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CN115109726A - 一株解淀粉芽胞杆菌hz-12及其应用 - Google Patents

一株解淀粉芽胞杆菌hz-12及其应用 Download PDF

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CN115109726A
CN115109726A CN202210816394.2A CN202210816394A CN115109726A CN 115109726 A CN115109726 A CN 115109726A CN 202210816394 A CN202210816394 A CN 202210816394A CN 115109726 A CN115109726 A CN 115109726A
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魏雪团
张岱源
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Huazhong Agricultural University
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Huazhong Agricultural University
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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽胞杆菌HZ‑12及其应用，涉及微生物技术领域，针对目前苹果防霉物理方法由于价格昂贵不能普遍应用，化学方法中过度依赖传统杀菌剂导致化学物质残留、环境污染、病原菌对杀菌剂抗性增加等一系列问题，不利于人体健康与生态环境的问题，现提出如下方案，一株解淀粉芽胞杆菌HZ‑12，菌体短杆状，革兰氏染色阳性，芽胞近似圆形，偏端生。本发明首次获得可在与金黄色葡萄球菌共培养中抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌，该菌株既高效拮抗有害真菌(禾谷镰刀菌、黑曲霉、绳状篮状菌、木霉、产黄青霉、聚多曲霉)又可高效降解呕吐毒素，该菌株在苹果中抗霉防腐方面具有较高的应用价值。

Description

一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用。
背景技术
苹果为身体提供有益的维生素、矿物质、有机酸和抗氧化剂，并且已被证明具有许多与健康有关的功效，如抗癌、保护皮肤、延缓衰老等(参见文献：Choi Moon Hee,Jo HanGyo,Kim Min Ju,Kang Min Jung,Shin Hyun Jae.Fruit Juice Supplementation AltersHuman Skin Antioxidant Levels In Vivo:Case Study of Korean Adults byResonance Raman Spectroscopy[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2018,23(1))。但苹果在采后储运和出售过程中，常面临霉菌侵染的问题，从而引发霉变腐败和经济损失。除了经济方面的考虑外，由于霉菌会产生霉菌毒素，在人体积累后存在潜在的健康风险，因此寻找合适的方法抑制霉菌的生长显得尤为重要。
但是，目前苹果防霉常采用物理方法和化学方法。物理方法如臭氧法，由于价格昂贵不能普遍应用(参见文献：Wallace R L,Hirkala D L,Nelson L M.Postharvestbiological control of blue mold of apple by Pseudomonas fluorescens duringcommercial storage and potential modes of action[J].Postharvest Biology&Technology,2017,133:1-11.)。而化学方法中过度依赖传统杀菌剂导致化学物质残留、环境污染、病原菌对杀菌剂抗性增加等一系列问题，不利于人体健康与生态环境。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前苹果防霉物理方法由于价格昂贵不能普遍应用，化学方法中过度依赖传统杀菌剂导致化学物质残留、环境污染、病原菌对杀菌剂抗性增加等一系列问题，不利于人体健康与生态环境的缺点，而提出的一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12，菌体短杆状，革兰氏染色阳性，芽胞近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，表面粗糙，边缘不齐，菌苔表面无光泽，不透明，蔓延。最适生长温度30-37℃，适宜pH 6.8-7.2。
在一个优选的实施方式中，所述解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌株的16S rRNA基因序列有1449个碱基，该16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12与金黄色葡萄球菌共培养中抑制金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
将解淀粉芽胞杆菌HZ-12与金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，分别得到解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌液与金黄色葡萄球菌菌液。将750μL解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌液与1.5mL金黄色葡萄球菌菌液共同加入LB液体培养基中，以只加入1.5mL金黄色葡萄球菌的LB液体培养基作为对照，在不同的时间点分别取样，进行稀释图平板计数。
一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用，所述解淀粉芽胞杆菌HZ-12在拮抗有害真菌(禾谷镰刀菌、黑曲霉、绳状篮状菌、木霉、产黄青霉、聚多曲霉)又可高效降解呕吐毒素的方法，包括以下步骤：霉菌孢子悬浮液制备：从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的105CFU/mL的孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩；
牛津杯抑菌实验：解淀粉芽胞杆菌HZ-12单菌落接入LB种子液培养基中，37℃、180rpm培养12h左右，菌液浓度达到108CFU/mL。将10mL沙氏与100μL霉菌孢子悬浮液(105CFU/mL)混合加入直径为9mm的一次性培养皿作为第一层，随后用灭菌后的镊子夹取无菌牛津杯放置该层，待再次倒入的沙氏凝固后移出牛津杯。将108CFU/mL的100μL解淀粉芽胞杆菌菌液加入每个琼脂孔中。于28℃，培养5d后观察抑菌圈大小；
呕吐毒素降解实验：将解淀粉芽胞杆菌HZ-12接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽胞杆菌菌液。称取8g麸皮和12g水，121℃灭菌后加入1.5mL芽胞杆菌菌液，以加入1.5mL的无菌蒸馏水作为空白对照，于37℃培养48h。测定芽胞杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用上海臻科生物科技有限公司的呕吐毒素检测试剂盒完成。呕吐毒素降解率根据如下公式计算获得：呕吐毒素降解率＝100％×(空白-样品)/空白。
一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用，所述解淀粉芽胞杆菌HZ-12在苹果中抗霉防腐的方法，包括以下步骤：
a、HZ-12菌株接在LB培养基固体斜面上37℃培养；刮取菌苔于LB液体培养基中37℃、180rpm、12h培养；吸取一定体积的菌液至甘油保藏管保存于-80℃超低温冰箱中；
b、制备种子液：
(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养24-36h，使其活化；
(2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养14-16h至生长中期，得最适浓度在108CFU/mL；
c、霉菌孢子悬液制备：
从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无菌蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的105CFU/mL的孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩；
d、苹果中抗霉防腐应用：
苹果经过蒸馏水清洗后使用浓度为0.1％的次氯酸钠浸润1min进行苹果消毒，消毒后用蒸馏水冲洗避免次氯酸钠残余，晾干，并将苹果随机分组。在大小、外观一致的苹果表面赤道处用无菌打孔器打孔使伤口均匀(直径约5mm、深度约17mm)，在伤口部位注入30μL不同浓度的B.amyloliquefaciens HZ-12菌悬液(106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL)，对照组注入30μL无菌蒸馏水，2h后，同样的位置逐一注入2×104CFU/mL黑曲霉孢子悬浮液，在28℃下放置5d后，霉菌侵染面积扩大，即可观察到拮抗效果。
本发明的有益效果如下：
首次获得可在与金黄色葡萄球菌共培养中抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌，该菌株既高效拮抗有害真菌(禾谷镰刀菌、黑曲霉、绳状篮状菌、木霉、产黄青霉、聚多曲霉)又可高效降解呕吐毒素，该菌株在苹果中抗霉防腐方面具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明菌株菌落形态图；
图2为本发明菌株显微形态图；
图3为本发明基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树；
图4为本发明菌株与金黄色葡萄球菌共培养中抑制金黄色葡萄球菌平板结果图；
图5为本发明菌株与金黄色葡萄球菌共培养中抑制金黄色葡萄球菌计数结果图；
图6为本发明菌株抗真菌结果图；
图7为本发明菌株在苹果中抗霉防腐效果图；
图8为本发明菌株在苹果中对黑曲霉的抑制率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：解淀粉芽胞杆菌HZ-12在与金黄色葡萄球菌共培养中对金黄色葡萄球菌的抑制作用分析
将解淀粉芽胞杆菌HZ-12与金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，分别得到解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌液与金黄色葡萄球菌菌液。将750μL解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌液与1.5mL金黄色葡萄球菌菌液共同加入LB液体培养基中作为共培养组，以只加入1.5mL金黄色葡萄球菌的LB液体培养基作为对照组，在0h、4h、6h对共培养和单独培养液体培养基取样，进行稀释涂平板计数，平板结果如图4，计数结果如图5。与单独培养的金黄色葡萄球菌的对照组相比，对照组中金黄色葡萄球菌生物量随时间增加而增加，而共培养中的金黄色葡萄球菌随时间的增加呈下降趋势。在6h时共培养中的金黄色葡萄球菌的数量下降至0×108CFU/mL，而同一稀释度下的单独培养的金黄色葡萄球菌的数量有11×108CFU/mL。说明解淀粉芽胞杆菌HZ-12在与金黄色葡萄球菌共培养中对金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果。
实施例2：解淀粉芽胞杆菌HZ-12抗真菌活性分析
霉菌孢子悬浮液制备：从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的105CFU/mL的孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩。
牛津杯抑菌实验：解淀粉芽胞杆菌HZ-12单菌落接入LB种子液培养基中，37℃、180rpm培养12h左右，菌液浓度达到108CFU/mL。将10mL沙氏与100μL霉菌孢子悬浮液(105CFU/mL)混合加入直径为9mm的一次性培养皿作为第一层，随后用灭菌后的镊子夹取无菌牛津杯放置该层，待再次倒入的沙氏凝固后移出牛津杯。将108CFU/mL的100μL解淀粉芽胞杆菌菌液加入每个琼脂孔中。于28℃，培养5d后观察抑菌圈大小。
以实验室前期保藏的具有抗菌活性的解淀粉芽胞杆菌为对照菌，抑菌圈大小如表1和附图6所示。与对照菌相比，解淀粉芽胞杆菌HZ-12对禾谷镰刀菌、黑曲霉、绳状篮状菌、木霉、产黄青霉、聚多曲霉的抑制活性均显著提高。
表1 菌株HZ-12对不同霉菌的抑菌圈大小
Figure BDA0003740850450000081
实施例3：解淀粉芽胞杆菌HZ-12降解呕吐毒素能力分析
将解淀粉芽胞杆菌HZ-12接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽胞杆菌菌液。称取8g麸皮和12g水，121℃灭菌后加入1.5mL芽胞杆菌菌液，以加入1.5mL的无菌蒸馏水作为空白对照，于37℃培养48h。测定芽胞杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用上海臻科生物科技有限公司的呕吐毒素检测试剂盒完成。呕吐毒素降解率根据如下公式计算获得：呕吐毒素降解率＝100％×(空白-样品)/空白。结果显示，解淀粉芽胞杆菌HZ-12对麸皮中呕吐毒素的降解率达到89％，说明解淀粉芽胞杆菌HZ-12具有高效的降解呕吐毒素的能力。
实施例4：芽胞杆菌在苹果中的抗霉防腐应用
a、用冷冻保藏的解淀粉芽胞杆菌HZ-12；
b、菌种活化
将冷冻保藏的菌种，接种到LB固体培养基(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L、pH 7.0)，刮取菌苔接在LB液体培养基中37℃、180rpm、12h培养；吸取一定体积的菌液保存至甘油保藏管中，最终管内甘油体积为20％；-80℃冷冻保藏；
c、种子液培养
将上述冷冻保藏的菌种转接到LB固体培养基平板上，37℃培养24-36h，使其活化；将活化的种子转接到三角瓶液体种子培养基中(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L、pH 7.0)，37℃，180rpm培养14-16h至对数生长中期，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽胞杆菌菌液；
d、苹果中抗霉防腐实验
苹果经过蒸馏水清洗后使用浓度为0.1％的次氯酸钠浸润1min进行苹果消毒，消毒后用蒸馏水冲洗避免次氯酸钠残余，晾干，并将苹果随机分组。在大小、外观一致的苹果表面赤道处用无菌打孔器打孔使伤口均匀(直径约5mm、深度约17mm)，在伤口部位注入30μL不同浓度的B.amyloliquefaciens HZ-12菌悬液(106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL)，对照组注入30μL无菌蒸馏水，2h后，同样的位置逐一注入2×104CFU/mL黑曲霉孢子悬浮液，在28℃下放置5d后，霉菌侵染面积扩大。不同浓度的B.amyloliquefaciensHZ-12对苹果黑曲霉的拮抗效果如图7所示，随着B.amyloliquefaciens HZ-12浓度的升高，对苹果黑曲霉的拮抗能力越强。如图8，106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL的B.amyloliquefaciens HZ-12对黑曲霉的抑制率分别为对照组的22％、28％、69％、89％。其中109CFU/mL的B.amyloliquefaciens HZ-12接种在苹果上快速覆盖于苹果的伤口部位，表现出了最强的拮抗功能。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (5)

1.一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12，其特征在于：菌体短杆状，革兰氏染色阳性，芽胞近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，表面粗糙，边缘不齐，菌苔表面无光泽，不透明，蔓延。最适生长温度30-37℃，适宜pH 6.8-7.2。
2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用，其特征在于：所述解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌株的16S rRNA基因序列有1449个碱基，该16S rRNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12与金黄色葡萄球菌共培养中抑制金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将解淀粉芽胞杆菌HZ-12与金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，分别得到解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌液与金黄色葡萄球菌菌液。将750μL解淀粉芽胞杆菌HZ-12菌液与1.5mL金黄色葡萄球菌菌液共同加入LB液体培养基中，以只加入1.5mL金黄色葡萄球菌的LB液体培养基作为对照，在不同的时间点分别取样，进行稀释图平板计数。
4.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用，其特征在于：所述解淀粉芽胞杆菌HZ-12在拮抗有害真菌(禾谷镰刀菌、黑曲霉、绳状篮状菌、木霉、产黄青霉、聚多曲霉)又可高效降解呕吐毒素的方法，包括以下步骤：
霉菌孢子悬浮液制备：从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的105CFU/mL的孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩；
牛津杯抑菌实验：解淀粉芽胞杆菌HZ-12单菌落接入LB种子液培养基中，37℃、180rpm培养12h左右，菌液浓度达到108CFU/mL。将10mL沙氏与100μL霉菌孢子悬浮液(105CFU/mL)混合加入直径为9mm的一次性培养皿作为第一层，随后用灭菌后的镊子夹取无菌牛津杯放置该层，待再次倒入的沙氏凝固后移出牛津杯。将108CFU/mL的100μL解淀粉芽胞杆菌菌液加入每个琼脂孔中，于28℃，培养5d后观察抑菌圈大小；
呕吐毒素降解实验：将解淀粉芽胞杆菌HZ-12接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽胞杆菌菌液。称取8g麸皮和12g水，121℃灭菌后加入1.5mL芽胞杆菌菌液，以加入1.5mL的无菌蒸馏水作为空白对照，于37℃培养48h。测定芽胞杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用上海臻科生物科技有限公司的呕吐毒素检测试剂盒完成。呕吐毒素降解率根据如下公式计算获得：呕吐毒素降解率＝100％×(空白-样品)/空白。
5.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽胞杆菌HZ-12及其应用，其特征在于：所述解淀粉芽胞杆菌HZ-12在苹果中抗霉防腐的方法，包括以下步骤：
a、HZ-12菌株接在LB培养基固体斜面上37℃培养；刮取菌苔于LB液体培养基中37℃、180rpm、12h培养；吸取一定体积的菌液至甘油保藏管保存于-80℃超低温冰箱中；
b、制备种子液：
(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养24-36h，使其活化；
(2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养14-16h至生长中期，得最适浓度在108CFU/mL；
c、霉菌孢子悬液制备：
从4℃冰箱保藏的霉菌沙氏斜面上挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无菌蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的105CFU/mL的孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩；
d、苹果中抗霉防腐应用：
苹果经过蒸馏水清洗后使用浓度为0.1％的次氯酸钠浸润1min进行苹果消毒，消毒后用蒸馏水冲洗避免次氯酸钠残余，晾干，并将苹果随机分组。在大小、外观一致的苹果表面赤道处用无菌打孔器打孔使伤口均匀(直径约5mm、深度约17mm)，在伤口部位注入30μL不同浓度的B.amyloliquefaciens HZ-12菌悬液(106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL)，对照组注入30μL无菌蒸馏水，2h后，同样的位置逐一注入2×104CFU/mL黑曲霉孢子悬浮液，在28℃下放置5d后，霉菌侵染面积扩大，即可观察到拮抗效果。
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