CN115003825A

CN115003825A - 检测试样中的特定dna的方法

Info

Publication number: CN115003825A
Application number: CN202180009880.7A
Authority: CN
Inventors: 真下知士; 吉见一人; 涩村里美
Original assignee: C4u Corp; Osaka University NUC
Current assignee: C4u Corp; University of Osaka NUC
Priority date: 2020-01-24
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2022-09-02
Also published as: CA3165508A1; KR20220130727A; BR112022013752A2; WO2021149829A1; US12460271B2; US20230099483A1; JP6940086B1; AU2021210313A1; EP4095245A1; JPWO2021149829A1; EP4095245A4

Abstract

发现了通过预先在包含要检测靶标DNA的试样和CRISPR‑Cas3系统的反应系统中使其切割能够检测的单链探针DNA混合存在，从而能够以通过该单链探针DNA的切割而产生的信号为指标，检测试样中的靶标DNA。

Description

检测试样中的特定DNA的方法

技术领域

本发明涉及利用CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA来检测试样中的特定DNA的方法。

背景技术

基因组编辑技术是通过在动物、植物的细胞中特异性地切割基因组DNA序列，通过利用内在的修复机制，自由地重写成任意序列的技术。不仅在生物科学研究中，在世界中其应用推广到农作物/畜产动物的品种改良、再生医疗、基因组编辑治疗等。

细菌、古细菌所具有的CRISPR-Cas系统被分为通过多种蛋白质的复合体而切割靶标序列的1类、和通过单种蛋白质而切割的2类。到目前为止作为基因组编辑工具而开发出的CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cas12(Cpf1)系统、CRISPR-Cas13系统等全部被分类为2类。

在这样的状况下，本发明者发现，作为属于1类的I型CRISPR-Cas系统的CRISPR-Cas3系统可以作为真核细胞的基因组编辑工具利用(专利文献1)。

然而，关于CRISPR-Cas3系统怎样切割DNA而导入突变，其详细的分子机制至今不明。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2018/225858号公报

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的是阐明利用CRISPR-Cas3系统的DNA切割的分子机制，提供利用了该分子机制的靶标DNA的检测方法。本发明的进一步目的是提供用于该检测方法的试剂盒。

用于解决课题的手段

本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，如果CRISPR-Cas3系统识别并结合试样中的靶标DNA，则无差别地切割存在于周围的单链DNA(ssDNA)。进而，本发明者们发现，如果基于该知识，则通过预先使包含要检测靶标DNA的试样和CRISPR-Cas3系统的反应系统中，混合存在其切割能够检测的单链探针DNA，从而能够以该单链探针DNA的切割所产生的信号为指标，检测试样中的靶标DNA，从而完成了本发明。

即，本发明涉及利用了由CRISPR-Cas3系统造成的单链DNA的无差别切割的靶标DNA的检测方法、和用于该检测方法的试剂盒，更详细地提供以下(1)和(2)。

(1)检测试样中的特定DNA的方法，

该方法包括：

(a)使该试样与以该特定DNA为靶标的CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA接触的工序，和

(b)对于在该试样中存在该特定DNA的情况下发生的、由CRISPR-Cas3系统造成的单链探针DNA的切割进行检测的工序。

(2)用于通过(1)所述的方法检测试样中的特定DNA的试剂盒，

该试剂盒包含：

(a)以该特定DNA为靶标的CRISPR-Cas3系统、和

(b)单链探针DNA。

发明的效果

根据本发明，通过利用CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA，能够检测试样中的靶标DNA。本发明的方法能够以通过单链探针DNA的切割而产生的信号为指标，检测试样中的靶标DNA，是简便的(参照图10)。仅在正确地识别并结合了靶标DNA的情况下，CRISPR-Cas3系统才切割单链探针DNA，但该靶标DNA的检测中的特异性为单碱基水平，极高。另外，本发明的方法中，即使试样中存在的靶标DNA为微量也能够检测。例如，通过与RPA(recombinasepolymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)法、LAMP(loop-mediated isothermalAmplification，环介导等温扩增)法等基因扩增法组合，从而即使在试样中仅存在1拷贝～10拷贝的靶标DNA的情况下也能够检测，灵敏度高。

本发明的方法可以作为例如，以各种体液(尿、唾液、血清、血浆、全血等)作为试样的短时间内的病毒的鉴定、向检测血中的微量DNA及其突变的液体活检的应用、或者区分宏基因组中所包含的微量的病原体DNA的种类的检测等用于新一代型诊断的工具利用。

作为类似的方法，报告了使用属于22类的CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas14a的DETECTR、Cas14-DETECTR(Chen et al.,Science.2018Apr 27；360(6387):436-439、Harrington et al.,Science.2018Nov 16；362(6416):839-842)。这些系统中的靶标序列分别为21碱基、20碱基，与此相对，作为属于1类的I型CRISPR-Cas系统的CRISPR-Cas3系统的靶标序列长达27碱基。因此，与现有的系统相比，能够以更高的特异性检测靶标DNA。

附图说明

图1是显示CRISPR-Cas3系统在hEMX1靶标序列存在下非特异性地切割单链DNA的图。图上部显示试样的组成，图下部显示毛细管电泳的结果。仅对于存在包含适当的PAM序列和靶标序列的DNA片段的试样4、5，观察到了非特异性的单链DNA切割活性(箭头)。

图2是显示CRISPR-Cas3系统即使在hEMX1靶标序列存在下也不非特异性地切割双链DNA的图。图上部显示试样的组成，图下部显示毛细管电泳的结果。即使对于存在包含适当的PAM序列和靶标序列的DNA片段的试样4、5，也未观察到非特异性的双链DNA切割活性(箭头)。

图3是使用通过切割而发出荧光的单链DNA探针(DNaseAlert^TM)，检测CRISPR-Cas3系统在hEMX1靶标序列存在下非特异性地切割单链DNA的检测结果的图。图上部显示试样的组成，图下部显示检测荧光的结果。仅对于存在包含适当的PAM序列和靶标序列的DNA片段的试样4、5，检测到了经时的非特异性的核酸酶活性(荧光)。

图4是显示使用通过切割而发出荧光的单链DNA探针(DNaseAlert^TM)，检测CRISPR-Cas3系统在mTyr靶标序列存在下非特异性地切割单链DNA的检测结果的图。图上部显示试样的组成，图下部显示检测荧光的结果。仅对于存在包含PAM序列和靶标序列的DNA片段的试样4、5，检测到了经时的非特异性的核酸酶活性(荧光)。

图5A是显示使用通过切割而发出荧光的单链DNA探针(Taqman^TM探针)，检测CRISPR-Cas3系统在hEMX1靶标序列存在下非特异性地切割单链DNA的检测结果的图。图上部显示试样的组成，图下部显示检测荧光的结果。仅对于存在包含适当的PAM序列和靶标序列的DNA片段的试样2、3，检测到了经时的非特异性的单链DNA切割活性(荧光)。

图5B是将图5A中的荧光强度的上升度作为活性强度表示而得的图。

图6是显示使用通过切割而发出荧光的探针(Taqman^TM探针)，检测CRISPR-Cas3系统在hEMX1靶标序列或mTyr靶标序列存在下非特异性地切割单链DNA的结果的图。本实验中，靶标序列使用单链DNA。图上部显示试样的组成，图下部将荧光强度的上升度作为活性强度表示。即使在由CRISPR-Cas3所识别的靶标序列是单链DNA片段的情况下，也与双链DNA片段的情况同样地，能够诱导非特异性的单链DNA切割。N＝3。

图7是显示将与图5同样的实验用各种PAM序列(64种)进行评价而得的结果的图。图上部显示活性强度的测定结果，图下部是利用序列标识(Sequence logo)将PAM序列的指向性可视化的图。N＝3。

图8是显示对CRISPR-Cas3的检测限浓度进行评价而得的结果的图。将包含靶标序列(图上部显示hEMX1、图下部显示mTyr)的DNA片段有限稀释，进行与图5同样的实验。1×10¹⁰拷贝以上的存在下有意义地检测到信号。N＝3。

图9是显示将1拷贝DNA片段通过与图5同样的实验进行检测而得的结果的图。为了检测试样中的1拷贝DNA片段，利用了通过RPA法的DNA扩增。N＝3。

图10是显示利用了由CRISPR-Cas3系统造成的非特异性的单链DNA切割活性的本发明的检测法的概要的图。

图11是显示使用包含靶标DNA片段和小鼠基因组DNA的混合基因组溶液进行与图9同样的实验而得的结果的图。

图12是显示使用通过RT-LAMP法扩增后的新型冠状病毒基因组，进行与图9同样的实验而得的结果的图。

图13A是显示在新型冠状病毒的检测中利用的侧向流检测(lateral flow assay)的检测原理的图。

图13B是显示将新型冠状病毒用图13A的侧向流检测(lateral flow assay)进行检测而得的结果的图。

图14是显示对连续稀释而得的病毒RNA的样品，与图13B同样地进行侧向流检测(lateral flow assay)而得的结果的图。

图15是显示用于将RNA病毒通过侧向流检测(lateral flow assay)进行检测的本发明的方法(CONAN法)的流程的图。

图16是显示使用Taqman^TM探针检测甲型流感病毒(H1N1、H3N2)的巴洛沙韦(Xofluza)耐性突变部位而得的结果的图。检测到突变部位为野生型的基因。

图17是显示使用Taqman^TM探针进行检测甲型流感病毒(H1N1、H3N2)的达菲(Tamiflu)耐性突变部位而得的结果的图。检测到突变部位为突变型的基因。

具体实施方式

＜检测试样中的特定DNA的方法＞

本发明提供利用了CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA的、检测试样中的特定DNA的方法。

本发明的检测方法包括：(a)使该试样与以该特定DNA为靶标的CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA接触的工序，和(b)检测在该试样中存在该特定DNA的情况下产生的、由CRISPR-Cas3系统造成的单链探针DNA的切割的工序。

-靶标DNA-

在本发明的检测方法中，作为成为检测的对象的特定DNA(以下称为“靶标DNA”)，只要能够成为CRISPR-Cas3系统的靶标，就不特别限制。靶标DNA既可以是双链DNA，也可以是单链DNA(参照图6)。

靶标DNA的来源不特别限制，既可以是来源于自然界的DNA，也可以是人工的DNA。作为来源于自然界的DNA，可列举例如，来源于病毒(例如，动物病毒、植物病毒、细菌病毒)的DNA、来源于原核生物(例如，细菌、放线菌、原核藻类、古细菌)的DNA、来源于真核生物(例如，动物、植物、真核藻类、真菌、原虫)的DNA。

本发明的检测方法的一个优选方案的例子是病毒感染的诊断。作为成为检测对象的靶标DNA所来源的病毒，不特别限制，既可以是DNA病毒，也可以是RNA病毒。在RNA病毒的情况下，可以通过进行反转录而制成靶标DNA。作为具体的病毒，可列举例如，反转录病毒、小RNA病毒、杯状病毒(Calcivirus)、披膜病毒、感冒病毒(フラウイルス)、冠状病毒(例如，新型冠状病毒“SARS-CoV2”)、弹状病毒、丝状病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亚病毒(ブンガウイルス)、沙粒病毒、正呼肠病毒、双RNA病毒、嗜肝DNA病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、双粒病毒、藻DNA病毒等，但不限于这些。

本发明的检测方法的其他优选方案的例子是病原菌感染、原虫感染的诊断。作为成为检测对象的靶标DNA所来源的病原菌、原虫，可列举例如，志贺氏菌、伤寒菌、沙门氏菌、病原性大肠杆菌、霍乱弧菌、弧菌属菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、耶尔森菌属、金黄色葡萄球菌、溶组织内阿米巴原虫、利什曼原虫、疟疾原虫、锥虫、弓形虫、兰氏鞭毛虫、滴虫、肠袋虫、球虫等，但不限于这些。

本发明的检测方法的其他优选方案的例子是基因的突变、多态性的诊断。例如，病毒基因的突变可以作为该病毒的耐药性等的指标利用。例如，已知甲型流感病毒H1N1的RNA聚合酶基因(以下称为“PA基因”)的I38T突变(ATA→AGA)和甲型流感病毒H3N2的PA基因的I38T突变(ATA→ACA)与对巴洛沙韦(Xofluza)的耐性相关，甲型流感病毒H1N1的神经氨酸酶基因(以下称为“NA基因”)的I222R突变(ATA→AGA)、H274Y突变(CAC→TAC)、N294S突变(AAC→AGC)、以及甲型流感病毒H3N2的NA基因的E119V突变(GAA→GTA)、R292K突变(AGA→AAA)、N294S突变(AAC→AGC)与对达菲(Tamiflu)、瑞乐砂(Relenza)的耐性有关(Pizzornoet al.,Front.Immunol.,2019March 19,doi.10.3389/fimmu.2019.00531)。因此，通过将这些病毒基因的突变用本发明的方法进行检测，可以评价对病毒治疗药的耐性。

另外，人等的基因的突变、多态性(例如，单碱基多态性)可以作为例如，疾病的发病风险、药剂的有效性和/或副作用等的指标来利用。

本发明中，在试样中存在10¹⁰拷贝以上的靶标DNA的情况下，可以适合地进行检测(参照图8)，但通过进行试样中的DNA的扩增，从而即使当初的试样中仅包含1拷贝～10拷贝的靶标DNA的情况下也能够检测(参照图9、11、12)。

试样中的DNA的扩增可以在与CRISPR-Cas3系统接触前、或接触中实施。另外，DNA的扩增可以是靶标DNA(或者其特定区域)特异性的扩增或者偏重靶标DNA(或者其特定区域)的扩增。

DNA的扩增的方法是本领域技术人员公知的，可以利用各种方法。例如，各种PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)法(PCR法、RT-PCR法、定量PCR法等)、RPA(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)法、各种LAMP(loop-mediated isothermal Amplification，环介导等温扩增)法(LAMP法、RT-RAMP法、定量LAMP法等)、HDA(helicase-dependent Amplification，解旋酶依赖性扩增)法、SDA(stranddisplacement amplification，链置换扩增)法、NASBA(nucleic acid sequence-basedamplification，核酸序列依赖性扩增)法、TMA(transcription mediated amplification，转录介导的扩增)法、NEAR(nicking enzyme amplification reaction，切口酶扩增反应)法、MDA(multiple displacement amplification，多重置换扩增)法、RAM(Ramification，分歧)法等，但不限于这些。

-受检试样-

作为本发明的检测方法中的试样，可以使用想要检测靶标DNA的存在的所期望的试样(以下称为“受检试样”)。作为受检试样，可列举例如，包含体液(尿、唾液、血清、血浆、全血等)、生物体组织、细胞、细胞溶解物、纯化或合成而得的DNA的试样。

在诊断病毒、病原菌、或者原虫的感染的情况下，受检试样可以来源于例如，被怀疑这些感染的人患者、动物、植物等。

作为受检试样所来源的动物，可列举例如，哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行类、两栖类、昆虫类。哺乳动物是包含人和非人哺乳动物的概念。作为非人哺乳动物的例子，可列举牛、野猪、家猪、绵羊、山羊等偶蹄类、马等奇蹄类、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠等啮齿类、兔等兔目、犬、猫、鼬等食肉类等。上述非人哺乳动物可以是家畜或伴侣动物(宠物)，也可以是野生动物。动物细胞包括例如，构成动物的个体的细胞、构成由动物摘出的器官或组织的细胞、来源于动物的组织的培养细胞等。具体地，可列举例如，卵母细胞、精子等生殖细胞；各阶段的胚的胚细胞(例如，1细胞期胚、2细胞期胚、4细胞期胚、8细胞期胚、16细胞期胚、桑葚期胚等)；诱导多能性干(iPS)细胞、胚胎干(ES)细胞等干细胞；成纤维细胞、造血细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胰脏细胞、脑细胞、肾细胞等体细胞等。

作为受检试样所来源的植物，可列举例如，谷物类、油料作物、饲料作物、水果、蔬菜类，具体可列举例如，稻、玉米、香蕉、花生、向日葵、番茄、拟南芥、烟草、小麦、大麦、马铃薯、大豆、棉花、康乃馨等。植物细胞包含例如，构成植物的个体的细胞、构成从植物分离的器官或组织的细胞、来源于植物的组织的培养细胞等。作为植物的器官或组织，可列举例如，叶、茎、茎尖(生长点)、根、块茎、愈伤组织、繁殖材料(例如，种子、块根、块茎等)。

-CRISPR-Cas3系统-

1类的CRISPR-Cas系统分类为I型和III型，进而I型根据构成级联反应(Cascade)的蛋白质(以下，仅称为“级联反应”或“级联反应蛋白质”)的种类分类为I-A型、I-B型、I-C型、I-D型、I-E型、和I-F型的6个种类、以及作为I-B型的亚型的I-G型(例如，参照[van derOost J et al.,Nature Reviews Microbiologym,2014 12(7):479-492]、[Jackson RN etal.,Current Opinion in Structural Biology,2014 24:106-114])。

I型的CRISPR-Cas系统通过Cas3(具有核酸酶活性和解旋酶活性的蛋白质)、级联反应和crRNA协同，而具有切割DNA的功能。因为作为核酸酶使用Cas3，因而本发明中称为“CRISPR-Cas3系统”。

通过使用本发明的CRISPR-Cas3系统，例如，可得到以下优点。

首先，CRISPR-Cas3系统中使用的crRNA一般识别32～37碱基的目标序列(Ming Liet al.,Nucleic Acids Res.2017May 5；45(8):4642-4654)。与此相对，CRISPR-Cas9系统中使用的crRNA一般识别18～24碱基的目标序列。因此，认为CRISPR-Cas3系统能够比CRISPR-Cas9系统更正确地识别目标序列。

另外，作为2类的II型的系统的CRISPR-Cas9系统的PAM序列，是与目标序列的3’侧相邻的“NGG(N为任意碱基)”。另外，作为2类的V型的系统的CRISPR-Cpf1系统的PAM序列是与目标序列的5’侧相邻的“AA”。与此相对，本发明的CRISPR-Cas3系统的PAM序列，是与目标序列的5’侧相邻的“AAG”或与其类似的碱基序列(例如，“AGG”、“GAG”、“TAC”、“ATG”、“TAG”等)。因此认为，如果使用本发明的CRISPR-Cas3系统，则能够以现有方法不能识别的DNA区域作为靶标。

本发明的CRISPR-Cas3系统包含I型的全部6种亚型。即，构成CRISPR-Cas3系统的蛋白质有时根据亚型其构成等有若干不同(例如，构成级联反应的蛋白质不同)，本发明包含全部这些蛋白质。另外，关于本发明的CRISPR-Cas3系统，其来源的细菌的种类可以是任意的。

在I型的CRISPR-Cas3系统中一般的I-E型的CRISPR-Cas3系统通过crRNA与Cas3和级联反应(Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas5、Cas6、和Cas7)协同，来切割DNA。

I-A型的系统中，作为级联反应以Cas8a1、Csa5(Cas11)、Cas5、Cas6、和Cas7为构成要素，I-B型中，作为级联反应以Cas8b1、Cas5、Cas6、和Cas7为构成要素，I-C型中，作为级联反应以Cas8c、Cas5、和Cas7为构成要素，I-D型中，作为级联反应以Cas10d、Csc1(Cas5)、Cas6、和Csc2(Cas7)为构成要素，I-F型中，作为级联反应以Csy1(Cas8f)、Csy2(Cas5)、Cas6、和Csy3(Cas7)为构成要素，I-G型的系统中，作为级联反应以Cst1(Cas8a1)、Cas5、Cas6、和Cst2(Cas7)为构成要素。本发明中，将Cas3和级联反应总称为“Cas蛋白质群”。

以下，以I-E型的CRISPR-Cas3系统作为代表例进行说明，但对于其他类型的CRISPR-Cas3系统，适宜替换阅读成构成系统的级联反应即可。

-Cas蛋白质群、编码该蛋白质群的多核苷酸、表达该多核苷酸的载体-

在本发明的检测方法中，Cas蛋白质群可以以蛋白质的形态、编码该蛋白质的多核苷酸的形态、或者包含该多核苷酸的表达载体的形态利用。

构成在本发明中使用的Cas蛋白质群的各蛋白质的一个优选方案是以下的野生型大肠杆菌的蛋白质。

Cas3：由序列号1所记载的氨基酸序列组成的蛋白质(由序列号7所记载的碱基序列编码的蛋白质)

Cse1(Cas8)：由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质(由序列号8所记载的碱基序列编码的蛋白质)

Cse2(Cas11)：由序列号3所记载的氨基酸序列组成的蛋白质(由序列号9所记载的碱基序列编码的蛋白质)

Cas5：由序列号4所记载的氨基酸序列组成的蛋白质(由序列号10所记载的碱基序列编码的蛋白质)

Cas6：由序列号5所记载的氨基酸序列组成的蛋白质(由序列号11所记载的碱基序列编码的蛋白质)

Cas7：由序列号6所记载的氨基酸序列组成的蛋白质(由序列号12所记载的碱基序列编码的蛋白质)。

构成在本发明中使用的Cas蛋白质群的各蛋白质的其他一个优选方案，是由在上述各蛋白质的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质。这里所谓“多个”，通常为50个氨基酸以内、优选为30个氨基酸以内、更优选为20个氨基酸以内、特别优选为10个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内、1个氨基酸)。

构成在本发明中使用的Cas蛋白质群的各蛋白质的其他一个优选方案，是由与上述各蛋白质的氨基酸序列具有高的同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。所谓高的同一性，例如是80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上(例如，91％以上、92％以上、93％以上、94％以上)、进一步优选为95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)的序列的同一性。序列的同一性可以利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool atthe National Center for Biological Information(美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具))等(使用例如，默认、即初始设定的参数)来确定。

构成在本发明中使用的Cas蛋白质群的各蛋白质的其他一个优选方案，是由与由上述各蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的蛋白质。

其中“严格条件”是指2条多核苷酸链形成碱基序列特异性的双链多核苷酸，但不形成非特异性的双链多核苷酸的条件。所谓“在严格条件下杂交”，换言之，也可以说是在序列同一性高的核酸彼此(例如完全配对的杂交体)的熔解温度(Tm值)至低于熔解温度15℃的温度、优选低于熔解温度10℃的温度、更优选低于熔解温度5℃的温度的温度范围内能够杂交的条件。

如果显示严格条件的一例，则如下。首先，在由0.25M Na₂HPO₄、7％SDS、1mM EDTA、1×邓哈特溶液(Denhardt’s solution)组成的缓冲液(pH7.2)中，以60～68℃(优选为65℃、更优选为68℃)使2种多核苷酸杂交16～24小时。然后，在由20mM Na₂HPO₄、1％SDS、1mM EDTA组成的缓冲液(pH7.2)中，以60～68℃(优选为65℃、更优选为68℃)进行2次15分钟的洗涤。

作为其他例，可列举以下方法。首先，在包含25％甲酰胺(更严格的条件下为50％甲酰胺)、4×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)、50mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH7.0)、10×邓哈特溶液(Denhardt’s solution)、20μg/mL变性鲑鱼精DNA的杂交溶液中，以42℃进行一夜预杂交后，添加经标记的探针，在42℃保温一夜，从而进行2种多核苷酸的杂交。

接下来，在以下任一条件下进行洗涤。通常的条件：以1×SSC和0.1％SDS作为洗涤液，在37℃左右洗涤。严格的条件：以5×SSC和0.1％SDS作为洗涤液，在42℃左右洗涤。更严格的条件：以0.2×SSC和0.1％SDS作为洗涤液，在65℃左右洗涤。

这样，杂交的洗涤条件越严格，则越成为特异性高的杂交。此外，上述SSC、SDS和温度条件的组合只不过是例示。通过将确定杂交的严格性的上述要素、或其他要素(例如，探针浓度、探针的长度、杂交反应时间等)适宜组合，能够实现与上述同样的严格性。这在例如[Joseph Sambrook&David W.Russell,Molecular cloning:a laboratory manual 3rdEd.,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001]等中记载。

上述各蛋白质在与构成CRISPR-Cas3系统的其他分子形成复合体而识别靶标DNA时，给该复合体带来单链DNA的非特异性切割活性(请参照实施例)。

构成上述Cas蛋白质群的各蛋白质根据需要可以进一步添加功能性分子。作为功能性分子，可列举例如，用于促进真核细胞向核内的转运的核定位信号、用于使纯化容易的标签、用于使检测容易的报告物蛋白质等，但不限于这些。这些功能性分子可以添加在例如，构成Cas蛋白质群的各蛋白质的N末端侧和/或C末端侧。

作为核定位信号，可列举例如，PKKKRKV(序列号13)、KRTADGSEFESPKKKRKVE(序列号14)等。作为标签，可列举例如，多聚组氨酸标签、FLAG-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等。另外，作为报告物蛋白质，可列举例如，绿色荧光蛋白(GFP)等荧光蛋白质、萤光素酶等化学发光蛋白质等。

本发明中，可以利用编码Cas蛋白质群的多核苷酸，其一个优选方案为以下。

Cas3：由序列号7所记载的碱基序列组成的多核苷酸

Cse1(Cas8)：由序列号8所记载的碱基序列组成的多核苷酸

Cse2(Cas11)：由序列号9所记载的碱基序列组成的多核苷酸

Cas5：由序列号10所记载的碱基序列组成的多核苷酸

Cas6：由序列号11所记载的碱基序列组成的多核苷酸

Cas7：由序列号12所记载的碱基序列组成的多核苷酸。

这些是编码大肠杆菌的野生型Cas蛋白质群的多核苷酸，但也可以根据目的利用人工改变了的多核苷酸。作为多核苷酸的人工改变，可列举例如，向适合宿主细胞内或者体外(in vitro)表达系统中的表达的碱基序列的改变(例如，密码子的最优化)。

本发明中，可以利用用于表达Cas蛋白质群的表达载体。作为表达载体，可以使用各种公知的载体。作为表达载体，可列举例如，噬菌体载体、质粒载体、病毒载体、反转录病毒载体、染色体载体、附加体载体和病毒来源载体(细菌质粒、噬菌体、酵母附加体等)、酵母染色体元件和病毒(杆状病毒、乳多泡病毒(papovavirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、腺病毒、禽痘病毒(avipoxvirus)、假性狂犬病病毒、疱疹病毒、慢病毒、反转录病毒等)、和来源于它们的组合的载体(粘粒、噬菌粒等)。

表达载体进一步优选包含用于转录起始和转录终止的部位，并且转录区域中包含核糖体结合部位。载体中的成熟转录物的编码部分在应被翻译的多肽的开始处包含转录起始密码子AUG，并且在结束处包含适当位置的终止密码子。

本发明中，用于表达Cas蛋白质群的表达载体可以包含启动子序列。启动子序列根据基因表达的场所(例如，宿主的种类)而适宜选择即可。另外，表达载体可以包含用于增强从DNA的转录的序列、例如增强子序列。作为增强子，可列举例如，SV40增强子(其配置在复制起点的下游100～270bp处)、巨细胞病毒的初始启动子增强子、配置在复制起点的下游的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。另外，表达载体可以包含用于使转录出的RNA稳定化的序列、例如多聚A添加序列(多聚腺苷化序列、polyA)。作为多聚A添加序列的例子，可列举生长激素基因来源的多聚A添加序列、牛生长激素基因来源的多聚A添加序列、人生长激素基因来源的多聚A添加序列、SV40病毒来源的多聚A添加序列、人或兔的β珠蛋白基因来源的多聚A添加序列。

编码Cas蛋白质群的多核苷酸可以是搭载在1种(同一)载体这样的设计，另外，也可以是将编码各Cas蛋白质群的多核苷酸的全部或一部分搭载在各自不同的载体这样的设计。例如，可以是将编码级联反应蛋白质的多核苷酸搭载在1种(同一)载体、将编码Cas3的多核苷酸搭载在别的载体这样的设计。

另外，也可以使用包含编码Cas蛋白质群的多个碱基序列、在该多个碱基序列之间插入有编码被细胞内的蛋白酶切割的氨基酸序列(2A肽等)的碱基序列的表达载体。如果具有这样的碱基序列的多核苷酸被转录/翻译，则在细胞内表达连接成一体的多肽链。然后，通过细胞内蛋白酶的作用，Cas蛋白质群被分离，形成单个的蛋白质后形成复合体，发挥功能。由此，能够调整所表达的Cas蛋白质群的量比。

本发明中使用的表达载体可以通过公知的方法制作。作为这样的方法，除了载体制作用的试剂盒所附带的实施手册中记载的方法之外，还可列举各种指导书中记载的方法。例如，[Joseph Sambrook&David W.Russell,Molecular cloning:a laboratorymanual 3rd Ed.,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001]是总括的指导书。

-crRNA、编码该crRNA的多核苷酸、或包含该多核苷酸的表达载体-本发明中使用的CRISPR-Cas3系统为了对特定DNA的目标化，包含crRNA、编码crRNA的多核苷酸、或包含该多核苷酸的表达载体。

crRNA是形成CRISPR-Cas系统的一部分的RNA，具有与靶标DNA中的靶标序列互补的碱基序列。CRISPR-Cas3系统可以通过crRNA而特异性地识别目标序列并切割该序列。

在使CRISPR-Cas3系统的功能性复合体在细胞内形成的情况下，作为crRNA，优选使用pre-crRNA(国际公开2018/225858号公报)。

pre-crRNA典型地具有“前导序列-重复序列-间隔序列-重复序列(LRSR结构)”或“重复序列-间隔序列-重复序列(RSR结构)”的结构。前导序列是AT富集的序列，作为表达pre-crRNA的启动子发挥功能。重复序列是隔着间隔序列而反复的序列，间隔序列是作为与靶标DNA中的靶标序列互补的序列而在本发明中设计的序列(本来是在适应的过程中引入的外来DNA来源的序列)。pre-crRNA被构成级联反应的蛋白质(例如，I-A、I-B、I-D～I-E型中为Cas6、I-C型中为Cas5)切割，则变成成熟crRNA。

典型地，前导序列的链长为86碱基，重复序列的链长为29碱基。间隔序列的链长例如为10～60碱基、优选为20～50碱基、更优选为25～40碱基、典型为32～37碱基。因此，本发明中使用的pre-crRNA的链长在LRSR结构的情况下，例如为154～204碱基、优选为164～194碱基、更优选为169～184碱基、典型为176～181碱基。另外，在RSR结构的情况下，例如为68～118碱基、优选为78～108碱基、更优选为83～98碱基、典型为90～95碱基。

认为为了使CRISPR-Cas3系统的复合体在细胞内形成并发挥功能，pre-crRNA的重复序列被构成级联反应的蛋白质切割的过程是重要的。因此请理解，上述重复序列只要产生这样的切割，则可以比上述链长短，也可以长。即，pre-crRNA可以说是在后述的成熟crRNA的两端添加了对于由构成级联反应的蛋白质产生的切割充分的序列的crRNA。

另一方面，pre-crRNA被切割而生成的成熟crRNA具有“5’柄序列-间隔序列-3’柄序列”的结构。典型地，5’柄序列由重复序列的第22～29位的8碱基组成，被Cas5握持。另外，典型地，3’柄序列由重复序列的第1～21位的21碱基组成，以第6～21位的碱基形成茎环结构，被Cas6握持。因此，成熟crRNA的链长通常为61～66碱基。但是，根据CRISPR-Cas3系统的类型，也有不带3’柄序列的成熟crRNA，因此此时链长变短至21碱基。

此外，RNA的序列可以根据靶标序列而适宜设计。另外，RNA的合成可以使用该领域已知的任意方法进行。

-单链探针DNA-

在本发明的检测方法中使用的单链探针DNA只要其切割能够检测到，就不特别限制。单链探针DNA可以是直链状，也可以是环状，但优选为直链状(请参照图1)。构成单链探针DNA的核酸可以包含1种以上的修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰、糖修饰)。

结合于单链探针DNA的标记的一个优选方案是荧光色素/猝灭剂对。在该方案中，在荧光色素/猝灭剂对与单链探针DNA结合而接近的状态下，来自荧光色素的信号减低或消失，但如果单链探针DNA被切割而荧光色素与猝灭剂分离，则检测到来自荧光色素的充分的信号。因此，以由通过识别并结合了靶标DNA的CRISPR-Cas3系统而被切割了的单链探针DNA产生的荧光信号作为指标，能够检测受检试样中的靶标DNA。

荧光色素和猝灭剂对单链探针DNA的结合，只要两者接近到足以产生消光，并且单链探针DNA被切割后两者分离，就不特别限制，例如，可以在单链探针DNA的一个末端结合荧光色，另一个末端结合猝灭剂。为了增大探针内的消光作用，也可以结合补加的猝灭剂。在这种情况下，可以制成在单链探针DNA的内部结合有补加的猝灭剂(内部猝灭剂)的双猝灭剂探针。

作为在荧光色素/猝灭剂对中使用的荧光色素，可列举例如，ATTO色素、花青色素(例如，Cy3、Cy5)、四甲基罗丹明(例如，TRITC)、羧酸荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)、德克萨斯红、Yakima Yellow等，作为猝灭剂的具体例，可列举例如，darkquencher、BHQ(Black Hole Quencher)、IBFQ(Iowa Blak FQ)、IBRQ(Iowa Blak RQ)、Eclipse等，但不限于这些。作为内部猝灭剂，可以适合使用例如，ZEN、TAO。用于检测探针DNA的切割的荧光色素/猝灭剂对的利用对于本领域技术人员是公知的(例如，请参照国际公开2019/104058号公报)。

结合于单链探针DNA的标记的其他优选方案，是用于荧光共振能量转移(FRET)的供体/受体对。在该方案中，在供体/受体对与单链探针DNA结合并接近的状态下，供体的激发引起受体的激发和发光(即，产生FRET信号)，但如果单链探针DNA被切割而供体与受体分离，则FRET信号减低或消失。因此，以通过识别并结合了靶标DNA的CRISPR-Cas3系统而被切割了的单链探针DNA中的FRET信号的减低或消失作为指标，能够检测受检试样中的靶标DNA。

FRET的供体和受体对单链探针DNA的结合，只要两者接近到对于产生FRET充分，并且在单链探针DNA被切割后两者分离，就不特别限制，例如，可以使单链探针DNA的一个末端结合供体，另一末端结合受体。

作为用于FRET的供体/受体对，可列举例如，BFP/eGFP、BFP/YFP、BFP/DsRed2、CFP/YFP、CFP/DsRed2、Midoriishi-Cyan/Kusabira-Orange、eGFP/DsRed、eGFP/Rhod-2、FITC/TRITC、FITC/Rhod-2、FITC/Cy3、Alexa488/Alexa546、Alexa488/Alexa555、Alexa488/Cy3、YFP/TRITC、YFP/Cy3、Cy3/Cy5、Cy3/Cy5.5、荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/FITC、IAEDANS/5-(碘乙酰胺基)荧光素、荧光素/荧光素、EDANS/丹酰、色氨酸/丹酰、色氨酸/芘、丹酰/荧光素、萘/丹酰、芘/香豆素、藻红蛋白/Cy5等，但不限于这些。用于检测探针DNA的切割的供体/受体对的利用对于本领域技术人员而言是公知的(例如，请参照国际公开2019/104058号公报)。

另外，利用了单链探针DNA的本发明的检测方法，可以应用于免疫层析法(侧向流检测(lateral flow assay))。在该方案中，例如，作为单链探针DNA，使用结合有第一标签和第二标签的单链探针DNA，作为捕捉结合有标签的单链探针DNA的标记体，使用经标记的针对第二标签的抗体(以下，称为“标记抗体”)。并且，预先在免疫层析法用试纸条的第一测线(试纸条的上游的测线)上固定针对第一标签的结合分子，预先在第二测线(试纸条的下游的测线)上固定针对上述标记抗体的结合分子。

在该免疫层析法中，在试样中不存在靶标DNA的情况下，介由单链探针DNA(未被切割)的第二标签，形成该单链探针DNA与标记抗体的复合体，该复合体介由单链探针DNA(未被切割)的第一标签，被固定于第一测线上的针对第一标签的结合分子捕捉，在第一测线上检测到由标记抗体产生的信号。

另一方面，在试样中存在靶标DNA的情况下，通过单链探针DNA的切割而第一标签与第二标签分离。形成被分离的第二标签与标记抗体的复合体，该复合体通过固定于第二测线的针对该标记抗体的结合分子而被第二测线，在第二测线上检测到由标记抗体产生的信号。第二标签与标记抗体的复合体不保持第一标签、不被第一测线捕捉，因而在第一测线上检测不到该信号。

第一标签和第二标签对单链探针DNA的结合，只要是在单链探针DNA被切割后两标签分离，不特别限制，例如，可以在单链探针DNA的一个末端结合第一标签，在另一个末端结合第二标签。

作为第一标签及其结合分子，可列举例如，链霉抗生物素蛋白与生物素的组合，作为第二标签，可列举例如FITC，作为标记抗体中的标记，可列举例如金粒子，作为针对标记抗体的结合分子，可列举例如，蛋白A、二抗(与标记抗体结合的抗体)。利用免疫层析法的单链探针DNA的切割的检测的原理对于本领域技术人员而言是公知的(Gootenberg et al.，Science2018；360：439-444)。该免疫层析法中的试纸可以利用市售品(例如，HybriDetect(Milenia Biotec社))。

在单链探针DNA的切割的检测中，可以利用上述以外的各种手法(例如，请参照国际公开2019/104058号公报)。

-受检试样、CRISPR-Cas3系统、和单链探针DNA的接触-

本发明的检测方法中的受检试样、CRISPR-Cas3系统、和单链探针DNA的接触，例如，可以通过受检试样、CRISPR-Cas3系统、和单链探针DNA的混合来进行。在受检试样包含细胞的情况下，可以包括向受检试样中的细胞导入CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA的进一步操作。

受检试样与CRISPR-Cas3系统的接触中，可以单独制备crRNA和Cas蛋白质群，使它们与受检试样接触，另外，也可以预先制备crRNA与Cas蛋白质群的复合体，使该复合体与受检试样接触。在受检试样中的细胞中导入CRISPR-Cas3系统时，可以在该细胞内使crRNA和/或Cas蛋白质群表达。

作为将构成本发明的CRISPR-Cas3系统的分子以多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体的形态导入细胞的方法，可以利用例如，电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、阳离子脂质体介导转染、电穿孔、转导、使用病毒载体的感染等公知的方法，作为将构成CRISPR-Cas3系统的分子以蛋白质(或者，核糖核蛋白复合体)的形态导入细胞的方法，可以利用例如，显微注射法、电穿孔法、阳离子脂质体介导转染等公知的方法。这样的方法在“Leonard G.Daviset al.,Basic methods in molecular biology,New York:Elsevier,1986”等大量的标准的研究室手册中记载。

＜用于检测试样中的特定DNA的试剂盒＞

本发明中的用于检测试样中的特定DNA的试剂盒包含(a)以特定DNA作为靶标的CRISPR-Cas3系统、和(b)单链探针DNA。本发明的试剂盒的构成要素可以是各自独立的方式，也可以是全部或一部分混合的方式。

另外，本发明的试剂盒根据检测方法的方式，可以进一步包含例如，标准试样(各浓度)、对照试样、试样稀释液、反应缓冲液、洗涤液等。另外，根据单链探针DNA中的标记的种类，可以进一步包含例如，针对标记(例如，标签)的结合分子(例如，与标签结合的标记抗体)、标记的检测所需的试剂等。本发明的试剂盒可以进一步包含使用说明书。

实施例

基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。

A.材料和方法

(1)Cas3和级联反应蛋白质的制备

在本检测系统中，利用大肠杆菌来源I-E型CRISPR。Cas3蛋白质使用昆虫细胞Sf9来纯化。将His标签化后的带有核定位信号(bpNLS)的Cas3序列装入杆状病毒基因表达载体中，然后使用大肠杆菌株DH10bac制成杆状病毒。使昆虫细胞Sf9感染所制成得杆状病毒并表达Cas3蛋白质，然后回收总蛋白质，通过镍柱和凝胶过滤纯化来纯化Cas3蛋白质。在包含crRNA的带有NLS的级联反应复合体的制备中，制成经His标签化的Cas11表达质粒(pCDFDuet-1)、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas11表达质粒(pRSFDuet-1)、靶标crRNA表达质粒(pACYCDuet-1)3种，将全部导入大肠杆菌BL21使其表达。回收总蛋白质，然后通过镍柱和凝胶过滤纯化来纯化级联反应复合体。

此外，靶标序列为人EMX1基因内序列(TGGCGCATTGCCACGNNNCAGGCCAATGGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAG/序列号：15)和小鼠Tyr基因内序列(GCATTACTATGTGTCNNNGGACACACTGCTTGGGGGCTCTGAAATATGGAGGGACATTGA/序列号：16)。“NNN”是在各实验中利用的PAM序列。另外，Cas蛋白质群的序列示于序列号1～12，核定位信号(bpNLS)的序列示于序列号14。

(2)利用电泳测定非特异性切割

在反应缓冲液(5mM HEPES-K pH7.5、60mM KCl、10mM MgCl₂、10μM CoCl₂、2.5mMATP)中混合Cas3蛋白质(5ng/μL)、级联反应复合体(25ng/μL)、包含靶标序列的双链DNA片段(2ng/μL)、和用于确认非特异性切割的供体DNA(4.5ng/μL)。将反应溶液在37℃温育1小时，使用毛细管电泳装置“MultiNa”(岛津制作所)进行电泳。作为双链DNA片段的PAM序列，除了CRISPR-Cas3系统能够识别的“AAG”和“ATG”之外，还使用不能识别的“CCA”，分别进行了研究。作为供体DNA，使用约1kb的直链状单链DNA、约7kb的环状单链DNA(M13mp18 DNA)、和约3kb的环状双链DNA(pBlueScript)，分别研究利用CRISPR-Cas3系统的切割活性。

(3)利用DNaseAlert^TM的核酸酶活性测定

为了用荧光探针检测非特异性切割，使用DNaseAlert^TM Kit(IDT社)进行非特异性切割的测定。在反应缓冲液(5mM HEPES-K pH7.5、60mM KCl、10mM MgCl₂、10μM CoCl₂、2.5mMATP)中混合了Cas3蛋白质(20ng/μL)、级联反应复合体(32ng/μL)、包含靶标序列的双链DNA片段(2ng/μL)。在DNaseAlert的底物管中加入5μL的无核酸酶水和10×Alert Buffer制备底物溶液，然后将试样20μL与底物溶液(荧光探针溶液)5μL混合，使用实时PCR装置在37℃每隔30秒经时观察HEX信号的强度。

(4)利用Taqman^TM探针的核酸酶活性测定

为了也用单链DNA的荧光探针进行检测，而使用Taqman^TM探针(序列信息：HEX-AAGGTCGGA-ZEN-GTCAACGGATTTGGTC-IBFQ/序列号：17；Thermo Fisher社)进行非特异性切割的测定。在反应缓冲液(5mM HEPES-K pH7.5、60mM KCl、10mM MgCl₂、10μM CoCl₂、2.5mMATP)中混合了Cas3蛋白质(20ng/μL)、级联反应复合体(32ng/μL)、包含靶标序列的双链DNA片段或单链DNA片段(2ng/μL)。将Taqman^TM探针0.5μL使用5μL的无核酸酶水和10×AlertBuffer进行制备，然后混合试样20μL和底物溶液5μL，使用实时PCR装置(CFX Connect、Bio-Rad Laboratories社)，在37℃每隔30秒经时观察HEX信号的强度。

(5)PAM序列的靶标特异性评价

制备将双链DNA片段的PAM序列(3碱基)变更为全部的序列图谱(64种)的样品，与(4)同样地使用Taqman^TM探针测定非特异性切割活性。计算出反应开始后1分钟中的荧光信号的上升速度，将其值进行比较，从而评价由PAM序列的靶标识别的差异造成的活性强度。

(6)检测限浓度的测定

(i)双链DNA片段溶液中的测定

通过连续稀释调整双链DNA片段的浓度，与(4)同样地使用Taqman^TM探针测定各浓度中的活性强度。另外，针对稀释后的DNA试样，将使用TwistAmp Basic kit(TwistDx社)的RPA法在37℃、20分钟的温育的条件实施，扩增试样中的DNA，再次测定活性强度。

(ii)基因组混合溶液中的测定

在将双链DNA片段的浓度连续稀释而得的DNA溶液中作为非特异性的DNA混合小鼠基因组20ng而制备基因组混合溶液，然后将使用TwistAmp Basic kit(TwistDx社)的RPA法在37℃、20分钟的温育的条件下实施，扩增试样中的DNA，与(4)同样地使用Taqman^TM探针测定各浓度中的活性强度。

(7)新型冠状病毒RNA的检测

以新型冠状病毒(SAS-CoV2)的N基因作为靶标，制备在检测中使用的SARS特异性的Cascade复合体。作为新型冠状病毒RNA，使用将利用VeroE6/TMPRSS2细胞株增殖而得的病毒通过QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN社)纯化而得的。将病毒RNA溶液进行连续稀释之后，将利用WarmStart LAMP Kit(NEB社)的RT-LAMP法在62℃、30分钟的温育的条件下实施，扩增病毒基因组。在反应缓冲液(5mM HEPES-K pH7.5、60mM KCl、10mM MgCl₂、10μMCoCl₂、2.5mM ATP、400nM Cas3蛋白质、100nM级联反应复合体、250nM Taqman^TM探针)18μl中混合上述病毒基因组扩增液2μl，通过实时PCR测定各浓度中的活性强度。在靶标扩增中使用的引物组使用PrimerExplorerV5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)进行设计。

此外，病毒特异的靶标序列如下。

SARS-N1：aaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgag/序列号：18

SARS-N2：aaggaactgattacaaacattggccgcaaattgca/序列号：19

另外，在RT-RAMP法中使用的引物如下。

＜SARS-N1组＞

SARS-N1-FIP：GTTGGCCTTTACCAGACATTTTGGTGATGCTGCTCTTGCTT/序列号：20

SARS-N1-BIP：TGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCAGCTTGTGTTACATTGTATGC/序列号：21

SARS-N1-F3：ACTTCTCCTGCTAGAATGG/序列号：22

SARS-N1-B3：GTTTGTTCTGGACCACGT/序列号：23

SARS-N1-LF：TTCAATCTGTCAAGCAGCAGCA/序列号：24

SARS-N1-LB：GGCAAAAACGTACTGCCACTA/序列号：25。

＜SARS-N2组＞

SARS-N2-FIP：TCTGATTAGTTCCTGGTCCCCAAAGCATACAATGTAACACAAGC/序列号：26

SARS-N2-BIP：CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG/序列号：27

SARS-N2-F3：GCAAAAACGTACTGCCAC/序列号：28

SARS-N2-B3：GAAATTTGGATCTTTGTCATCC/序列号：29

SARS-N2-LF：TGGACCACGTCTGCCGA/序列号：30

SARS-N2-LB：ACCTTCGGGAACGTGGTT/序列号：31。

(8)利用侧向流试纸的检测

为了用侧向流试纸将信号可视化，委托FASMAC社合成用FITC和生物素标记化了的信号探针(FITC-GTCAACGGATTTGGTC-BIO/序列号：32)。在反应缓冲液(5mM HEPES-K pH7.5、60mM KCl、10mM MgCl₂、10μM CoCl₂、2.5mM ATP、400nM Cas3蛋白质、200nM级联反应复合体、100nM探针)18μl中混合上述病毒基因组扩增液2μl，在37℃温育10分钟。加入水50μl之后，在反应缓冲液中浸入HybriDetect(Milenia Biotec社)的试纸的一端(对照测线侧)，在室温静置2分钟之后，进行检测。

(9)耐药性突变流感病毒序列的检测

为了检测耐药性突变流感病毒的单碱基突变，针对巴洛沙韦制剂和神经氨酸酶抑制药的耐性突变部分，设计crRNA的靶标序列，制备包含该crRNA的级联反应复合体。制备具有野生型序列和突变型序列的双链DNA片段溶液(40ng/μl)与反应缓冲液(5mM HEPES-KpH7.5、60mM KCl、10mM MgCl₂、10μM CoCl₂、2.5mM ATP、400nM Cas3蛋白质、100nM级联反应复合体、250nM Taqman^TM探针)的混合液20μl，使用实时PCR装置(CFX Connect、Bio-RadLaboratories社)测定活性强度。

此外，crRNA序列如下。

＜巴洛沙韦(Xofluza)耐性突变＞

野生型检测用；H1N1-Cascade-I38：TGCAGCAAACTTATTAGTTTCAATTTTGGGGT/序列号：33

野生型检测用；H3N2-Cascade-I38：TGCACTCACTTGGAGGTGTGTTTCATGTATTC/序列号：34。

＜达菲(Tamiflu)耐性突变＞

突变型检测用；H1N1-Cascade-I222：ATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTG/序列号：35

突变型检测用；H1N1-Cascade-H274：TAATTAGGGGCTTTCATTTCGACTGATTTGAT/序列号：36

突变型检测用；H3N2-Cascade-N294：CTGTCTCTGCAGACACATCTGACACCAGGATA/序列号：37。

另外，用于检测流感病毒的耐药性突变的DNA片段序列如下(下划线表示与突变部位对应的碱基)。

H1N1-PA-I38：GGGAAGACCCCAAAATTGAAACTAATAAGTTTGCTGCAATTTGCACACATTTGGAAGTTTGTTTCATGTATTCGGATTTC/序列号：38

H1N1-PA-I38T：GGGAAGACCCCAAAATTGAAACTAATAAGTTTGCTGCAACTTGCACACATTTGGAAGTTTGTTTCATGTATTCGGATTTC/序列号：39

H3N2-PA-I38：GGGGAGGATCTGAAAATTGAAACCAACAAATTTGCAGCAATATGCACTCACTTGGAGGTGTGTTTCATGTATTCAGATTT/序列号：40

H3N2-PA-I38T：GGGGAGGATCTGAAAATTGAAACCAACAAATTTGCAGCAACATGCACTCACTTGGAGGTGTGTTTCATGTATTCAGATTT/序列号：41

H1N1-NA-I222：GGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGGAACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGG/序列号：42

H1N1-NA-I222R：GGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGGAACAATAGATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGG/序列号：43

H1N1-NA-H274：AAAGATAATCAAATCAGTCGAAATGAAAGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTACCCTGATTCTAGTGAAA/序列号：44

H1N1-NA-H274Y：AAAGATAATCAAATCAGTCGAAATGAAAGCCCCTAATTATTACTATGAGGAATGCTCCTGTTACCCTGATTCTAGTGAAA/序列号：45

H3N2-PA-N294：TATCCTCGATATCCTGGTGTCAGATGTGTCTGCAGAGACAACTGGAAAGGATCCAACCGGCCCATCATAGATATAAACAT/序列号：46

H3N2-PA-N294S：TATCCTCGATATCCTGGTGTCAGATGTGTCTGCAGAGACAGCTGGAAAGGATCCAACCGGCCCATCATAGATATAAACAT/序列号：47。

B.结果

利用电泳的非特异性切割的测定的结果是，在单独Cas3蛋白质、单独级联反应复合体、Cas3蛋白质与级联反应复合体的组合的任一情况下，只要没有包含靶标序列的DNA片段，就检测不到单链DNA的切割活性。另一方面，在混合了CRISPR-Cas3系统能够识别的PAM序列(AAG或ATG)和包含靶标序列的DNA片段的情况下，检测到供体单链DNA的分解(图1箭头)。另一方面，在混合了变更为CRISPR-Cas3系统不能识别的PAM序列(CCA)的DNA片段的情况下，检测不到供体DNA的分解。即使在以环状的单链DNA为对象的情况下，也确认了由CRISPR-Cas3系统产生的切割活性，但与以直链状的单链DNA为对象的情况相比，切割活性低一些。另一方面，使用双链DNA作为供体DNA的结果是，即使在包含靶标序列的DNA片段存在下也检测不到DNA的分解(图2箭头)。由以上的结果表明，CRISPR-Cas3系统仅在靶标序列存在下显示非特异性的单链DNA的切割活性。

接着，利用该CRISPR-Cas3系统的特征，研究能否用荧光探针(DNaseAlert^TM；在各端结合了荧光色素“HEX”和猝灭剂“dark quencher”的探针)检测靶标序列的有无。混合通过DNA分解(DNase)而发出荧光的底物(荧光探针)经时地测量荧光信号的结果表明，仅在混合了CRISPR-Cas3系统能够识别的PAM序列(AAG或ATG)和包含靶标序列的DNA片段的情况下，检测到强的荧光信号(图3)。在靶标序列为mTyr的情况下也得到同样的结果(图4)。为了更正确地检测单链DNA分解，使用荧光探针(Taqman^TM探针；在各端结合了荧光色素“HEX”和猝灭剂“IBFQ”，并作为内部猝灭剂导入了“ZEN”的双猝灭剂探针)进行了研究，结果表明，同样地仅在CRISPR-Cas3系统能够识别靶标序列的情况下，检测到荧光信号(图5)。

进而，为了确认是否即使靶标DNA为单链、CRISPR-Cas3系统也显示非特异性的单链DNA切割活性，进行了作为靶标DNA使用单链DNA片段的实验。其结果表明，即使靶标DNA是单链(靶标链)，也有意义地显示非特异性的单链DNA切割活性(图6)。

由以上的结果判明，通过CRISPR-Cas3系统识别靶标DNA序列(既可以是单链DNA，也可以是双链DNA)，从而诱导存在于周围的单链DNA的非特异性的切割活性。另外，判明了CRISPR-Cas3系统的该活性可以通过使用荧光探针来简便且有效地判别。

接着，为了研究由CRISPR-Cas3系统的靶标特异性不同造成的单链DNA切割活性的差异，改变靶标双链DNA片段内的PAM序列，在全部的PAM序列的图谱进行该活性的测定。其结果表明，对于以往报告的PAM序列(AAG、ATG等)显示高的活性强度，另一方面，在第1个碱基或第2个碱基为C的情况、第3个碱基为T的情况下，基本不显示活性(图7)。判明了由于PAM序列上的单碱基的变化影响由CRISPR-Cas3系统造成的非特异性的单链DNA切割活性，因而能够以该活性作为指标以单碱基水平的特异性来检测试样中的靶标DNA。

接着，为了研究能够检测的靶标DNA的临界浓度，将靶标DNA片段有限稀释而制备成单拷贝至10¹²拷贝，对于各浓度的靶标DNA片段测定活性强度。其结果是在使用10¹⁰拷贝以上的靶标DNA的情况下能够检测到有意义的信号(图8)。利用Cas12a、Cas13的现有系统也被报告显示10¹⁰拷贝左右的检测灵敏度，表明CRISPR-Cas3系统与它们显示同等的检测灵敏度。进而，将这些稀释试样中的DNA使用RPA法进行扩增，再次测定活性强度，结果即使当初仅包含1拷贝的靶标DNA的试样，也检测到非特异性的单链DNA切割活性(图9)。以上表明，仅通过组合RPA法等的简便的基因扩增法，就能够通过CRISPR-Cas3系统检测试样中的极微量(例如，1拷贝)的靶标DNA。

另外，为了研究非特异性的DNA序列大量存在的状况下的靶标DNA的临界浓度，在将靶标DNA片段有限稀释后的样品中混合小鼠基因组DNA，测定活性强度。其结果与图9同样地，即使对于仅包含1拷贝的靶标DNA的试样也能够检测(图11)。即表明，通过用RPA法等的方法扩增靶标DNA，即使在包含其他DNA的状态下也能够特异性地检测1拷贝以上的靶标DNA。

为了显示能够实际地在新兴感染症等的病毒检测中利用，合成了对新型冠状病毒(SARS-CoV2)的N基因特异的2种级联反应复合体(N1、N2)。对于各个区域实施RT-LAMP法，将扩增后的病毒基因组与Cas3和级联反应复合体蛋白质混合。其结果是N1能够以1拷贝的病毒RNA样品检测到信号，N2能够以10拷贝的病毒RNA样品检测到信号。包含1000拷贝以上的病毒的样品均能够100％检测(图12)。

接着，为了用侧向流检测(lateral flow assay)(图13A)检测新型冠状病毒，将通过RT-LAMP法扩增后的病毒基因组与用FITC和生物素标记化了的信号探针、Cas3、和Cascade复合体蛋白质混合，在该反应系统中浸泡侧向流试纸的一端(对照测线侧)。其结果表明，根据反应时间，侧向流试纸上的阳性带的信号变强，在37℃使其反应了10分钟的阶段，能够充分判别带的有无(图13B)。

进而，对连续稀释后的病毒RNA的样品进行侧向流检测(lateral flow assay)的结果表明，在使用100拷贝样品的情况下能够充分判别(图14)。

将本实验的测定的概要归纳于图15。由以上的结果证实，通过使用Cascade复合体和Cas3蛋白质，能够简便地检测新型冠状病毒(SARS-CoV2)。

接着，研究能否使用CRISPR-Cas3系统，检测针对巴洛沙韦制剂(巴洛沙韦(Xofluza)等)和神经氨酸酶抑制药(达菲(Tamiflu)、瑞乐砂(Relenza)等)的耐性流感病毒所具有的单碱基突变。对于作为甲型流感病毒(H1N1、H3N2)的巴洛沙韦(Xofluza)耐性突变已知的RNA聚合酶(PA)基因的I38T分别进行检测，结果H1N1、H3N2均成功地在野生型序列中获得了有意义地强的信号(图16)。

接下来，对于作为甲型流感病毒的达菲(Tamiflu)和瑞乐砂(Relenza)耐性突变已知的神经氨酸酶(NA)基因的突变(H1N1：I222R或H274Y、H3N2：N294S)分别进行检测，结果H1N1、H3N2均成功地在突变型序列中获得了有意义地强的信号(图17)。

由以上，通过针对突变部位设计CRISPR-Cas3系统中的crRNA的靶标序列，从而成功地检测单碱基水平的耐药性突变。

产业可利用性

根据本发明，通过利用CRISPR-Cas3系统和单链探针DNA，能够简便且有效地检测试样中的靶标DNA。本发明较大地贡献于例如，由病毒、病原菌、原虫造成的感染的诊断，与疾病风险、药剂有效性等有关的基因突变、多态性的诊断等。

序列表

<110> C4U株式会社

国立大学法人大阪大学

<120> 检测试样中的特定DNA的方法

<130> G20200143

<150> JP 2020-010216

<151> 2020-01-24

<150> JP 2020-086698

<151> 2020-05-18

<160> 47

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 888

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Met Glu Pro Phe Lys Tyr Ile Cys His Tyr Trp Gly Lys Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Leu Thr Lys Gly Asn Asp Ile His Leu Leu Ile Tyr His Cys Leu

20 25 30

Asp Val Ala Ala Val Ala Asp Cys Trp Trp Asp Gln Ser Val Val Leu

35 40 45

Gln Asn Thr Phe Cys Arg Asn Glu Met Leu Ser Lys Gln Arg Val Lys

50 55 60

Ala Trp Leu Leu Phe Phe Ile Ala Leu His Asp Ile Gly Lys Phe Asp

65 70 75 80

Ile Arg Phe Gln Tyr Lys Ser Ala Glu Ser Trp Leu Lys Leu Asn Pro

85 90 95

Ala Thr Pro Ser Leu Asn Gly Pro Ser Thr Gln Met Cys Arg Lys Phe

100 105 110

Asn His Gly Ala Ala Gly Leu Tyr Trp Phe Asn Gln Asp Ser Leu Ser

115 120 125

Glu Gln Ser Leu Gly Asp Phe Phe Ser Phe Phe Asp Ala Ala Pro His

130 135 140

Pro Tyr Glu Ser Trp Phe Pro Trp Val Glu Ala Val Thr Gly His His

145 150 155 160

Gly Phe Ile Leu His Ser Gln Asp Gln Asp Lys Ser Arg Trp Glu Met

165 170 175

Pro Ala Ser Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Gln Asp Lys Gln Ala Arg Glu

180 185 190

Glu Trp Ile Ser Val Leu Glu Ala Leu Phe Leu Thr Pro Ala Gly Leu

195 200 205

Ser Ile Asn Asp Ile Pro Pro Asp Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gly Phe

210 215 220

Cys Ser Leu Ala Asp Trp Leu Gly Ser Trp Thr Thr Thr Asn Thr Phe

225 230 235 240

Leu Phe Asn Glu Asp Ala Pro Ser Asp Ile Asn Ala Leu Arg Thr Tyr

245 250 255

Phe Gln Asp Arg Gln Gln Asp Ala Ser Arg Val Leu Glu Leu Ser Gly

260 265 270

Leu Val Ser Asn Lys Arg Cys Tyr Glu Gly Val His Ala Leu Leu Asp

275 280 285

Asn Gly Tyr Gln Pro Arg Gln Leu Gln Val Leu Val Asp Ala Leu Pro

290 295 300

Val Ala Pro Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys

305 310 315 320

Thr Glu Thr Ala Leu Ala Tyr Ala Trp Lys Leu Ile Asp Gln Gln Ile

325 330 335

Ala Asp Ser Val Ile Phe Ala Leu Pro Thr Gln Ala Thr Ala Asn Ala

340 345 350

Met Leu Thr Arg Met Glu Ala Ser Ala Ser His Leu Phe Ser Ser Pro

355 360 365

Asn Leu Ile Leu Ala His Gly Asn Ser Arg Phe Asn His Leu Phe Gln

370 375 380

Ser Ile Lys Ser Arg Ala Ile Thr Glu Gln Gly Gln Glu Glu Ala Trp

385 390 395 400

Val Gln Cys Cys Gln Trp Leu Ser Gln Ser Asn Lys Lys Val Phe Leu

405 410 415

Gly Gln Ile Gly Val Cys Thr Ile Asp Gln Val Leu Ile Ser Val Leu

420 425 430

Pro Val Lys His Arg Phe Ile Arg Gly Leu Gly Ile Gly Arg Ser Val

435 440 445

Leu Ile Val Asp Glu Val His Ala Tyr Asp Thr Tyr Met Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Glu Ala Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Val Gly Gly Ser Val Ile

465 470 475 480

Leu Leu Ser Ala Thr Leu Pro Met Lys Gln Lys Gln Lys Leu Leu Asp

485 490 495

Thr Tyr Gly Leu His Thr Asp Pro Val Glu Asn Asn Ser Ala Tyr Pro

500 505 510

Leu Ile Asn Trp Arg Gly Val Asn Gly Ala Gln Arg Phe Asp Leu Leu

515 520 525

Ala His Pro Glu Gln Leu Pro Pro Arg Phe Ser Ile Gln Pro Glu Pro

530 535 540

Ile Cys Leu Ala Asp Met Leu Pro Asp Leu Thr Met Leu Glu Arg Met

545 550 555 560

Ile Ala Ala Ala Asn Ala Gly Ala Gln Val Cys Leu Ile Cys Asn Leu

565 570 575

Val Asp Val Ala Gln Val Cys Tyr Gln Arg Leu Lys Glu Leu Asn Asn

580 585 590

Thr Gln Val Asp Ile Asp Leu Phe His Ala Arg Phe Thr Leu Asn Asp

595 600 605

Arg Arg Glu Lys Glu Asn Arg Val Ile Ser Asn Phe Gly Lys Asn Gly

610 615 620

Lys Arg Asn Val Gly Arg Ile Leu Val Ala Thr Gln Val Val Glu Gln

625 630 635 640

Ser Leu Asp Val Asp Phe Asp Trp Leu Ile Thr Gln His Cys Pro Ala

645 650 655

Asp Leu Leu Phe Gln Arg Leu Gly Arg Leu His Arg His His Arg Lys

660 665 670

Tyr Arg Pro Ala Gly Phe Glu Ile Pro Val Ala Thr Ile Leu Leu Pro

675 680 685

Asp Gly Glu Gly Tyr Gly Arg His Glu His Ile Tyr Ser Asn Val Arg

690 695 700

Val Met Trp Arg Thr Gln Gln His Ile Glu Glu Leu Asn Gly Ala Ser

705 710 715 720

Leu Phe Phe Pro Asp Ala Tyr Arg Gln Trp Leu Asp Ser Ile Tyr Asp

725 730 735

Asp Ala Glu Met Asp Glu Pro Glu Trp Val Gly Asn Gly Met Asp Lys

740 745 750

Phe Glu Ser Ala Glu Cys Glu Lys Arg Phe Lys Ala Arg Lys Val Leu

755 760 765

Gln Trp Ala Glu Glu Tyr Ser Leu Gln Asp Asn Asp Glu Thr Ile Leu

770 775 780

Ala Val Thr Arg Asp Gly Glu Met Ser Leu Pro Leu Leu Pro Tyr Val

785 790 795 800

Gln Thr Ser Ser Gly Lys Gln Leu Leu Asp Gly Gln Val Tyr Glu Asp

805 810 815

Leu Ser His Glu Gln Gln Tyr Glu Ala Leu Ala Leu Asn Arg Val Asn

820 825 830

Val Pro Phe Thr Trp Lys Arg Ser Phe Ser Glu Val Val Asp Glu Asp

835 840 845

Gly Leu Leu Trp Leu Glu Gly Lys Gln Asn Leu Asp Gly Trp Val Trp

850 855 860

Gln Gly Asn Ser Ile Val Ile Thr Tyr Thr Gly Asp Glu Gly Met Thr

865 870 875 880

Arg Val Ile Pro Ala Asn Pro Lys

885

<210> 2

<211> 502

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Asn Leu Leu Ile Asp Asn Trp Ile Pro Val Arg Pro Arg Asn Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Leu Gln Ser Leu Tyr Cys Ser Arg Asp

20 25 30

Gln Trp Arg Leu Ser Leu Pro Arg Asp Asp Met Glu Leu Ala Ala Leu

35 40 45

Ala Leu Leu Val Cys Ile Gly Gln Ile Ile Ala Pro Ala Lys Asp Asp

50 55 60

Val Glu Phe Arg His Arg Ile Met Asn Pro Leu Thr Glu Asp Glu Phe

65 70 75 80

Gln Gln Leu Ile Ala Pro Trp Ile Asp Met Phe Tyr Leu Asn His Ala

85 90 95

Glu His Pro Phe Met Gln Thr Lys Gly Val Lys Ala Asn Asp Val Thr

100 105 110

Pro Met Glu Lys Leu Leu Ala Gly Val Ser Gly Ala Thr Asn Cys Ala

115 120 125

Phe Val Asn Gln Pro Gly Gln Gly Glu Ala Leu Cys Gly Gly Cys Thr

130 135 140

Ala Ile Ala Leu Phe Asn Gln Ala Asn Gln Ala Pro Gly Phe Gly Gly

145 150 155 160

Gly Phe Lys Ser Gly Leu Arg Gly Gly Thr Pro Val Thr Thr Phe Val

165 170 175

Arg Gly Ile Asp Leu Arg Ser Thr Val Leu Leu Asn Val Leu Thr Leu

180 185 190

Pro Arg Leu Gln Lys Gln Phe Pro Asn Glu Ser His Thr Glu Asn Gln

195 200 205

Pro Thr Trp Ile Lys Pro Ile Lys Ser Asn Glu Ser Ile Pro Ala Ser

210 215 220

Ser Ile Gly Phe Val Arg Gly Leu Phe Trp Gln Pro Ala His Ile Glu

225 230 235 240

Leu Cys Asp Pro Ile Gly Ile Gly Lys Cys Ser Cys Cys Gly Gln Glu

245 250 255

Ser Asn Leu Arg Tyr Thr Gly Phe Leu Lys Glu Lys Phe Thr Phe Thr

260 265 270

Val Asn Gly Leu Trp Pro His Pro His Ser Pro Cys Leu Val Thr Val

275 280 285

Lys Lys Gly Glu Val Glu Glu Lys Phe Leu Ala Phe Thr Thr Ser Ala

290 295 300

Pro Ser Trp Thr Gln Ile Ser Arg Val Val Val Asp Lys Ile Ile Gln

305 310 315 320

Asn Glu Asn Gly Asn Arg Val Ala Ala Val Val Asn Gln Phe Arg Asn

325 330 335

Ile Ala Pro Gln Ser Pro Leu Glu Leu Ile Met Gly Gly Tyr Arg Asn

340 345 350

Asn Gln Ala Ser Ile Leu Glu Arg Arg His Asp Val Leu Met Phe Asn

355 360 365

Gln Gly Trp Gln Gln Tyr Gly Asn Val Ile Asn Glu Ile Val Thr Val

370 375 380

Gly Leu Gly Tyr Lys Thr Ala Leu Arg Lys Ala Leu Tyr Thr Phe Ala

385 390 395 400

Glu Gly Phe Lys Asn Lys Asp Phe Lys Gly Ala Gly Val Ser Val His

405 410 415

Glu Thr Ala Glu Arg His Phe Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Ile Pro

420 425 430

Asp Val Leu Ala Asn Val Asn Phe Ser Gln Ala Asp Glu Val Ile Ala

435 440 445

Asp Leu Arg Asp Lys Leu His Gln Leu Cys Glu Met Leu Phe Asn Gln

450 455 460

Ser Val Ala Pro Tyr Ala His His Pro Lys Leu Ile Ser Thr Leu Ala

465 470 475 480

Leu Ala Arg Ala Thr Leu Tyr Lys His Leu Arg Glu Leu Lys Pro Gln

485 490 495

Gly Gly Pro Ser Asn Gly

500

<210> 3

<211> 160

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

Met Ala Asp Glu Ile Asp Ala Met Ala Leu Tyr Arg Ala Trp Gln Gln

1 5 10 15

Leu Asp Asn Gly Ser Cys Ala Gln Ile Arg Arg Val Ser Glu Pro Asp

20 25 30

Glu Leu Arg Asp Ile Pro Ala Phe Tyr Arg Leu Val Gln Pro Phe Gly

35 40 45

Trp Glu Asn Pro Arg His Gln Gln Ala Leu Leu Arg Met Val Phe Cys

50 55 60

Leu Ser Ala Gly Lys Asn Val Ile Arg His Gln Asp Lys Lys Ser Glu

65 70 75 80

Gln Thr Thr Gly Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu Ala Asn Ser Gly Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Arg Ile Phe Gln Leu Ile Arg Ala Asp Arg Thr Ala

100 105 110

Asp Met Val Gln Leu Arg Arg Leu Leu Thr His Ala Glu Pro Val Leu

115 120 125

Asp Trp Pro Leu Met Ala Arg Met Leu Thr Trp Trp Gly Lys Arg Glu

130 135 140

Arg Gln Gln Leu Leu Glu Asp Phe Val Leu Thr Thr Asn Lys Asn Ala

145 150 155 160

<210> 4

<211> 224

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

Met Arg Ser Tyr Leu Ile Leu Arg Leu Ala Gly Pro Met Gln Ala Trp

1 5 10 15

Gly Gln Pro Thr Phe Glu Gly Thr Arg Pro Thr Gly Arg Phe Pro Thr

20 25 30

Arg Ser Gly Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Cys Leu Gly Ile Gln Arg

35 40 45

Asp Asp Thr Ser Ser Leu Gln Ala Leu Ser Glu Ser Val Gln Phe Ala

50 55 60

Val Arg Cys Asp Glu Leu Ile Leu Asp Asp Arg Arg Val Ser Val Thr

65 70 75 80

Gly Leu Arg Asp Tyr His Thr Val Leu Gly Ala Arg Glu Asp Tyr Arg

85 90 95

Gly Leu Lys Ser His Glu Thr Ile Gln Thr Trp Arg Glu Tyr Leu Cys

100 105 110

Asp Ala Ser Phe Thr Val Ala Leu Trp Leu Thr Pro His Ala Thr Met

115 120 125

Val Ile Ser Glu Leu Glu Lys Ala Val Leu Lys Pro Arg Tyr Thr Pro

130 135 140

Tyr Leu Gly Arg Arg Ser Cys Pro Leu Thr His Pro Leu Phe Leu Gly

145 150 155 160

Thr Cys Gln Ala Ser Asp Pro Gln Lys Ala Leu Leu Asn Tyr Glu Pro

165 170 175

Val Gly Gly Asp Ile Tyr Ser Glu Glu Ser Val Thr Gly His His Leu

180 185 190

Lys Phe Thr Ala Arg Asp Glu Pro Met Ile Thr Leu Pro Arg Gln Phe

195 200 205

Ala Ser Arg Glu Trp Tyr Val Ile Lys Gly Gly Met Asp Val Ser Gln

210 215 220

<210> 5

<211> 199

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

Met Tyr Leu Ser Lys Val Ile Ile Ala Arg Ala Trp Ser Arg Asp Leu

1 5 10 15

Tyr Gln Leu His Gln Gly Leu Trp His Leu Phe Pro Asn Arg Pro Asp

20 25 30

Ala Ala Arg Asp Phe Leu Phe His Val Glu Lys Arg Asn Thr Pro Glu

35 40 45

Gly Cys His Val Leu Leu Gln Ser Ala Gln Met Pro Val Ser Thr Ala

50 55 60

Val Ala Thr Val Ile Lys Thr Lys Gln Val Glu Phe Gln Leu Gln Val

65 70 75 80

Gly Val Pro Leu Tyr Phe Arg Leu Arg Ala Asn Pro Ile Lys Thr Ile

85 90 95

Leu Asp Asn Gln Lys Arg Leu Asp Ser Lys Gly Asn Ile Lys Arg Cys

100 105 110

Arg Val Pro Leu Ile Lys Glu Ala Glu Gln Ile Ala Trp Leu Gln Arg

115 120 125

Lys Leu Gly Asn Ala Ala Arg Val Glu Asp Val His Pro Ile Ser Glu

130 135 140

Arg Pro Gln Tyr Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ser Gly Lys Ile Gln Thr

145 150 155 160

Val Cys Phe Glu Gly Val Leu Thr Ile Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ile

165 170 175

Asp Leu Val Gln Gln Gly Ile Gly Pro Ala Lys Ser Met Gly Cys Gly

180 185 190

Leu Leu Ser Leu Ala Pro Leu

195

<210> 6

<211> 363

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

Met Ser Asn Phe Ile Asn Ile His Val Leu Ile Ser His Ser Pro Ser

1 5 10 15

Cys Leu Asn Arg Asp Asp Met Asn Met Gln Lys Asp Ala Ile Phe Gly

20 25 30

Gly Lys Arg Arg Val Arg Ile Ser Ser Gln Ser Leu Lys Arg Ala Met

35 40 45

Arg Lys Ser Gly Tyr Tyr Ala Gln Asn Ile Gly Glu Ser Ser Leu Arg

50 55 60

Thr Ile His Leu Ala Gln Leu Arg Asp Val Leu Arg Gln Lys Leu Gly

65 70 75 80

Glu Arg Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp Lys Thr Leu Ala Leu Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Ser Val Asp Glu Ala Glu Lys Ile Ser Ala Asp Ala Val Thr

100 105 110

Pro Trp Val Val Gly Glu Ile Ala Trp Phe Cys Glu Gln Val Ala Lys

115 120 125

Ala Glu Ala Asp Asn Leu Asp Asp Lys Lys Leu Leu Lys Val Leu Lys

130 135 140

Glu Asp Ile Ala Ala Ile Arg Val Asn Leu Gln Gln Gly Val Asp Ile

145 150 155 160

Ala Leu Ser Gly Arg Met Ala Thr Ser Gly Met Met Thr Glu Leu Gly

165 170 175

Lys Val Asp Gly Ala Met Ser Ile Ala His Ala Ile Thr Thr His Gln

180 185 190

Val Asp Ser Asp Ile Asp Trp Phe Thr Ala Val Asp Asp Leu Gln Glu

195 200 205

Gln Gly Ser Ala His Leu Gly Thr Gln Glu Phe Ser Ser Gly Val Phe

210 215 220

Tyr Arg Tyr Ala Asn Ile Asn Leu Ala Gln Leu Gln Glu Asn Leu Gly

225 230 235 240

Gly Ala Ser Arg Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala Thr His Val Val His

245 250 255

Met Leu Ala Thr Glu Val Pro Gly Ala Lys Gln Arg Thr Tyr Ala Ala

260 265 270

Phe Asn Pro Ala Asp Met Val Met Val Asn Phe Ser Asp Met Pro Leu

275 280 285

Ser Met Ala Asn Ala Phe Glu Lys Ala Val Lys Ala Lys Asp Gly Phe

290 295 300

Leu Gln Pro Ser Ile Gln Ala Phe Asn Gln Tyr Trp Asp Arg Val Ala

305 310 315 320

Asn Gly Tyr Gly Leu Asn Gly Ala Ala Ala Gln Phe Ser Leu Ser Asp

325 330 335

Val Asp Pro Ile Thr Ala Gln Val Lys Gln Met Pro Thr Leu Glu Gln

340 345 350

Leu Lys Ser Trp Val Arg Asn Asn Gly Glu Ala

355 360

<210> 7

<211> 2667

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

atggaacctt ttaaatatat atgccattac tggggaaaat cctcaaaaag cttgacgaaa 60

ggaaatgata ttcatctgtt aatttatcat tgccttgatg ttgctgctgt tgcagattgc 120

tggtgggatc aatcagtcgt actgcaaaat actttttgcc gaaatgaaat gctatcaaaa 180

cagagggtga aggcctggct gttatttttc attgctcttc atgatattgg aaagtttgat 240

atacgattcc aatataaatc agcagaaagt tggctgaaat taaatcctgc aacgccatca 300

cttaatggtc catcaacaca aatgtgccgt aaatttaatc atggtgcagc cggtctgtat 360

tggtttaacc aggattcact ttcagagcaa tctctcgggg attttttcag tttttttgat 420

gccgctcctc atccttatga gtcctggttt ccatgggtag aggccgttac aggacatcat 480

ggttttatat tacattccca ggatcaagat aagtcgcgtt gggaaatgcc agcttctctg 540

gcatcttatg ctgcgcaaga taaacaggct cgtgaggagt ggatatctgt actggaagca 600

ttatttttaa cgccagcggg gttatctata aacgatatac cacctgattg ttcatcactg 660

ttagcaggtt tttgctcgct tgctgactgg ttaggctcct ggactacaac gaataccttt 720

ctgtttaatg aggatgcgcc ttccgacata aatgctctga gaacgtattt ccaggaccga 780

cagcaggatg cgagccgggt attggagttg agtggacttg tatcaaataa gcgatgttat 840

gaaggtgttc atgcactact ggacaatggc tatcaaccca gacaattaca ggtgttagtt 900

gatgctcttc cagtagctcc cgggctgacg gtaatagagg cacctacagg ctccggtaaa 960

acggaaacag cgctggccta tgcttggaaa cttattgatc aacaaattgc ggatagtgtt 1020

atttttgccc tcccaacaca agctaccgcg aatgctatgc ttacgagaat ggaagcgagc 1080

gcgagccact tattttcatc cccaaatctt attcttgctc atggcaattc acggtttaac 1140

cacctctttc aatcaataaa atcacgcgcg attactgaac aggggcaaga agaagcgtgg 1200

gttcagtgtt gtcagtggtt gtcacaaagc aataagaaag tgtttcttgg gcaaatcggc 1260

gtttgcacga ttgatcaggt gttgatatcg gtattgccag ttaaacaccg ctttatccgt 1320

ggtttgggaa ttggtcgaag tgttttaatt gttgatgaag ttcatgctta cgacacctat 1380

atgaacggct tgctggaggc agtgctcaag gctcaggctg atgtgggagg gagtgttatt 1440

cttctttccg caaccctacc aatgaaacaa aaacagaaac ttctggatac ttatggtctg 1500

catacagatc cagtggaaaa taactccgca tatccactca ttaactggcg aggtgtgaat 1560

ggtgcgcaac gttttgatct gctagctcat ccagaacaac tcccgccccg cttttcgatt 1620

cagccagaac ctatttgttt agctgacatg ttacctgacc ttacgatgtt agagcgaatg 1680

atcgcagcgg caaacgcggg tgcacaggtc tgtcttattt gcaatttggt tgacgttgca 1740

caagtatgct accaacggct aaaggagcta aataacacgc aagtagatat agatttgttt 1800

catgcgcgct ttacgctgaa cgatcgtcgt gaaaaagaga atcgagttat tagcaatttc 1860

ggcaaaaatg ggaagcgaaa tgttggacgg atacttgtcg caacccaggt cgtggaacaa 1920

tcactcgacg ttgattttga ttggttaatt actcagcatt gtcctgcaga tttgcttttc 1980

caacgattgg gccgtttaca tcgccatcat cgcaaatatc gtcccgctgg ttttgagatt 2040

cctgttgcca ccattttgct gcctgatggc gagggttacg gacgacatga gcatatttat 2100

agcaacgtta gagtcatgtg gcggacgcag caacatattg aggagcttaa tggagcatcc 2160

ttatttttcc ctgatgctta ccggcaatgg ctggatagca tttacgatga tgcggaaatg 2220

gatgagccag aatgggtcgg caatggcatg gataaatttg aaagcgccga gtgtgaaaaa 2280

aggttcaagg ctcgcaaggt cctgcagtgg gctgaagaat atagcttgca ggataacgat 2340

gaaaccattc ttgcggtaac gagggatggg gaaatgagcc tgccattatt gccttatgta 2400

caaacgtctt caggtaaaca actgctcgat ggccaggtct acgaggacct aagtcatgaa 2460

cagcagtatg aggcgcttgc acttaatcgc gtcaatgtac ccttcacctg gaaacgtagt 2520

ttttctgaag tagtagatga agatgggtta ctttggctgg aagggaaaca gaatctggat 2580

ggatgggtct ggcagggtaa cagtattgtt attacctata caggggatga agggatgacc 2640

agagtcatcc ctgcaaatcc caaataa 2667

<210> 8

<211> 1509

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 8

atgaatttgc ttattgataa ctggatccct gtacgcccgc gaaacggggg gaaagtccaa 60

atcataaatc tgcaatcgct atactgcagt agagatcagt ggcgattaag tttgccccgt 120

gacgatatgg aactggccgc tttagcactg ctggtttgca ttgggcaaat tatcgccccg 180

gcaaaagatg acgttgaatt tcgacatcgc ataatgaatc cgctcactga agatgagttt 240

caacaactca tcgcgccgtg gatagatatg ttctacctta atcacgcaga acatcccttt 300

atgcagacca aaggtgtcaa agcaaatgat gtgactccaa tggaaaaact gttggctggg 360

gtaagcggcg cgacgaattg tgcatttgtc aatcaaccgg ggcagggtga agcattatgt 420

ggtggatgca ctgcgattgc gttattcaac caggcgaatc aggcaccagg ttttggtggt 480

ggttttaaaa gcggtttacg tggaggaaca cctgtaacaa cgttcgtacg tgggatcgat 540

cttcgttcaa cggtgttact caatgtcctc acattacctc gtcttcaaaa acaatttcct 600

aatgaatcac atacggaaaa ccaacctacc tggattaaac ctatcaagtc caatgagtct 660

atacctgctt cgtcaattgg gtttgtccgt ggtctattct ggcaaccagc gcatattgaa 720

ttatgcgatc ccattgggat tggtaaatgt tcttgctgtg gacaggaaag caatttgcgt 780

tataccggtt ttcttaagga aaaatttacc tttacagtta atgggctatg gccccatccg 840

cattcccctt gtctggtaac agtcaagaaa ggggaggttg aggaaaaatt tcttgctttc 900

accacctccg caccatcatg gacacaaatc agccgagttg tggtagataa gattattcaa 960

aatgaaaatg gaaatcgcgt ggcggcggtt gtgaatcaat tcagaaatat tgcgccgcaa 1020

agtcctcttg aattgattat ggggggatat cgtaataatc aagcatctat tcttgaacgg 1080

cgtcatgatg tgttgatgtt taatcagggg tggcaacaat acggcaatgt gataaacgaa 1140

atagtgactg ttggtttggg atataaaaca gccttacgca aggcgttata tacctttgca 1200

gaagggttta aaaataaaga cttcaaaggg gccggagtct ctgttcatga gactgcagaa 1260

aggcatttct atcgacagag tgaattatta attcccgatg tactggcgaa tgttaatttt 1320

tcccaggctg atgaggtaat agctgattta cgagacaaac ttcatcaatt gtgtgaaatg 1380

ctatttaatc aatctgtagc tccctatgca catcatccta aattaataag cacattagcg 1440

cttgcccgcg ccacgctata caaacattta cgggagttaa aaccgcaagg agggccatca 1500

aatggctga 1509

<210> 9

<211> 483

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 9

atggctgatg aaattgatgc aatggcttta tatcgagcct ggcaacaact ggataatgga 60

tcatgtgcgc aaattagacg tgtttcagaa cctgatgaat tacgcgatat ccctgcgttt 120

tataggctgg tgcaaccttt tggttgggaa aacccacgtc accagcaggc tcttttgcgc 180

atggtgtttt gcctgagcgc aggaaagaat gtcatccgac atcaggacaa aaaatcggag 240

caaacaacag gtatctcgtt gggaagagct ttagccaata gtggaagaat taacgagcgc 300

cgtatctttc aattaattcg ggctgacaga acagccgata tggtccagtt acgtcgatta 360

cttactcacg ccgaacccgt acttgactgg ccattaatgg ccaggatgtt gacctggtgg 420

ggaaagcgcg aacgccagca acttctggaa gattttgtat tgaccacaaa caaaaatgcg 480

taa 483

<210> 10

<211> 675

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 10

atgagatctt atttgatctt gcggcttgct gggccaatgc aagcctgggg gcagccgacc 60

tttgaaggaa cgcgacctac cggaagattt ccgacccgaa gcgggttatt agggctactc 120

ggggcttgtc ttgggatcca acgtgatgat acttcttcat tacaggcgtt atcagagagt 180

gtgcaatttg cagtgcgctg cgatgaactc attcttgacg atcgtcgtgt gtctgtaacg 240

gggttgcgtg attaccatac agtccttgga gcgcgagaag attaccgtgg tttgaaaagt 300

catgaaacga ttcaaacatg gcgcgaatat ttatgtgatg cctcctttac cgtcgctctc 360

tggttaacac cccatgcaac gatggttatc tcagaacttg aaaaagcagt attaaagcct 420

cggtatacac cttacctggg gcggagaagt tgcccactaa cacacccgct ttttttgggg 480

acatgtcagg catcggatcc tcagaaggcg ctattaaatt atgagcccgt tggcggcgat 540

atatatagtg aggaatcagt tacagggcat catttaaaat ttacggcgcg cgacgaaccg 600

atgatcacct tgcctcgaca atttgcttcc cgagaatggt atgtgattaa aggaggtatg 660

gatgtatctc agtaa 675

<210> 11

<211> 600

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

atgtatctca gtaaagtcat cattgccagg gcctggagca gggatcttta ccaacttcac 60

cagggattat ggcatttatt tccaaacaga ccggatgctg ctcgtgattt tctttttcat 120

gttgagaagc gaaacacacc agaaggctgt catgttttat tgcagtcagc gcaaatgcct 180

gtttcaactg ccgttgcgac agtcattaaa actaaacagg ttgaatttca acttcaggtt 240

ggtgttccac tctattttcg gcttcgggca aatccgatca aaactattct cgacaatcaa 300

aagcgcctgg acagtaaagg gaatattaaa cgctgtcggg ttccgttaat aaaagaagca 360

gaacaaatcg cgtggttgca acgtaaattg ggcaatgcgg cgcgcgttga agatgtgcat 420

cccatatcgg aacggccaca gtatttttct ggtgatggta aaagtggaaa gatccaaacg 480

gtttgctttg aaggtgtgct caccatcaac gacgcgccag cgttaataga tcttgtacag 540

caaggtattg ggccagctaa atcgatggga tgtggcttgc tatctttggc tccactgtga 600

<210> 12

<211> 1092

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 12

atgtctaact ttatcaatat tcatgttctg atctctcaca gcccttcatg tctgaaccgc 60

gacgatatga acatgcagaa agacgctatt ttcggcggca aaagacgagt aagaatttca 120

agtcaaagcc ttaaacgtgc gatgcgtaaa agtggttatt acgcacaaaa tattggtgaa 180

tccagtctca gaaccattca tcttgcacaa ttacgtgatg ttcttcggca aaaacttggt 240

gaacgttttg accaaaaaat catcgataag acattagcgc tgctctccgg taaatcagtt 300

gatgaagccg aaaagatttc tgccgatgcg gttactccct gggttgtggg agaaatagcc 360

tggttctgtg agcaggttgc aaaagcagag gctgataatc tggatgataa aaagctgctc 420

aaagttctta aggaagatat tgccgccata cgtgtgaatt tacagcaggg tgttgatatt 480

gcgcttagtg gaagaatggc aaccagcggc atgatgactg agttgggaaa agttgatggt 540

gcaatgtcca ttgcgcatgc gatcactact catcaggttg attctgatat tgactggttc 600

accgctgtag atgatttaca ggaacaaggt tctgcacatc tgggaactca ggaattttca 660

tcgggtgttt tttatcgtta tgccaacatt aacctcgctc aacttcagga aaatttaggt 720

ggtgcctcca gggagcaggc tctggaaatt gcaacccatg ttgttcatat gctggcaaca 780

gaggtccctg gagcaaaaca gcgtacttat gccgctttta accctgcgga tatggtaatg 840

gttaatttct ccgatatgcc actttctatg gcaaatgctt ttgaaaaagc ggttaaagcg 900

aaagatggct ttttgcaacc gtctatacag gcgtttaatc aatattggga tcgcgttgcc 960

aatggatatg gtctgaacgg agctgctgcg caattcagct tatctgatgt agacccaatt 1020

actgctcaag ttaaacaaat gcctacttta gaacagttaa aatcctgggt tcgtaataat 1080

ggcgaggcgt ga 1092

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NLS

<400> 13

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 14

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bpNLS

<400> 14

Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg

1 5 10 15

Lys Val Glu

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标DNA(hEMX1)

<220>

<221> protein_bind

<222> (16)..(18)

<223> 不同的PAM sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

tggcgcattg ccacgnnnca ggccaatggg gaggacatcg atgtcacctc caatgactag 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标DNA(mTyr)

<220>

<221> protein_bind

<222> (16)..(18)

<223> 不同的PAM序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 16

gcattactat gtgtcnnngg acacactgct tgggggctct gaaatatgga gggacattga 60

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman探针序列

<400> 17

gtcaacggat ttggtc 16

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 冠状病毒(Coronavirus)

<400> 18

aaggccaaac tgtcactaag aaatctgctg ctgag 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 冠状病毒(Coronavirus)

<400> 19

aaggaactga ttacaaacat tggccgcaaa ttgca 35

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N1-FIP"

<400> 20

gttggccttt accagacatt ttggtgatgc tgctcttgct t 41

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N1-BIP"

<400> 21

tgctgaggct tctaagaagc cagcttgtgt tacattgtat gc 42

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N1-F3"

<400> 22

acttctcctg ctagaatgg 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N1-B3"

<400> 23

gtttgttctg gaccacgt 18

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N1-LF"

<400> 24

ttcaatctgt caagcagcag ca 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N1-LB"

<400> 25

ggcaaaaacg tactgccact a 21

<210> 26

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N2-FIP"

<400> 26

tctgattagt tcctggtccc caaagcatac aatgtaacac aagc 44

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N2-BIP"

<400> 27

cgcattggca tggaagtcac tttgatggca cctgtgtag 39

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N2-F3"

<400> 28

gcaaaaacgt actgccac 18

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N2-B3"

<400> 29

gaaatttgga tctttgtcat cc 22

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N2-LF"

<400> 30

tggaccacgt ctgccga 17

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 "SARS-N2-LB"

<400> 31

accttcggga acgtggtt 18

<210> 32

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于侧向流检测的探针序列

<400> 32

gtcaacggat ttggtc 16

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA "H1N1-Cascade-I38"

<400> 33

tgcagcaaac ttattagttt caattttggg gt 32

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA "H3N2-Cascade-I38"

<400> 34

tgcactcact tggaggtgtg tttcatgtat tc 32

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA "H1N1-Cascade-I222"

<400> 35

attgagaaca caagagtctg aatgtgcatg tg 32

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA "H1N1-Cascade-H274"

<400> 36

taattagggg ctttcatttc gactgatttg at 32

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA "H3N2-Cascade-N294"

<400> 37

ctgtctctgc agacacatct gacaccagga ta 32

<210> 38

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 38

gggaagaccc caaaattgaa actaataagt ttgctgcaat ttgcacacat ttggaagttt 60

gtttcatgta ttcggatttc 80

<210> 39

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 39

gggaagaccc caaaattgaa actaataagt ttgctgcaac ttgcacacat ttggaagttt 60

gtttcatgta ttcggatttc 80

<210> 40

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 40

ggggaggatc tgaaaattga aaccaacaaa tttgcagcaa tatgcactca cttggaggtg 60

tgtttcatgt attcagattt 80

<210> 41

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 41

ggggaggatc tgaaaattga aaccaacaaa tttgcagcaa catgcactca cttggaggtg 60

tgtttcatgt attcagattt 80

<210> 42

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 42

ggcataataa cagacactat caagagttgg aggaacaata tattgagaac acaagagtct 60

gaatgtgcat gtgtaaatgg 80

<210> 43

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 43

ggcataataa cagacactat caagagttgg aggaacaata gattgagaac acaagagtct 60

gaatgtgcat gtgtaaatgg 80

<210> 44

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 44

aaagataatc aaatcagtcg aaatgaaagc ccctaattat cactatgagg aatgctcctg 60

ttaccctgat tctagtgaaa 80

<210> 45

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 45

aaagataatc aaatcagtcg aaatgaaagc ccctaattat tactatgagg aatgctcctg 60

ttaccctgat tctagtgaaa 80

<210> 46

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 46

tatcctcgat atcctggtgt cagatgtgtc tgcagagaca actggaaagg atccaaccgg 60

cccatcatag atataaacat 80

<210> 47

<211> 80

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 47

tatcctcgat atcctggtgt cagatgtgtc tgcagagaca gctggaaagg atccaaccgg 60

cccatcatag atataaacat 80

Claims

1.检测试样中的特定DNA的方法，

该方法包括：

2.用于通过权利要求1所述的方法检测试样中的特定DNA的试剂盒，

该试剂盒包含：

(a)以该特定DNA为靶标的CRISPR-Cas3系统、和

(b)单链探针DNA。