注射或者输液途径给药。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的哺乳动物是人，且所述的静脉注射的方案包括：以5-10mg/kg的剂量每10-15天注射一次。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的静脉注射的方案包括：以10-15mg/kg的剂量作为起始注射剂量，后改为5-10mg/kg维持剂量每10天注射一次。

6.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的哺乳动物是被动人IgA注射鼠模型、人IgA1转基因鼠模型或灵长类动物模型，且所述的静脉注射的方案包括：以5-10mg/kg的剂量每5-10天注射一次。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的静脉注射的方案包括：以5mg/kg的剂量每5天注射一次。

8.一种重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID No.5所示。

9.一种重组融合蛋白基因表达载体，它是由运载体和目的基因重组融合构成的质粒，其中，所述的目的基因是编码氨基酸序列如SEQID No.5所示蛋白的重组融合基因。

10.权利要求9所述的重组融合蛋白基因表达载体，其特征在于：所述的运载体是适用于原核表达系统的运载体。

11.权利要求9所述的重组融合蛋白基因表达载体，其特征在于：所述的运载体是与大肠杆菌表达系统匹配的运载体。

12.权利要求9-11任意一项所述的重组融合蛋白基因表达载体，其特征在于：所述的运载体是带纯化标签的运载体。

13.权利要求9-11任意一项所述的重组融合蛋白基因表达载体，其特征在于：所述的运载体是pET30a质粒。

14.基于AK183蛋白酶的重组融合蛋白表达及纯化的方法，包括：将权利要求9所述的重组融合蛋白基因表达载体转染入大肠杆菌感受态细胞，在诱导剂诱导下进行蛋白表达，得到所述的重组融合蛋白；所述的诱导剂浓度为0.1-0.5 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPGT）；所述的蛋白表达温度为15-18℃；所述的蛋白表达时间为20-30小时；完成表达后按照常规方法处理大肠杆菌胞体超声碎裂后高速离心并保留上清，然后采用亲和层析及分子筛纯化得到所述重组融合蛋白。

15.权利要求14所述的方法，其特征在于：所述的诱导剂为浓度0.3 mM的IPGT；所述的蛋白表达温度为16-18℃；所述的蛋白表达时间为24小时。

16.权利要求14所述的方法，其特征在于：所述的亲和层析及分子筛纯化是在4摄氏度进行，并使用包含0.8mM EDTA的缓冲液最大限度保护蛋白酶活性，最后所得纯化蛋白冻存于中性磷酸盐缓冲液中。

17.包含权利要求8所述重组融合蛋白的药物组合物。