CN115058375A - 一种产甲基丙二酸单酰辅酶a的基因工程菌及其制备方法与应用 - Google Patents
一种产甲基丙二酸单酰辅酶a的基因工程菌及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的基因工程菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提供一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法。本发明公开一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的基因工程菌，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌，过表达乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB、乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC、丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc和丙酰辅酶A合酶基因pcs。本发明可以降低甲基丙二酸单酰辅酶A的生产成本，促进甲基丙二酸单酰辅酶A在科研及生产方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的基因工程菌及 其制备方法与应用。
背景技术
甲基丙二酸单酰辅酶A是由辅酶A与甲基丙二酸通过硫酯键结合形成的重要中间代谢 产物，参与许多生物合成与分解反应。甲基丙二酸单酰辅酶A也是某些药物合成的重要前体 物质，参与如红霉素，FK506等聚酮类物质的合成，在生物的正常生命活动及次级代谢产物 的生物合成中，发挥重要作用。其中在聚酮类物质的生物合成过程中，添加甲基丙二酸单酰 辅酶A，有助于提高产品的产量，但甲基丙二酸单酰辅酶A价格昂贵，且难以化学合成，不 符合低碳经济的需求。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法。
本发明提供一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的基因工程菌，所述基因工程菌是以大肠杆菌 为出发菌，过表达乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB、乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC、丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc和丙酰辅酶A合酶基因pcs。
进一步地限定，所述乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB来源于大肠杆菌，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC来源于大肠杆菌，其 基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc来源于枯草芽孢杆 菌，其基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述丙酰辅酶A合酶基因pcs来自橙色绿曲挠菌，其 基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供上述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
步骤1：将乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB、乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC、丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc连接到表达载体pETDuet，获得重组载体1；
步骤2：将丙酰辅酶A合酶基因pcs连接到表达载体pACYCDuet，获得重组载:2；
步骤3：将步骤1和步骤2获得的重组载体1和重组载体2共转到大肠杆菌BL21(DE3)获得基因工程菌。
本发明提供一种胞内产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法，其特征在于，所述方法是将上述 的基因工程菌在含有3-羟基丙酸的发酵液中进行发酵，温度为37℃，发酵时间至少5h。
进一步地限定，发酵液的成分：14.04g/L三水合磷酸氢二钾，5.24g/L磷酸二氢钾，1g/L 氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L酵母粉，4g/L碳酸氢钠，40mg/L生物素，0.5g/L硫酸镁，20g/L葡萄糖和2g/L 3-羟基丙酸。
本发明提供一种胞外产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法，将上述的基因工程菌进行处理获 得上清液，将上清液以含有3-羟基丙酸的培养液为反应底物进行反应，温度为37℃，反应 时间至少1h。
进一步地限定，培养液的成分：Tris-HCl、MgCl2、DTT、KCl、NaHCO3、生物素、辅 酶A、NADPH、ATP和3-羟基丙酸。
进一步地限定，获得上清液的方法如下：将上述的基因工程菌接种到LB培养基中，在 30℃条件下培养至菌体浓度为OD600为0.6～0.8，加入IPTG后，在30℃条件下培养6～8h， 获得培养液，将培养液进行离心获得菌体悬浮液，进过破碎后获得细胞破碎液，离心后获得 细胞破碎液的上清液。
进一步地限定，所述上清液的浓度为10mg/ml。
本发明提供上述的基因工程菌在产甲基丙二酸单酰辅酶A中的应用。
有益效果：本发明提供的方法能够在体外利用酶反应将3-羟基丙酸和辅酶A转化为甲 基丙二酸单酰辅酶A，产量达到25.6mg/L，为甲基丙二酸单酰辅酶A的体外制备提供了新 思路。
具体实施方式
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，同源重组用的试剂盒为南京诺唯赞公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
LB液体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性， 如100mg/L的氨苄青霉素与50mg/L的氯霉素。
实施例1.基因工程菌株的制备
(1)获取来源于橙色绿曲挠菌的丙酰辅酶A合酶基因pcs(基因序列如SEQ ID NO.4所示)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5’- TCATCACCACAGCCAGGGATCCatgatcgacactgcgcccctt-3’(SEQ ID NO.5)和5’- GCGCGCCGAGCTCGAATTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCCACG-3’(SEQ ID NO.6))，然后 利用回收试剂盒回收目的片段，获得pcs基因片段。
(2)将质粒pACYCDuet利用BamHI进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述pcs基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有50mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳 性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-pcs后，然后通过测序方式鉴定，获得工 程质粒pACYCDuet-pcs。
(3)获取来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因accBC(乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC， 其基因序列如SEQ ID NO.2所示)，是以大肠杆菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引 物：5'-TCATCACCACAGCCAGGGATCCatggatattcgtaagattaaaaa-3'(SEQ ID NO.7)和5'- GCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTTTTCCTGAAGACCGAG-3'(SEQ ID NO.8))，然后利 用回收试剂盒回收目的片段。
(4)将质粒pETDuet利用BamHI进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述accBC基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR 筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-accBC后，然后通过测序方式鉴定，获 得工程质粒pETDuet-accBC。
(5)获取来源于枯草芽孢杆菌的丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc(基因序列如SEQID NO.3所示)，是以枯草芽孢杆菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'- GAGATATACATATGGCAAGATCTatgaacgaacatatggatcattt-3'(SEQ ID NO.9)和 5'-CGGCCGATATCCAATTGTTACAGCGGAATATTGCCATGT-3'(SEQ ID NO.10))，然后利 用回收试剂盒回收目的片段。
(6)将质粒pETDuet-accBC利用BglII进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述pcc基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上， PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-accBC-pcc后，然后通过测序方式 鉴定，获得工程质粒pETDuet-accBC-pcc。
(7)将上述获得的pETDuet-accBC-pcc载体与pACYCDuet-pcs载体，利用热激方式导 入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有100mg/L氨苄青霉素与50mg/L氯霉素的固体 LB平板上，涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆，获得工程菌株E.coli BL21(DE3)(pETDuet-accBC-pcc、pACYCDuet-pcs)。
实施例2.甲基丙二酸单酰辅酶A的体外制备
(1)将实施例1获得的基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pETDuet-accBC-pcc、pACYCDuet-pcs)接种到LB培养基中，加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素与50mg/L的氯 霉素，在30℃、220rpm条件下培养至菌体浓度为OD600为0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的 IPTG后，在30℃条件下培养6～8h，获得培养液。
(2)将所获培养液10000rpm离心10min后，弃上清，并用20mL的PBS溶液洗涤三 次后，再用5mL上述PBS溶液充分悬浮；菌体悬浮液利用高压细胞破碎仪进行破碎，破碎 压力为15Mpa，获得细胞破碎液；细胞破碎液在13000rpm、4℃条件下离心30min，获得细 胞破碎液的上清液，该上清液即为蛋白酶液。
(3)将蛋白酶液与反应底物混合，形成含有如下组分的反应体系：100mM的pH＝7.5的Tris-HCl、5mM的MgCl2、1mM的DTT、10mM的KCl、40mM的NaHCO3、1mM的生 物素、1mM的辅酶A、2mM的NADPH、10mM的ATP、5mM的3-羟基丙酸。将反应体 系密封于2ml离心管中，置于37℃、180rpm摇床中反应1h，获得甲基丙二酸单酰辅酶A。
(4)甲基丙二酸单酰辅酶A的检测。利用采用HPLC-MS方法对甲基丙二酸单酰辅酶A进行定性和定量。HPLC采用Thermo-Acclaim RSLC 120C18 2.1×100mm柱子，流速为0.25ml/min，柱温为30℃，进样量为2微升，梯度洗脱方法为表1所示：
表1
MS采用ESI离子源的compact-QTOF质谱仪，检测采用的离子模式为正离子模式，电压为4500V，检测范围为100-1300m/z，离子源温度为200℃，干燥气流速为2.0L/min。
通过抽提分子量868±0.2的甲基丙二酸单酰辅酶A的离子峰图，可以对产物进行定性； 通过进行积分，测得产物甲基丙二酸单酰辅酶A的产量为25.6mg/L。
实施例3.胞内产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法
将实施例1获得的基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pETDuet-accBC-pcc、pACYCDuet-pcs) 接种在培养液(14.04g/L三水合磷酸氢二钾，5.24g/L磷酸二氢钾，1g/L氯化钠，1g/L氯 化铵，3g/L酵母粉，4g/L碳酸氢钠，40mg/L生物素，0.5g/L硫酸镁，20g/L葡萄糖和2g/L 3-羟基丙酸)中，置于37℃反应5h，获得甲基丙二酸单酰辅酶A。获得甲基丙二酸单酰辅 酶A的产量为14.4mg/L。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明 书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括 在本发明的专利保护范围内。
SEQ ID NO.1：
atggatattcgtaagattaaaaaactgatcgagctggttgaagaatcaggcatctccgaactggaaatttctgaaggcgaagagtcagta cgcattagccgtgcagctcctgccgcaagtttccctgtgatgcaacaagcttacgctgcaccaatgatgcagcagccagctcaatctaacgcag ccgctccggcgaccgttccttccatggaagcgccagcagcagcggaaatcagtggtcacatcgtacgttccccgatggttggtactttctaccg caccccaagcccggacgcaaaagcgttcatcgaagtgggtcagaaagtcaacgtgggcgataccctgtgcatcgttgaagccatgaaaatgatgaaccagatcgaagcggacaaatccggtaccgtgaaagcaattctggtcgaaagtggacaaccggtagaatttgacgagccgctggtcgtc atcgagtaa
SEQ ID NO.2：
atgctggataaaattgttattgccaaccgcggcgagattgcattgcgtattcttcgtgcctgtaaagaactgggcatcaagactgtcgctgt gcactccagcgcggatcgcgatctaaaacacgtattactggcagatgaaacggtctgtattggccctgctccgtcagtaaaaagttatctgaaca tcccggcaatcatcagcgccgctgaaatcaccggcgcagtagcaatccatccgggttacggcttcctctccgagaacgccaactttgccgagc aggttgaacgctccggctttatcttcattggcccgaaagcagaaaccattcgcctgatgggcgacaaagtatccgcaatcgcggcgatgaaaa aagcgggcgtcccttgcgtaccgggttctgacggcccgctgggcgacgatatggataaaaaccgtgccattgctaaacgcattggttatccgg tgattatcaaagcctccggcggcggcggcggtcgcggtatgcgcgtagtgcgcggcgacgctgaactggcacaatccatctccatgacccgt gcggaagcgaaagctgctttcagcaacgatatggtttacatggagaaatacctggaaaatcctcgccacgtcgagattcaggtactggctgac ggtcagggcaacgctatctatctggcggaacgtgactgctccatgcaacgccgccaccagaaagtggtcgaagaagcgccagcaccgggc attaccccggaactgcgtcgctacatcggcgaacgttgcgctaaagcgtgtgttgatatcggctatcgcggtgcaggtactttcgagttcctgttc gaaaacggcgagttctatttcatcgaaatgaacacccgtattcaggtagaacacccggttacagaaatgatcaccggcgttgacctgatcaaag aacagctgcgtatcgctgccggtcaaccgctgtcgatcaagcaagaagaagttcacgttcgcggccatgcggtggaatgtcgtatcaacgcc gaagatccgaacaccttcctgccaagtccgggcaaaatcacccgtttccacgcacctggcggttttggcgtacgttgggagtctcatatctacg cgggctacaccgtaccgccgtactatgactcaatgatcggtaagctgatttgctacggtgaaaaccgtgacgtggcgattgcccgcatgaaga atgcgctgcaggagctgatcatcgacggtatcaaaaccaacgttgatctgcagatccgcatcatgaatgacgagaacttccagcatggtggca ctaacatccactatctggagaaaaaactcggtcttcaggaaaaataa
SEQ ID NO.3：
atgaacgaacatatggatcatttctacaccaaacgtaaacaggcagaagaaggtggcggccgtgaaaaactggcacagcagcgtcag aaaggtaaactgaccgcccgcgaacgcattatttttctgctggatcaggatagttttattgaactgcatccgtttatggaaagccaggtgctgacc cgtgaacagcgtatgctgggtgacggtgttgttaccggttatggtaccattgatggtcgcagcgtttatgtttttgcacaggattttaccgtgtatgg tggtgccctgggtgaaacccatgcccgcaaaatttgcgcactgatggatctggccgccaaaaataaggcaccgattattggtctgaatgatagc ggtggtgcccgtattcaggaaggtgttctgagcctggatggttatggccatattttctatcgtaatgttctgtatagcggtgttattccgcagattag cgttattctgggtccgtgtgcaggcggtgccgtttatagcccggccctgaccgattttatttttatggccgaacagaccggtcgtatgtttattaccg gcccgaaagttattgaaaaagttaccggtgaacaggtggatgccgaaagtctgggcggcgcaggtattcataatgcagtgagtggtaatgcac attttagcggccataccgaaaaagaagttctgaccggtgtgcgtaaactgctgagttatctgccgctgaatggccgtaccaccgaaccgaaacc ggaaaaagaagcaagccgtccgctgctgaatcgtctggttccggccgataccaccaaaccgtatgatgtgcgtaaagttattcgcgaactggc cgatccgcagagctttttcgaaattcagccgtttttcgcaaaaaatattgttattggtttcgcacgtctgggtgaaaaagccattggtattgtggcaa gtcagccgaaacatctggcaggtagtctgaccattgatgccgcagataaagcagcacgttttattcgtttttgtgatgcatttgatatcccgctgctgaccgtggaagatgtgccgggttttctgccgggcattcagcaggaacataatggtattattcgccatggcgcaaaactgctgtttgcctatgcag aagcaaccgtgccgaaagttaccctgattattcgcaaagcctatggtggcgcatatgtggccatgaatagcaaagccattggcgccgatctggt ttttgcctggccgaatgccgaaattgcagttatgggtccggaaggtgcagcaagcattctgtatgaaaaagaaattaaggccagcgccgatccg caaaaaaccaaacgtgaaaaaaccgcagaatataaaaagcagaatgcaggcccgtataaagcagccgcatgcggcatggtggatgatattat tctgccggaagaaagtcgcggtcgtctgattcaggcatttcatatgctgacccataaaaccgaagaacgtccgaaaaagaaacatggcaatatt ccgctgtaa
SEQ ID NO.4：
atgatcgacactgcgccccttgccccaccacgggcgccccgctctaatccgattcgggatcgagttgattgggaagctcagcgcgctg ctgcgctggcagatcccggtgcctttcatggcgcgattgcccggacagttatccactggtacgacccacaacaccattgctggattcgcttcaa cgagtctagtcagcgttgggaagggctggatgccgctaccggtgcccctgtaacggtagactatcccgccgattatcagccctggcaacagg cgtttgatgatagtgaagcgccgttttaccgctggtttagtggtgggttgacaaatgcctgctttaatgaagtagaccggcatgtcacgatgggctatggcgacgaggtggcctactactttgaaggtgaccgctgggataactcgctcaacaatggtcgtggtggtccggttgtccaggagacaatca cgcggcggcgcctgttggtggaggtggtgaaggctgcgcaggtgttgcgtgatctgggcctgaagaagggtgatcggattgctctgaatatg ccgaatattatgccgcagatttattatacggaagcggcaaaacgactgggtattctgtacacgccggtcttcggtggcttctcggacaagactctt tccgaccgtattcacaatgccggtgcacgagtggtgattacctctgatggtgcgtaccgcaacgcgcaggtggtgccctacaaagaagcgtat accgatcaggcgctcgataagtatattccggttgagacggcgcaggcgattgttgcgcagaccctggccaccttgcccctgactgagtcgcag cgccagacgatcatcaccgaagtggaggccgcactggccggtgagattacggttgagcgctcggacgtgatgcgtggggttggttctgccct cgcaaagctccgcgatcttgatgcaagcgtgcaggcaaaggtgcgtacagtactggcgcaggcgctggtcgagtcgccgccgcgggttgaa gctgtggtggttgtgcgtcataccggtcaggagattttgtggaacgaggggcgagatcgctggagtcacgacttgctggatgctgcgctggcg aagattctggccaatgcgcgtgctgccggctttgatgtgcacagtgagaatgatctgctcaatctccccgatgaccagcttatccgtgcgctcta cgccagtattccctgtgaaccggttgatgctgaatatccgatgtttatcatttacacatcgggtagcaccggtaagcccaagggtgtgatccacgt tcacggcggttatgtcgccggtgtggtgcacaccttgcgggtcagttttgacgccgagccgggtgatacgatatatgtgatcgccgatccgggc tggatcaccggtcagagctatatgctcacagccacaatggccggtcggctgaccggggtgattgccgagggatcaccgctcttcccctcagc cgggcgttatgccagcatcatcgagcgctatggggtgcagatctttaaggcgggtgtgaccttcctcaagacagtgatgtccaatccgcagaat gttgaagatgtgcgactctatgatatgcactcgctgcgggttgcaaccttctgcgccgagccggtcagtccggcggtgcagcagtttggtatgc agatcatgaccccgcagtatatcaattcgtactgggcgaccgagcacggtggaattgtctggacgcatttctacggtaatcaggacttcccgctt cgtcccgatgcccatacctatcccttgccctgggtgatgggtgatgtctgggtggccgaaactgatgagagcgggacgacgcgctatcgggtc gctgatttcgatgagaagggcgagattgtgattaccgccccgtatccctacctgacccgcacactctggggtgatgtgcccggtttcgaggcgt acctgcgcggtgagattccgctgcgggcctggaagggtgatgccgagcgtttcgtcaagacctactggcgacgtgggccaaacggtgaatg gggctatatccagggtgattttgccatcaagtaccccgatggtagcttcacgctccacggacgctctgacgatgtgatcaatgtgtcgggccac cgtatgggcaccgaggagattgagggtgccattttgcgtgaccgccagatcacgcccgactcgcccgtcggtaattgtattgtggtcggtgcg ccgcaccgtgagaagggtctgaccccggttgccttcattcaacctgcgcctggccgtcatctgaccggcgccgaccggcgccgtctcgatga gctggtgcgtaccgagaagggggcggtcagtgtcccagaggattacatcgaggtcagtgcctttcccgaaacccgcagcgggaagtatatg cggcgctttttgcgcaatatgatgctcgatgaaccactgggtgatacgacgacgttgcgcaatcctgaagtgctcgaagagattgcagccaaga tcgctgagtggaaacgccgtcagcgtatggccgaagagcagcagatcatcgaacgctatcgctacttccggatcgagtatcacccaccaacg gccagtgcgggtaaactcgcggtagtgacggtgacaaatccgccggtgaacgcactgaatgagcgtgcgctcgatgagttgaacacaattgt tgaccacctggcccgtcgtcaggatgttgccgcaattgtcttcaccggacagggcgccaggagttttgtcgccggcgctgatattcgccagttg ctcgaagagattcatacggttgaagaggcaatggccctgccgaataacgcccatcttgctttccgcaagattgagcgtatgaataagccgtgtat cgcggcgatcaacggtgtggcgctcggtggtggtctggaattcgccatggcctgccattaccgggttgccgatgtctatgccgaattcggtcag ccagagattaatctgcgcttgctacctggttatggtggcacgcagcgcttgccgcgcctgttgtacaagcgcaacaacggcaccggtctgctcc gagcgctggagatgattctgggtgggcgtagcgtaccggctgatgaggcgctggagctgggtctgatcgatgccattgctaccggcgatcag gactcactgtcgctggcatgcgcgttagcccgtgccgcaatcggcgccgatggtcagttgatcgagtcggctgcggtgacccaggctttccgc catcgccacgagcagcttgacgagtggcgcaaaccagacccgcgctttgccgatgacgaactgcgctcgattatcgcccatccacgtatcga gcggattatccggcaggcccataccgttgggcgcgatgcggcagtgcatcgggcactggatgcaatccgctatggcattatccacggcttcg aggccggtctggagcacgaggcgaagctctttgccgaggcagtggttgacccgaacggtggcaagcgtggtattcgcgagttcctcgaccg ccagagtgcgccgttgccaacccgccgaccattgattacacctgaacaggagcaactcttgcgcgatcagaaagaactgttgccggttggttc acccttcttccccggtgttgaccggattccgaagtggcagtacgcgcaggcggttattcgtgatccggacaccggtgcggcggctcacggcg atcccatcgtggctgaaaagcagattattgtgccggtggaacgcccccgcgccaatcaggcgctgatctatgttctggcctcggaggtgaactt caacgatatctgggcgattaccggtattccggtgtcacggtttgatgagcacgaccgcgactggcacgttaccggttcaggtggcatcggcctg atcgttgcgctgggtgaagaggcgcgacgcgaaggccggctgaaggtgggtgatctggtggcgatctactccgggcagtcggatctgctctc accgctgatgggccttgatccgatggccgccgatttcgtcatccaggggaacgacacgccagatggatcgcatcagcaatttatgctggccca ggccccgcagtgtctgcccatcccaaccgatatgtctatcgaggcagccggcagctacatcctcaatctcggtacgatctatcgcgccctcttta cgacgttgcaaatcaaggccggacgcaccatctttatcgagggtgcggcgaccggtaccggtctggacgcagcgcgctcggcggcccgga atggtctgcgcgtaattggaatggtcagttcgtcgtcacgtgcgtctacgctgctggctgcgggtgcccacggtgcgattaaccgtaaagaccc ggaggttgccgattgtttcacgcgcgtgcccgaagatccatcagcctgggcagcctgggaagccgccggtcagccgttgctggcgatgttcc gggcgcagaacgacgggcgactggccgattatgtggtctcgcacgcgggcgagacggccttcccgcgcagtttccagcttctcggcgagcc acgcgatggtcacattccgacgctcacattctacggtgccaccagtggctaccacttcaccttcctgggtaagccagggtcagcttcgccgacc gagatgctgcggcgggccaatctccgcgccggtgaggcggtgttgatctactacggggttgggagcgatgacctggtagataccggcggtct ggaggctatcgaggcggcgcggcaaatgggagcgcggatcgtcgtcgttaccgtcagcgatgcgcaacgcgagtttgtcctctcgttgggct tcggggctgccctacgtggtgtcgtcagcctggcggaactcaaacggcgcttcggcgatgagtttgagtggccgcgcacgatgccgccgttg ccgaacgcccgccaggacccgcagggtctgaaagaggctgtccgccgcttcaacgatctggtcttcaagccgctaggaagcgcggtcggtg tcttcttgcggagtgccgacaatccgcgtggctaccccgatctgatcatcgagcgggctgcccacgatgcactggcggtgagcgcgatgctgatcaagcccttcaccggacggattgtctacttcgaggacattggtgggcggcgttactccttcttcgcaccgcaaatctgggtgcgccagcgcc gcatctacatgccgacggcacagatctttggtacgcacctctcaaatgcgtatgaaattctgcgtctgaatgatgagatcagcgccggtctgctg acgattaccgagccggcagtggtgccgtgggatgaactacccgaagcacatcaggcgatgtgggaaaatcgccacacggcggccacttatg tggtgaatcatgccttaccacgtctcggcctaaagaacagggacgagctgtacgaggcgtggacggccggcgagcggtag SEQ ID NO.5
TCATCACCACAGCCAGGGATCCatgatcgacactgcgcccctt
SEQ ID NO.6
GCGCGCCGAGCTCGAATTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCCACG
SEQ ID NO.7
TCATCACCACAGCCAGGGATCCatggatattcgtaagattaaaaa
SEQ ID NO.8
GCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTTTTCCTGAAGACCGAG
SEQ ID NO.9
GAGATATACATATGGCAAGATCTatgaacgaacatatggatcattt
SEQ ID NO.10
CGGCCGATATCCAATTGTTACAGCGGAATATTGCCATGT
SEQUENCE LISTING
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<213> 人工合成
<400> 1
atggatattc gtaagattaa aaaactgatc gagctggttg aagaatcagg catctccgaa 60
ctggaaattt ctgaaggcga agagtcagta cgcattagcc gtgcagctcc tgccgcaagt 120
ttccctgtga tgcaacaagc ttacgctgca ccaatgatgc agcagccagc tcaatctaac 180
gcagccgctc cggcgaccgt tccttccatg gaagcgccag cagcagcgga aatcagtggt 240
cacatcgtac gttccccgat ggttggtact ttctaccgca ccccaagccc ggacgcaaaa 300
gcgttcatcg aagtgggtca gaaagtcaac gtgggcgata ccctgtgcat cgttgaagcc 360
atgaaaatga tgaaccagat cgaagcggac aaatccggta ccgtgaaagc aattctggtc 420
gaaagtggac aaccggtaga atttgacgag ccgctggtcg tcatcgagta a 471
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atgctggata aaattgttat tgccaaccgc ggcgagattg cattgcgtat tcttcgtgcc 60
tgtaaagaac tgggcatcaa gactgtcgct gtgcactcca gcgcggatcg cgatctaaaa 120
cacgtattac tggcagatga aacggtctgt attggccctg ctccgtcagt aaaaagttat 180
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ggttacggct tcctctccga gaacgccaac tttgccgagc aggttgaacg ctccggcttt 300
atcttcattg gcccgaaagc agaaaccatt cgcctgatgg gcgacaaagt atccgcaatc 360
gcggcgatga aaaaagcggg cgtcccttgc gtaccgggtt ctgacggccc gctgggcgac 420
gatatggata aaaaccgtgc cattgctaaa cgcattggtt atccggtgat tatcaaagcc 480
tccggcggcg gcggcggtcg cggtatgcgc gtagtgcgcg gcgacgctga actggcacaa 540
tccatctcca tgacccgtgc ggaagcgaaa gctgctttca gcaacgatat ggtttacatg 600
gagaaatacc tggaaaatcc tcgccacgtc gagattcagg tactggctga cggtcagggc 660
aacgctatct atctggcgga acgtgactgc tccatgcaac gccgccacca gaaagtggtc 720
gaagaagcgc cagcaccggg cattaccccg gaactgcgtc gctacatcgg cgaacgttgc 780
gctaaagcgt gtgttgatat cggctatcgc ggtgcaggta ctttcgagtt cctgttcgaa 840
aacggcgagt tctatttcat cgaaatgaac acccgtattc aggtagaaca cccggttaca 900
gaaatgatca ccggcgttga cctgatcaaa gaacagctgc gtatcgctgc cggtcaaccg 960
ctgtcgatca agcaagaaga agttcacgtt cgcggccatg cggtggaatg tcgtatcaac 1020
gccgaagatc cgaacacctt cctgccaagt ccgggcaaaa tcacccgttt ccacgcacct 1080
ggcggttttg gcgtacgttg ggagtctcat atctacgcgg gctacaccgt accgccgtac 1140
tatgactcaa tgatcggtaa gctgatttgc tacggtgaaa accgtgacgt ggcgattgcc 1200
cgcatgaaga atgcgctgca ggagctgatc atcgacggta tcaaaaccaa cgttgatctg 1260
cagatccgca tcatgaatga cgagaacttc cagcatggtg gcactaacat ccactatctg 1320
gagaaaaaac tcggtcttca ggaaaaataa 1350
<210> 3
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atgaacgaac atatggatca tttctacacc aaacgtaaac aggcagaaga aggtggcggc 60
cgtgaaaaac tggcacagca gcgtcagaaa ggtaaactga ccgcccgcga acgcattatt 120
tttctgctgg atcaggatag ttttattgaa ctgcatccgt ttatggaaag ccaggtgctg 180
acccgtgaac agcgtatgct gggtgacggt gttgttaccg gttatggtac cattgatggt 240
cgcagcgttt atgtttttgc acaggatttt accgtgtatg gtggtgccct gggtgaaacc 300
catgcccgca aaatttgcgc actgatggat ctggccgcca aaaataaggc accgattatt 360
ggtctgaatg atagcggtgg tgcccgtatt caggaaggtg ttctgagcct ggatggttat 420
ggccatattt tctatcgtaa tgttctgtat agcggtgtta ttccgcagat tagcgttatt 480
ctgggtccgt gtgcaggcgg tgccgtttat agcccggccc tgaccgattt tatttttatg 540
gccgaacaga ccggtcgtat gtttattacc ggcccgaaag ttattgaaaa agttaccggt 600
gaacaggtgg atgccgaaag tctgggcggc gcaggtattc ataatgcagt gagtggtaat 660
gcacatttta gcggccatac cgaaaaagaa gttctgaccg gtgtgcgtaa actgctgagt 720
tatctgccgc tgaatggccg taccaccgaa ccgaaaccgg aaaaagaagc aagccgtccg 780
ctgctgaatc gtctggttcc ggccgatacc accaaaccgt atgatgtgcg taaagttatt 840
cgcgaactgg ccgatccgca gagctttttc gaaattcagc cgtttttcgc aaaaaatatt 900
gttattggtt tcgcacgtct gggtgaaaaa gccattggta ttgtggcaag tcagccgaaa 960
catctggcag gtagtctgac cattgatgcc gcagataaag cagcacgttt tattcgtttt 1020
tgtgatgcat ttgatatccc gctgctgacc gtggaagatg tgccgggttt tctgccgggc 1080
attcagcagg aacataatgg tattattcgc catggcgcaa aactgctgtt tgcctatgca 1140
gaagcaaccg tgccgaaagt taccctgatt attcgcaaag cctatggtgg cgcatatgtg 1200
gccatgaata gcaaagccat tggcgccgat ctggtttttg cctggccgaa tgccgaaatt 1260
gcagttatgg gtccggaagg tgcagcaagc attctgtatg aaaaagaaat taaggccagc 1320
gccgatccgc aaaaaaccaa acgtgaaaaa accgcagaat ataaaaagca gaatgcaggc 1380
ccgtataaag cagccgcatg cggcatggtg gatgatatta ttctgccgga agaaagtcgc 1440
ggtcgtctga ttcaggcatt tcatatgctg acccataaaa ccgaagaacg tccgaaaaag 1500
aaacatggca atattccgct gtaa 1524
<210> 4
<211> 5469
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atgatcgaca ctgcgcccct tgccccacca cgggcgcccc gctctaatcc gattcgggat 60
cgagttgatt gggaagctca gcgcgctgct gcgctggcag atcccggtgc ctttcatggc 120
gcgattgccc ggacagttat ccactggtac gacccacaac accattgctg gattcgcttc 180
aacgagtcta gtcagcgttg ggaagggctg gatgccgcta ccggtgcccc tgtaacggta 240
gactatcccg ccgattatca gccctggcaa caggcgtttg atgatagtga agcgccgttt 300
taccgctggt ttagtggtgg gttgacaaat gcctgcttta atgaagtaga ccggcatgtc 360
acgatgggct atggcgacga ggtggcctac tactttgaag gtgaccgctg ggataactcg 420
ctcaacaatg gtcgtggtgg tccggttgtc caggagacaa tcacgcggcg gcgcctgttg 480
gtggaggtgg tgaaggctgc gcaggtgttg cgtgatctgg gcctgaagaa gggtgatcgg 540
attgctctga atatgccgaa tattatgccg cagatttatt atacggaagc ggcaaaacga 600
ctgggtattc tgtacacgcc ggtcttcggt ggcttctcgg acaagactct ttccgaccgt 660
attcacaatg ccggtgcacg agtggtgatt acctctgatg gtgcgtaccg caacgcgcag 720
gtggtgccct acaaagaagc gtataccgat caggcgctcg ataagtatat tccggttgag 780
acggcgcagg cgattgttgc gcagaccctg gccaccttgc ccctgactga gtcgcagcgc 840
cagacgatca tcaccgaagt ggaggccgca ctggccggtg agattacggt tgagcgctcg 900
gacgtgatgc gtggggttgg ttctgccctc gcaaagctcc gcgatcttga tgcaagcgtg 960
caggcaaagg tgcgtacagt actggcgcag gcgctggtcg agtcgccgcc gcgggttgaa 1020
gctgtggtgg ttgtgcgtca taccggtcag gagattttgt ggaacgaggg gcgagatcgc 1080
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atcatgaccc cgcagtatat caattcgtac tgggcgaccg agcacggtgg aattgtctgg 1740
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ccctgggtga tgggtgatgt ctgggtggcc gaaactgatg agagcgggac gacgcgctat 1860
cgggtcgctg atttcgatga gaagggcgag attgtgatta ccgccccgta tccctacctg 1920
acccgcacac tctggggtga tgtgcccggt ttcgaggcgt acctgcgcgg tgagattccg 1980
ctgcgggcct ggaagggtga tgccgagcgt ttcgtcaaga cctactggcg acgtgggcca 2040
aacggtgaat ggggctatat ccagggtgat tttgccatca agtaccccga tggtagcttc 2100
acgctccacg gacgctctga cgatgtgatc aatgtgtcgg gccaccgtat gggcaccgag 2160
gagattgagg gtgccatttt gcgtgaccgc cagatcacgc ccgactcgcc cgtcggtaat 2220
tgtattgtgg tcggtgcgcc gcaccgtgag aagggtctga ccccggttgc cttcattcaa 2280
cctgcgcctg gccgtcatct gaccggcgcc gaccggcgcc gtctcgatga gctggtgcgt 2340
accgagaagg gggcggtcag tgtcccagag gattacatcg aggtcagtgc ctttcccgaa 2400
acccgcagcg ggaagtatat gcggcgcttt ttgcgcaata tgatgctcga tgaaccactg 2460
ggtgatacga cgacgttgcg caatcctgaa gtgctcgaag agattgcagc caagatcgct 2520
gagtggaaac gccgtcagcg tatggccgaa gagcagcaga tcatcgaacg ctatcgctac 2580
ttccggatcg agtatcaccc accaacggcc agtgcgggta aactcgcggt agtgacggtg 2640
acaaatccgc cggtgaacgc actgaatgag cgtgcgctcg atgagttgaa cacaattgtt 2700
gaccacctgg cccgtcgtca ggatgttgcc gcaattgtct tcaccggaca gggcgccagg 2760
agttttgtcg ccggcgctga tattcgccag ttgctcgaag agattcatac ggttgaagag 2820
gcaatggccc tgccgaataa cgcccatctt gctttccgca agattgagcg tatgaataag 2880
ccgtgtatcg cggcgatcaa cggtgtggcg ctcggtggtg gtctggaatt cgccatggcc 2940
tgccattacc gggttgccga tgtctatgcc gaattcggtc agccagagat taatctgcgc 3000
ttgctacctg gttatggtgg cacgcagcgc ttgccgcgcc tgttgtacaa gcgcaacaac 3060
ggcaccggtc tgctccgagc gctggagatg attctgggtg ggcgtagcgt accggctgat 3120
gaggcgctgg agctgggtct gatcgatgcc attgctaccg gcgatcagga ctcactgtcg 3180
ctggcatgcg cgttagcccg tgccgcaatc ggcgccgatg gtcagttgat cgagtcggct 3240
gcggtgaccc aggctttccg ccatcgccac gagcagcttg acgagtggcg caaaccagac 3300
ccgcgctttg ccgatgacga actgcgctcg attatcgccc atccacgtat cgagcggatt 3360
atccggcagg cccataccgt tgggcgcgat gcggcagtgc atcgggcact ggatgcaatc 3420
cgctatggca ttatccacgg cttcgaggcc ggtctggagc acgaggcgaa gctctttgcc 3480
gaggcagtgg ttgacccgaa cggtggcaag cgtggtattc gcgagttcct cgaccgccag 3540
agtgcgccgt tgccaacccg ccgaccattg attacacctg aacaggagca actcttgcgc 3600
gatcagaaag aactgttgcc ggttggttca cccttcttcc ccggtgttga ccggattccg 3660
aagtggcagt acgcgcaggc ggttattcgt gatccggaca ccggtgcggc ggctcacggc 3720
gatcccatcg tggctgaaaa gcagattatt gtgccggtgg aacgcccccg cgccaatcag 3780
gcgctgatct atgttctggc ctcggaggtg aacttcaacg atatctgggc gattaccggt 3840
attccggtgt cacggtttga tgagcacgac cgcgactggc acgttaccgg ttcaggtggc 3900
atcggcctga tcgttgcgct gggtgaagag gcgcgacgcg aaggccggct gaaggtgggt 3960
gatctggtgg cgatctactc cgggcagtcg gatctgctct caccgctgat gggccttgat 4020
ccgatggccg ccgatttcgt catccagggg aacgacacgc cagatggatc gcatcagcaa 4080
tttatgctgg cccaggcccc gcagtgtctg cccatcccaa ccgatatgtc tatcgaggca 4140
gccggcagct acatcctcaa tctcggtacg atctatcgcg ccctctttac gacgttgcaa 4200
atcaaggccg gacgcaccat ctttatcgag ggtgcggcga ccggtaccgg tctggacgca 4260
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ggtgaggcgg tgttgatcta ctacggggtt gggagcgatg acctggtaga taccggcggt 4740
ctggaggcta tcgaggcggc gcggcaaatg ggagcgcgga tcgtcgtcgt taccgtcagc 4800
gatgcgcaac gcgagtttgt cctctcgttg ggcttcgggg ctgccctacg tggtgtcgtc 4860
agcctggcgg aactcaaacg gcgcttcggc gatgagtttg agtggccgcg cacgatgccg 4920
ccgttgccga acgcccgcca ggacccgcag ggtctgaaag aggctgtccg ccgcttcaac 4980
gatctggtct tcaagccgct aggaagcgcg gtcggtgtct tcttgcggag tgccgacaat 5040
ccgcgtggct accccgatct gatcatcgag cgggctgccc acgatgcact ggcggtgagc 5100
gcgatgctga tcaagccctt caccggacgg attgtctact tcgaggacat tggtgggcgg 5160
cgttactcct tcttcgcacc gcaaatctgg gtgcgccagc gccgcatcta catgccgacg 5220
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atcagcgccg gtctgctgac gattaccgag ccggcagtgg tgccgtggga tgaactaccc 5340
gaagcacatc aggcgatgtg ggaaaatcgc cacacggcgg ccacttatgt ggtgaatcat 5400
gccttaccac gtctcggcct aaagaacagg gacgagctgt acgaggcgtg gacggccggc 5460
gagcggtag 5469
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tcatcaccac agccagggat ccatgatcga cactgcgccc ctt 43
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gcgcgccgag ctcgaattcc taccgctcgc cggccgtcca cg 42
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tcatcaccac agccagggat ccatggatat tcgtaagatt aaaaa 45
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gcgcgccgag ctcgaattct tatttttcct gaagaccgag 40
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gagatataca tatggcaaga tctatgaacg aacatatgga tcattt 46
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cggccgatat ccaattgtta cagcggaata ttgccatgt 39
Claims (10)
1.一种产甲基丙二酸单酰辅酶A的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌，过表达乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB、乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC、丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc和丙酰辅酶A合酶基因pcs。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB来源于大肠杆菌，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC来源于大肠杆菌，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc来源于枯草芽孢杆菌，其基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述丙酰辅酶A合酶基因pcs来自橙色绿曲挠菌，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1或2所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
步骤1：将乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB、乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC、丙酰辅酶A羧化酶CT亚基基因pcc连接到表达载体pETDuet，获得重组载体1；
步骤2：将丙酰辅酶A合酶基因pcs连接到表达载体pACYCDuet，获得重组载:2；
步骤3：将步骤1和步骤2获得的重组载体1和重组载体2共转到大肠杆菌BL21(DE3)获得基因工程菌。
4.一种胞内产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌在含有3-羟基丙酸的发酵液中进行发酵，温度为37℃，发酵时间至少5h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵液的成分：14.04g/L三水合磷酸氢二钾，5.24g/L磷酸二氢钾，1g/L氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L酵母粉，4g/L碳酸氢钠，40mg/L生物素，0.5g/L硫酸镁，20g/L葡萄糖和2g/L 3-羟基丙酸。
6.一种胞外产甲基丙二酸单酰辅酶A的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌进行处理获得上清液，将上清液以含有3-羟基丙酸的培养液为反应底物进行反应，温度为37℃，反应时间至少1h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养液的成分：Tris-HCl、MgCl2、DTT、KCl、NaHCO3、生物素、辅酶A、NADPH、ATP和3-羟基丙酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，获得上清液的方法如下：将权利要求1或2所述的基因工程菌接种到LB培养基中，在30℃条件下培养至菌体浓度为OD600为0.6～0.8，加入IPTG后，在30℃条件下培养6～8h，获得培养液，将培养液进行离心获得菌体悬浮液，进过破碎后获得细胞破碎液，离心后获得细胞破碎液的上清液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述上清液的浓度为10mg/ml。
10.权利要求1或2所述的基因工程菌在产甲基丙二酸单酰辅酶A中的应用。
Priority Applications (1)
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| CN202210677610.XA CN115058375A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 一种产甲基丙二酸单酰辅酶a的基因工程菌及其制备方法与应用 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220916 |