CN114994195B - 一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法 - Google Patents
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，即采用高效液相色谱仪，以AQ‑C18 5μm×4.6mm×250mm柱和Hydro‑RP 80A 4μm×4.6mm×250mm柱为色谱柱，以磷酸水溶液和磷酸盐缓冲溶液为流动相，控制流动相的流速为0.80‑1.20mL/min；色谱柱温度为30℃；进样量为20μL；检测波长为210nm的条件下进行色谱分离，有效的实现了枸橼酸铁及其六种有机酸杂质的分离和测定。本发明峰形好，无拖尾，该方法具有可行性高，操作简便，分离效果好，分离成本低等特点。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及药用级枸橼酸铁，具体来说是一种枸橼酸铁 及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法。
背景技术
枸橼酸铁的英文名是Ferric Citrate Hydrate，化学名为枸橼酸铁水合物，分子式为FeC6H5O7+nH2O。枸橼酸铁是治疗慢性肾脏病(Chronic kidney disease， CKD)，该药用于CKD患者的益处除了可以改善体内贫血状态外，还能够通过调 节钙磷代谢和血红蛋白水平进而延缓肾功能减退，改善预后。含铁磷结合剂能降 低慢性肾脏病患者的血磷水平，同时可以在一定程度上改善肾脏功能和心功能。 因此，对枸橼酸铁中有机酸杂质分离方法研究有着重要的药用价值和工业价值。 枸橼酸铁的结构式如下所示：
根据相关文献报道，合成枸橼酸铁主要是用三氯化铁作为起始物料，与氢氧 化钠反应，生成氢氧化铁絮状物，过滤的絮状物再与一水合柠檬酸反应，反应完 全后，加入有机溶剂，将枸橼酸铁水合物析出。具体工艺路线如下：
FeCl3·6H2O+3NaOH→Fe(OH)3+3NaCl+6H2O
Fe(OH)3+C6H8O7·H2O→枸橼酸铁水合物
枸橼酸铁在合成过程中柠檬酸会分解出多种有机酸杂质，本发明所涉及到的 有机酸及其具体结构式分解过程如下：
分解的有机酸分别有乙酸、1.3-丙酮二羧酸、顺式乌头酸、反式乌头酸、乙 酰乙酸、衣康酸。
由于枸橼酸铁在合成过程中柠檬酸受热会不稳定而分解，生成多种有机酸杂 质进而影响药物活性。因此控制枸橼酸铁中有机酸的含量对于药品改善肾功能衰 退，在一定功能上改善贫血，保护广大患者用药的安全性具有重要的意义。通过 大量文献检索，目前还没有对枸橼酸铁中有机酸杂质分离分析的相关文献报道， 因此开发一种枸橼酸铁中有机酸分离的高效液相分离分析方法，这对医药生产企 业来说显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液 相色谱分离分析方法，以及提供一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分 离分析方法。
为了解决上述问题，本发明提供了一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相 色谱分离分析方法，采用如下的色谱分离条件进行分离：
流动相流速为0.80-1.20mL/min；色谱柱温度为30℃；进样量为20μL；检测 波长为210-240nm；流动相为磷酸水溶液和磷酸盐缓冲溶液；色谱柱为 AQ-C18 5μm×4.6mm×250mm柱、Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm柱、 CAPCELL PAK ADME 3μm×4.6mm×250mm柱、Ultimate OAA 5μm 4.6mm×300mm柱、Acclaim Mixed-Mode WAX-1 5μm×4.6mm×250mm柱。
进一步的，所述的色谱柱可优选为十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱AQ-C18，色谱柱规格为5μm，4.6mm*250mm；Hydro-RP 80A，色谱 柱规格为4μm，4.6mm×250mm。
进一步的，所述的流动相流速可优选为1.00mL/min，色谱柱柱温为30℃，检 测波长为210nm。
进一步的，所述的流动相可优选为磷酸水溶液，用正磷酸调pH为2.00。
进一步的，所述的流动相可优选为40mmol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液，用正 磷酸调pH为2.00。
进一步的，所用的高效液相色谱仪可优选为安捷伦1260Infinity II。
本发明针对合成技术存在的问题，提供一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效 液相色谱分离分析方法，所述的这种分离方法解决了合成枸橼酸铁的工艺技术中 存在的有机酸杂质，有机酸杂质会影响药品质量，该方法保证了在原料药选择上 的可靠性。
另一方面，本发明提供一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分 析方法，采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，该方法 分离的峰形好，灵敏度高，分离度好，结果准确可靠。可有效快速且灵敏地检测 枸橼酸铁及其六种有机酸杂质，也可应用于有关及含量的质量控制。
本发明的一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，采用 了高效液相色谱法对合成枸橼酸铁过程中产生的有机酸杂质进行分离，由于这几 种有机酸属于强极性化合物，在一般C18色谱柱中不易保留，经过大量尝试和筛 选，该方法可令分析物与键合相充分作用，在100％纯水相条件下强保留，能够 有效的将六种杂质在选用的色谱条件中完全分离，能有效的解决枸橼酸铁的质量 控制问题。本发明设备要求不高，不需要昂贵的离子色谱来分离，液相通用易得， 可行性高，操作简便，普适性好。为工业化生产带来了巨大的社会意义，具有很 强的实用性。
本发明是新颖的分析技术，目前还没有枸橼酸铁中有机酸的分离方法。本发 明灵敏度高，分离度良好，分析方法可靠，适用于枸橼酸铁的有关及其质量控制。
附图说明
图1为实施例1中枸橼酸铁及其六种有机酸的色谱分离图；
图2为实施例2中枸橼酸铁及其六种有机酸的色谱分离图；
图3为实施例3中枸橼酸铁及其六种有机酸的色谱分离图；
图4为实施例4中枸橼酸铁及其六种有机酸的色谱分离图；
图5为实施例5中枸橼酸铁及其六种有机酸的色谱分离图；
图6为实施例6中枸橼酸铁及其六种有机酸的色谱分离图；
图7为实施例7中柠檬酸标准品的色谱分离图；
图8为实施例8中柠檬酸标准品的色谱分离图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。 实施例所用到的仪器型号及生产厂家的信息如下表所示：
实施例所用到的杂质标准品的批号及生产厂家的信息如下表所示：
实施例1
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其步骤如下： 称取乙酸标准品40mg、1.3-丙酮二羧酸标准品20mg、乙酰乙酸20mg、顺式乌 头酸标准品20mg、反式乌头酸标准品20mg、衣康酸标准品20mg,精密称定于 100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，混匀，作为杂质储备溶液；再准确移取该 溶液5.0mL到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为杂质母液。称取 70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，先加少量水溶解，再加入5.0mL 杂质母液，用水稀释至刻度，混匀，作为分离度溶液。即采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm为色谱柱， 采用如下分离条件进行分离：
流动相：磷酸水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.0mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱分离结果如下表所示：
| 样品名称 | RT(min) | R |
| 乙酸 | 6.065 | / |
| 1.3-丙酮二羧酸 | 7.802 | 8.27 |
| 乙酰乙酸 | 8.944 | 4.55 |
| 柠檬酸 | 10.180 | 6.58 |
| 顺式乌头酸 | 15.806 | 13.29 |
| 反式乌头酸 | 19.777 | 8.60 |
| 衣康酸 | 28.906 | 14.68 |
从上表结果可以看出，本实施例中研究的色谱条件能完全分离柠檬酸及其六 种有机酸杂质，分离度良好，满足中国药典的要求；色谱分离谱图结果见图1。
实施例2
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其步骤如下： 称取乙酸标准品40mg、1.3-丙酮二羧酸标准品20mg、乙酰乙酸20mg、顺式乌 头酸标准品20mg、反式乌头酸标准品20mg、衣康酸标准品20mg,精密称定于 100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，混匀，作为杂质储备溶液；再准确移取该 溶液5.0mL到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为杂质母液。称取 70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，先加少量水溶解，再加入5.0mL 杂质母液，用水稀释至刻度，混匀，作为分离度溶液。即采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm为色谱柱， 采用如下分离条件进行分离：
流动相：磷酸水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为0.8mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱分离结果如下表所示：
| 样品名称 | RT(min) | R |
| 乙酸 | 7.457 | / |
| 1.3-丙酮二羧酸 | 10.064 | 7.13 |
| 乙酰乙酸 | 10.904 | 3.12 |
| 柠檬酸 | 12.352 | 4.18 |
| 顺式乌头酸 | 21.163 | 16.32 |
| 反式乌头酸 | 23.938 | 4.84 |
| 衣康酸 | 34.705 | 14.49 |
从上表结果可以看出，本实施例中研究的色谱条件能完全分离柠檬酸及其六 种有机酸杂质，分离度满足中国药典的要求，但出峰时间相对较长，需从节约时 间和流动相等多方面因素考虑；色谱分离谱图结果见图2。
实施例3
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其步骤如下： 称取乙酸标准品40mg、1.3-丙酮二羧酸标准品20mg、乙酰乙酸20mg、顺式乌 头酸标准品20mg、反式乌头酸标准品20mg、衣康酸标准品20mg,精密称定于 100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，混匀，作为杂质储备溶液；再准确移取该 溶液5.0mL到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为杂质母液。称取 70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，先加少量水溶解，再加入5.0mL 杂质母液，用水稀释至刻度，混匀，作为分离度溶液。即采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm为色谱柱， 采用如下分离条件进行分离：
流动相：磷酸水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.2mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱分离结果如下表所示：
| 样品名称 | RT(min) | R |
| 乙酸 | 5.760 | / |
| 1.3-丙酮二羧酸 | 6.295 | 2.31 |
| 乙酰乙酸 | 6.636 | 1.84 |
| 柠檬酸 | 8.668 | 7.19 |
| 顺式乌头酸 | 11.818 | 8.95 |
| 反式乌头酸 | 14.897 | 8.26 |
| 衣康酸 | 19.459 | 9.78 |
从上表结果可以看出，本实施例中研究的色谱条件能完全分离柠檬酸及其六 种有机酸杂质，分离度满足中国药典的要求，但1,3-丙酮二羧酸与乙酰乙酸保留 时间较为接近，分离度接近规定限值；色谱分离谱图结果见图3。
实施例4
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其步骤如下： 称取乙酸标准品40mg、1.3-丙酮二羧酸标准品20mg、乙酰乙酸20mg、顺式乌 头酸标准品20mg、反式乌头酸标准品20mg、衣康酸标准品20mg,精密称定于 100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，混匀，作为杂质储备溶液；再准确移取该 溶液5.0mL到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为杂质母液。称取 70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，先加少量水溶解，再加入5.0mL 杂质母液，用水稀释至刻度，混匀，作为分离度溶液。即采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm为色谱柱， 采用如下分离条件进行分离：
流动相：40mmol/L磷酸二氢铵水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.0mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱分离结果如下表所示：
| 样品名称 | RT(min) | R |
| 乙酸 | 6.155 | / |
| 1.3-丙酮二羧酸 | 7.902 | 7.60 |
| 乙酰乙酸 | 9.385 | 8.21 |
| 柠檬酸 | 10.414 | 4.46 |
| 顺式乌头酸 | 16.023 | 14.02 |
| 反式乌头酸 | 20.027 | 8.63 |
| 衣康酸 | 29.800 | 15.45 |
从上表结果可以看出，本实施例中研究的色谱条件能完全分离柠檬酸及其六 种有机酸杂质，分离度良好，满足中国药典的要求；色谱分离谱图结果见图4。
实施例5
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其步骤如下： 称取乙酸标准品40mg、1.3-丙酮二羧酸标准品20mg、乙酰乙酸20mg、顺式乌 头酸标准品20mg、反式乌头酸标准品20mg、衣康酸标准品20mg,精密称定于 100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，混匀，作为杂质储备溶液；再准确移取该 溶液5.0mL到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为杂质母液。称取 70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，先加少量水溶解，再加入5.0mL 杂质母液，用水稀释至刻度，混匀，作为分离度溶液。即采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的AQ-C18 5μm×4.6mm×250mm为色谱 柱，采用如下分离条件进行分离：
流动相：磷酸水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.0mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱分离结果如下表所示：
| 样品名称 | RT(min) | R |
| 乙酸 | 4.641 | / |
| 1.3-丙酮二羧酸 | 5.193 | 3.35 |
| 乙酰乙酸 | 5.525 | 2.51 |
| 柠檬酸 | 6.105 | 3.75 |
| 顺式乌头酸 | 8.200 | 8.75 |
| 反式乌头酸 | 10.387 | 8.05 |
| 衣康酸 | 13.451 | 9.02 |
从上表结果可以看出，本实施例中研究的色谱条件能完全分离柠檬酸及其六 种有机酸杂质，分离度良好，满足中国药典的要求；色谱分离谱图结果见图5。
实施例6
一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其步骤如下： 称取乙酸标准品40mg、1.3-丙酮二羧酸标准品20mg、乙酰乙酸20mg、顺式乌 头酸标准品20mg、反式乌头酸标准品20mg、衣康酸标准品20mg,精密称定于 100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，混匀，作为杂质储备溶液；再准确移取该 溶液5.0mL到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为杂质母液。称取 70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，先加少量水溶解，再加入5.0mL 杂质母液，用水稀释至刻度，混匀，作为分离度溶液。即采用高效液相色谱仪，以十八烷基键合硅胶为填充剂的AQ-C18 5μm×4.6mm×250mm为色谱 柱，采用如下分离条件进行分离：
流动相：40mmol/L磷酸二氢铵水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.0mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱分离结果如下表所示：
| 样品名称 | RT(min) | R |
| 乙酸 | 4.462 | / |
| 1.3-丙酮二羧酸 | 5.153 | 4.53 |
| 乙酰乙酸 | 5.777 | 4.82 |
| 柠檬酸 | 6.736 | 4.73 |
| 顺式乌头酸 | 9.236 | 8.79 |
| 反式乌头酸 | 11.529 | 7.61 |
| 衣康酸 | 15.021 | 9.31 |
从上表结果可以看出，本实施例中研究的色谱条件能完全分离柠檬酸及其六 种有机酸杂质，分离度良好，满足中国药典的要求；色谱分离谱图结果见图6。
实施例7
一种枸橼酸铁及其六种有机酸分离方法中柠檬酸出峰位置的标定，其步骤如 下：称取70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释到 刻度，混匀，作为参比溶液。按照色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂的 Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm为色谱柱，采用如下分离条件进行分离：
流动相：磷酸水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.0mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱图分离结果如图7所示，从图7可以看出柠檬酸的保留时间为 10.414min，并与实施例1比较，由于实施例7与实施例1所用的液相方法相同， 说明在实施例1以及其他实施例中出峰在10min左右的为柠檬酸。
实施例8
一种枸橼酸铁及其六种有机酸分离方法中柠檬酸出峰位置的标定，其步骤如 下：称取70mg柠檬酸标准品，精密称定于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释到 刻度，混匀，作为参比溶液。按照色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂的 AQ-C18 5μm×4.6mm×250mm为色谱柱，采用如下分离条件进行分离：
流动相：磷酸水溶液，pH＝2.00；
流动相流速为1.0mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210nm；
色谱图分离结果如图8所示，从图8可以看出柠檬酸的保留时间为6.110min， 并与实施例5比较，由于实施例8与实施例5所用的液相方法相同，说明在实施 例5以及其他实施例中出峰在6min左右的为柠檬酸。
综上所述，本发明的一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析 方法，可以有效的将柠檬酸与其他六种有机酸杂质很好分离，其Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm柱的分离度可高达4.46-15.45；其AQ-C18 5μm×4.6mm×250mm柱的分离度可高达2.51-9.31，均满足中国药典要求。
Claims (2)
1.一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其特征在于，所述有机酸为乙酸、1,3-丙酮二羧酸、乙酰乙酸、柠檬酸、顺式乌头酸、反式乌头酸、衣康酸；
采用高效液相色谱仪，选用以十八烷基键合硅胶为填充剂的Ultimate® AQ-C18 5μm×4.6mm×250mm柱或Hydro-RP 80A 4μm×4.6mm×250mm柱为色谱柱，以磷酸水溶液和磷酸盐缓冲溶液为流动相，所述的流动相为磷酸水溶液，用正磷酸调pH为2.00或/和40mmol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液，用正磷酸调pH为2.00；采用如下的色谱分离条件均可进行分离：
流动相流速为0.80-1.20mL/min；
色谱柱温度为30℃；
进样量为20μL；
检测波长为210-240nm；
洗脱方法为等度洗脱，其等度洗脱条件如下：
。
2.如权利要求1所述的一种枸橼酸铁及其六种有机酸的高效液相色谱分离分析方法，其特征在于所述的流动相流速为1.0mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为210nm。
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