CN115054705A - 一种抑制jak-stat通路的体内高通量药物检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制JAK‑STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒及其使用方法，试剂盒的液体培养基按体积分数包括5%‑10%蔗糖+5%‑10%酵母提取物、0.3%‑6%DSS，余量为1×PBS缓冲液/超纯水；试剂盒的孔板侧壁设遮光层，孔板顶面设覆盖层，覆盖层上设通孔；使用方法为将高通量液体培养基加入孔板、果蝇杂交后转移、培养果蝇幼虫、制作试剂盒并将果蝇幼虫移入培养观察和分析。本发明的试剂盒及其使用方法应用荧光标记的转基因果蝇模型筛选新药物，不但提供活体动物的体内生理环境，而且费用低、样品用量少、能够从成千上万种样品中快速筛选有效药物。
Description
技术领域
本发明属于高通量筛选技术领域，具体涉及一种抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
迄今为止，大多数疾病的发病机制均离不开炎症的发生，炎症相关免疫细胞（如巨噬细胞）可通过释放和激活炎症信号相关因子，促使肿瘤和自身免疫性等疾病的发生。近年来，肿瘤及自身免疫性等疾病发病率、死亡率呈上升趋势，越来越影响人类身体健康和正常生活，因此高效的寻找治疗药物尤为重要。
JAK-STAT是机体内重要的信号传导通路，在细胞的增殖、凋亡、分化和免疫应答中发挥重要作用，其在多种炎症因子刺激下激活，发挥信号转导和转录调控功能。脂质代谢异常、脑血管疾病、全身性炎症、肿瘤、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生使JAK-STAT通路中的JAK、STAT等基因上调，基于此出现了一些JAK抑制剂治疗心血管疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、全身炎症等疾病，其主要是通过抑制上游的JAK基因来发挥作用。目前，JAK抑制剂仍较少，需要研发新的JAK抑制剂药物，并且高通量药物筛选仅是体外模型，无体内高效筛选药物的模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒及其使用方法，以解决上述问题。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒，包括液体培养基，液体培养基按体积分数包括5%-10%蔗糖+5%-10%酵母提取物、0.3%-6%DSS，余量为1×PBS缓冲液/超纯水。
为了进一步实现本发明，所述试剂盒包括孔板，孔板的侧壁设置遮光层，孔板的顶面设置覆盖层，覆盖层上设置若干与孔板的孔对应的通孔，通孔的孔径为0.4mm-0.8mm。
为了进一步实现本发明，所述通孔的投影位于孔板的孔的中心位置。
为了进一步实现本发明，抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）将高通量液体培养基加入孔板内；
（2）选取2-3日龄10×STAT-GFP的转基因雌雄果蝇，置于固体基础培养基中杂交，12h后转移；
（3）对固体基础培养基培养84h-96h后出现果蝇幼虫，使用1×PBS缓冲液清洗食物残渣；
（4）选取需要进行检测的药物，加入高通量液体培养基中，混匀，得到检测试剂盒；
（5）将步骤（3）得到的果蝇幼虫用刷子分别放入步骤（4）得到的试剂盒内，将覆盖层盖在孔板上，置于18℃-20℃恒温和55%-75%恒湿的保温箱内，荧光显微拍摄，每6h一次，共4次，对得到的结果进行分析。
为了进一步实现本发明，步骤（1）中所述转基因雌雄果蝇的比例为2:1。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
试剂盒培养基的酵母与蔗糖为幼虫提供基本的蛋白质和糖类，DSS作为激活JAK-STAT通路的试剂，配置、操作简便，试剂盒以简单的96孔板为基础，添加黑色胶带可以保证光源垂直射入，保持变量恒定，在板上覆盖塑料薄膜，打孔，以确保空气流通及孔板内部恒定。果蝇作为研究人类疾病发病机制的重要模型，在药物开发与筛选药物新作用靶点中有非常广泛的应用。果蝇基因组测序已于2000年完成，75%的人类已知致病基因与果蝇同源，同源物的蛋白序列的总体相似性约60%且保守功能域相似性达80%-90%并且转基因技术较为完善，应用荧光标记的转基因果蝇模型（针对JAK/STAT通路的10×STAT-GFP果蝇）筛选新药物，不但提供活体动物的体内生理环境，而且费用低、样品用量少、能够从成千上万种样品中快速筛选有效药物。
附图说明
图1为本发明中试剂盒的结构示意图；
图2为本发明中筛选高通量液体普通培养基中蔗糖、酵母提取物最适培养液量结果图；
图3为本发明中筛选高通量液体培养基溶液结果图；
图4为本发明中筛选高通量液体培养基中DSS的浓度结果图；
图5为本发明中采用托法替尼验证高通量体内药物筛选的试剂盒的准确性结果图；
图6为本发明中采用巴西替尼验证高通量体内药物筛选的试剂盒的准确性结果图；
附图标记含义如下：1、孔板；2、遮光层；3、覆盖层；4、通孔。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
一种抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒，包括液体培养基，液体培养基按体积分数包括5%-10%蔗糖+5%-10%酵母提取物、0.3%-6%DSS，余量为1×PBS缓冲液/超纯水。
如图1所示，试剂盒包括孔板1，孔板1的侧壁设置遮光层2，孔板1的顶面设置覆盖层3，覆盖层3上设置若干与孔板1的孔对应的通孔4，通孔4的孔径为0.4mm-0.8mm，通孔4的投影位于孔板1的孔的中心位置。
抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）将高通量液体培养基加入孔板内；
（2）选取2-3日龄10×STAT-GFP的转基因雌雄果蝇，包括雌性80只、雄性40只，置于固体基础培养基中杂交12h后转移；
（3）对固体基础培养基培养84h-96h后出现果蝇幼虫，使用1×PBS缓冲液清洗食物残渣；
（4）选取需要进行检测的药物，加入高通量液体培养基中，混匀，得到检测试剂盒；
（5）将步骤（3）得到的果蝇幼虫用刷子分别放入步骤（4）得到的试剂盒内，将覆盖层盖在孔板上，置于18℃-20℃恒温和55%-75%恒湿的保温箱内，荧光显微拍摄，每6h一次，共4次，对得到的结果进行分析。
实验例检测标准：
采用双盲的方法进行果蝇幼虫肠道的荧光范围打分，计分越高表明荧光范围越多。
（1）果蝇幼虫肠道未观察到荧光，计分为0分；
（2）果蝇幼虫摄取后肠道出现点状的绿色荧光，计分为0.5分；
（3）果蝇幼虫摄取后肠道出现块状的绿色荧光，计分为1分；
（4）果蝇幼虫摄取后肠道出现短段的绿色荧光，计分为1.5分；
（5）果蝇幼虫摄取后肠道出现长段的绿色荧光，计分为2分；
（6）果蝇幼虫摄取后肠道大面积出现荧光，计分为2.5分。
实验例1、筛选高通量液体普通培养基中蔗糖、酵母提取物最适培养液量：
实验材料：
10×STAT-GFP转基因果蝇的2-3龄的幼虫。
实验方法设计：
将果蝇幼虫放入5%蔗糖＋5%酵母提取物、5%蔗糖＋10%酵母提取物、10%蔗糖＋10%酵母提取物的高通量液体培养基中，每6h时用荧光显微镜拍摄，一共拍摄24h。
实验结果及分析：
结果显示在6h荧光强度依次递增，差异无统计学意义，如图2（A）；12h时，5%蔗糖＋10%酵母提取物的荧光强度低于5%蔗糖＋5%酵母提取物、10%蔗糖＋10%酵母提取物，差异无统计学意义，如图2（B）；18h时，10%蔗糖＋10%酵母提取物的荧光强度低于5%蔗糖＋10%酵母提取物、5%蔗糖＋5%酵母提取物，差异无统计学意义，如图2（C）；24h时荧光强度依次递减，差异无统计学意义，如图2（D）。
由上可见，5%-10%蔗糖＋5%-10%酵母提取物作为培养基的基础液体，6h时果蝇腹部的荧光范围均低于1.0分，12h时低于1.2分，18h时低于1.5分，24h时低于1.8分。其中5%蔗糖+10%酵母提取物效果最佳。
实验例2、筛选高通量液体培养基溶液：
实验材料：
10×STAT-GFP转基因果蝇的2-3龄的幼虫。
实验方法设计：
将果蝇幼虫放入溶液为超纯水或1×PBS缓冲液的高通量液体培养基中，每6h时用荧光显微镜拍摄，一共拍摄24h。
实验结果及分析：
结果显示，在6h、12h时，使用1×PBS缓冲液时果蝇腹部的荧光范围低于超纯水的荧光范围，差异无统计学意义，如图3（A，B）；在18h、24h时，使用1×PBS缓冲液与超纯水时果蝇腹部的荧光范围无差异且无统计学意义，如图3（C，D）。
由上可见，使用超纯水或1×PBS缓冲液作为基础培养液，6h时果蝇腹部的荧光范围低于1.0分，12h时低于1.2分，18h时低于1.5分，24h时低于1.8分，其中使用1×PBS缓冲液作为培养基的基础液体效果最佳。
实验例3、筛选高通量液体培养基中DSS的浓度：
实验材料：
10×STAT-GFP转基因果蝇的2-3龄的幼虫；
基础液（Control）采用5%蔗糖＋10%酵母提取物。
实验方法设计：
将果蝇幼虫放入Control+0%DSS、Control+0.3%DSS、Control+1%DSS、Control+3%DSS、Control+6%DSS浓度的高通量液体培养基中，每6h时用荧光显微镜拍摄，一共拍摄24h。
实验结果及分析：
3h结果显示0.3%DSS、1%DSS、3%DSS、6%DSS浓度的高通量液体培养基荧光强度均比没加入DSS荧光强，其中0.3%DSS差异明显，**p<0.01差异有统计学意义，如图4（A）。6h结果显示0.3%DSS、1%DSS、3%DSS、6%DSS浓度的高通量液体培养基荧光强度均比没加入DSS荧光强且均差异明显，*p<0.05、**p<0.01差异有统计学意义,如图4（B）。12h结果显示0.3%DSS、1%DSS、3%DSS、6%DSS浓度的高通量液体培养基荧光强度均比没加入DSS荧光强且均差异明显，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001差异有统计学意义,如图4（C）。18h结果显示0.3%DSS、1%DSS、3%DSS、6%DSS浓度的高通量液体培养基荧光强度均比没加入DSS荧光强且均差异明显，***p<0.001、****p<0.0001差异有统计学意义差异有统计学意义,如图4（D）。24h结果显示0.3%DSS、1%DSS、3%DSS、6%DSS浓度的高通量液体培养基荧光强度均比没加入DSS荧光强且差异明显，*p<0.05、**p<0.01，如图4（E）。
由图可见，0.3%-6%DSS处理后果蝇腹部的荧光强度均比Conrtol强，其中使用1%的DSS浓度效果最佳。
实验例4、采用托法替尼验证高通量体内药物筛选的试剂盒的准确性：
实验材料：
10×STAT-GFP转基因果蝇的2-3龄的幼虫；
实验方法设计：
选取JAK抑制剂（托法替尼）为阳性药，利用10×STAT-GFP的转基因果蝇的2-3龄的幼虫，将果蝇幼虫放入0.1mM、1mM浓度的JAK抑制剂托法替尼高通量液体培养基中，每6h时用荧光显微镜拍摄，共拍摄24h。
实验结果及分析：
结果显示，6h-24h荧光强度依次递减，其中12h、18h、24h时Control+1%DSS+1mM浓度托法替尼荧光强度低于Control+1%DSS且差异明显，**p<0.05、****p<0.01，如图5（B,C,D）。
结果表明JAK抑制剂托法替尼能显著抑制果蝇体内JAK-STAT通路，证明了试剂盒的正确性。
实验例5、采用巴西替尼验证高通量体内药物筛选的试剂盒的准确性：
实验材料：
10×STAT-GFP转基因果蝇的2-3龄的幼虫；
实验方法设计：
选取JAK抑制剂（巴西替尼）为阳性药，利用10×STAT-GFP的转基因果蝇的2-3龄的幼虫，将果蝇幼虫放入1mM浓度的JAK抑制剂（巴西替尼）高通量液体培养基中，12h时进行观察，结果显示，其中12h Control+1%DSS+1mM浓度巴西替尼荧光强度低于Control+1%DSS且差异明显，**p<0.05，如图6所示。
实验结果及分析：
结果表明JAK抑制剂巴西替尼能显著抑制果蝇体内JAK-STAT通路，证明了试剂盒的正确性。
Claims (5)
1.一种抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒，其特征在于：包括液体培养基，液体培养基按体积分数包括5%-10%蔗糖+5%-10%酵母提取物、0.3%-6%DSS，余量为1×PBS缓冲液/超纯水。
2.如权利要求1所述的抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括孔板（1），孔板（1）的侧壁设置遮光层（2），孔板（1）的顶面设置覆盖层（3），覆盖层（3）上设置若干与孔板（1）的孔对应的通孔（4），通孔（4）的孔径为0.4mm-0.8mm。
3.如权利要求2所述的抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒，其特征在于：所述通孔（4）的投影位于孔板（1）的孔的中心位置。
4.权利要求1-3中任一项所述抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将高通量液体培养基加入孔板内；
（2）选取2-3日龄10×STAT-GFP的转基因雌雄果蝇，置于固体基础培养基中杂交，12h后转移；
（3）对固体基础培养基培养84h-96h后出现果蝇幼虫，使用1×PBS缓冲液清洗食物残渣；
（4）选取需要进行检测的药物，加入高通量液体培养基中，混匀，得到检测试剂盒；
（5）将步骤（3）得到的果蝇幼虫用刷子分别放入步骤（4）得到的试剂盒内，将覆盖层盖在孔板上，置于18℃-20℃恒温和55%-75%恒湿的保温箱内，荧光显微拍摄，每6h一次，共4次，对得到的结果进行分析。
5.如权利要求4中任一项所述抑制JAK-STAT通路的体内高通量药物检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤（1）中所述转基因雌雄果蝇的比例为2:1。
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