CN115066499A - 用于基因转移载体的高效产生的培养系统 - Google Patents

Abstract

已被设计作为复制缺陷构建体的基因转移载体的产生可能是无效的，因此限制了它们在药物中的广泛用途。本发明提供针对该问题的解决方案。它描述如何可以增强通过DNA和RNA到产生细胞内的转移产生的基因转移载体的产生效率。本发明在于利用细胞周期控制优化基因转移载体的产生。本专利的主题是细胞生长和生理机能的修饰以增强载体产生的效率。给出了某些介质组分对细胞周期以及完全缺失的辅助病毒非依赖型腺病毒载体的产生率的影响的实例。列出了该技术的其它应用。

Description

用于基因转移载体的高效产生的培养系统

交叉引用

本申请是要求2019年12月30日提交的美国临时申请序列号62/955,002的优先权权益的国际申请，该美国临时申请的公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于基因转移载体的衣壳化和/或产生的组织培养系统，并且涉及它们用于转染核酸到细胞、组织和器官内的用途，尤其是用于在基因药物中的应用。

背景技术

基因疗法的目标是通过引入或修复导致疾病的基因缺陷来治愈疾病。它的主要候选者是其疾病是通过给定基因的缺失或功能失调版本所导致的患者。随着人类基因组以其整体被测序，更多的疾病已经变得容易使用基因疗法。实际上，基因疗法已经发展到临床试验阶段，它的成功曾被所使用的基因疗法载体的底层生物学所阻碍。

基因疗法可使用不同策略以递送或校正基因异常。必需的基因可在体外递送到干细胞、细胞、组织和器官，在其上修饰的材料被引入到体内。可选地，基因材料在体内被直接输送到细胞。在另外的应用中，核酸在体外被转染到细胞主要用于蛋白质或其它生物产物的产生。

不同技术已经被开发以引入基因材料到不同细胞和细胞群内。这些技术可以是包括结合DEAE-葡聚糖的DNA或RNA的不同制剂，也可以是具有核蛋白、具有脂质、具有聚赖氨酸、具有聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的组合物。此外，包装有脂质体或类似物的DNA用于递送。可选地，已经研究了被工程化作为基因转染的载体以及疫苗接种的载体的病毒。它们包括修饰的逆转录病毒(劳斯氏肉瘤病毒-RSV、莫洛尼氏白血病病毒-MLV、HIV-衍生的-慢病毒等等)、单纯性疱疹病毒-HSV、腺相关病毒-AAV、腺病毒-Ad、黄热病病毒-YF病毒、牛痘病毒和其它。

基因疗法载体，诸如那些基于逆转录病毒、AAV、YF病毒和完全缺失的Ad，通过将DNA或RNA构建体转移到真核细胞(诸如人胚肾细胞-HEK和HeLa细胞)内产生，在所述细胞内相应的载体被组装。DNA和RNA的聚阴离子性质严重限制它们进入到产生细胞内以及它们转变到这些细胞的核内。载体产生的效率取决于DNA的摄取率、细胞摄取后DNA的命运以及产生细胞的状态。用裸核酸的细胞转染是无效的，但是可通过转染介质(诸如天然脂质以及某些阳离子聚合物的制剂)的使用来增强。产生细胞必须处于一种以便它们可使用外源DNA以产生相应的基因疗法载体的状态。外源DNA不能通过细胞的DNAse活性被完全破坏，并且它必须转变到细胞区室(诸如细胞核)内，以使得能够载体产生。

基因转移载体被以显著的数量递送到受试者。为了促进它们在人类疗法中的用途，因此必需开发高效递送基因疗法载体的产生系统。

附图说明

图1是阐明完全缺失的辅助病毒非依赖型腺病毒的衣壳化的示例性系统的图。

图2描绘抗坏血酸的分子结构。

图3A和3B阐明抗坏血酸对真核细胞内DNA的存在的影响。具体地，图3A反映不添加抗坏血酸，并且图3B反映添加抗坏血酸。如在实施例1中所进一步描述的，在不存在抗坏血酸的情况下培养的HEK293-型细胞显示了低水平的DNA含量，指示很少细胞在细胞周期的S和G2期内。相反，在存在抗坏血酸的情况下培养的HEK293-型细胞显示了提高水平的DNA。因此，更大百分比的细胞已经进入细胞周期的S和G2期。

图4A以及4B阐明抗坏血酸对完全缺失的辅助病毒非依赖型腺病毒载体的产生的影响。具体地，图4A反映不添加抗坏血酸，并且图4B反映添加抗坏血酸。如在实施例2中所进一步描述的，当使用从在不存在抗坏血酸的情况下生长的细胞中收获的包含腺病毒载体的上清感染HEK293-型细胞时，看到很少GFP-表达细胞。在用在存在抗坏血酸的情况下产生的包含腺病毒的上清感染之后，检测到显著更大数量的感染的细胞。

具体实施方式

本发明在于细胞周期控制在优化基因转移载体的产生中的用途。该策略通过但不限于使用抗坏血酸以及理解为包括如式(I)或式(II)的抗坏血酸的其衍生物来举例说明。可用于该目的的其它试剂是但不限于脱氢抗坏血酸、羟基脲(hyrdoxturea)、蚜肠毒素、PD0332991 HCl、Dinaciclib、AT7519、BS-181HCl、AZD7762、PF 477736、LY2603618、CHIR-124和MK-8776。

在本申请中使用的抗坏血酸以及其它组分可以是通过天然组分化学合成的或纯化的。为了优化载体产生的效率，将在本申请中描述的组合物添加到组织培养介质，在其中培养真核包装细胞。本领域技术人员根据用于该目的的组合物可调整培养介质中的组合物的浓度。

如在本申请中所理解的载体产生是携带感兴趣的基因材料的基因转移载体的完全组装。如在本申请中所理解的，转染需要编码在讨论中的载体的产生所涉及的基因的多核苷酸到真核细胞内的转染。如在本申请中所理解的，组织培养介质由水基组成，向其中添加对于真核细胞的增殖必需的组分。如在本申请中所理解的，载体产生由完全组装的基因转移载体组成，所述基因转移载体由蛋白衣壳或包膜以及携带在内的一条或多条多核苷酸链组成。

在本发明的实施方式中，基因转移载体源自修饰的逆转录病毒，诸如劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、莫洛尼氏白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯性疱疹病毒(HSV)、腺相关病毒(AAV)、腺病毒(Ad)、黄热病病毒(YF病毒)、牛痘病毒(VV)、猴空泡病毒(SV)以及其它适合基因转移的天然或合成病毒。它们也可以是昆虫、蜘蛛或其它非脊椎动物病毒，诸如但不限于杆状病毒、或植物病毒诸如但不限于烟草花叶病毒。它们可以用于在体外或体内转移基因信息到人、动物或植物来源的真核细胞内。它们可用于基因缺陷的治疗、细胞功能的增强、细胞分化的诱导、细胞的死亡、细胞功能的诱导、免疫应答的诱导等等。

在本发明的实施方式中，一种或多种多核苷酸用于在它们已被转染到其中的细胞内指导某些基因的表达。在本发明的另一实施方式中，一种或多种多核苷酸可编码指导基因转移载体的组装以及提供基因信息两者的基因信息，诸如某个转基因或某些转基因，其被用于产生某些分子，诸如但不限于具有某些功能的蛋白质产物或RNA分子。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸可以是天然或人工来源的DNA或RNA二者之一，诸如双或单链DNA或RNA、DNA/RNA杂交序列、合成或半合成序列。核酸的范围可以从寡核苷酸到染色体。它们可以是单链或一些不同的链。它们可以是人、动物、植物、细菌、病毒等等来源。它们可通过本领域技术人员已知的任何技术获得，并且尤其是通过文库的筛选、通过化学合成或可选地通过混合方法包括通过文库的筛选获得的序列的化学或酶修饰。此外，它们可并入到载体内，诸如质粒或其它载体。它们可以是单-或双-链。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸可以携带在如上清单所发现的基因转移载体内。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸也可携带转基因，诸如但不限于治疗基因、调节转录或复制的序列、反义序列、用于结合其它细胞组分的区等等。治疗基因被理解尤其是意指任何编码具有治疗效果的蛋白质产物的基因。这样编码的蛋白质产物可以是蛋白质、肽等等。该蛋白质产物相对于靶细胞可以是同源的(也就是说，当靶细胞不患有任何病理时通常表达在靶细胞内的产物)。在这种情况下，蛋白质的表达使其例如，补救在细胞内的不足表达或由于修饰是无活性的或微弱活性的蛋白质的表达，或可选地过表达所述蛋白质成为可能。治疗基因也可编码具有增强的稳定性、修饰的活性等等的细胞蛋白质的突变体。蛋白质产物相对于靶细胞也可以是异源的。在这种情况下，表达的蛋白质可例如补充或提供在细胞内缺乏的活性，使其能够对抗病理或刺激免疫应答。治疗基因也可编码分泌到体内的蛋白质。在用于本发明的目的的治疗产物中，可更特别地提及酶；血衍生物；激素；淋巴因子，即白介素、干扰素、TNF等等(FR 92/03120)；生长因子；神经递质或它们的前体或合成酶；营养因子，即BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效营养因子等等；载脂蛋白，即ApoAI、ApoAIV、ApoE等等(FR 93/05125)；肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白(FR 91/11947)；与囊胞性纤维症相关的CFTR蛋白质；肿瘤-抑制基因，即p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等等(FR93/04745)；编码在凝血中涉及的因子的基因，即因子VII、VIII、IX；参与DNA修复的基因；自杀基因(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶)等等。

在本发明的实施方式中，转基因也可以是反义基因、基因、一种序列或多种序列，其在靶细胞内的表达进行(enable)或抑制要控制的基因的表达或细胞mRNA的转录。这样的序列可以例如是在靶细胞中转录为与细胞mRNA互补的RNA并且可因此阻断它们翻译为蛋白质。

在本发明的实施方式中，转基因可以是参与调节在细胞中天然发现的或通过基因手段递送到细胞的其它蛋白质或RNA分子的表达和功能的蛋白质或RNA分子。转基因可编码分子，诸如但不限于具有抗体或抗体-样结合性质的蛋白质、具有蛋白质或其它分子的酶功能的蛋白质、具有与蛋白质和其它分子的结合能力的RNA分子以及具有蛋白质或其它分子的酶功能的RNA分子。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸也可包含一种或多种编码能够在人或动物内产生免疫应答的抗原肽的基因。在该特定的实施方式中，本发明因此使应用于人或动物的尤其是针对微生物、病毒或癌症的疫苗或免疫疗法治疗之一的产生成为可能。这样的肽尤其是包括对Epstein Barr病毒、HIV病毒、乙型肝炎、流感病毒、埃博拉病毒、登革病毒以及其它医学上显著的病毒特异的抗原蛋白，以及源自感染的细菌(诸如炭疽杆菌、结核杆菌以及其它医学上显著的细菌)以及其它感染的疾病(诸如但不限于疟疾)的蛋白质和其它抗原，以及可提高针对有益的免疫应答的与肿瘤相关的蛋白质抗原。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸可包括允许治疗或抗原基因的表达的序列。这些序列可以是天然负责在讨论中的基因的表达的那些或可以具有不同来源。具体的，它们可以是真核细胞或病毒基因的启动子序列。在这一点上，E1A、MLP、CMV、RSV等等的启动子，例如可描述为基因。此外，这些表达序列可通过添加激活或调节序列或允许组织-特异的表达或增强的表达的序列来修饰。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸可携带核酸序列，其也可包含，特别是在治疗基因的上游，引导合成到靶细胞的分泌途径内的治疗产物的信号序列。该信号序列可以是治疗产物的天然信号序列，但是它也可以是任何其它功能信号序列或人工信号序列。此外，核酸也可另外包含，特别是在治疗基因的上游，引导趋向优选的细胞区室合成的治疗产物的序列，诸如核定位序列。

在本发明的实施方式中，用于基因转移载体的产生的真核细胞是人细胞系，诸如但不限于HEK 293细胞、HeLa细胞、A549等等、或从不同组织收获的原代人细胞。这些细胞可以是源自动物来源，诸如但不限于中国仓鼠卵巢细胞、Vero细胞等等。它们可以源自昆虫、蜘蛛或非脊椎动物，诸如但不限于sf9细胞等等。它们可以源自植物。

在本发明的实施方式中，核酸的转染通过添加单个或一些多核苷酸到真核细胞的培养物实现，目标是多核苷酸进入这些细胞。转染率可通过在添加真核细胞的培养物时添加某些化合物到多核苷酸来增强。此外，这些组合物包括能够组合聚合物/核酸复合物以及改善转染能力的佐剂，诸如能够组合聚合物/核酸复合物的某些佐剂(例如脂质、蛋白质、脂多胺、合成聚合物)。这些佐剂可以是但不限于是CaCl2、Lipofectamine，RocheX-tremeGENE，JetPEI等等。

在本发明的实施方式中，这些多核苷酸以在组合物中为线性或环形的DNA分子的一条或多条链提供。它们可以是单或双链DNA分子。它们可以是在组合物中为线性或环形的RNA分子的一条或多条链。它们可以是单或双链RNA分子。它们可作为不同组合物的DNA和/或RNA分子(单或双链、线性或环形分子)的组合递送。它们可以是包括不同组合物的DNA和RNA分子(单或双链、线性或环形分子)的杂交分子。它们可以从天然来源(诸如但不限于细菌、动物细胞、动物组织、病毒、植物细胞、植物组织等等)收获。它们可以通过本领域已知的技术合成。

在本发明的实施方式中，用于基因转移载体的产生的真核细胞的生长行为通过接种不同细胞数量、通过培养时间的长度、通过培养介质、通过培养温度、通过培养容器以及通过其它在细胞培养过程中的可能的变量来控制。

在本发明的实施方式中，用于基因转移载体的产生的真核细胞的细胞行为通过添加不同化合物(诸如但不限于抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、羟基脲(hyrdoxturea)、蚜肠毒素、PD 0332991 HCl、Dinaciclib、AT7519、BS-181HCl、AZD7762、PF 477736、LY2603618、CHIR-124、MK-8776等等)来改进。细胞行为可通过在用于基因转移载体的产生的真核细胞的培养期间添加这样的化合物的时间来改进。这样的化合物的添加可发生在用于基因转移载体的产生的真核细胞的转染之前、期间或之后，所述基因转移载体具有携带指导基因转移载体的产生的基因的核酸。用于基因转移载体的产生的真核细胞可暴露于这样的化合物一段有限的时间段，随后去除这样的化合物，或在它们的培养期间的延长的时间段。它们可暴露于单一这样的化合物多于一个培养期。它们可在相同的时间或在不同时间暴露于添加到培养物的多于一种这样的化合物。

在本发明的实施方式中，用于某些分子(诸如蛋白质或RNA)的产生的真核细胞的细胞行为通过添加不同化合物(诸如但不限于抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、羟基脲(hyrdoxturea)、蚜肠毒素、PD 0332991 HCl、Dinaciclib、AT7519、BS-181HCl、AZD7762、PF477736、LY2603618、CHIR-124、MK-8776等等)来改进。细胞行为可通过在用于基因转移载体的产生的真核细胞的培养期间添加这样的化合物的时间来改进。这样的化合物的添加可发生在用于基因转移载体的产生的真核细胞的转染之前、期间或之后，所述基因转移载体具有携带指导基因转移载体的产生的基因的核酸。这些真核细胞可暴露于这样的化合物一段有限的时间段，随后去除这样的化合物，或在它们的培养期间的延长的时间段。它们可暴露于单一这样的化合物多于一个培养期。它们可在相同的时间或在不同时间暴露于添加到培养物的多于一种这样的化合物。

在本发明的实施方式中，产生的基因转移载体通过用于基因转移载体的产生的真核细胞释放到培养介质内。它们可在用于基因转移载体的产生的真核细胞内发现以及可通过不同形式的细胞裂解(诸如但不限于低孵育温度、去污剂的添加)从这些细胞释放。它们可在用于基因转移载体的产生的真核细胞的培养介质中和在用于基因转移载体的产生的真核细胞内发现。它们可在它们被用于它们的预期应用之前必须经历富集和/或纯化过程。

实施例

本发明将通过以下被认为是说明性的和非限制性的实施例更完整地进行描述。

在本实施例内，抗坏血酸组合物的用途通过它用于DNA病毒(诸如但不限于完全缺失的辅助病毒非依赖型腺病毒载体)的产生的用途进行例证。载体产生系统包括三种组分(如在图1中所例证的):(i)GreVac模块被包装到载体中。它携带用于转基因(诸如两侧带有ITR以及ψ序列的绿色荧光蛋白(巨细胞病毒极早期启动子/增强子/转基因/人生长激素聚-腺苷酰化序列))的表达盒，并且称为fdhiAdGFP。人5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶基因的非-编码内部片段作为填充用于缺失的Ad基因组的"填充物"使用。(ii)pPAC5包装质粒提供Ad晚期基因(L1、L2、L3、L4、L5)，以及用于GreVac载体模块的复制和包装的E2和E4基因。(iii)HEK293-型宿主细胞基于HEK293人细胞。它们携带Ad E1A和pIX的基因。

实施例1-通过抗坏血酸到培养的细胞培养物的添加来增加细胞DNA。

HEK293-型细胞取自工作细胞库并且以合适的组织培养介质培养在合适的组织培养容器中，合适的组织培养介质和合适的组织培养容器两者为本领域技术人员已知。它们在合适的条件诸如37℃、5％CO₂扩增。每天监测细胞生长和密度。达到细胞汇合之后一天，通过本领域技术人员已知的方法收获细胞。收获的HEK293-型细胞在组织培养介质中稀释并且重接种在合适的组织培养容器以及合适的组织培养介质中。抗坏血酸以5μg/ml的终浓度添加到一组HEK293-型细胞。培养24小时后，收获细胞并染色用于根据厂商方案通过Vybrant(Invitrogen)测定DNA含量。在荧光激活细胞分析仪(Beckman-Coulter CytomicsFC500)上通过荧光分析细胞。如图3A和3B内所例证的，在不存在抗坏血酸的情况下培养的HEK293-型细胞显示了低水平的DNA含量，这指示很少细胞在细胞周期的S和G2期内。相反，在存在抗坏血酸的情况下培养的HEK293-型细胞显示了提高水平的DNA。因此，更大比例的细胞已经进入细胞周期的S和G2期。

实施例2-携带作为转基因的绿色荧光蛋白的基因的完全缺失的辅助病毒非依赖 型腺病毒载体的产生。

HEK293-型细胞取自工作细胞库并且以合适的组织培养介质培养在合适的组织培养容器中，合适的组织培养介质和合适的组织培养容器两者为本领域技术人员已知。它们在37℃，5％CO₂扩增。每天通过光学显微镜监测细胞生长和密度。达到细胞汇合之后一天，通过本领域技术人员已知的方法收获细胞。收获的HEK293-型细胞在组织培养介质中稀释并且重接种在合适的组织培养容器以及合适的组织培养介质中。抗坏血酸以5μg/ml的终浓度添加到一组HEK293-型细胞。根据厂商方案，用fdhiAd GFP载体模块的线性DNA以及pPAC5包装质粒的DNA连同转染介质诸如JetPEI(PolyPlus)转染HEK293-型细胞。转染的细胞在合适的条件诸如37℃、5％CO₂培养合适的时间诸如5天。然后收获细胞。在改良的PBS介质内离心细胞并重悬。衣壳化的腺病毒载体从细胞释放。在负80℃冷冻细胞，然后在室温解冻。重复该循环。通过离心去除细胞碎片并且收集包含释放的腺病毒载体的上清液。

为了测量衣壳化的效率，用限定体积的包含腺病毒载体的上清液感染在培养中的HEK293-型细胞。转导的细胞在37℃、5％CO₂孵育2天。然后收获细胞并在荧光激活细胞分析仪(Beckman-Coulter Cytomics FC500)上检测绿色荧光的程度，作为从产生细胞释放的感染的腺病毒颗粒的数量的指示。

如在图4A和4B中所例证的，当使用从在不存在抗坏血酸的情况下生长的细胞收获的包含腺病毒载体的上清液感染HEK293-型细胞时，看到很少GFP-表达细胞。在用在存在抗坏血酸的情况下产生的包含腺病毒的上清液感染之后，检测到显著的更大数量的感染的细胞。

这些研究指示了通过添加抗坏血酸介导的细胞行为的变化提高了基因转移载体(诸如，通过转染指导载体组装以及携带转基因的多核苷酸产生的完全缺失的辅助病毒非依赖型腺病毒载体)的衣壳化率。

定义

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可以在Benjamin Lewin，Genes V，牛津大学出版社出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编辑)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，Blackwell出版公司出版，1994(ISBN 0-632-02182-0)；以及Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，VCH出版商公司出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。化学术语的定义可在McGraw-Hill，Dictionary of Chemistry，2003(ISBN 0-07-141046-5)中找到。

如本文所用，术语“聚合物”是指由通过聚合过程产生的重复结构单元组成的一种化学化合物或化合物的混合物。

如本文所用，术语“合成”是指在其中化学反应被有目的地执行以获得一种产物或几种产物的化学合成。

如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”以及"多核苷酸"包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两者以及，除非另外指明，包括双-链和单-链核酸两者。还包括的是包含DNA和RNA两者的分子，或DNA/RNA异源双链核酸分子(heteroduplex)(也称为DNA/RNA杂交体)或在相同的链中包含DNA和RNA两者的嵌合分子。本发明的核酸分子可包含修饰的碱基(basis)。本发明以“有义”取向(即以与基因的编码链相同的取向)以及以“反义”取向(即以与基因的编码链互补的取向)两者提供核酸分子。

如本文所用，DNA可通过被称为“转染”或“转化”的过程引入细胞内。转染是指通过化学、机械或物理手段引入基因材料穿过真核细胞的膜。转化是指通过化学、机械或物理手段引入基因材料到非真核细胞(诸如细菌)内。

如本文所用，术语“细胞”是指源自真核生物的细胞，所述真核生物是其细胞包含封闭在膜以及核和其它细胞器内的复合结构的有机体，并且其正式称为毒素真核生物。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”是指任何氨基酸链而不管长度或后-翻译修饰(例如，糖基化或磷酸化)，诸如不修饰的蛋白质或片段或蛋白质的部分。

如本文所用，术语“抗原”是指任何可在动物或人内刺激抗体的产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。“表位”是指抗体以及T细胞应答所针对的抗原上的位点。

如本文所用，术语“启动子”意指DNA的调节区，其通常包括能够引导DNA聚合物酶II以在特定编码序列的合适的转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外包括但不限于影响转录起始率的被称为上游启动子元件的其它识别序列。术语“组成型启动子”是指允许其相关的基因的转录的启动子。

如本文所用，术语“基因”是指直接或间接编码具有限定的生物活性的核酸或蛋白质产物的DNA序列。

如本文所用，术语"转基因"是指携带在转染入细胞的多核苷酸上的基因序列。

应当理解，若干其它特征和功能或其替代物可被期望地组合到许多其它系统或应用中。各种目前未预见的或未预料到的其中的各种替代、修饰、变化或改进可之后由本领域技术人员做出，其也旨在包含在本发明内。

Claims (15)

1.一种用于基因转移载体的增强的产生的方法，所述方法包括:(a)提供载体产生细胞；(b)转染一种或多种编码载体基因组和载体产生信息的基因构建体到产生细胞内；以及(c)能够诱导载体产生细胞的细胞周期的停滞的剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中基因转移载体基于DNA病毒。

3.根据权利要求1所述的方法，其中基因转移载体基于RNA病毒。

4.根据权利要求1所述的方法，其中载体产生细胞是动物细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中载体产生细胞是人细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中载体产生细胞是昆虫细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中载体产生细胞是真菌细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中诱导载体产生细胞的细胞周期的停滞的剂选自由脱氢抗坏血酸、羟基脲、蚜肠毒素、PD 0332991HCl、Dinaciclib、AT7519、BS-181HCl、AZD7762、PF477736、LY2603618、CHIR-124和MK-8776组成的组。

9.根据权利要求1所述的方法，其中被添加以诱导载体产生细胞的细胞周期停滞的剂的添加是定时的。

10.一种用于腺病毒基因转移载体的增强的产生的方法，所述方法包括：(a)提供人载体产生细胞；(b)转染修饰的腺病毒基因组到产生细胞内；以及(c)脱氢抗坏血酸作为能够诱导载体产生细胞的细胞周期的停滞的剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中载体产生细胞是HEK293衍生的细胞。

12.根据权利要求10所述的方法，其中载体产生细胞是携带腺病毒E1区的基因的细胞。

13.根据权利要求10所述的方法，其中腺病毒基因转移载体是部分缺失的腺病毒载体。

14.根据权利要求10所述的方法，其中修饰的腺病毒基因组缺失所有腺病毒基因。

15.根据权利要求10所述的方法，其中修饰的腺病毒基因组包括缺失所有腺病毒基因的腺病毒基因组的构建体和提供腺病毒基因组的包装信息的第二构建体。

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