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CN115161338A - 基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用 - Google Patents

基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用 Download PDF

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CN115161338A
CN115161338A CN202210682700.8A CN202210682700A CN115161338A CN 115161338 A CN115161338 A CN 115161338A CN 202210682700 A CN202210682700 A CN 202210682700A CN 115161338 A CN115161338 A CN 115161338A
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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，本发明公开了一种基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法：利用质粒pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe3在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。本发明利用病毒TRVe3在表达外源蛋白速度快与含量高的特点对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。

Description

基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体包括利用烟草脆裂病毒(tobacco rattlevirus,TRV)构建在植物中表达Cas12a蛋白载体和表达Cas12a蛋白并转录CRISPR-derivedRNA(crRNA)载体，并利用TRV重组病毒在植物中对靶标基因进行定点编辑。
背景技术
基因组定点编辑技术依赖于序列特异性核酸酶在基因组定点位置精准切割双链DNA，造成双链DNA断裂，并激活细胞内的非同源末端连接或同源介导DNA修复。无同源的序列供体DNA，通过NHEJ途径在DNA双链断裂处插入或缺失少量碱基而造成基因突变；存在同源的序列供体DNA，通过HDR途径在DNA双链断裂位置产生精确定点插入或替换。近年来，基因组定点编辑技术的出现，为农作物的精准育种开辟新途径；在水稻、玉米、小麦、马铃薯、番茄和大豆等重要农作物的基因组功能研究和遗传育种改良展现出巨大的应用前景。
目前基因组定点编辑有3种类型，1)锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术，2)转录激活因子类效应物核酸酶(transcription activator-like effectornuclease,TALEN)技术，3)串联间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins,CRISPR/Cas)技术，其中CRISPR/Cas技术是目前应用最为广泛的基因组定点编辑方法，成功应用于模式植物、粮油作物、蔬菜、果实、花卉等的产量、品质、抗病以及抗逆性的改良。
CRISPR/Cas核酸酶如何在细胞中高效表达是植物基因组定点编辑的最重要步骤之一，因植物细胞存在细胞壁，如何快速高效地递送表达CRISPR/Cas核酸酶是植物基因组编辑的主要限制因素。目前，在植物中可通过转基因、非转基因和病毒载体3种方式表达CRISPR/Cas核酸酶，而转基因表达CRISPR/Cas蛋白为最常用的方法。通过农杆菌介导转基因，农杆菌进入植物细胞后，CRISPR/Cas基因随T-DNA随机整合到植物基因组中并表达，并对靶标基因进行编辑，通过筛选培养基组培再生获得靶标基因编辑的植株。植物转基因流程简单、技术成熟，但亦存诸多不足，1)农杆菌主要侵染双子叶植物，而在单子叶植物转基因则效率低下；2)T-DNA在植物基因组中随机插入可能到底非预期的遗传性状产生；3)再生植株中Cas蛋白持续过表达增加潜在的脱靶风险；4)转基因需要组织培养、植株再生等过程，工作量大、周期长；基因枪介导的遗传转化和农杆菌介导的T-DNA插入不同的是通过轰击方式直接将CRISPR/Cas核酸酶基因整合到植物基因组中，克服农杆菌难以侵染单子叶植物的弊端，但由该方法而来的再生植株为多拷贝插入，难以获得不含CRISPR/Cas基因的子代。由于转基因农作物日益受到严格的监管，实现大规模商品化推广非常不容易，无转基因递送CRISPR/Cas核酸酶编辑植物基因组越来越受到重视。无转基因CRISPR/Cas核酸酶递送方式主要有：瞬时表达、原生质体转化以及基因枪轰击。
病毒具有基因组复制快，蛋白翻译效率高，在寄主植物中产生大量基因组RNA和病毒蛋白，并且基因组小易操作，目前大量病毒用作构建表达外源蛋白的载体。采用病毒载体进行植物基因组的编辑具有巨大优势：1)CRISPR/Cas核酸酶和靶标基因的crRNA随着病毒的高效复制/翻译而大量产生，提高了靶标基因的编辑效率；2)利用病毒载体编辑植物功能基因，可在较短的时间内获得靶标基因编辑后的生物学表型；3)通过病毒载体可构建多个目的基因的crRNA，可实现多靶标基因的编辑。然而，由于在病毒基因组中可容纳外源基因片段长度非常有限，CRISPR/Cas核酸酶基因长度至少超过3.8kb，利用病毒载体在植物同时表达Cas12a蛋白并转录crRNA非常困难。对植物基因组进行定点编辑往往是利用RNA病毒载体转录靶基因的crRNA，CRISPR/Cas蛋白表达则借助植物转基因。目前，已有TRV、烟草花叶病毒(TMV)、豌豆早枯病毒(PEBV)、马铃薯X病毒(PVX)、甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)和狗尾草花叶病毒(FoMV)等众多的正义单链RNA病毒用作构建转录crRNA的载体，并借助转Cas9基因的植物，用于植物基因组定点编辑。
苦苣菜黄网(SYNV)是目前报道的在病毒基因组插入Cas9基因和gRNA后能系统性侵染整个本氏烟植株重组病毒，该病毒载体同时表达Cas9和转录靶标基因gRNA后能有效对寄主的外源基因和内源基因进行定点编辑，编辑后的植株呈现相应的生物学表型，可同时实现多靶标的基因定点编辑。SYNV为负链RNA病毒，侵染本氏烟需要通过外源T-DNA载体表达复制酶N、P和L及多个病毒基因沉默抑制子，且病毒基因组大小为～13.7kb，病毒接种流程和病毒基因组分子操作较为繁琐。由于SYNV分子特性，病毒系统性整个寄主植物周期长，在接种叶有效表达外源蛋白需要6d，接种15d才开始在植株顶部呈现叶片卷曲病毒症状；弹状负链RNA病毒大麦黄色条点花叶病毒(BYSMV)在寄主植物中表达Cas9蛋白则需要14d，并且重组病毒不能系统性侵染，而由其构建的基因编辑体能对靶标基因进行编辑。SYNV寄主为心叶烟、苦苣菜、莴苣等植物，不能侵染马铃薯、番茄和棉花等重要的农作物，因此基于SYNV构建的基因编辑体应用在农作物品种改良的价值受到影响。目前以PVX构建的同时表达Cas9和gRNA载体pPZPVX-Cas9在本氏烟接种叶能编辑靶标基因；在pPZPVX-Cas9基因编辑载体中，Cas9基因和靶标基因gRNA是通过PVX的外壳蛋白(CP)亚基因组启动子表达，Cas9的ORF和gRNA在一条RNA分子中，gRNA前体的5′端含有超过4.2kb核苷酸序列影响靶标基因的编辑效率。由一个FoMV载体表达Cas9及另一个FoMV转录靶标基因的gRNA组成的基因编辑体在本氏烟能编辑靶标基因，但未能对植株的生殖细胞进行基因编辑；由于表达Cas9基因FoMV的基因组大于转录gRNA的FoMV基因组，在病毒增殖过程中，转录gRNA的FoMV占优势，表达Cas9的FoMV含量低，最终影响载体的定点编辑基因的效率。
TRV是烟草脆裂病毒属(Tobravirus)的典型成员，寄主范围泛，超过50种双子叶和单子叶家族的400多种植物，包括番茄、马铃薯和棉花等重要农作物。TRV为正义单链RNA病毒，基因组由RNA1和RNA2组成；RNA1所编码4个蛋白参与病毒的复制、移动及症状产生，RNA2中包含3个开放阅读框(ORF)，编码外壳蛋白(cp)、27kDa的2b和18kDa的2c，2b和2c基因完全缺失的TRV还是能系统性侵染寄主植物。TRV寄主范围广泛，引起的症状反应相对温和，目前被应用于构建病毒诱导的基因沉默(VIGS)、转录指导RNA(gRNA)和表达单个外源蛋白的载体。
发明人所在课题组前期构建病毒载体TRVe3(专利申请号202110836772.9)以TRV基因组RNA2的2b亚基因启动子(2b SGP)和2c亚基因启动子(2c SGP)驱动2个外源基因的表达，该载体能在整个寄主植物中同时表达2个非融合的外源蛋白，并且表达外源蛋白具有时间短和表达量高特性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时表达Cas12a蛋白并转录crRNA的病毒载体的构建方法，并利用该重组病毒在本氏烟中进行基因定点编辑；从而实现利用病毒TRVe3中的2c SGP表达Cas12a蛋白，2b SGP转录crRNA。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法：利用质粒pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe3在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。
即，通过TRVe3中的基因组RNA2的2c亚基因启动子(2c SGP)和2b亚基因启动子(2bSGP)分别表达Cas12a蛋白和转录靶标基因的crRNA，并利用重组病毒TRVe3在寄主植物中表达外源蛋白速度快与含量高的特点，表达Cas12a蛋白和转录crRNA对靶标基因进行定点编辑。
作为本发明的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法的改进：利用了重组质粒pTRV2e3，所述pTRV2e3中含有来源于TRV基因组RNA2中的2b SGP和2cSGP序列以及相应的多克隆位点1(MCS1)和多克隆位点2(MCS2)。
作为本发明的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法的进一步改进：利用pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白的载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a和表达Cas12a蛋白并转录crGFP的载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a。
作为本发明的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法的进一步改进，载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a的构建方法为：
1)、PCR扩增Cas12a基因并通过BamHⅠ/SmaⅠ克隆至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a；
2)、通过CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线软件选择GFP基因的编辑靶点，PCR扩增、双酶切将crGFP序列克隆至质粒pTRV2e3-MCS1-Cas12a中，获得载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a。
作为本发明的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法的进一步改进：
3)、载体pTRV2e3、pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a农杆菌(农杆菌GV3101)转化后，并与农杆菌pTRV1混和后，从而对应的形成TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a这3种农杆菌混和物；浸润接种于本氏烟中，分析病毒表达Cas12a蛋白情形；
即，设定了pTRV2e3相关载体的农杆菌转化，并分别与农杆菌pTRV1混和接种于本氏烟中；接种30h，Western blot各个病毒载体表达Cas12a蛋白情形；
4)、在TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a中分别加入35S-p19农杆菌，从而对应的形成TRVe3-Cas12a+35S-p19、TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19这3种农杆菌混和物，然后将TRVe3-Cas12a+35S-p19、TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19浸润接种于本氏烟16c，5d观察病毒接种叶中的荧光表型，确定病毒TRVe3-crGFP-Cas12a对本氏烟16c中GFP基因的编辑情形。
作为本发明的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法的进一步改进，还包括以下步骤：
1)提取各个病毒载体侵染叶片中总蛋白用于Western blot分析，蛋白杂交检测TRVe3-Cas12a、TRVe3-crGFP-Cas12a侵染的植物中总蛋白中GFP含量以及Cas12a表达情形；
2)提取各个病毒载体侵染叶片的基因组DNA用作模板，通过特异性引物扩增基因组中的外源插入GFP基因，GFP基因PCR产物用限制性内切酶NdeⅠ，确定病毒TRVe3-crGFP-Cas12a对靶标基因GFP的定点编辑效率。
本发明还同时提供了利用上述方法构建所得表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体的用途：利用病毒TRVe3在表达外源蛋白速度快与含量高的特点对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。
本发明将Cas12a基因插入到pTRV2e3多克隆位点2(MCS2)，获得载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a；在pTRV2e3-MCS1-Cas12a载体MCS1中插入靶标基因GFP的crGFP，获得载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a，并将载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a分别转入农杆菌GV3101；农杆菌TRV1分别与pTRV2e3-MCS1-Cas12a、pTRV2e3-crGFP-Cas12a混和，获得病毒TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a；2个病毒分别浸润接种于转GFP基因的本氏烟16c植株中，以病毒TRVe3对照，用于分析TRV介导的基因定点编辑编辑情形。
本发明的技术方案具体如下：
1、在载体pTRV2e3中的MCS1中插入Cas12a基因获得载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a；
说明：pTRV2e3制备方法在前期申请的专利(申请号202110836772.9)中有明确告知，pTRV2e3载体中RNA2的序列为SEQ ID NO:1，Cas12a基因ORF序列为SEQ ID NO:2。
2、在载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a中的MCS1中插入绿色荧光蛋白(GFP)基因的靶标crGFP获得载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a。
3、载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a分别转入农杆菌GV3101，分别与农杆菌TRV1混和共同浸润本氏烟；病毒TRVe3-Cas12a为TRV1+pTRV2e3-MCS1-Cas12a、TRVe3-crGFP-Cas12a为TRV1+pTRV2e3-crGFP-Cas12a、以病毒TRVe3(TRV1+pTRV2e3)对照。
4、病毒接种30h，分别提取TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a侵染的本氏烟总蛋白，蛋白电泳、转膜与Flag抗体杂交检测，分析病毒载体TRVe3在寄主中表达Cas12a情形。
5、TRVe3+35S-p19和TRVe3-Cas12a+35S-p19和TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19分别浸润接种于本氏烟16c植株。
6、在TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a接种本氏烟16c植株5d，绿色荧光表型的观察，采集样品用于提取植物DNA和总蛋白的，Flag和GFP抗体的蛋白杂交检测。
7、以植物DNA为模板，PCR扩增GFP；PCR产物回收，NdeⅠ酶切鉴定GFP基因编辑情况。
本发明基于TRV构建在植物中表达Cas12a蛋白载体和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体。所具有的技术优势是：通过TRVe3基因组RNA的2c SGP和2b SGP分别表达Cas12a蛋白、转录靶标基因的crRNA，并利用TRVe3在寄主植物中表达外源蛋白速度快与含量高的特点对靶标基因进行定点编辑。
本发明利用重组病毒TRVe3同时表达Cas12a蛋白和crRNA以定点编辑植物基因组，进一步拓展申请号202110836772.9的发明的应用范围。
综上，本发明构建以TRVe3中2c SGP表达Cas12a蛋白、2b SGP转录靶标基因的crRNA的病毒载体TRVe3-crRNA-Cas12a，并应用于植物基因组的定点编辑。本发明是国内外首次通过一个植物病毒表达载体构建CRISPR/Cas12a基因编辑体，并成功地应用于植物基因的定点编辑。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为pTRV2e3相关载体中TRV基因组RNA2示意图；
图2为TRVe3相关载体表达Cas12a的蛋白杂交照片图；即，病毒TRVe3-Cas12a侵染本氏烟30h表达Cas12a的Western blot照片图；
图3为本氏烟16c植株接种TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a的荧光表型图；即，TRVe3+35S-p19、TRVe3-Cas12a+35S-p19和TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19在本氏烟16c中的荧光表型图；
图4为本氏烟16c中GFP和Cas12a蛋白杂交照片图；
图5为GFP基因PCR产物NdeⅠ的酶切照片图；
图6为限制性内切酶NdeⅠ不能切开的GFP基因的PCR产物的克隆测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
载体p35S-Cas12a，即，pcDNA3.1-hLbCpf1,Addgene plasmid#69988。
实施例1、pTRV2e3-Cas12a相关表达载体的构建
1)、载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a的构建：
以载体p35S-Cas12a为扩增Cas12a基因(Cas12a基因ORF序列如SEQ ID NO:2)模板，通过引物对P1/P2进行PCR扩增，获得大小为～3800bp的DNA片段，目的PCR产物割胶回收；通过BamHⅠ和SmaⅠ双酶切连接到载体pTRV2e3的MCS2中，获得载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a。
引物P1和P2序列分别为：5'CGggatccATGGACTATAAGGACCACGACG 3'和5'TCCcccgggTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGG 3'，PCR扩增体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P1/P2(10μmol/L)各2μL，p35S-Cas12a模板20ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，60℃15s，72℃2min，29个循环，72℃5min；酶切反应体系：10×quick buffer 3μL，BamHⅠ/SmaⅠ1.5μL，Cas12a的PCR扩增产物或载体pTRV2e3 200ng，ddH2O补足至30μL，37℃60min。pTRV2e3载体中TRV2e3的序列如SEQ ID NO:1。
2)、载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a的构建：
以载体pTRV2e3为模板，采用引物P3/P4，PCR扩增获得crGFP-2c，目的片段割胶回收后XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，清洁回收；并克隆至步骤1)所得的载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a中，获得pTRV2e3-crGFP-Cas12a载体。
引物P3和P4序列分别为：5'cgTCTAGAtaatttctactaagtgtagaAAGATACCCAGATCATATGAAGtaatttctactaagtgtagaTAGAATCGGTCCAATCGTTTACG 3'和5'GCggatccCGCTCCTTTGGTCACAATCAC 3'，PCR扩增体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，5×Q5 high GC enhancer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P3/P4(10μmol/L)各2μL，模板pTRV2e310ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，60℃15s，72℃15s，29个循环，72℃5min。通过CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线软件选择GFP基因的靶标位点为AAGATACCCAGATCATATGAAG，该序列中包含了NdeⅠ酶切位点(CATATG)；Cas12a的DR序列为taatttctactaagtgtaga。
载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a中TRV基因组RNA2的结构示意图(见图1)，在载体pTRV2e3中，2b SGP转录crGFP，Cas12a由2c SGP驱动表达。Cas12a基因序列和crGFP序列分别见SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:3中：taatttctactaagtgtaga为DR序列，AAGATACCCAGATCATATGAAG为GFP基因靶标序列，CATATG为NdeⅠ酶切位点。
实施例2、pTRV2e3-Cas12a相关载体的农杆菌转化、活化和扩大培养
pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a转化至农杆菌GV3101，并活化零下80℃冰箱保存的农杆菌pTRV2e3、TRV1和35S-p19，各个农杆菌扩大培养的具体方法参照发明专利《同时表达两个外源蛋白载体TRVe 2的构建方法与应用》(申请号为201810261990.2)。最后用浸润接种缓冲液将各个菌体浓度调至OD 600为0.2。
实施例3、农杆菌浸润接种
1)、分别取实施例2所得的OD600为0.2的pTRV2e3、pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a农杆菌菌液5mL，与5mL浓度为0.2OD600的pTRV1农杆菌混和，获得TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a病毒接种组合，分别接种3株本氏烟，用于检测病毒表达Cas12a蛋白情形。
农杆菌混和物在室温黑暗预处理4h，通过无针头1mL灭菌注射器浸润本氏烟叶片背部，所有接种植物置于25℃、光照期16h黑暗8h植物生长室培养。
2)、分别取实施例2所得的OD600为0.2的pTRV2e3、pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a农杆菌菌液5mL，与5mL浓度为0.2OD600的35S-p19农杆菌和5mL浓度为0.2OD600的pTRV1农杆菌混和，并分别接种于3株本氏烟16c，用于分析病毒TRVe3-crGFP-Cas12a对本氏烟16c中GFP基因的定点编辑情形。
农杆菌混和物在室温黑暗预处理4h，通过无针头1mL灭菌注射器浸润本氏烟叶片背部，所有接种植物置于25℃、光照期16h黑暗8h植物生长室培养。
实施例4、Western blot检测病毒TRVe3在本氏烟中表达Cas12a
实施例3的步骤1)的病毒TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a浸润接种30h，分别采集3个病毒的接种叶用于提取植物总蛋白。总蛋白提取方法如下：各称取0.1g叶片，用液氮研磨志粉末状，加入蛋白提取液(2％SDS，10％甘油，0.1mol/Lβ-巯基乙醇和50mmol/LpH值6.8Tris-HCl)200μL研磨至均一状液体，离心后取上清并加入200μL 2×loading buffer，95℃水浴煮10min，10000r/min 5min，取上清备用。蛋白SDS-PAGE电泳、转膜、抗体杂交和底物显色的方法参考精编分子生物学实验指南(第三版)，所用抗体为Flag标签和GFP抗体。TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a浸润接种30h，病毒侵染叶片的总蛋白中Western blot检测Cas12的结果如图2所示。图2显示，病毒TRVe3接种叶片中检测不到Cas12a蛋白，而病毒TRVe3-Cas12a、TRVe3-crGFP-Cas12a侵染叶片中均能检测到目的蛋白，并且二者表达量没有差别，表明病毒TRVe3能在寄主植物中快速地表达Cas12a蛋白。
实施例5、利用病毒TRVe3对本氏烟16中的GFP基因进行定点编辑
本氏烟16c是在本氏烟中转入GFP，在紫外灯下整个植株为绿色；接种过程中加入基因沉默抑制子p19是为了增加本氏烟16c中GFP的表达量，使得植株呈现的绿色荧光更为明显。实施例3的步骤2)中的TRVe3+35S-p19、TRVe3-Cas12a+35S-p19和TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19接种本氏烟16c第5天，浸润接种叶的GFP荧光表型如图3所示。图3显示：TRVe3+35S-p19和TRVe3-Cas12a+35S-p19浸润叶片区域与未浸润区域的颜色相同，说明GFP荧光强度没有降低，而TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19浸润叶片区域加深，表明该区域的绿色荧光表型降低。3个病毒在本氏烟16c浸润接种叶总蛋白中Cas12a和GFP蛋白的Western blot检测结果如图4所示，TRVe3+35S-p19、TRVe3-Cas12a+35S-p19和TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19接种叶中均能检测到Cas12a蛋白且表达量基本相同，但TRVe3+35S-p19、TRVe3-Cas12a+35S-p19中的GFP含量明显高于TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19。以上结果说明TRVe3-crGFP-Cas12a能同时表达Cas12a并转录crGFP，Cas12a和crGFP对本氏烟16c中的GFP进行定点编辑，导致植株GFP量降低，从而使得接种叶片GFP荧光表型减弱。本氏烟16c中的GFP序列见SEQ ID NO:4。
实施例6、病毒TRVe3对GFP基因进行定点编辑的鉴定
提取实施例5中的TRVe3-crGFP-Cas12a接种叶的基因组DNA，基因组提取采用CTAB法，具体方法参考精编分子生物学实验指南(第三版)。靶标基因的PCR产物酶切鉴定基因编辑效率的原理为：采用Cas12a的PAM区域下游含有酶切位点的靶标序列，靶标基因被编辑后，酶切位点中的碱基缺失/插入导致PCR产物不能被相对应的内切酶切开，不能切开的条带含量反映编辑效率的高低。以基因组DNA为模板，通过引物P5和P6进行PCR扩增GFP基因，目的片段回收后浓度测定，并用于NdeⅠ酶切。PCR扩增体系为：2×mix buffer 30μL，P5/P6(10μmol/L)各1.2μL，植物DNA模板100ng，ddH2O补足至60μL；PCR反应程序为：94℃3min，94℃10s，60℃15s，72℃45s，29个循环，72℃5min。引物P5和P6的序列分别为5'TTCAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG 3'和5'TTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATC 3'。PCR产物割胶回收、浓度测定以及NdeⅠ酶切。NdeⅠ酶切反应体系：10×buffer 2μL，NdeⅠ1μL，PCR产物400ng，ddH2O补足至20μL，37℃水浴酶切1h。酶切产物在1.5％琼脂糖电泳、EB染色和凝胶成像，并通过Image J软件分析酶切产物的亮度，确定病毒TRVe3-Cas12a-crGFP对GFP基因的编辑效率，结果如图5所示。由图5可知，在TRVe3+35S-p19和TRVe3-Cas12a+35S-p19接种的样品中，PCR产物完全被NdeⅠ切开，而TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19接种的样品中，PCR产物则不能完全切开，经Image J软件计算，3个NdeⅠ不能切开的PCR产物的含量分别为不加NdeⅠ阴性对照的33％、32％和29％。以上结果表明：重组病毒TRVe3-Cas12a-crGFP能对本氏烟16c中的GFP基因进行有效编辑。NdeⅠ不能切开的PCR产物克隆至T-载体中，在菌液PCR鉴定为阳性克隆中随机挑选10个用于测序，Cas12a的PAM区(GFP靶标序列)测序峰图见图6。将10个克隆的PAM区的测序结果与GFP靶标序列进行比对，不能切开的PCR产物在NdeⅠ酶切位点附近缺失4bp(TGAA)有1个(d1×1)、缺失6bp(ATGAAG)有5个(d6×5)、缺失7bp(ATGAAGC)有1个(d7×1)和缺失8bp(ATATGAAG)有3个(d8×3)(见图6)，进一步证实了病毒载体TRVe3能同时表达Cas12a并转录crRNA对植物基因组DNA进行定点编辑。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江理工大学
<120> 基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataaaacatt gcacctatgg tgttgccctg gctggggtat gtcagtgatc gcagtagaat 60
gtactaattg acaagttgga gaatacggta gaacgtcctt atccaacaca gcctttatcc 120
ctctccctga cgaggttttt gtcagtgtaa tatttctttt tgaactatcc agcttagtac 180
cgtacgggaa agtgactggt gtgcttatct ttgaaatgtt actttgggtt tcggttcttt 240
aggttagtaa gaaagcactt gtcttctcat acaaaggaaa acctgagacg tatcgcttac 300
gaaagtagca atgaaagaaa ggtggtggtt ttaatcgcta ccgcaaaaac gatggggtcg 360
ttttaattaa cttctcctac gcaagcgtct aaacggacgt tggggttttg ctagtttctt 420
tagagaaaac tagctaagtc tttaatgtta tcattagaga tggcataaat ataatacttg 480
tgtctgctga taagatcatt ttaatttgga cgattagact tgttgaacta caggttactg 540
aatcacttgc gctaatcaac atgggagata tgtacgatga atcatttgac aagtcgggcg 600
gtcctgctga cttgatggac gattcttggg tggaatcagt ttcgtggaaa gatctgttga 660
agaagttaca cagcataaaa tttgcactac agtctggtag agatgagatc actgggttac 720
tagcggcact gaatagacag tgtccttatt caccatatga gcagtttcca gataagaagg 780
tgtatttcct tttagactca cgggctaaca gtgctcttgg tgtgattcag aacgcttcag 840
cgttcaagag acgagctgat gagaagaatg cagtggcggg tgttacaaat attcctgcga 900
atccaaacac aacggttacg acgaaccaag ggagtactac tactaccaag gcgaacactg 960
gctcgacttt ggaagaagac ttgtacactt attacaaatt cgatgatgcc tctacagctt 1020
tccacaaatc tctaacttcg ttagagaaca tggagttgaa gagttattac cgaaggaact 1080
ttgagaaagt attcgggatt aagtttggtg gagcagctgc tagttcatct gcaccgcctc 1140
cagcgagtgg aggtccgata cgtcctaatc cctagggatt taaggacgtg aactctgttg 1200
agatctctgt gaaattcaga gggtgggtga taccatattc actgatgcca ttagcgacat 1260
ctaaataggg ctaattgtga ctaatttgag ggaatttcct ttaccattga cgtcagtgtc 1320
gttggtagca tttgagtttc gcaaggcacg aattacttag gaagtggctt gaattctcta 1380
gactcgagac gcgttagaat cggtccaatc gtttacggtt ggttattgtg attggttgat 1440
gaggaaattc tgtttgaagg ctggttgaaa gtaccagggc gggagaagcc atattctcta 1500
tcgttgtagg aagcgattga aataattcct gtggtcacgt cgcacgtgag gtggttgtta 1560
ccataaacaa taatgtcgtt ggcagcattt aaaataattc catagttact aagagggtga 1620
ttgtgaccaa aggagcggga tccatggggt acccgggcat gtcccgaaga cattaaacta 1680
cggttcttta agtagatccg tgtctgaagt tttaggttca atttaaacct acgagattga 1740
cattctcgac tgatcttgat tgatcggtaa gtcttttgta atttaatttt ctttttgatt 1800
ttattttaaa ttgttatctg tttctgtgta tagactgttt gagatcggcg tttggccgac 1860
tcattgtctt accatagggg aacggacttt gtttgtgttg ttattttatt tgtattttat 1920
taaaattctc aacgatctga aaaagcctcg cggctaagag attgttgggg ggtgagtaag 1980
tacttttaaa gtgatgatgg ttacaaaggc aaaaggggta aaacccctcg cctacgtaag 2040
cgttattacg ccc 2053
<210> 2
<211> 3852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggattaca aggatcacga tggagattac aaagatcacg atatagatta caaagatgat 60
gatgataaaa tggcacctaa gaagaaaaga aaggttggaa ttcatggtgt gcctgctgca 120
agcaagctgg agaagtttac aaactgctac tccctgtcta agaccctgag gttcaaggcc 180
atccctgtgg gcaagaccca ggagaacatc gacaataagc ggctgctggt ggaggacgag 240
aagagagccg aggattataa gggcgtgaag aagctgctgg atcgctacta tctgtctttt 300
atcaacgacg tgctgcacag catcaagctg aagaatctga acaattacat cagcctgttc 360
cggaagaaaa ccagaaccga gaaggagaat aaggagctgg agaacctgga gatcaatctg 420
cggaaggaga tcgccaaggc cttcaagggc aacgagggct acaagtccct gtttaagaag 480
gatatcatcg agacaatcct gccagagttc ctggacgata aggacgagat cgccctggtg 540
aacagcttca atggctttac cacagccttc accggcttct ttgataacag agagaatatg 600
ttttccgagg aggccaagag cacatccatc gccttcaggt gtatcaacga gaatctgacc 660
cgctacatct ctaatatgga catcttcgag aaggtggacg ccatctttga taagcacgag 720
gtgcaggaga tcaaggagaa gatcctgaac agcgactatg atgtggagga tttctttgag 780
ggcgagttct ttaactttgt gctgacacag gagggcatcg acgtgtataa cgccatcatc 840
ggcggcttcg tgaccgagag cggcgagaag atcaagggcc tgaacgagta catcaacctg 900
tataatcaga aaaccaagca gaagctgcct aagtttaagc cactgtataa gcaggtgctg 960
agcgatcggg agtctctgag cttctacggc gagggctata catccgatga ggaggtgctg 1020
gaggtgttta gaaacaccct gaacaagaac agcgagatct tcagctccat caagaagctg 1080
gagaagctgt tcaagaattt tgacgagtac tctagcgccg gcatctttgt gaagaacggc 1140
cccgccatca gcacaatctc caaggatatc ttcggcgagt ggaacgtgat ccgggacaag 1200
tggaatgccg agtatgacga tatccacctg aagaagaagg ccgtggtgac cgagaagtac 1260
gaggacgatc ggagaaagtc cttcaagaag atcggctcct tttctctgga gcagctgcag 1320
gagtacgccg acgccgatct gtctgtggtg gagaagctga aggagatcat catccagaag 1380
gtggatgaga tctacaaggt gtatggctcc tctgagaagc tgttcgacgc cgattttgtg 1440
ctggagaaga gcctgaagaa gaacgacgcc gtggtggcca tcatgaagga cctgctggat 1500
tctgtgaaga gcttcgagaa ttacatcaag gccttctttg gcgagggcaa ggagacaaac 1560
agggacgagt ccttctatgg cgattttgtg ctggcctacg acatcctgct gaaggtggac 1620
cacatctacg atgccatccg caattatgtg acccagaagc cctactctaa ggataagttc 1680
aagctgtatt ttcagaaccc tcagttcatg ggcggctggg acaaggataa ggagacagac 1740
tatcgggcca ccatcctgag atacggctcc aagtactatc tggccatcat ggataagaag 1800
tacgccaagt gcctgcagaa gatcgacaag gacgatgtga acggcaatta cgagaagatc 1860
aactataagc tgctgcccgg ccctaataag atgctgccaa aggtgttctt ttctaagaag 1920
tggatggcct actataaccc cagcgaggac atccagaaga tctacaagaa tggcacattc 1980
aagaagggcg atatgtttaa cctgaatgac tgtcacaagc tgatcgactt ctttaaggat 2040
agcatctccc ggtatccaaa gtggtccaat gcctacgatt tcaacttttc tgagacagag 2100
aagtataagg acatcgccgg cttttacaga gaggtggagg agcagggcta taaggtgagc 2160
ttcgagtctg ccagcaagaa ggaggtggat aagctggtgg aggagggcaa gctgtatatg 2220
ttccagatct ataacaagga cttttccgat aagtctcacg gcacacccaa tctgcacacc 2280
atgtacttca agctgctgtt tgacgagaac aatcacggac agatcaggct gagcggagga 2340
gcagagctgt tcatgaggcg cgcctccctg aagaaggagg agctggtggt gcacccagcc 2400
aactccccta tcgccaacaa gaatccagat aatcccaaga aaaccacaac cctgtcctac 2460
gacgtgtata aggataagag gttttctgag gaccagtacg agctgcacat cccaatcgcc 2520
atcaataagt gccccaagaa catcttcaag atcaatacag aggtgcgcgt gctgctgaag 2580
cacgacgata acccctatgt gatcggcatc gataggggcg agcgcaatct gctgtatatc 2640
gtggtggtgg acggcaaggg caacatcgtg gagcagtatt ccctgaacga gatcatcaac 2700
aacttcaacg gcatcaggat caagacagat taccactctc tgctggacaa gaaggagaag 2760
gagaggttcg aggcccgcca gaactggacc tccatcgaga atatcaagga gctgaaggcc 2820
ggctatatct ctcaggtggt gcacaagatc tgcgagctgg tggagaagta cgatgccgtg 2880
atcgccctgg aggacctgaa ctctggcttt aagaatagcc gcgtgaaggt ggagaagcag 2940
gtgtatcaga agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaagaag 3000
tctaatcctt gtgcaacagg cggcgccctg aagggctatc agatcaccaa taagttcgag 3060
agctttaagt ccatgtctac ccagaacggc ttcatctttt acatccctgc ctggctgaca 3120
tccaagatcg atccatctac cggctttgtg aacctgctga aaaccaagta taccagcatc 3180
gccgattcca agaagttcat cagctccttt gacaggatca tgtacgtgcc cgaggaggat 3240
ctgttcgagt ttgccctgga ctataagaac ttctctcgca cagacgccga ttacatcaag 3300
aagtggaagc tgtactccta cggcaaccgg atcagaatct tccggaatcc taagaagaac 3360
aacgtgttcg actgggagga ggtgtgcctg accagcgcct ataaggagct gttcaacaag 3420
tacggcatca attatcagca gggcgatatc agagccctgc tgtgcgagca gtccgacaag 3480
gccttctact ctagctttat ggccctgatg agcctgatgc tgcagatgcg gaacagcatc 3540
acaggccgca ccgacgtgga ttttctgatc agccctgtga agaactccga cggcatcttc 3600
tacgatagcc ggaactatga ggcccaggag aatgccatcc tgccaaagaa cgccgacgcc 3660
aatggcgcct ataacatcgc cagaaaggtg ctgtgggcca tcggccagtt caagaaggcc 3720
gaggacgaga agctggataa ggtgaagatc gccatctcta acaaggagtg gctggagtac 3780
gcccagacca gcgtgaagca caaaagacca gcagcaacaa agaaagcagg acaggctaaa 3840
aagaagaagt ga 3852
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatttctac taagtgtaga aagataccca gatcatatga agtaatttct actaagtgta 60
ga 62
<210> 4
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60
gaattcagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 120
ggtgatgtta atgggtacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 180
ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca 240
cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccaga tcatatgaag 300
cggcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggatacg tgcaggagag gaccatcttc 360
ttcaaggacg acgggaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaggg agacaccctc 420
gtcaacagga tcgagcttaa gggaatcgat ttcaaggagg acggaaacat cctcggccac 480
aagttggaat acaactacaa ctcccacaac gtatacatca tggccgacaa gcaaaagaac 540
ggcatcaaag ccaacttcaa gacccgccac aacatcgaag acggcggcgt gcaactcgct 600
gatcattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 660
tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 720
cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact atacaaacat 780
gatgagcttt aa 792

Claims (7)

1.基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用质粒pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe3在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。
2.根据权利要求1所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用了重组质粒pTRV2e3，所述pTRV2e3中含有来源于TRV基因组RNA2中的2bSGP和2c SGP序列以及相应的多克隆位点1和多克隆位点2。
3.根据权利要求2所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白的载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a和表达Cas12a蛋白并转录crGFP的载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a。
4.根据权利要求3所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a的构建方法为：
1)、PCR扩增Cas12a基因并通过BamHⅠ/SmaⅠ克隆至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3-MCS1-Cas12a；
2)、通过CRISPR-P在线软件选择GFP基因的编辑靶点，PCR扩增、双酶切将crGFP序列克隆至质粒pTRV2e3-MCS1-Cas12a中，获得载体pTRV2e3-crGFP-Cas12a。
5.根据权利要求4所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：
载体pTRV2e3、pTRV2e3-MCS1-Cas12a和pTRV2e3-crGFP-Cas12a农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和后，从而对应的形成TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a这3种农杆菌混和物；浸润接种于本氏烟中，分析病毒表达Cas12a蛋白情形；
在TRVe3、TRVe3-Cas12a和TRVe3-crGFP-Cas12a中分别加入35S-p19农杆菌，从而对应的形成TRVe3-Cas12a+35S-p19、TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19这3种农杆菌混和物，然后将TRVe3-Cas12a+35S-p19、TRVe3-crGFP-Cas12a+35S-p19浸润接种于本氏烟16c，观察病毒接种叶中的荧光表型，确定病毒TRVe3-crGFP-Cas12a对本氏烟16c中GFP基因的编辑情形。
6.根据权利要求4或5所述基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是还包括以下步骤：
1)提取各个病毒载体侵染叶片中总蛋白用于Western blot分析，蛋白杂交检测TRVe3-Cas12a、TRVe3-crGFP-Cas12a侵染的植物中总蛋白中GFP含量以及Cas12a表达情形；
2)提取各个病毒载体侵染叶片的基因组DNA用作模板，通过特异性引物扩增基因组中的外源插入GFP基因，GFP基因PCR产物用限制性内切酶NdeⅠ，确定病毒TRVe3-crGFP-Cas12a对靶标基因GFP的定点编辑效率。
7.利用权利要求1～6任一所述方法构建所得表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体的用途，其特征是：利用病毒TRVe3在表达外源蛋白速度快与含量高的特点对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。
CN202210682700.8A 2022-06-16 2022-06-16 基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用 Active CN115161338B (zh)

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