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CN114958979A - 一种核酸检测方法 - Google Patents

一种核酸检测方法 Download PDF

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CN114958979A
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居金良
金浩
赵玉军
毛雅辰
张家铨
石宝岭
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Shanghai Rendu Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种核酸检测方法，公开了在自动化核酸检测系统中反应容器内隔离加液的方法，该方法包含了石蜡加热装置使石蜡保持在液态，通过自动化加样枪将液态石蜡注入被恒温加热的反应容器并保持液态状，石蜡为轻质油性密度小，浮在核酸反应液的上层，再直接加入其它组分的反应液体通过重力渗透穿过石蜡隔离层和容器内核酸反应液混合，有效防止反应过程气溶胶的扩散，并通过使用黑色石蜡阻止外界光进入暗室干扰光学数据检测，在检测完成后常温时石蜡保持在固体状态可封住反应容器口阻止反应容器内液体溢出。

Description

一种核酸检测方法
技术领域
本发明属于化学和生物实验的技术领域，尤其涉及一种核酸检测方法，应用于自动化核酸检测系统，或人工核酸检测。
背景技术
在化学和生物实验过程中，需要采取隔离反应容器中的液体溢出或蒸发的气溶胶扩散的措施，防止因溢出和扩散产生对环境、人体、交叉的污染。根据反应体系的预设整个实验过程中反应容器需要在不同的时间段加入不同组分的液体，这样就会出现隔离、打开、再隔离容器的操作过程，目前反应容器的隔离常用的方法有下列几种：
第一种方法是对反应容器加盖或封膜，主要应用于人工实验操作，在实验过程中手工加盖或封膜，手工开盖或撕膜。
第二种方法是利用液态的轻质矿物油上浮在反应液体上方隔绝反应容器内的反应液体，主要应用于自动化设备，通过自动化设备的移液部件对反应容器加或抽矿物油，可以省略加盖或封膜、开盖或撕膜的动作。
第三种方法是通过一种低密度的化学组合物其在反应中为液体、在反应终止后通过化学变化或温度变化成为固体上浮在反应液体上方隔绝反应容器内的反应液体。
同时，在核酸扩增检测过程中，光学数据的测定是在封闭的暗室中进行，防止外界光的干扰，这就需要人工转入光学测量模块或由专用的机械手转入光学测量模块的暗室中。并且聚合酶链式反应(简称PCR)各阶段最高温达约94℃，核酸扩增液会沸腾翻滚，液体矿物油或高温时为液体状的低密度的化学组合物无法有效隔离，造成飞溅和蒸发。
目前在核酸的自动化检测过程的实际应用中，采用上述的一种或几种组合方法对反应容器进行隔离，但自动化仪器很难自动完成加盖或封膜操作，如果容器加盖或封膜需要由自动化仪器完成，需要为这一个步骤，增加比较复杂的机械结构，会增大成本。
在现有的核酸自动化检测系统中存在以下问题和缺点：
1.大多数自动化核酸检测设备需要人工参与加盖或封膜，开盖或撕膜，自动化程度不高；
2.自动化核酸检测设备增加加盖或封膜，开盖或撕膜的自动化结构，会大幅增加制造成本和故障率；
3.自动化核酸检测设备需增加将反应管转移到暗室的特制机械手，以及暗室开闭伸缩等机械结构和电路控制，同样增加了设备的制造成本和故障率。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸检测方法，提供一种通过低密度轻质、在特定温度下可实现固态-液态相变转换的石蜡隔离反应容器内的核酸液体，应用于恒温(低于60℃)扩增反应方法的核酸自动化检测过程，在自动化核酸检测过程中可以通过现有的加液系统对反应管加液态石蜡实现核酸液体的隔离。
为解决上述问题，本发明的技术方案为：
一种核酸检测方法，其特征在于，包括：
在核酸提取纯化后，将固体-液体的相变温度低于核酸反应温度的石蜡加入反应容器中，以实现反应容器内的核酸液体与外部环境的隔离，防止核酸液体溢出或蒸发；所述石蜡为低密度轻物质；
在进行核酸恒温扩增反应时，所述石蜡可被反应添加液从上向下穿透而过，实现反应添加液与核酸液体混合反应的同时，封堵反应容器，防止反应液扩散出反应容器而造成的污染。
根据本发明一实施例，所述石蜡的固体-液体的相变温度范围为35～40℃。
根据本发明一实施例，应用于自动化核酸检测系统；
在进行核酸检测前，将所述石蜡独立封装于适用于直接加热的容器，并将所述容器放置于自动化核酸检测系统中的加热位置，进行预融化，以便在核酸提取纯化后，通过自动化核酸检测系统的自动化移液器将液态石蜡加入反应容器。
根据本发明一实施例，所述石蜡为黑色，在进行荧光数据采集时，无需将反应容器另置于暗室中，就可形成防止外界光干扰的封闭环境。
根据本发明一实施例，在进行荧光数据采集时，将黑色的低密度轻质石蜡加入反应容器，以形成防止外界光干扰的封闭环境，无需将反应容器另置于暗室中。
根据本发明一实施例，在光学数据测量结束后，将固体-液体的相变温度高于核酸反应温度的石蜡加入反应容器中，以固态石蜡封堵反应容器，以防止丢弃反应容器时的液体流出。
根据本发明一实施例，所述固体-液体的相变温度高于核酸反应温度的石蜡的相变温度范围为50～80℃。
根据本发明一实施例，将不同颜色、不同固体-液体相变温度的石蜡区分放置在不同的加热区域，按照核酸检测实验流程，在不同阶段选取相应的石蜡，添加至反应容器。
本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
1)本发明一实施例中的核酸检测方法，公开了在自动化核酸检测系统中反应容器内隔离加液的方法，该方法包含了石蜡加热装置使石蜡保持在液态，通过自动化加样枪将液态石蜡注入被恒温加热的反应容器并保持液态状，石蜡为轻质油性密度小，浮在核酸反应液的上层，再直接加入其它组分的反应液体通过重力渗透穿过石蜡隔离层和容器内核酸反应液混合，有效防止反应过程气溶胶的扩散。
2)本发明一实施例中的核酸检测方法，公开了在自动化核酸检测系统中阻止外界光干扰的方法，该方法在核酸扩增荧光值采集时，使用深孔反应容器并置入深孔座内从容器底部光照激发和荧光数据采集，只封堵容器上部即可形成暗室防止外部光干扰，使用黑色石蜡就可以有效防止外部光线对容器内核酸扩增液荧光采集的干扰。
3)本发明一实施例中的核酸检测方法，自动化核酸检测系统在实验过程中减少人工参与度，提高自动化程度；使用现有的硬件结构就可以完成封堵反应管，不需要增加额外的硬件结构，节约成本。
附图说明
图1为本发明一实施例中的自动化核酸检测系统中对反应容器加液(包括液态石蜡)的示意图；
图2为本发明一实施例中的反应容器内核酸液体和石蜡分层的示意图；
图3为本发明一实施例中的对反应容器中石蜡液体隔离的核酸液体内加液的过程示意图；
图4为本发明一实施例中的自动化核酸检测系统使用不同相变温度的石蜡隔离反应容器中核酸液体的示意图；
图5为本发明一实施例中的自动化核酸检测系统结构示意图。
附图标记说明：
1：反应容器；2：液态石蜡；21：高熔点石蜡；22:低熔点石蜡；3：核酸液体；4：组分液体；51：自动化移液枪；52：tip吸头；6：光学测量模块；61:光学数据收集模块；62：反应管放置架。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种核酸检测方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
本发明公开了在自动化核酸检测系统中反应容器内隔离加液和阻止外界光干扰的方法，该方法包含了石蜡加热装置使石蜡保持在液态，通过自动化加样枪将液态石蜡注入被恒温加热的反应容器并保持液态状，石蜡为轻质油性密度小，浮在核酸反应液的上层，再直接加入其它组分的反应液体通过重力渗透穿过石蜡隔离层和容器内核酸反应液混合，有效防止反应过程气溶胶的扩散，进而在核酸扩增荧光值采集时，使用深孔反应容器并置入深孔座内从容器底部光照激发和荧光数据采集，只封堵容器上部即可形成暗室防止外部光干扰，使用黑色石蜡就可以有效防止外部光线对容器内核酸扩增液荧光采集的干扰。
进一步的，该石蜡独立封装在适用于直接加热的容器，直接放置在自动化核酸检测系统中的加热位置预融化使用，将不同固体-液体相变温度的石蜡区分放置在不同的加热融化区域，按照实验流程和方法设置在不同阶段对反应管加相应的石蜡液体。
进一步的，固体-液体相变温度在35～40℃(低温)的石蜡在自动化核酸检测系统实验过程的提取纯化、恒温扩增、光学数据测量阶段中用于封堵容器内核酸液体，反应管内核酸体系在正常的反应温度时石蜡保持为液态状态；固体-液体相变温度在50～80℃(高温)的石蜡在自动化核酸检测系统实验过程结束后用于封堵容器内混合物。
进一步的，低温石蜡是黑色的，高温石蜡可在光学测量后加入反应容器。
实施例
图1是本发明实施例中自动化核酸检测系统中对反应容器加液(包括液态石蜡)的示意图，由图1可知，该过程自动化装置包括：反应容器1、低熔点石蜡21、高熔点石蜡22、核酸液体3、组分液体4、自动化移液枪51、tip吸头52、光学测量模块6、光学数据收集模块61、反应管放置架62。反应容器1通过两个自动化移液枪51的夹取配合及移动放置在光学测量模块6的反应管放置架62上，反应管放置架62有多组放置位，可以一次性放置多组(每组6个)反应容器。在自动化核酸检测系统中，其具体实施方式如下：
1.常温时为固态的石蜡容器置于加热装置上，自动化核酸检测系统运行时，加热装置自动加热，将固体石蜡融化为液态石蜡，方便使用自动化移液枪51通过移液方式转移石蜡；
2.如图5所示在核酸提取纯化完成后，反应容器内核酸液体需要40～60℃加热温育，为防止液体长时间加热蒸发损失和气溶胶交叉污染，自动化移液枪51取tip吸头52将35～40℃熔点的液态石蜡2移至反应容器1中，如图2所示液态石蜡位于核酸液体的上层，用于将反应溶液和与外界环境隔离；
优选的，选择石蜡熔点低于核酸反应温度，并高于室温的石蜡，可以保证在核酸反应时，石蜡是液体状态。
3.在保持核酸反应温度的情况下，需加入其它的组分液体4进行核酸恒温扩增复制反应，恒温扩增温度大约42～55℃。如图3所示加入的组分液体4通过自身重力渗透穿过液态石蜡2与隔离的核酸液体3混合反应，且在反应的过程中，反应液被液态石蜡2隔离，不会从反应容器1的管口中扩散出来。
4.光学测量模块6对反应管中核酸恒温扩增反应进行光学数据测量，加入的石蜡如果是黑色的如图1所示，会形成防止外界光干扰的封闭环境。
5.光学数据测量结束后，反应管置于常温放置，液态石蜡凝固为固态石蜡，此时反应管的最上层为固态可封堵核酸液体溢出，可通过自动化核酸检测装置自动丢入垃圾箱进行后续处理。
优选的，为了在高温环境防止核酸液体溢出，可在光学数据测量结束后，在反应管中加入高熔点石蜡，如图4所示形成高熔点石蜡21和低熔点石蜡22两层石蜡封堵核酸液体，防止溢出。
本实施例中的核酸检测方法能够应用于自动化核酸检测系统，也可用于人工核酸检测。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明作出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种核酸检测方法，其特征在于，包括：
在核酸提取纯化后，将固体-液体的相变温度低于核酸反应温度的石蜡加入反应容器中，以实现反应容器内的核酸液体与外部环境的隔离，防止核酸液体溢出或蒸发；所述石蜡为低密度轻物质；
在进行核酸恒温扩增反应时，所述石蜡可被反应添加液从上向下穿透而过，实现反应添加液与核酸液体混合反应的同时，封堵反应容器，防止反应液扩散出反应容器而造成的污染。
2.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述石蜡的固体-液体的相变温度范围为35～40℃，保证在正常环境温度时为固体，在反应温度时为液体。
3.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，用于自动化核酸检测系统；
在进行核酸检测前，将所述石蜡独立封装于适用于直接加热的容器，并将所述容器放置于自动化核酸检测系统中的加热位置，进行预融化，以便在核酸提取纯化后，通过自动化核酸检测系统的自动化移液器将液态石蜡加入反应容器。
4.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述石蜡为黑色，在进行荧光数据采集时，无需将反应容器另置于暗室中，就可形成防止外界光干扰的封闭环境。
5.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，还包括：在进行荧光数据采集时，将黑色的低密度轻质石蜡加入反应容器，以形成防止外界光干扰的封闭环境，无需将反应容器另置于暗室中。
6.如权利要求1或5所述的核酸检测方法，其特征在于，还包括：在光学数据测量结束后，将固体-液体的相变温度高于核酸反应温度的石蜡加入反应容器中，以固态石蜡封堵反应容器，以防止丢弃反应容器时的液体流出。
7.如权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述固体-液体的相变温度高于核酸反应温度的石蜡的相变温度范围为50～80℃。
8.如权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于，将不同颜色、不同固体-液体相变温度的石蜡区分放置在不同的加热区域，按照核酸检测实验流程，在不同阶段选取相应的石蜡，添加至反应容器。
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