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CN115154618A - 一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂及其制备方法 - Google Patents

一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂及其制备方法 Download PDF

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CN115154618A
CN115154618A CN202210848536.3A CN202210848536A CN115154618A CN 115154618 A CN115154618 A CN 115154618A CN 202210848536 A CN202210848536 A CN 202210848536A CN 115154618 A CN115154618 A CN 115154618A
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silica particles
biotinylated
sustained
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王一飞
王运生
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Original Assignee
Hangzhou Zhunxing Medical Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂及其制备方法，旨在解决现有技术中的药物识别T细胞效果差、药物在肿瘤微环境中的活性维持时间短和抗肿瘤效果差的问题。介孔二氧化硅缓释制剂，包括介孔二氧化硅微粒，介孔二氧化硅微粒上装载有细胞因子且包裹有生物素化脂质体；生物素化脂质体负载有T细胞功能调节剂。制备方法，采用介孔二氧化硅微粒吸附细胞因子，制备装载细胞因子的介孔二氧化硅微粒；在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体；在生物素化脂质体表面，通过链霉亲和素与生物素连接T细胞功能调节剂。介孔二氧化硅缓释制剂识别T细胞效果好、药物在肿瘤微环境中的活性维持时间长和抗肿瘤效果好。

Description

一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤免疫细胞的治疗药品技术领域，具体涉及一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂及其制备方法。
背景技术
正常情况下，当肿瘤细胞侵袭机体正常组织时，免疫系统通过识别肿瘤表面所表达的抗原并消除它们。然而，肿瘤细胞能通过多种机制逃避机体免疫系统的攻击，这是癌症发生和转移的关键。肿瘤免疫逃逸机制主要包括：肿瘤细胞下调表面抗原的表达以逃避免疫细胞的识别，肿瘤细胞高表达免疫检查点如PD-1、CTLA-1等抑制T细胞的杀瘤活性，肿瘤细胞通过分泌免疫抑制因子募集或激活免疫抑制细胞如MDSC、Treg到肿瘤微环境中，这些细胞分泌IL-10等细胞因子抑制肿瘤免疫应答。肿瘤免疫治疗主要通过改善肿瘤微环境，重新激活免疫响应以杀死肿瘤细胞，最终达到治疗效果。临床上，常见的肿瘤免疫治疗主要包括递送IL-2、IFN-γ等细胞因子及抗CD3抗体、抗PD-1抗体等T细胞功能调节剂到肿瘤部位调节机体免疫应答，从而实现对肿瘤的清除。
但是现有的大多数免疫药物主要成分：细胞因子等都属大分子药物，存在半衰期短、快速释放易引发毒副作用等问题。因此，如何将这些药物准确靶向肿瘤部位及维持这些药物在肿瘤微环境中的活性和抗肿瘤效应成为当前需要解决的关键问题。
发明内容
本发明提供了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂及其制备方法，旨在解决现有技术中的药物识别T细胞效果差、药物在肿瘤微环境中的活性维持时间短和抗肿瘤效果差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，包括介孔二氧化硅微粒，所述介孔二氧化硅微粒上装载有用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子；所述介孔二氧化硅微粒上包裹有用于提高介孔二氧化硅微粒生物相容性的生物素化脂质体；所述生物素化脂质体负载有T细胞功能调节剂。
进一步改进的方案：所述细胞因子包括IL-2，所述细胞因子还包括IL-12、IL-21和TGF-β1中的至少一种；所述细胞因子混合后通过物理吸附法装载到介孔二氧化硅微粒中；
当加入IL-12时，所述IL-2与IL-12质量比为1∶0.05～0.2；
当加入IL-21时，I所述IL-2与IL-21质量比为1∶0.05～0.3；
当加入TGF-β1时，所述IL-2与TGF-β1质量比为1∶0.05～0.25。
基于上述方案：在该比例的缓释条件下，肿瘤微环境中TIL(人肿瘤浸润淋巴细胞)的浸润程度更强、有效杀伤肿瘤细胞的CD8+T细胞占比最高。
进一步改进的方案：所述生物素化脂质体由POPC和Cap PE混合制成；所述POPC与Cap PE的摩尔比为500～1100∶1。
进一步改进的方案：所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体的质量比为1∶0.81.2；所述生物素化脂质体设置一层或两层。
设置两层生物素化脂质体，可以进一步增强介孔二氧化硅缓释细胞因子性能，提高微粒的生物相容性。
进一步改进的方案：所述介孔二氧化硅微粒为长条形，且长度为80±40μm，宽为6±2.5μm，中孔大小为5±2.5nm。
基于上述方案，所述介孔二氧化硅微粒采用长条形及上述的尺寸，可以避免介孔二氧化硅微粒被肿瘤细胞(20微米)吞噬；提高了降解周期从而且提高了缓释时间周期。
进一步改进的方案：所述T细胞功能调节剂包括抗CD3抗体，所述T细胞功能调节剂还包括抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体的中的至少一种；所述T细胞功能调节剂通过链霉亲和素与生物素的连接方式连接在生物素化脂质体表面；
按照质量比：
当加入抗PD-1抗体时，抗CD3抗体∶抗PD-1抗体＝1∶0.2～2；
当加入CTLA-4阻断剂时，抗CD3抗体∶CTLA-4阻断剂＝1∶0.2～2；
当加入4-1BB激动剂时，抗CD3抗体∶4-1BB激动剂＝1∶0.1～1；
当加入aCCR8抗体时，抗CD3抗体∶aCCR8抗体＝1∶1～2。
基于上述方案，所述抗CD3抗体设置在外侧，便于识别T细胞，通过抗CD3抗体识别T细胞后，所述抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体用来重新激活肿瘤微环境的免疫响应，激活肿瘤免疫微环境中T细胞的杀瘤活性，提高机体免疫应答能力；增强T细胞的增殖能力及促进T细胞分泌效应分子，协同细胞因子药物改善肿瘤微环境以起到抗肿瘤疗效。
且在该比例下，介孔二氧化硅脂质制剂用于临床患者来源的腹水体外T细胞扩增，效果最佳。在该比例下，该制剂用于扩增小鼠腹水瘤来源的T细胞，回输小鼠后，抗肿瘤效果最好。
第二方面，本发明提供了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用介孔二氧化硅微粒吸附用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子，制备装载细胞因子的介孔二氧化硅微粒；
S2、在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体；
S3、在生物素化脂质体表面，通过链霉亲和素与生物素的连接方式，连接T细胞功能调节剂。
进一步改进的方案：所述细胞因子包括IL-2，所述细胞因子还包括IL-12、IL-21和TGF-β1中的至少一种；所述细胞因子混合后通过物理吸附法装载到介孔二氧化硅微粒中；
当加入IL-12时，所述IL-2与IL-12质量比为1∶0.05～0.2；
当加入IL-21时，I所述IL-2与IL-21质量比为1∶0.05～0.3；
当加入TGF-β1时，所述IL-2与TGF-β1质量比为1∶0.05～0.25。
基于上述方案：在该比例的缓释条件下，肿瘤微环境中TIL的浸润程度更强、有效杀伤肿瘤细胞的CD8+T细胞占比最高。
进一步改进的方案：所述生物素化脂质体制备方法为：
由POPC和Cap PE按照摩尔比为500～1100∶1的比例混合，经旋转蒸发得到脂质体薄膜，然后添加PBS进行超声混匀，通过物理挤压得到尺寸均一的生物素化脂质体。
进一步改进的方案：在步骤S2中，在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体过程中：所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体按照质量比为1∶0.8～1.2的比例在室温下混合1h，得到表面包裹有生物素化脂质体的二氧化硅微粒。
进一步改进的方案：所述生物素化脂质体设置两层。
设置两层生物素化脂质体，可以进一步增强介孔二氧化硅缓释细胞因子性能，提高微粒的生物相容性。
进一步改进的方案：所述介孔二氧化硅微粒为长条形，且长度为80±40μm，宽为6±2.5μm，中孔大小为5±2.5nm。
进一步改进的方案：所述T细胞功能调节剂包括抗CD3抗体，所述T细胞功能调节剂还包括抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体的中的至少一种；所述T细胞功能调节剂通过链霉亲和素与生物素的连接方式连接在生物素化脂质体表面；
按照质量比：
当加入抗PD-1抗体时，抗CD3抗体∶抗PD-1抗体＝1∶0.2～2；
当加入CTLA-4阻断剂时，抗CD3抗体∶CTLA-4阻断剂＝1∶0.2～2；
当加入4-1BB激动剂时，抗CD3抗体∶4-1BB激动剂＝1∶0.1～1；
当加入aCCR8抗体时，抗CD3抗体∶aCCR8抗体＝1∶1～2。
基于上述方案：在该比例下，介孔二氧化硅脂质制剂用于临床患者来源的腹水体外T细胞扩增，效果最佳。
本发明的有益效果为：
本发明公开了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅脂质制剂，在介孔二氧化硅中装载IL-2、IL-12、IL-21、TGF-β1等用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子，由于介孔二氧化硅的物理特性以及介孔二氧化硅微粒上包裹有生物素化脂质体；这些细胞因子能从介孔二氧化硅微粒(相当于一个支架)中缓慢释放，从而延长了细胞因子的生物活性；且IL-2等细胞因子也会随着支架的降解逐渐释放。
在介孔二氧化硅微粒表面包裹类似细胞膜的生物素化脂质体，从而调整介孔二氧化硅微粒表面的刚性及硬度，提高了介孔二氧化硅微粒的生物相容性。
最后在生物素化脂质体表面连接抗CD3抗体、抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂、aCCR8抗体等T细胞功能调节剂；抗CD3抗体设置在外侧，便于识别T细胞，通过抗CD3抗体识别T细胞后，所述抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体用来重新激活肿瘤微环境的免疫响应，增强T细胞的增殖能力及促进T细胞分泌效应分子，协同细胞因子药物改善肿瘤微环境以起到抗肿瘤疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关附图。
图1是本发明中培养2天后，细胞状态图。
图2是本发明中分别培养5天和10天后，细胞状态图。
图3是本发明中分别培养17天和21天后，细胞状态图。
图4是本发明中细胞数量变化图。
图5是本发明中流式分析人腹水瘤效应T细胞表型图。
图6是本发明中流式分析人腹水瘤效应记忆T细胞表型图。
图7是本发明中流式分析人腹水瘤效应记忆T细胞耗竭表型图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例一：
本实施例提供了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，包括介孔二氧化硅微粒，所述介孔二氧化硅微粒上装载有用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子；所述介孔二氧化硅微粒上包裹有用于提高介孔二氧化硅微粒生物相容性的生物素化脂质体；所述生物素化脂质体负载有T细胞功能调节剂。
其中，所述细胞因子包括IL-2，所述细胞因子还包括IL-12、IL-21和TGF-β1中的至少一种；所述细胞因子混合后通过物理吸附法装载到介孔二氧化硅微粒中；
当加入IL-12时，所述IL-2与IL-12质量比为1∶0.05～0.2；
当加入IL-21时，I所述IL-2与IL-21质量比为1∶0.05～0.3；
当加入TGF-β 1时，所述IL-2与TGF-β 1质量比为1∶0.05～0.25。
其中，所述生物素化脂质体由POPC和Cap PE混合制成；所述POPC与Cap PE的摩尔比为500～1100∶1，优选1010∶1。其中，POPC是生物膜的主要成分，Cap PE是一种生物素化磷脂。
其中，所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体的质量比为1∶0.8～1.2；所述生物素化脂质体设置一层或两层。优选方案中，所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体的质量比为1∶1；所述生物素化脂质体设置两层。
其中，介孔二氧化硅微粒采用模板法合成，具体制作为：所述介孔二氧化硅微粒为长条形，且长度为80±40μm，宽为6±2.5μm，中孔大小为5±2.5nm。
其中，所述T细胞功能调节剂为抗CD3抗体、抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体的混合物；所述T细胞功能调节剂通过链霉亲和素与生物素的连接方式连接在生物素化脂质体表面；
按照质量比：
抗CD3抗体∶抗PD-1抗体＝1∶0.2～2；
抗CD3抗体∶CTLA-4阻断剂＝1∶0.2～2；
抗CD3抗体∶4-1BB激动剂＝1∶0.1～1；
抗CD3抗体∶aCCR8抗体＝1∶1～2。
在使用时，针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂经腹腔注射到癌性腹水中，以达到提高癌性腹水中T细胞的增殖能力及杀瘤细胞活性、以期达到杀灭腹水中肿瘤细胞，并重新激活肿瘤微环境免疫应答的治疗效果。
在介孔二氧化硅中装载的IL-2、IL-12、IL-21、TGF-β1等用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子，由于介孔二氧化硅的物理特性，这些细胞因子能从介孔二氧化硅微粒中缓慢释放，从而延长了细胞因子的生物活性。最后在生物素化脂质体表面连接抗CD3抗体、抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂、aCCR8抗体等T细胞功能调节剂；抗CD3抗体设置在外侧，便于识别T细胞，通过抗CD3抗体识别T细胞后，所述抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体用来激活肿瘤免疫微环境中T细胞的杀瘤活性，提高机体免疫应答能力。
实施例二：
本实施例提供了一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用介孔二氧化硅微粒吸附用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子，制备装载细胞因子的介孔二氧化硅微粒；
所述细胞因子包括IL-2，所述细胞因子还包括IL-12、IL-21和TGF-β1中的至少一种；所述细胞因子混合后通过物理吸附法装载到介孔二氧化硅微粒中；
当加入IL-12时，所述IL-2与IL-12质量比为1∶0.05～0.2；
当加入IL-21时，I所述IL-2与IL-21质量比为1∶0.05～0.3；
当加入TGF-β1时，所述IL-2与TGF-β1质量比为1∶0.05～0.25。
所述IL-12、IL-21和TGF-β1可以同时加入1种、2种或3种。
S2、在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体；
所述生物素化脂质体制备方法为：由POPC和Cap PE按照摩尔比为500～1100∶1的比例混合，经旋转蒸发得到脂质体薄膜，然后添加PBS进行超声混匀，通过物理挤压得到尺寸均一的生物素化脂质体。
在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体过程中：所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体按照质量比为1∶0.8～1.2的比例在室温(20-30℃)下混合1h，得到表面包裹有生物素化脂质体的二氧化硅微粒。
S3、在生物素化脂质体表面，通过链霉亲和素与生物素的连接方式，连接T细胞功能调节剂；
所述T细胞功能调节剂包括抗CD3抗体，所述T细胞功能调节剂还包括抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体的中的至少一种；所述T细胞功能调节剂通过链霉亲和素与生物素的连接方式连接在生物素化脂质体表面；
按照质量比：
当加入抗PD-1抗体时，抗CD3抗体∶抗PD-1抗体＝1∶0.2～2；
当加入CTLA-4阻断剂时，抗CD3抗体∶CTLA-4阻断剂＝1∶0.2～2；
当加入4-1BB激动剂时，抗CD3抗体∶4-1BB激动剂＝1∶0.1～1；
当加入aCCR8抗体时，抗CD3抗体∶aCCR8抗体＝1∶1～2。
下面结合实验对本发明做进一步说明：
1.小鼠实验
1.1介孔二氧化硅微粒的制备：
向250ml反应瓶中添加65ml去离子水、2gP123、10ml HCL(37％)，以40℃、600r.p.m.的条件搅拌反应液1-2h，接着添加4.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)到反应液中，在40℃、600r.p.m.的搅拌条件下搅拌；20小时后，调整搅拌条件为100℃、600r.p.m.并继续搅拌20小时；接着真空抽滤反应液，所得介孔二氧化硅固体在室温下干燥1-2h；在1L反应瓶中加入250ml无水乙醇、2.5ml HCL(37％)，介孔二氧化硅固体，在70℃、600r.p.m.的条件下搅拌，24h后，真空抽滤反应液，所得固体在100℃下干燥24h，得介孔二氧化硅产品，即长条形的介孔二氧化硅微粒，高温灭菌。
1.2生物素化脂质体制备：
抽取2.5mgPOPC、3.6μg CAP PE、500μl氯仿于旋转瓶中，在50℃水浴条件下旋转蒸发反应液1h，得到生物素化脂质体薄膜；所得生物素化脂质体薄膜加入1mlPBS，使用最大速度的涡旋混合器大力混合生物素化脂质体悬浮液1小时。取出生物素化脂质体悬浮液吸到预湿的注射器中，接着使用生物素化脂质体挤出器挤出悬浮液，直至悬浮液变透明。
1.3介孔二氧化硅缓释制剂制备：
取4μg IL-2、4μg IL-2、0.8μg IL-12、1.2μg IL-21和1μgTGF-β 1轻轻混合制备得细胞因子混合物；取10mg介孔二氧化硅微粒用200μl去离子水重悬；接着取50μl介孔二氧化硅微粒混悬液于组装管中，在组装管补充细胞因子混合物并轻轻混合，使细胞因子在室温下吸附一小时以上。接着补充1ml生物素化脂质体至组装管中，在室温下使生物素化脂质体在介孔二氧化硅微粒上覆盖一小时。将物料悬浮液以700g离心5分钟，用针管吸弃上清液，用1ml PBS洗涤2次，最后一次洗涤所得的沉淀用500μl介孔二氧化硅微粒封闭液(0.25％BSA)室温封闭10min；轻轻混合物料悬浮液，然后在组装管中加入3μg链霉亲和素并混匀；允许链霉亲和素在室温下与生物素化脂质结合10分钟，每2分钟温和混合一次(总共5次混合)；取5μg抗CD3抗体、10μg抗PD-1抗体、10μgCTLA-4阻断剂、5μg4-1BB激动剂、10μgaCCR8抗体混合制备得T细胞配体混合物；在组装管中加入T细胞配体混合物混匀，允许表面配体在室温下与链霉亲和素结合40分钟，每10分钟温和混合一次(总共5次混合)；添加500μl介孔二氧化硅微粒封闭液，混匀，以700g离心5分钟，用2ml一次性针管吸弃上清液；沉淀按上述步骤用2ml PBS洗涤2次；最后一次洗涤所得的沉淀用1ml无菌PBS重悬。
1.4小鼠癌性腹水动物模型的建立
H22细胞(小鼠肝癌细胞)37℃水浴复苏，后移至含5mlDMEM完全培养基的T25瓶培养，1天后换液；培养3-4天后传代一次，H22细胞移至T75瓶继续培养。T75瓶弃培养基，PBS洗涤2次后，补充2ml胰酶消化5min，添加10mlDMEM完全培养基混匀，离心得细胞沉淀，沉淀用无PBS重悬，调整细胞浓度至21×107个细胞/ml。取0.2mL(约含2×107个瘤细胞)分别接种于40只BALB/C小鼠腹腔内制剂治疗腹水瘤小鼠；
小鼠接种H22细胞6天后，观察记录各小鼠腹水情况，腹水小鼠随机分3组(模型组、介孔二氧化硅缓释制剂治疗组、药物治疗组)，各组8只，尾部标记序号。
小鼠接种H22细胞6天后开始治疗，模型组每只小鼠于腹水注射0.2ml PBS、介孔二氧化硅缓释制剂治疗组每只小鼠于腹水注射0.2ml组装完成的介孔二氧化硅缓释制剂、药物治疗组每只小鼠于腹水注射0.2ml肿瘤免疫药物混合物(取4μg IL-2、0.8μg IL-12、1.2μg IL-21、1μgTGF-β1、5μg抗CD3抗体、10μg抗PD-1抗体、10μgCTLA-4阻断剂、5μg4-1BB激动剂、10μgaCCR8抗体用PBS补充至1ml后混匀制备得到肿瘤免疫药物混合物)，以上3组小鼠每6-7天注射一次，共注射3次，治疗18天，实验持续24天。每隔2～3天记录小鼠生存率、腹围周径；记录数据如下表所示：
组别 生存率 腹围(cm)
模型组 0/15 12.2±5.8
介孔二氧化硅缓释制剂治疗组 12/15 6.3±3.1
药物治疗组 8/15 9.3±4.8
通过记录数据，可以看出介孔二氧化硅缓释制剂治疗组，生存率较高；此外，介孔二氧化硅缓释制剂治疗组的腹围较小，说明腹水量少；介孔二氧化硅缓释制剂具备较好的抗肿瘤作用。
此外，药物治疗组与介孔二氧化硅缓释制剂治疗组药物成分虽然一样，但是本发明的结构中，介孔二氧化硅微粒上装载有细胞因子，介孔二氧化硅微粒上包裹有生物素化脂质体，生物素化脂质体负载有T细胞功能调节剂；使得细胞因子能从介孔二氧化硅微粒中缓慢释放，延长了细胞因子的生物活性，且重新激活肿瘤微环境的免疫响应，增强T细胞的增殖能力及促进T细胞分泌效应分子，提高机体免疫应答能力，协同细胞因子药物改善肿瘤微环境以起到抗肿瘤疗效。
2.体外临床实验：
关于腹水瘤：
病人信息：31岁女；腹水：共1L；
实验操作：
(1)取200ml腹水(含有肿瘤细胞和TIL细胞)于离心管中，于400g条件下离心8min，细胞沉淀用25ml红细胞裂解液重悬，置于4℃条件下避光孵育4min，后补充20mlPBS混匀，离心，细胞沉淀用5ml人TIL CM(Complete Medium，完全培养基)重悬。
(2)计数：共计1.5X108个细胞(肿瘤细胞和TIL细胞)，从中取1.5X107个TIL细胞于T75瓶中，加入本发明中的针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂与人TIL CM，混匀，后置于培养箱中培养数天。
(3)换液：培养4天后，更换一半培养基。
图1为培养两天后各种细胞含量的照片；图中，圆形为TIL细胞，梭形(类似长条形)为肿瘤细胞。
参阅图2：
培养5天后，TIL细胞开始扩增，肿瘤细胞开始扩增。
培养10天后，TIL数量增加，但扩增速率较缓，TIL细胞趋向于集中在肿瘤细胞周围，肿瘤细胞数量增加，且状态良好。
参阅图3：
培养17天后，TIL细胞开始大量扩增，并有较多聚团，显微镜下观察肿瘤细胞大幅度减少。
培养21天后，TIL细胞大量扩增，且聚团体积变大，此时在显微镜下观察没有看到肿瘤细胞。
细胞变化量如图4所示：初始播种量为1.5X107；培养14天后细胞数量为8X107；培养21天后细胞数量为3.6X108。
通过流式细胞仪流式分析人腹水瘤TIL细胞表型：
参阅图5：
培养7天后，CD4+的含量为22.72％；培养21天后，CD4+的含量为76.11％；
培养7天后，CD8+的含量为42.12％；培养21天后，CD8+的含量为18.54％。
虽然CD8+的含量有所降低，但是效应T细胞(CD4+和CD8+)的总含量由66.84％变化为94.65％。
参阅图6：
培养7天后，效应记忆T细胞(CD45RO+CCR7-)的含量为47.7％；培养21天后，效应记忆T细胞(CD45RO+CCR7-)的含量为83.74％；
参阅图7：
培养7天后PD-1(T细胞耗竭的标志物)的含量为2.09％；培养21天后，PD-1的含量为PD-1：5.41％；
培养7天后TIM-3(T细胞耗竭的标志物)的含量为0.79％；培养21天后，TIM-3的含量为PD-1：5.33％。
由此可见，T细胞耗竭始终维持在一个较低的水平。
综上可以看出，本发明制备的介孔二氧化硅缓释制剂，对效应T细胞和效应记忆T细胞有着增长作用，可以提高癌细胞的灭杀效果；此外，本发明制备的介孔二氧化硅缓释制剂可以使得T细胞耗竭始终维持在一个较低的水平，有助于维持癌细胞的灭杀效果。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，其特征在于：包括介孔二氧化硅微粒，所述介孔二氧化硅微粒上装载有用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子；所述介孔二氧化硅微粒上包裹有用于提高介孔二氧化硅微粒生物相容性的生物素化脂质体；所述生物素化脂质体负载有T细胞功能调节剂。
2.根据权利要求1所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，其特征在于：所述细胞因子包括IL-2，所述细胞因子还包括IL-12、IL-21和TGF-β1中的至少一种；所述细胞因子混合后通过物理吸附法装载到介孔二氧化硅微粒中；
当加入IL-12时，所述IL-2与IL-12质量比为1:0.05～0.2；
当加入IL-21时，I所述IL-2与IL-21质量比为1:0.05～0.3；
当加入TGF-β1时，所述IL-2与TGF-β1质量比为1:0.05～0.25。
3.根据权利要求1所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，其特征在于：所述生物素化脂质体由POPC和Cap PE混合制成；所述POPC与Cap PE的摩尔比为500～1100:1。
4.根据权利要求1所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，其特征在于：所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体的质量比为1:0.8～1.2；所述生物素化脂质体设置一层或两层；
所述介孔二氧化硅微粒为长条形，且长度为80±40μm，宽为6±2.5μm，中孔大小为5±2.5nm。
5.根据权利要求1所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂，其特征在于：所述T细胞功能调节剂包括抗CD3抗体，所述T细胞功能调节剂还包括抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体的中的至少一种；所述T细胞功能调节剂通过链霉亲和素与生物素的连接方式连接在生物素化脂质体表面；
按照质量比：
当加入抗PD-1抗体时，抗CD3抗体：抗PD-1抗体＝1：0.2～2；
当加入CTLA-4阻断剂时，抗CD3抗体：CTLA-4阻断剂＝1：0.2～2；
当加入4-1BB激动剂时，抗CD3抗体：4-1BB激动剂＝1：0.1～1；
当加入aCCR8抗体时，抗CD3抗体：aCCR8抗体＝1：1～2。
6.一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用介孔二氧化硅微粒吸附用于调节机体进行肿瘤免疫应答的细胞因子，制备装载细胞因子的介孔二氧化硅微粒；
S2、在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体；
S3、在生物素化脂质体表面，通过链霉亲和素与生物素的连接方式，连接T细胞功能调节剂。
7.根据权利要求6所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述细胞因子包括IL-2，所述细胞因子还包括IL-12、IL-21和TGF-β1中的至少一种；所述细胞因子混合后通过物理吸附法装载到介孔二氧化硅微粒中；
当加入IL-12时，所述IL-2与IL-12质量比为1:0.05～0.2；
当加入IL-21时，I所述IL-2与IL-21质量比为1:0.05～0.3；
当加入TGF-β1时，所述IL-2与TGF-β1质量比为1:0.05～0.25。
8.根据权利要求6所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述生物素化脂质体制备方法为：
由POPC和Cap PE按照摩尔比为500～1100:1的比例混合，经旋转蒸发得到脂质体薄膜，然后添加PBS进行超声混匀，通过物理挤压得到尺寸均一的生物素化脂质体。
9.根据权利要求6所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，在所述装载细胞因子的二氧化硅微粒表面包裹生物素化脂质体过程中：所述介孔二氧化硅微粒与生物素化脂质体按照质量比为1:0.8～1.2的比例在室温下混合1h，得到表面包裹有生物素化脂质体的二氧化硅微粒。
10.根据权利要求6所述的一种针对癌性腹水的介孔二氧化硅缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述T细胞功能调节剂包括抗CD3抗体，所述T细胞功能调节剂还包括抗PD-1抗体、CTLA-4阻断剂、4-1BB激动剂和aCCR8抗体的中的至少一种；所述T细胞功能调节剂通过链霉亲和素与生物素的连接方式连接在生物素化脂质体表面；
按照质量比：
当加入抗PD-1抗体时，抗CD3抗体：抗PD-1抗体＝1：0.2～2；
当加入CTLA-4阻断剂时，抗CD3抗体：CTLA-4阻断剂＝1：0.2～2；
当加入4-1BB激动剂时，抗CD3抗体：4-1BB激动剂＝1：0.1～1；
当加入aCCR8抗体时，抗CD3抗体：aCCR8抗体＝1：1～2。
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