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CN114959079B - 一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、引物、试剂盒及其方法 - Google Patents

一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、引物、试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、引物、试剂盒及其方法，属于PCR检测技术领域。该特异分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。采用本发明的引物针对待测样本进行PCR扩增，通过检测扩增产物是否含有目的条带，判定样本中是否含有绿色气球菌，具有灵敏性高，特异性强等优点，可以满足快速、特异性检测鸭源绿色气球菌的需求。

Description

一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、引物、试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于PCR检测技术领域，具体涉及一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、引物、试剂盒及其方法。
背景技术
绿色气球菌是一种人畜共患条件性致病菌，在机体免疫力低下或免疫功能不健全时，可导致人发生败血症、菌血症、心内膜炎、尿道感染、脑膜炎以及关节炎等。但随着技术的发展，目前该病菌已在多种经济动物和养殖动物上发现，如猪、羊、牛、鼠、罗非鱼及虾蟹。现有的研究表明，绿色气球菌对幼畜的危害严重，对成年家畜及水产领域也有一定危害。绿色气球菌引起的猪关节炎、牛乳房炎等，在畜牧业和养殖业造成了巨大的经济损失。
目前常规的细菌分离培养、形态学观察和生理生化检验方法较为费时繁琐，且极易造成污染，检测结果需要一周左右。随着分子生物学的发展，PCR方法已成为快速检测病原体的有效手段，通过对待测菌的基因进行检测定性分析是否存在目的菌。目前该项技术已经广泛应用于畜牧业中，可以更有效、快速鉴定病原菌，为临床诊断提供极大的助力。然而，据国内外文献报道，现有技术目前还未建立绿色气球菌的特异性PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测绿色气球菌的特异分子靶标，利用该特异分子靶标设计的引物对待测样本的DNA进行PCR扩增，再检测扩增产物是否含有特异性条带，判定样本中是否含有绿色气球菌，从而实现对绿色气球菌的特异性鉴定。
本发明的第二个目的在于提供一种检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物。
本发明的第三个目的在于提供一种检测绿色气球菌的试剂盒。
本发明的第四个目的在于提供一种检测绿色气球菌的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种检测绿色气球菌的特异分子靶标，所述特异分子靶标的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明旨在识别该细菌基因组DNA序列中具有PCR扩增特异性的模板序列，通过截取kemr序列，使用bwa比对到CARD、VAFD和8株绿色气球菌，并使用samtools过滤掉比对到CARD和VAFD的序列和未比对到绿色气球菌的序列，将所有的KMER序列通过BLAST比对到NCBI NT数据库，统计并分析比对结果，筛选绿色气球菌种的特异性序列，对筛选的特异性序列作为PCR鉴定的模板序列。采用BLAST primer对引物进行在线比对，其准确性、特异性较好，无其他细菌非特异性扩增，实现了绿色气球菌PCR鉴定。
本发明的检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物采用的技术方案为：
一种检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物，正向引物AU-F的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，反向引物AU-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明的引物是通过全基因组比较分析后获得，具体是将上述筛选的绿色气球菌的特异性序列作为PCR鉴定的模板序列，利用BLAST primer工具设计特异性PCR引物，所设计引物扩增的模板序列为312bp。
本发明的检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物，准确性和特异性较好，不会对其他细菌进行非特异性扩增，能够实现对绿色气球菌的特异性鉴定。
本发明的检测绿色气球菌的试剂盒采用的技术方案为：
一种检测绿色气球菌的试剂盒，包括所述正向引物AU-F和所述反向引物AU-R。
本发明的检测绿色气球菌的试剂盒，具有灵敏性高，特异性强等优点，可以满足快速、准确地检测绿色气球菌的需求。
进一步地，所述试剂盒还包括ddH2O、2×Es Taq Master Mix。
本发明的检测绿色气球菌的方法采用的技术方案为：
一种检测绿色气球菌的方法，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，用所述引物对所述DNA进行扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行电泳分析，确定是否存在绿色气球菌的特异性条带；如存在所述特异性条带，表明待测样本中含有绿色气球菌，否则，表明待测样本中无绿色气球菌。
本发明通过生物信息学手段获取可用于鉴定绿色气球菌的特异基因，并针对该基因设计引物、建立检测方法，本发明的检测绿色气球菌方法具有灵敏度高，特异性强的优点，与传统的绿色气球菌鉴定方法相比，成本相对更低，检测速度更快，操作简便，不仅易于掌握，而且便于推广，一般的分子实验室均可实施。
进一步地，所述扩增的反应体系包括7μL的ddH2O、10μL的2×Es Taq Master Mix、0.5μL的所述正向引物、0.5μL的所述反向引物和2μL的模板DNA；所述正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L。
进一步地，所述扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸共计重复30个循环；72℃终延伸10min。优选地，所述退火的温度为57℃。本发明针对退火温度进行优化，最后确定57℃为最佳退火温度。
进一步地，所述绿色气球菌的来源为畜牧业动物。
进一步地，所述畜牧业动物为鸭、猪、鸡、羊、鼠、牛、虾、蟹中的一种。
进一步地，所述扩增产物在4℃下保存。
附图说明
图1为本发明实验例中的电泳结果示意图，其中，M为DL2000 DNA Marker，1-3为鸭默里氏杆菌，4-6为金黄色葡萄球菌，7-9为大肠杆菌，10-12为沙门氏菌，13-15为链球菌，16-17为巴氏杆菌，18-21分别为羊源绿色气球菌、鸭源绿色气球菌、鸡源绿色气球菌、猪源绿色气球菌；
图2为本发明实验例中的灵敏度检测结果示意图，其中，M：DL2000 DNA Marker，1：1×104CFU/mL，2：1×105CFU/mL，3：1×106CFU/mL，4：1×107CFU/mL，5：1×108CFU/mL，6：1×101CFU/mL，7：1×102CFU/mL，8：1×103CFU/mL；
图3为本发明中退火温度的优选试验。
具体实施方式
本发明筛选绿色气球菌种的特异性序列的原理如下：
将组装好的绿色气球菌基因组序列从第一个碱基开始，每20个碱基移动一次，截取长度为300bp的固定长度序列，称之为Kmer序列，如果有连续的kemr序列或单个kmer序列只存在于绿色气球菌基因组中而不存在于其他物种基因组中则说明该段序列为绿色气球菌的特异性序列。把该特异性序列作为PCR特异性扩增的模板序列并设计合适的引物，特别说明所设计引物并非扩增全长序列而是模板序列的部分序列。
具体实施方法使用bwa(基因组序列比对工具)将所有kmer序列比对到CARD、VAFD和8株绿色气球菌；8株绿色气球菌基因组数据来自于ncbi genome数据库公开的绿色气球菌基因组，菌株编号为CCUG4311、NCTC8251、ATCC 11563、FDAARGOS_249、UMB0240、LL1、NCTC7595、32-41-5，对应的基因组编号为GCA_001543285.1、GCA_900445095.1、GCA_000178435.1、GCA_002083135.2、GCA_002871935.1、GCA_000262085.1、GCA_900445105.1、GCA_002280005.1；CARD是整合了各种微生物中抗药基因的数据库，收集了各种微生物的耐药基因序列；毒力因子(Virulence factor，VFs)指由细菌，病毒，真菌等代谢产生的带有侵袭力和毒素等毒力性质的分子，病原菌毒力因子数据库VFDB由中国医学科学院研发，收集整理了24个属100多种重要医学病原菌已知毒力因子的组成、结构、功能、致病机理、毒力岛、序列和基因组信息等内容；耐药基因和毒力因子通常会在多种细菌中出现，所以要把来自于耐药基因和毒力因子的kmer序列筛除掉，本发明使用samtools工具将比对到CARD和VAFD的序列过滤掉；同时未比对到绿色气球菌的序列过滤掉，将所有剩下的KMER序列通过BLAST比对到NCBI NT数据库，统计并分析比对结果，筛选只能比对到绿色气球菌种的特异性核苷酸序列。
采用BLAST primer对引物进行在线比对，准确性、特异性较好，无其他细菌非特异性扩增，实现了绿色气球菌PCR鉴定。
以下结合实施例对本发明做进一步地说明。
一、检测绿色气球菌的特异分子靶标的实施例
实施例1
本实施例的检测绿色气球菌的特异分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
二、检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物的实施例
实施例2
本实施例的检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物，包括正向引物AU-F和反向引物AU-R；正向引物AU-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物AU-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
三、检测绿色气球菌的试剂盒的实施例
实施例3
本实施例的检测绿色气球菌的试剂盒，包括实施例2中的正向引物、反向引物、ddH2O、2×Es Taq Master Mix。
四、检测绿色气球菌的方法的实施例
实施例4
本实施例的检测绿色气球菌的方法，包括以下步骤：
(1)用煮沸法提取鸭源待测样本的DNA；
(2)用实施例2中的引物对所述DNA进行扩增，得到扩增产物并在4℃下保存，PCR扩增的反应体系(20μL)为：7μL的ddH2O、10μL的2×Es Taq Master Mix、0.5μL的正向引物、0.5μL的反向引物和2μL的模板DNA，其中正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸共计重复30个循环；72℃终延伸10min；
(3)取7μL扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳分析结果显示扩增片段的大小为312bp左右，表明待测样本中含有鸭源绿色气球菌。
实施例5
本实施例的检测绿色气球菌的方法，与实施例4的区别仅在于，本实施例的待测样本分别来自猪、鸡、羊、鼠、牛、虾和蟹，未述及内容参照实施例4中的步骤进行。
五、实验例
1.1电泳实验
提取鸭源绿色气球菌与对照菌株(鸭疫里默杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌)基因组DNA为模板，用实施例4中的引物和PCR条件进行扩增，得到扩增产物，然后取7μL扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果如图1所示，其中，M为DL2000 DNA Marker，1-3为鸭默里氏杆菌，4-6为金黄色葡萄球菌，7-9为大肠杆菌，10-12为沙门氏菌，13-15为链球菌，16-17为巴氏杆菌，18-21分别为羊源绿色气球菌、鸭源绿色气球菌、鸡源绿色气球菌、猪源绿色气球菌。
从图1中可以看到，鸭源绿色气球菌扩增产物片段大小为312bp左右，而鸭疫里默杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌均未扩增出特异性条带，表明本发明能鉴定鸭源绿色气球菌。
1.2灵敏度实验
将鸭源绿色气球菌菌液进行10倍梯度稀释，浓度范围为1×101～1×108CFU/mL，利用煮沸法提取DNA，用实施例4中的引物和PCR条件进行扩增，然后取扩增产物进行电泳分析，结果如图2所示，其中，M为DL2000 DNA Marker，1：1×104CFU/mL，2：1×105CFU/mL，3：1×106CFU/mL，4：1×107CFU/mL，5：1×108CFU/mL，6：1×101CFU/mL，7：1×102CFU/mL，8：1×103CFU/mL。
从图2中可以看到，菌液浓度为1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL和1×108CFU/mL的电泳结果均出现了特异性条带，而当菌液浓度小于1×104CFU/mL时，电泳结果中未出现特异性条带，因此，鸭源绿色气球菌的检测限为1×104CFU/mL。
1.3退火温度优化试验
参考实施例4进行退火温度优化，设置11个温度梯度，分别为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，相应条带扩增结果如图3所示。
由图3可以看出，在57℃退火温度下，PCR检测效果最佳。
<110> 河南牧业经济学院
<120> 一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、引物、试剂盒及其方法
<170> PatentIn version 3.5
<211> 312
<212> DNA
<213> 绿色气球菌
<221> 特异分子靶标
<222> (1)..(312)
<400> 1
taagccgtgg gctttcacat cagacttaag aaaccacctg cgctcccttt acgcccaata 60
aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 120
gctttctgat aagataccgt caagactgta gcagttactc tacaatttgt tcttctctta 180
taacagagtt ttacgacccg aaggccttct tcactcacgc ggcattgctc cgtcaggctt 240
tcgcccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc cgtgtctcag 300
tcccaatgtg gc 312
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 正向引物
<222> (1)..(20)
<400> 2
taagccgtgg gctttcacat 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 反向引物
<222> (1)..(20)
<400> 3
gccacattgg gactgagaca 20

Claims (10)

1.一种检测绿色气球菌的特异分子靶标，其特征在于，所述特异分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种检测如权利要求1所述绿色气球菌的特异分子靶标的引物，其特征在于，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种检测绿色气球菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的检测绿色气球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddH2O、2×Es Taq Master Mix。
5.一种检测绿色气球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，用如权利要求2所述的引物对所述DNA进行扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行电泳分析，确定是否存在绿色气球菌的特异性条带；如存在所述特异性条带，表明待测样本中含有绿色气球菌，否则，表明待测样本中无绿色气球菌；所述方法为非疾病诊断治疗的。
6.根据权利要求5所述的检测绿色气球菌的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系包括7μL的ddH2O、10μL的2×Es Taq Master Mix、0 .5μL的所述正向引物、0 .5μL的所述反向引物和2μL的模板DNA；所述正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L。
7.根据权利要求6所述的检测绿色气球菌的方法，其特征在于，所述扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸共计重复30个循环；72℃终延伸10min。
8.根据权利要求7所述的检测绿色气球菌的方法，其特征在于，所述退火的温度为57℃。
9.根据权利要求5-8任一项所述的检测绿色气球菌的方法，其特征在于，所述绿色气球菌的来源为畜牧业动物。
10.根据权利要求9所述的检测绿色气球菌的方法，其特征在于，所述畜牧业动物为鸭、猪、鸡、羊、牛中的一种。
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