CN115109815A - 一种无细胞体系拓扑蛋白以及其结构单体的合成方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种无细胞体系拓扑蛋白结构单体的合成方法，包括如下步骤：合成包含表达目标蛋白的基因序列、表达SpyTag的基因序列或表达SpyCatcher的基因序列的基本序列；将所述基本序列加入到无细胞体系中以合成包括目标蛋白的结构单体。本申请还提供一种无细胞体系拓扑蛋白的合成方法。本申请的目的在于提供一种比细胞系统更简单、更快的蛋白质合成方法，在开放环境中具有前所未有的设计自由度，所合成的蛋白质的聚合度以及长度可控。

Description

一种无细胞体系拓扑蛋白以及其结构单体的合成方法

技术领域

本申请涉及合成生物学技术领域，具体涉及一种无细胞体系拓扑蛋白以及其结构单体的合成方法。

背景技术

化学工具奠定了蛋白质拓扑工程的基础。用于合成蛋白质的化学工具包括点击化学、表达蛋白质连接方法和分裂内含肽技术。点击化学对于生物偶联非常有用，但这种方法可能会受到有限的聚合度或缺乏序列控制的影响。表达蛋白连接方法利用形成硫酯的内含肽结构域来促进随后的连接/环化。分裂内含肽技术提供了在细胞中进行连接的机会。短肽段intein-C及其蛋白质伴侣intein-N可以在原位重组和剪接。SpyTag/SpyCatcher化学代表了一个强大的工具箱。SpyTag是一种短肽，当它遇到其蛋白质伴侣时会形成异肽键间谍捕手。各种拓扑蛋白，如环状弹性蛋白样多肽(ELP)、β-内酰胺酶和二氢叶酸还原酶(DHFR)、荧光素酶、和地衣酶、和3-臂/4-臂星形蛋白和H形分支ELP，已经成功合成。

自发的异肽键通常在革兰氏阳性菌中形成，这种异肽键通常存在于免疫球蛋白样结构域CnaB1和CnaB2中。化脓性链球菌的纤连蛋白结合蛋白的CnaB2的天冬氨酸117(Asp117)和赖氨酸(Lys31)之间可以形成异肽键。CnaB2可分为13个残基的肽Spytag和116个残基的互补域Spycatcher。SpyTag/SpyCatcher是一种多亚基人工复合蛋白，SpyCatcher和SpyTag可以与其他功能性蛋白质结合，然后充当连接两种蛋白质的介质，为构建蛋白质复合物提供即插即用的通用技术。Spytag/Spycatcher相互作用的特点是自催化，反应快，高产率高热稳定性，机械稳定性以及对蛋白酶的抗性。这种复合蛋白结构对于设计复合蛋白装配体和构建稳定的蛋白结构是非常有利的。Spytag/Spycatcher的稳定结构使其对高温以及抑制剂都具有非常出色的耐受性。虽然Spytag/Spycatcher具有如此多的优势，但其传统的制备方式是在细胞内表达再纯化，因此仍然具有一些局限性，例如由于细胞空间的限制表达量没有达到理想的效果，形成过程不易调控等，开发自由调控的技术是非常必要的。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷，本申请的目的在于提供一种比细胞系统更简单、更快的蛋白质合成方法，在开放环境中具有前所未有的设计自由度，所合成的蛋白质的聚合度以及长度可控。

本申请提供如下技术方案。

本申请提供一种无细胞体系拓扑蛋白结构单体的合成方法，包括如下步骤：

合成包含表达目标蛋白的基因序列、表达SpyTag的基因序列或表达SpyCatcher的基因序列的基本序列；

将所述基本序列加入到无细胞体系中以合成包括目标蛋白的结构单体。

本申请还提供一种无细胞体系拓扑蛋白的合成方法，包括如下步骤：

合成包含表达目标蛋白的基因序列和表达SpyTag的基因序列的第一基本序列；

合成包含表达目标蛋白的基因序列和表达SpyCatcher的基因序列的第二基本序列；

将所述第一基本序列和第二基本序列加入到无细胞体系中，以合成包括SpyTag和目标蛋白的第一结构单体，以及包括SpyCatcher和目标蛋白的第二结构单体；

所述第一结构单体和第二结构单体进一步聚合成具有拓扑结构的目标蛋白。

进一步地，无细胞体系中提纯所述第一结构单体以及第二结构单体后再合成具有拓扑结构的目标蛋白；或

所述第一结构单体以及第二结构单体在无细胞体系中原位直接合成具有拓扑结构的目标蛋白。

进一步地，所述基本序列还包括表达标签序列的基因序列，所述标签序列为His-tag。

进一步地，所述标签序列位于目标蛋白基因序列的C端或N端，优选为C端。

进一步地，所述基本序列选自His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS、SC-PS-His、His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS、ST-PS-His、His-SC-PS-SC、SC-PS-SC-His、His-ST-PS-ST、ST-PS-ST-His中的一种或两种以上，

其中SpyTag简称ST，SpyCatcher简称SC，His-Tag简称His，目标蛋白基因序列简称PS。

进一步地，所述无细胞体系的制备方法包括下述步骤：将细胞破碎得到细胞提取物，然后加入RNA聚合酶和辅助因子得到无细胞体系。

进一步地，所述辅助因子包括镁离子，所述无细胞体系中镁离子的浓度为5-35mM，优选为10-30mM。

进一步地，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶，优选为利用含有质粒pAR1219的\E.coli BL21所提取的T7 RNA聚合酶。

进一步地，所述基本序列是以质粒或线性DNA形式存在的。

进一步地，所述拓扑结构的目标蛋白为二聚体、三聚体或多聚体。

进一步地，所述第二基本序列与所述第一基本序列的摩尔比为(1～81):9，优选为(9～21):9。

在本申请提供的方法，利用无细胞体系，结合SpyCatcher/SpyTag化学，开发了一种无细胞一锅转录-翻译-组装系统，用于合成可灵活调控的拓扑蛋白材料。设计了12种可表达不同蛋白质的基本序列(质粒)，利用无细胞体系成功表达。首先用聚丙烯酰氨凝胶电泳法验证了已表达蛋白在无细胞体系中的可溶性，为后期蛋白聚合奠定了基础；然后发现与His-tag位于序列N端的质粒相比，C端带有His-tag的序列蛋白表达水平更高；接下来，通过调整镁离子浓度和不同质粒的摩尔比优化无细胞系统，以获得最大聚合度。

本申请提供的方法，通过无细胞合成体系可以简单、快速和有效的生产聚合度以及长度可控的蛋白质。本申请利用细胞提取物或与转录和翻译相关的酶系统，通过添加能量系统、DNA模板(质粒)、盐离子、辅因子、氨基酸等，在体外进行共表达，从而可以一锅获得目标聚合蛋白，既节省时间又提高了效率。

附图说明

图1为实施例1-实施例12制备的单体蛋白的上清和全蛋白样SDS-PAGE结果图。

图2为实施例1-实施例12制备的单体蛋白采用用酶标仪测得的荧光图。

图3为实施例1-实施例12制备的单体蛋白的WesternBlot结果图。

图4为实施例13-实施例33制备聚合蛋白的WesternBlot结果图。

图5为实施例34-实施例54制备聚合蛋白的WesternBlot结果图。

图6为实施例55-实施例58制备聚合蛋白的Western Blot以及荧光结果图。

图7为实施例59-实施例62制备聚合蛋白的WesternBlot结果图。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

蛋白质拓扑结构已成为蛋白质基材料的一个重要维度。蛋白质骨架的化学拓扑结构对蛋白质具有许多功能益处，例如结构稳定、动态转换特性、协同多价效应和四级结构控制。蛋白质拓扑工程提供了许多潜在的功能优势，即使不改变目标蛋白质的天然序列也能获得这些优势。这使得蛋白质工程在构建高度稳定的大型复合物方面具有重要意义。然而，尽管在蛋白质生物合成中对序列、长度和立体化学有着无与伦比的控制，蛋白质化学拓扑的多样性在很大程度上仍然没有得到开发。

蛋白质的拓扑特征是几百万年自然进化的结果。即便如此，自然界只是探索了所有可能的蛋白质拓扑结构中的一小部分。为了充分发挥蛋白质拓扑工程的潜力，明智的做法是从模仿自然界创造拓扑特征的过程开始。令人敬畏的蛋白质复杂性遮蔽了它们的设计和合成的简单方法。虽然将线性链改变为环、蝌蚪、星形和分支蛋白可以像一步接合一样简单，但很难从头开始设计一个不平凡的蛋白质拓扑结构。它不仅需要精确控制蛋白质折叠，还需要精确控制翻译后修饰，如切割和连接。因此，需要创造性的方法来实现这些复杂的拓扑结构，特别是那些具有机械键的拓扑结构，以实现按需“编织”蛋白质链的目标。

本申请提供一种无细胞体系拓扑蛋白结构单体的合成方法，包括如下步骤：

步骤一：合成包含表达目标蛋白的基因序列、表达SpyTag的基因序列或表达SpyCatcher的基因序列的基本序列；

步骤二：将所述基本序列加入到无细胞体系中以合成包括目标蛋白的结构单体。

具体地，包含表达目标蛋白的基因序列、表达SpyTag的基因序列的基因序列的基本序列为第一基本序列。

所述第一基本序列加入所述无细胞体系中可以合成包含目标蛋白的结构单体为第一结构单体。

具体地，包含表达目标蛋白的基因序列、表达SpyCatcher的基因序列的基本序列为第二基本序列。

所述第二基本序列加入所述无细胞体系中可以合成包含目标蛋白的结构单体为第二结构单体。

本申请提供一种无细胞体系拓扑蛋白的合成方法，包括如下步骤：

步骤一：合成包含表达目标蛋白的基因序列和表达SpyTag的基因序列的第一基本序列；

合成包含表达目标蛋白的基因序列和表达SpyCatcher的基因序列的第二基本序列；

步骤二：将所述第一基本序列和第二基本序列加入到无细胞体系中，以合成包括SpyTag和目标蛋白的第一结构单体，以及包括SpyCatcher和目标蛋白的第二结构单体；

所述第一结构单体和第二结构单体进一步聚合成具有拓扑结构的目标蛋白。

具体地，无细胞体系中提纯所述第一结构单体以及第二结构单体后再合成具有拓扑结构的目标蛋白；或

所述第一结构单体以及第二结构单体在无细胞体系中原位直接合成具有拓扑结构的目标蛋白。

在本申请中，所述第一基本序列以及第二基本序列均还包括表达标签序列的基因序列，所述标签序列为His-tag。

对于第一基本序列以及第二基本序列的类型，本申请没有任何限制，只要是能作为基因模板用于合成目标蛋白质即可，例如可以为线性DNA或者mRNA，也可以为环状DNA或RNA，可以是任何来源的DNA或RNA，也可以是任何结构形式的DNA或RNA，只要是能作为基因模板最终转录翻译成蛋白质即可。具体来说，如果是质粒DNA，其表达质粒上只要是携带有表达目标蛋白质的基因即可。

对于待合成的目标蛋白质含有的氨基酸的数量，本申请没有任何限制，例如，待合成的目标蛋白质可以含有10-3000个氨基酸，优选为10-1000个氨基酸，例如，待合成的目标蛋白质可以含有10个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸、200个氨基酸、300个氨基酸、400个氨基酸、500个氨基酸、600个氨基酸、700个氨基酸、800个氨基酸、900个氨基酸、1000个氨基酸、2000个氨基酸、3000个氨基酸等。

对于待合成的目标蛋白质的基因，本申请没有任何限制，例如可以为编码荧光蛋白的基因、编码生物催化酶的基因、编码疫苗蛋白的基因、编码抗体蛋白的基因、编码膜蛋白的基因、编码多肽的基因等。

SpyTag/SpyCatcher是一种多亚基人工复合蛋白，其中SpyTag是一种短肽，当它遇到其蛋白伴侣SpyCatcher时可以形成异肽键。SpyCatcher和SpyTag可以与其他功能性蛋白质结合，然后充当连接两种蛋白质的介质。Spytag/Spycatcher相互作用的特点是自催化，反应快，高产率高热稳定性，机械稳定性以及对蛋白酶的抗性。

His-Tag是一种蛋白纯化标签，His-Tag本身的特性对目标蛋白没有影响，不会形成二聚体，分子量较小，对蛋白的下游应用不会产生影响，免疫原性低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。其与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白的表达，可与其他标签构建双标签表达，可用于多种蛋白表达系统，纯化条件温和对蛋白影响较小。

在本申请中，所述标签序列位于目标蛋白基因序列的C端或N端，优选为C端。

在本申请中，所述基本序列选自His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS、SC-PS-His、His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS、ST-PS-His、His-SC-PS-SC、SC-PS-SC-His、His-ST-PS-ST、ST-PS-ST-His中的两种或两种以上，

其中SpyTag简称ST，SpyCatcher简称SC，His-Tag简称His，目标蛋白基因序列简称PS。

具体地，所述第一基本序列为His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS、ST-PS-His、His-ST-PS-ST或ST-PS-ST-His中的一种或两种以上。

所述第二基本序列可以为His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS、SC-PS-His、His-SC-PS-SC或SC-PS-SC-His中的一种或两种以上。

在目标蛋白的合成中，所述第二基本序列与第一基本序列的摩尔比为(1～81):9。

例如可以为1:9、2:9、3:9、4:9、5:9、6:9、7:9、8:9、9:9、10:9、11:9、12:9、13:9、14:9、15:9、16:9、17:9、18:9、19:9、20:9、21:9、22:9、23:9、24:9、25:9、26:9、27:9、28:9、29:9、30:9、31:9、32:9、33:9、34:9、35:9、36:9、37:9、38:9、39:9、40:9、41:9、42:9、43:9、44:9、45:9、46:9、47:9、48:9、49:9、50:9、51:9、52:9、53:9、54:9、55:9、56:9、57:9、58:9、59:9、60:9、61:9、62:9、63:9、64:9、65:9、66:9、67:9、68:9、69:9、70:9、71:9、72:9、73:9、74:9、75:9、76:9、77:9、78:9、79:9、80:9或81:9。

在本申请中，具有拓扑结构的目标蛋白为二聚体、三聚体或多聚体。

具体地，当需要合成二聚体时，第二基本序列His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS以及SC-PS-His分别与第一基本序列His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS或ST-PS-His中任意一种或两种以上在无细胞体系中合成二聚体，优选地，所述第二基本序列为SC-GFP-His与第一基本序列为GFP-ST-His在无细胞体系中合成二聚体，且第二基本序列与第一基本序列的摩尔比为21:9。

具体地，当需要合成三聚体时，第二基本序列His-SC-PS-SC以及SC-PS-SC-His分别与第一基本序列His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS或ST-PS-His中任意一种或两种以上在无细胞体系中合成三聚体，优选地，所述第二基本序列为SC-GFP-His与第一基本序列为ST-GFP-ST-His，且其摩尔比为21:9，或所述第二基本序列为SC-GFP-SC-His与第一基本序列为GFP-ST-His，且其摩尔比为9:9，在无细胞体系中合成三聚体。

具体地，当需要合成三聚体时，第一基本序列His-ST-PS-ST以及ST-PS-ST-His分别与第二基本序列His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS或SC-PS-His中任意一种或两种以上在无细胞体系中合成三聚体，优选地，所述第二基本序列为SC-GFP-SC-His与第一基本序列为ST-GFP-ST-His，且其摩尔比为21:9，在无细胞体系中合成多聚体。

具体地，当需要合成多聚体时，第一基本序列His-ST-PS-ST以及ST-PS-ST-His分别与第二基本序列His-SC-PS-SC或SC-PS-SC-His和/或His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS、SC-PS-His、His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS或ST-PS-His中任意一种或两种以上在无细胞体系中合成多聚体。

在本申请中，所述无细胞体系的制备方法包括下述步骤：将细胞破碎得到细胞提取物，然后加入RNA聚合酶和辅助因子得到无细胞体系，即所述无细胞体系包括细胞提取物、RNA聚合酶和辅助因子。

所述细胞提取物来源于细菌细胞或者兔网状细胞或者小麦胚芽或者昆虫，优选为细菌细胞提取物；所述细菌细胞可以为任何细菌菌株的细胞提取物，例如大肠杆菌。

RNA聚合酶，其识别基本序列可操作地连接的启动子，例如T7 RNA聚合酶；

在进行无细胞合成时，所述辅助因子提供蛋白质合成所需要的物质，所述辅助因子例如包括能量来源物质、氨基酸、盐、镁离子(Mg²⁺)以及其他试剂。

所述能量来源物质为化学底物，其可被酶促地作用以提供能量来实现期望的化学反应，通常使用的能量来源允许通过断裂如存在于核苷三磷酸(例如ATP)中的高能磷酸键来释放能量用于合成，可转变高能磷酸键的任何来源是特别适合的，通常，ATP、GTP以及其他磷酸盐被认为是用于支持蛋白合成的等同的能量来源，在本申请中优选为核苷三磷酸混合物(NTPmix)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，所述核苷三磷酸混合物包括亚精胺、腐胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、ATP、CTP、GTP、UTP、CoA、tRNA和亚叶酸。

在本申请中，所述无细胞体系中镁离子的浓度为5-50mM。例如可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM或50mM。

具体地，所述氨基酸包括精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、天冬酰氨(Asn)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)；

具体地，所述盐包括谷氨酸钾、谷氨酸铵和一水合草酸钾；

具体地，所述其他试剂包括氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽以及PEG8000。

具体地，所述基本序列是以质粒或线性DNA形式存在的。

在本申请提供的方法，利用无细胞体系，结合SpyCatcher/SpyTag化学，开发了一种无细胞一锅转录-翻译-组装系统，用于合成可灵活调控的拓扑蛋白材料。设计了12种可表达不同蛋白质的基本序列(质粒)，利用无细胞体系成功表达。首先用聚丙烯酰氨凝胶电泳法验证了已表达蛋白在无细胞体系中的可溶性，为后期蛋白聚合奠定了基础；然后发现与His-tag位于序列N端的质粒相比，C端带有His-tag的序列蛋白表达水平更高；接下来，通过调整镁离子浓度和不同质粒的摩尔比优化无细胞系统，以获得最大聚合度，结果发现本实验无细胞体系表达SpyCatcher/SpyTag的最佳镁离子浓度为10-30mM，第一基本序列和第二基本序列的摩尔比率为(1～81):9，尤其以(9～21):9为最佳，对于不同的聚合体有着不同的最佳质粒摩尔比例范围，二聚体(3～8)：2，三聚体(4～24)：6，多聚体(3～7)：3。

实施例

本申请在实施例中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

无细胞合成体系组分的制备

A、细胞提取物的制备

(1)细胞提取物所用缓冲液如表1所示：

表1细胞提取物制备所需缓冲液

(2)细菌培养：从不含抗生素的2×YT固体培养基中挑取单菌落至2×YT液体培养基，用一级种子液培养过夜；将一级种子液以5％接种量加入到新鲜的2×YT液体培养基中，培养至细胞长至对数生长期中间，制备二级种子液；将二级种子液以5％接种量转移到4×1L的培养基中，细胞生长。对数生长期结束时，收集菌液，8000rpm，4℃，30min离心，弃上清。

(3)将细菌重悬于破碎缓冲液中，然后以8000rpm、4℃、10min的速度离心，重复两次，称重细菌。

(4)每克细菌细胞加入1mL裂解缓冲液，重悬，置于冰上。

(5)用高压粉碎机粉碎前，必须加入没过破碎部分的冰水混合物，以防止粉碎时高温影响提取物的活性。打开高压破碎机，将压力控制在1000bar。待注射杯中的乙醇流出后，加入两柱无菌水，再加入一柱破碎缓冲液。待破碎缓冲液流出后，加入重悬菌液进行粉碎，粉碎后重复粉碎操作。将粉碎的样品在10,000rpm、4℃下离心30分钟。破损的进样杯需要用两柱无菌水和两柱75％乙醇清洗，最后用75％乙醇密封。

(6)将离心后的上清液转移到新的无菌BD管中，锡纸包裹，在摇床上以120rpm的速度避光37℃孵育80分钟。

(7)4℃10,000rpm离心样品30分钟。

(8)吸出上清液，加入MWCO 6-8kDa的透析袋中，在透析缓冲液中4℃透析过夜；

(9)将透析袋中的细胞提取液放入BD管中，10000rpm，4℃，30分钟，将上清液分装到多个1.5mL EP管中，液氮快速冷冻,储存在-80℃冰箱中。

B、T7 RNA聚合酶的制备

使用被pAR1219质粒化学转化后的E.coli BL21(DE3)菌株制备。

(1)所需缓冲溶液配制如表2所示：

表2本文T7RNA聚合酶制备所需配制缓冲溶液组分表

(2)菌株活化：将-80℃保存的E.coli BL21(DE3)-PAR1219菌株吸取到氨苄青霉素LB培养基上，在恒温培养箱中37℃培养12h；

(3)挑取单个菌落转移至LB液体培养基(20％液体含量)，200rpm，37℃，恒温摇床12h；

(4)以5％接种量将菌液转移到1L新鲜LB液体培养基中，在恒温摇床中200rpm、37℃培养约1小时；

(5)当OD600为0.6～0.8时，加入1mM IPTG(1％)；

(6)OD600为2.0时，8000rpm，4℃，20min离心，收集细胞；

(7)用预冷的S30缓冲液以5mL/g细胞的比例重悬细胞，并在4℃下以8000rpm离心20分钟。这个过程重复两次；

(8)用裂解缓冲液以4mL/g细胞的比例重悬细胞，超声40min(工作2s，间歇6s)，每10min更换一次冰块。

(9)8000rpm，4℃，20min离心，弃去沉淀，保留上清；

(10)将上清液加入MWCO 6-8kDa的透析袋中，用透析缓冲液4℃透析过夜；

(11)将透析袋中的液体转移至BD管中，10,000×g，4℃，30min离心，取上清液，分装于冰上，液体速冻后于-80℃冰箱中保存。

C、无细胞部分溶液制备

表3本实验中无细胞体系部分溶液组分表

D、25×的19种氨基酸混合溶液制备

19种氨基酸浓度均为50mM。在制备过程中，需要先完全溶解前一个氨基酸，然后再加入下一个氨基酸。最后加入的酪氨酸是不溶的。溶液混合均匀后，用浓盐酸调节pH至7.4。成分如表4所示。

表4本实验中无细胞体系25×的19种氨基酸混合溶液组分表

材料表征

A、酶标仪荧光测试

本研究使用TECAN的M200P40酶标仪。将荧光蛋白用1×PBS稀释20-40倍以测量荧光强度。测量前需摇动酶标仪30s以保证混合均匀，本论文中的蛋白质均包含绿色荧光蛋白sfGFP,激发波长为485nm,发射波长为520nm。

B、透射电子显微镜(TEM)

在这项研究中，使用了FEI的D1266透射电子显微镜。首先，将5μL稀释100倍的样品滴在超薄碳支撑膜上。向膜中滴加5μL醋酸铀(2％)，静置1分钟，用滤纸除去多余的醋酸铀，自然干燥1分钟。最后，将处理后的超薄碳支撑膜置于电压为120kV的TEM中观察。

C、激光共聚焦显微镜

在这项研究中，使用了蔡司的LSM-780激光共聚焦显微镜。首先，将样品稀释100倍，然后滴到带有盖玻片的载玻片上。将共聚焦显微镜调整到相应荧光蛋白的激发波长和发射波长，在10x物镜下找到样品后，切换到60x油物镜观察荧光蛋白的形态。

单体蛋白的表达

实施例1

为了探索无细胞系统中拓扑蛋白的合成，将绿色荧光蛋白GFP作为模型。在NCBI上获取GFP、His-tag、SpyTag和SpyCatcher的基因序列(其序列如表5)，并使用Snapgene进行序列的连接，连接序列是GGGGSGGGGS。将构建的基因序列嵌入pET23a载体，以Nde1和HindIII为酶切位点，并交付金维智公司订购，载体是pET23a。用于质粒提取的DH5a穿刺菌由金维智公司提供。将订购的穿刺菌在固体LB培养基上进行三区划线获得单菌落，将单菌落接种到37℃的10mL含100μg/mL氨苄青霉素抗生素的LB培养基中，平板划线和接种均在超净台中进行，将培养基置于37℃摇床上孵育过夜。第二天通过离心收获细胞，并用QiagenPlasmidMaxi Kit(Qiagen，Valencia，CA)提取质粒，从而获得所述基本序列。

表5

按照下表6将表中的组分依次加入到1.5mL EP管中，总反应体系为20μL，添加完所有组分后不足20μL的部分用无菌水补齐。反应条件为30℃，12h生化培养箱中培养。培养完成后取全蛋白通过SDS-PAGE、Western Blot以及酶标仪测定荧光蛋白的荧光值进行验证是否表达。结果如图1-图3所示。

表6

实施例2-实施例12与实施例1的不同之处在于基本序列，具体如表7所示，结果如图1-图3所示。

表7

小结：从上表以及图1-图3可知，对无细胞产物的全蛋白质溶液和离心后的上清液进行SDS-PAGE分析。发现在无细胞体系中实施例1-实施例12均合成了设计的单体蛋白，并且上述12种设计的单体蛋白都是可溶的。可溶性的蛋白更容易在无细胞体系下可以得到很好的分散，也就更利于后期的聚合，为后续蛋白聚合奠定了良好的基础和条件。而且当His-tag位于C端时，蛋白质表达水平较高。推测N端的His标签序列可能会影响蛋白质翻译，尤其是ST融合蛋白。SC-GFP-His(C)在无细胞系统中的表达水平是(N)His-SC-GFP的15倍。与(N)His-GFP-ST相比，GFP-ST-His(C)增加了8倍。与(N)His-ST-GFP-ST相比，ST-GFP-ST-His(C)增加了5倍。唯一相反的结果是(N)His-SC-GFP-SC具有比SC-GFP-SC-His(C)更高的荧光值。通过蛋白质印迹分析，发现SC-GFP-SC-His(C)的表达高于(N)His-SC-GFP-SC。推测GFP可能被SpyCatcher包裹，绿色荧光减弱，导致荧光值下降。尽管不同的构建体显示出不同的CFPS结果，但它们可以成功表达。

拓扑蛋白的表达

实施例13

将实施例6制备的含有sfGFP-ST-His(I)的液体与实施例4制备的含有SC-sfGFP-His(H)的液体分别取5μL，置于新的1.5mL EP管中，室温放置三个小时，SpyCatcher和SpyTag之间可以自发形成稳定的异肽键，使其充分反应以获得最多的聚合蛋白。做了蛋白质印迹法分析和ImageJ分析计算聚合比例，如图4。

从图4中可以看出反应结束后无细胞体系中包括合成的二聚体以及未反应的结构单体，形成的二聚体的比例为81％，其尺寸为70kDa，各项参数见表8。

实施例14-33与实施例13的不同之处在于结构单体的组合方式不同，各项参数见表8，以及图4。

表8

小结：由上表以及图4可知，通过SpyCatcher和SpyTag构建第二结构单体和第一结构单体，在无细胞合成体系中添加等体积的第一结构单体和第二结构单体，第一结构单体与第二结构单体聚合，成功合成了拓扑结构的蛋白质，包括二聚体、三聚体和多聚体。

原位共表达和聚合

实施例34

首先建立含有两种不同质粒的无细胞体系，6μL细胞提取物、0.2μL 1mol/L谷氨酸镁、0.8μL 19AA、1μLHepes缓冲液、0.8μLNTPs、0.8μLPEP、0.1μLT7 RNA聚合酶、1μL 10×salt放入1.5mL EP管中，第一基本序列与第二基本序列的摩尔数均为5×10^-12mol，然后用无菌水定容至20μL，用涡旋振荡器混匀，置于30℃恒温培养箱中过夜反应。反应后获得相应的绿色荧光聚合蛋白，SpyCatcher和SpyTag之间可以自发形成稳定的异肽键，使其充分反应以获得最多的聚合蛋白。在蛋白共表达后，将它们按照二聚体，三聚体和多聚体分类并点样在同一块SDS-Page胶上做了蛋白质印迹法分析和ImageJ分析计算聚合比例，如图5。其各项参数见表9。

实施例35-实施例54与实施例34的不同之处在于基本序列的组合方式不同，详情见表9以及图5。

表9

小结：由上表以及图5可知，在无细胞系统中添加通过SpyCatcher和SpyTag构建的基本序列，成功合成了拓扑结构的蛋白质，包括二聚体、三聚体和多聚体，实现了原位共表达并促进复杂蛋白质的聚合。

无细胞体系中镁离子的影响

实施例55

构建13种无细胞体系，分别含有递增的镁离子浓度(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100和200mmol/L)。首先将表6中除镁离子的组分依次加入到1.5mL EP管中，然后分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、4.0μL的1mol/L的镁离子溶液，加入第一基本序列和第二基本序列，按照下表10的组合方式来选择第一基本序列和第二基本序列，其中两种第一基本序列和第二基本序列的摩尔数均为5×10^-12mol，总反应体系为20μL，添加完所有组分后不足20μL的部分用无菌水补齐。反应条件为30℃，12h生化培养箱中反应。而后通过WesternBlot和ImageJ来进行分析得到最大聚合蛋白的镁离子浓度，其结果如图6，其各项参数见表10。

实施例56-实施例58与实施例55的不同之处在于基本序列的组合方式，其各项参数见表10，其结果如图6。

表10

小结：不同的镁离子浓度确实影响了四种组合的无细胞表达和聚合，如图6所示。如图6A1、B1、C1、D1所示，当Mg²⁺离子浓度为0时，单体蛋白不能表达，这进一步证实了镁离子的重要性。从图6D1和D2可知，多聚体K+L的合成看，当Mg²⁺离子为5mM时，单体有一定的表达，但未能形成聚合物。推测Mg²⁺离子对蛋白质的聚合也有一定的影响。当无细胞体系中的Mg²⁺离子浓度在10mM以上时，可以形成二聚体、三聚体和多聚体，本领域技术人员可以基于需要和合成的要求来选择，例如当Mg²⁺离子浓度为10-30mM时，二聚体、三聚体和多聚体表达水平相对较高。二聚体、三聚体和多聚体的最大形成比率可达为1.0、0.54和0.29。

无细胞体系中基本序列(质粒)的摩尔比例的影响

实施例59

设计了9种无细胞体系，即第二基本序列与第一基本序列的摩尔比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8和1:9的无细胞体系，第一基本序列和第二基本序列的摩尔总数为10×10^-12mol。基于上述镁离子浓度优化的结果，在接下来的实验中将选用15mmol/L的镁离子浓度，总反应体系为20μL，添加完表6所有的组分后不足20μL的部分用无菌水补齐。反应条件为30℃，12h生化培养箱中反应。而后通过WesternBlot和ImageJ来进行分析对于不同的聚合体得到最大聚合蛋白的质粒摩尔比例，结果如图7，其各项参数见表11，其结果如图7。

实施例60-实施例62与实施例59的不同之处在于基本序列的组合方式，其各项参数见表11，其结果如图7。

表11

小结：由图7可知，不同的质粒摩尔比例揭示了不同的聚合结果，最终二聚体(SC-GFP-His+GFP-ST-His,H+I)的最佳聚合摩尔比为(3～8)：2，三聚体(SC-GFP-His+ST-GFP-ST-His,H+L)为(3～8)：2，三聚体(SC-GFP-SC-His+GFP-ST-His,K+I)为(4～9)：6，多聚体(SC-GFP-SC-His+ST-GFP-ST-His，(K+L)为(3～7)：3，最终得到的二聚体比例可达73％，三聚体可达53％或60％，多聚体可达36％。

尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种无细胞体系拓扑蛋白以及其结构单体的合成方法

<130> TPF02178

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 1

gcccacattg tgatggtgga tgcctataag ccaacaaaat aa 42

<210> 2

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 2

gtagacaccc tgagtggcct cagcagtgaa caaggccaaa gtggagatat gaccattgaa 60

gaagatagtg ccactcatat caaattctcc aaaagagatg aagatggcaa agaactggct 120

ggtgccacta tggaactgag agatagcagt ggcaaaacca tctcaacctg gattagtgat 180

ggccaagtga aggattttta tctataccct ggcaaatata cctttgtgga aactgcagcc 240

cctgatggct atgaagtagc cacagccatt actttcacag ttaatgaaca aggccaagtt 300

acagtcaatg gcaaagccac caaaggggat gctcatatt 339

<210> 3

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 3

agtaagggtg aagaactgtt tactggtgtg gtgccaattc tggtggaact ggatggtgat 60

gtgaatggcc ataaatttag tgtgagaggt gaaggtgaag gtgatgccac caatggcaaa 120

ctgaccctga aatttatttg caccactggc aaactgcctg tgccatggcc aaccctggtg 180

accaccctga cctatggtgt gcagtgcttt agcagatatc ctgatcacat gaaaagacat 240

gattttttta aaagtgccat gcctgaaggc tatgtgcaag aaagaaccat tagctttaaa 300

gatgatggca cctataaaac tagagcagaa gtgaaatttg aaggtgatac cctggtgaac 360

agaattgaac tgaaaggcat tgattttaaa gaagatggca acattctggg ccataaactg 420

gaatataact ttaacagcca taatgtgtat attactgcag ataaacagaa aaatggcatt 480

aaagccaact ttaaaattag acataatgtg gaagatggca gtgtgcagct ggcagatcat 540

tatcagcaga acaccccaat tggtgatggc cctgtgctgc tgcctgataa ccattatctg 600

agcactcaga gtgtgctgag caaagatcca aatgaaaaaa gagatcacat ggtgctgctg 660

gaatttgtga ctgcagctgg cattacccat ggcatggatg aactgtataa a 711

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 4

catcatcatc atcatcac 18

Claims (12)

1.一种无细胞体系拓扑蛋白结构单体的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成包含表达目标蛋白的基因序列、表达SpyTag的基因序列或表达SpyCatcher的基因序列的基本序列；

将所述基本序列加入到无细胞体系中以合成包括目标蛋白的结构单体。

2.一种无细胞体系拓扑蛋白的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成包含表达目标蛋白的基因序列和表达SpyTag的基因序列的第一基本序列；

合成包含表达目标蛋白的基因序列和表达SpyCatcher的基因序列的第二基本序列；

将所述第一基本序列和第二基本序列加入到无细胞体系中，以合成包括SpyTag和目标蛋白的第一结构单体，以及包括SpyCatcher和目标蛋白的第二结构单体；

所述第一结构单体和第二结构单体进一步聚合成具有拓扑结构的目标蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，无细胞体系中提纯所述第一结构单体以及第二结构单体后再合成具有拓扑结构的目标蛋白；或

所述第一结构单体以及第二结构单体在无细胞体系中原位直接合成具有拓扑结构的目标蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基本序列还包括表达标签序列的基因序列，所述标签序列为His-tag。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标签序列位于目标蛋白基因序列的C端或N端，优选为C端。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基本序列选自His-PS-SC、PS-SC-His、His-SC-PS、SC-PS-His、His-PS-ST、PS-ST-His、His-ST-PS、ST-PS-His、His-SC-PS-SC、SC-PS-SC-His、His-ST-PS-ST、ST-PS-ST-His中的一种或两种以上，

其中SpyTag简称ST，SpyCatcher简称SC，His-Tag简称His，目标蛋白基因序列简称PS。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述无细胞体系的制备方法包括下述步骤：将细胞破碎得到细胞提取物，然后加入RNA聚合酶和辅助因子得到无细胞体系。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辅助因子包括镁离子，所述无细胞体系中镁离子的浓度为5-35mM，优选为10-30mM。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶，优选为利用含有质粒pAR1219的\E.coli BL21所提取的T7 RNA聚合酶。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基本序列是以质粒或线性DNA形式存在的。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述拓扑结构的目标蛋白为二聚体、三聚体或多聚体。

12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二基本序列与所述第一基本序列的摩尔比为(1～81):9，优选为(9～21):9。

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