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CN114934062B - 一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用 - Google Patents

一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用 Download PDF

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CN114934062B CN202210768159.2A CN202210768159A CN114934062B CN 114934062 B CN114934062 B CN 114934062B CN 202210768159 A CN202210768159 A CN 202210768159A CN 114934062 B CN114934062 B CN 114934062B
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Abstract

本发明构建了高效表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌，该工程菌中包含构建的重组表达载体和共表达载体，所述重组表达载体包含表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因，所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaJ、dnaK、GroEL和grpE。本发明通过替换启动子更高效的进行表达，并使D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶与分子伴侣共表达，有效减少包涵体蛋白的形成，分子伴侣进行辅助折叠形成四聚体高级结构，提高表达出可溶蛋白的效率，从而提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的表达水平，降低制备成本。

Description

一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用。
背景技术：
阿洛酮糖又称D-阿洛酮糖，为D-果糖三号位碳所对应的差向异构体，阿洛酮糖具有与蔗糖相似的口感，但其甜度相当于蔗糖的70%，热量相当于蔗糖的0.3 %，且几乎不在体内代谢。并且由于可以通过抑制葡萄糖的吸收来抑制葡萄糖，因此具有降血糖的功效，是最具潜力的蔗糖替代品之一。
阿洛酮糖天然存在于葡萄干、无花果、猕猴桃和红糖等食物中，是自然界中含量极少的稀有单糖，依靠天然产物提取的方法成本高，且很难达到量产。现有技术中，制造D-阿洛酮糖的方法中有化学方法和生物方法。如比利克(bilik)等人曾研发利用钼酸离子的催化作用来由果糖生产阿洛酮糖的技术。麦克唐纳(mcdonald)通过对1,2:4,5-二-o-丙酮缩甘油-β-d-果糖进行三步骤化学处理过程来生产了阿洛酮糖。
但化学方法会产生大量的副产物和使用大量化学试剂，且生产效率并不高。近年来，生物方法制备阿洛酮糖以其安全、绿色、环保的优势而逐渐成为未来的主流趋势。早期，肯·伊兹莫里(kenizumori)等人证实了利用微生物细胞反应以半乳糖醇、d-塔格糖或d-塔罗糖醇为原料生产阿洛酮糖，但原料不易取得，成本高。经过前人的不断研究，现阶段的生物转化法主要是以果糖为原料，经D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成D-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式。
如申请号为201710124243.X公开的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用，其中记载的D-阿洛酮糖3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并且该D-阿洛酮糖3-差向异构酶用于在工业上催化生产阿洛酮糖，或用作工业上催化生产阿洛酮糖的催化剂。
但由于来源于野生菌株未经改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。现有技术常通过改造菌体来提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化活性，如申请号为201610818847.X公开的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用，该专利提供了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，含有G86D、D164E、W262S突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，降低了合成D-阿洛酮糖过程中的酶的用量。
虽然现有技术通过突变等方式提高了酶的催化活性，但仍然存在用大肠杆菌或芽孢杆菌表达蛋白时有大量包涵体蛋白，表达出可溶蛋白效率较低的问题。且由于阿洛酮糖与果糖的差价较低，因此制备阿洛酮糖的关键因素在于酶的制备成本。基于此，如何构建出高效可溶性表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌株成为低成本制备阿洛酮糖的关键点。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明构建了高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，该工程菌中包含构建的重组表达载体和共表达载体，提高了表达出可溶蛋白的效率，从而提高了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达水平。
本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：
发明提供的技术方案之一，是提供重组表达载体，所述重组表达载体包含表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因。
进一步的，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶是如下a）或b）蛋白质：
a）具有SEQ NO：1所示氨基酸序列的蛋白质；
b）由SEQ NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
进一步的，所述组成型启动子HCE是如下c）或d）的DNA片段：
c)具有SEQ NO：2所示核苷酸序列的DNA片段；
d)与SEQ NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段。
优选的，所述载体为pET21a、pET20b、pET22b、pET28a中的任意一种。
本发明提供的技术方案之二，是提供共表达载体，所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaJ、dnaK、GroEL和grpE。
进一步的，所述dnaJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述dnaK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述GroEL基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
进一步的，所述grpE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。
在一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：
将dnaJ、dnaK、GroEL和grpE的基因序列按照dnaJ-dnaK-GroEL-grpE的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
在另一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：
将dnaJ、dnaK、GroEL和grpE的基因序列按照dnaJ-dnaK-grpE-GroEL的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
本发明提供的技术方案之三，是一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，所述工程菌的底盘菌株中包含上述重组表达载体和共表达载体。
优选的，述底盘菌株选自E.coli K12、E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliRosetta、E.coli BL21 plysS、E.coli Top 10、E.coli DH5α中的一种。
在一种具体实施方式中，所述高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的构建方法为：将上述重组表达载体和共表达载体转入底盘菌株中，得到工程菌。
本发明提供的一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的应用：是用于胞内生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，催化D-果糖生产D-阿洛酮糖。
本发明提供的技术方案之四，是一种制备D-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求7所述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养；
2)在发酵培养基中添加诱导剂进行诱导表达，得到发酵液；
3)分离发酵液，获得菌体，加入缓冲液重悬，得到菌液；
4)向D-果糖溶液中加入菌液进行生物转化，得到D-阿洛酮糖。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明一方面将表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的载体中表达目的基因的启动子替换为组成型启动子HCE，通过替换启动子更高效的进行表达。另一方面，本发明将在表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌中同时转化含分子伴侣蛋白dnaJ、dnaK、GroEL和grpE的载体，使D-阿洛酮糖3-差向异构酶与分子伴侣共表达，有效减少包涵体蛋白的形成，分子伴侣进行辅助折叠形成四聚体高级结构，提高表达出可溶蛋白的效率，从而提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达水平，降低制备成本。且本发明的组成型启动子HCE和分子伴侣蛋白的基因来源于同一供体生物，同源性好，有助于目的基因表达的稳定性，进而提升表达效率。
附图说明：
图1为实施例1的核酸电泳验证图。
图2为实施例1构建的重组表达载体pHCE-DPE的质粒图谱。
图3为实施例2构建的共表达载体pUC19-JKLE的质粒图谱。
图4为实施例3构建的共表达载体pUC19-JKEL的质粒图谱。
图5为实施例5中三种工程菌制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶粗酶液的蛋白电泳验证图。
图6为实施例6的样品HPLC色谱图。
具体实施方式：
本发明提供的重组表达载体，所述重组表达载体包含表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因。
其中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶来源于瘤胃球菌（Ruminococcus sp．）。
上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶是如下a）或b）蛋白质：
a）具有SEQ NO：1所示氨基酸序列的蛋白质；
b）由SEQ NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
所述组成型启动子HCE来源于芽孢杆菌（Geobacillus sp. WCH70），芽孢杆菌（Geobacillus sp. WCH70）是从威斯康星州Middleton的热堆肥中分离出来的嗜热生物之一，于2009年12月保藏在NCBI（CP001638）。
上述组成型启动子HCE是如下c）或d）的DNA片段：
c)具有SEQ NO：2所示核苷酸序列的DNA片段；
d)与SEQ NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段。
常用的载体均适用于该重组表达载体，没有特殊限制。优选的，载体为质粒，选择但不限于pET21a、pET20b、pET22b、pET28a中的任意一种。
进一步优选的，本发明采用的载体为pET28a质粒。
本发明还提供共表达载体，所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaJ、dnaK、GroEL和grpE。
上述分子伴侣蛋白dnaJ、dnaK、GroEL和grpE来源于芽孢杆菌Geobacillus sp.WCH70。
其中，dnaJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
dnaK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
GroEL基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
grpE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。
用的载体均适用于该共表达载体，没有特殊限制。优选的，载体为质粒，选择但不限于pUC18、pUC19中的一种。
dnaJ、dnaK、GroEL和grpE基因在载体中的组装顺序不同，对表达有一定影响。
优选的，在一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：
将dnaJ、dnaK、GroEL和grpE的基因序列按照dnaJ-dnaK-GroEL-grpE的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
在另一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：
将dnaJ、dnaK、GroEL和grpE的基因序列按照dnaJ-dnaK-grpE-GroEL的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
在上述重组表达载体和共表达载体的基础上，本发明还提供一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，所述工程菌的底盘菌株中包含上述重组表达载体和共表达载体。
优选的，所述底盘菌株选自E.coli K12、E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliRosetta、E.coli BL21 plysS、E.coli Top 10、E.coli DH5α中的一种。
在一种具体实施方式中，所述高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的构建方法为：将上述重组表达载体和共表达载体转入底盘菌株中，得到工程菌。
本发明提供的一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的应用：是用于胞内生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，催化D-果糖生产D-阿洛酮糖。
本发明提供的技术方案之四，是一种制备D-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求7所述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养；
2)在发酵培养基中添加诱导剂进行诱导表达，得到发酵液；
3)分离发酵液，获得菌体，加入缓冲液重悬，得到菌液；
4)向D-果糖溶液中加入菌液进行生物转化，得到D-阿洛酮糖。
进一步的，步骤1）中，所述发酵培养基为：酵母浸膏20～25g/L，大豆蛋白胨5～10g/L，甘油4～6g/L，磷酸二氢钾2～3g/L，磷酸氢二钾12～16g/L。
发酵培养的条件为：初始pH6～7，培养温度22～37℃，200～600rpm，培养20～28h，溶氧20%～30%。
进一步的，步骤2）中，发酵培养至OD600大于20后，降温至22～25℃，开始加入诱导剂，诱导剂的加入量为0.21～0.25mM终浓度。
优选的，所述诱导剂为IPTG。
进一步的，步骤3中的缓冲液选用Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0，缓冲液与菌体的添加比例为5：1。
进一步的，步骤4）中，D-果糖溶液为500～800g/L，菌液加入量为6-12g/L。
生物转化的条件为pH6-7，50～60℃，转化16～18h。
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。本发明所用的试剂或原料，若无特殊声明，均为市售可得。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南：第4版》中所述的条件进行，或按照试剂盒说明书、试剂生产厂商建议的条件进行。
实施例1 重组表达载体的构建
本实施例中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因来源于瘤胃球菌Ruminococcussp．, 组成型启动子HCE的基因来源于芽孢杆菌Geobacillus sp. WCH70。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列由Genescript公司优化，在5’端添加组成型启动子HCE及核糖体结合位点（RBS）序列，两端分别引入XbaI和XhoI酶切位点，并进行全合成，得到全合成基因片段。上述全合成基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示。
分别将全合成基因片段和pET28a载体进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用T4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
将此重组质粒转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得重组表达载体pHCE-DPE。
进一步，提取质粒，用PCR获取目的基因片段，进行核酸电泳验证。
PCR引物如下：
p1：ATGAAGTACGGTATCTACTATGCTTATTGGG
p2：CCTCGAAAACGTGTTTAACAAAATGCAAC
核酸电泳验证如图1所示，目的基因的大小为873bp，电泳验证结果与目的基因的大小一致，表明成功构建了该重组表达载体。
实施例2 dnaJ-dnaK-GroEL-grpE共表达载体的构建
本实施例中，4个分子伴侣蛋白dnaJ、dnaK、GroEL、grpE的基因来源于芽孢杆菌Geobacillus sp. WCH70。
将分子伴侣蛋白dnaJ、dnaK、grpE、GroEL按照dnaJ-dnaK-GroEL-grpE的顺序组装，在dnaJ和GroEL之后插入RBS序列，在dnaK之后插入lac启动子和RBS序列。整个序列两端分别引入XbaI和KpnI酶切位点，由Genescript公司进行全合成，得到全合成基因片段，该基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
分别将全合成基因片段和pUC 19载体进行XbaI和KpnI双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用T4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
将此重组质粒转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得共表达载体pUCMOD-JKLE。
实施例3 dnaJ-dnaK-grpE -GroEL共表达载体的构建
本实施例中，4个分子伴侣蛋白dnaJ、dnaK、GroEL、grpE的基因来源于芽孢杆菌Geobacillus sp. WCH70。
将分子伴侣蛋白dnaJ、dnaK、grpE、GroEL按照dnaJ-dnaK-grpE-GroEL的顺序组装，在dnaJ和grpE之后分别插入RBS序列，在dnaK之后插入lac启动子和RBS序列。序列两端分别引入XbaI和KpnI酶切位点，由Genescript公司进行全合成，得到全合成基因片段，该基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示。
分别将全合成基因片段和pUC 19载体进行XbaI和KpnI双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用T4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
将此重组质粒转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得共表达载体pUCMOD-JKEL。
实施例4 工程菌的构建
将实施例1制备得到的重组表达质粒pHCE-DPE转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞，用含有卡那霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得菌株DPE-A。
用DPE- A菌株制备感受态细胞，将实施例2制备得到的分子伴侣质粒pUCMOD-JKLE转化入DPE-1感受态细胞，用含有氨苄青霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得工程菌DPE-B1。
用DPE- A菌株制备感受态细胞，将实施例3制备得到的分子伴侣质粒pUCMOD-JKEL转化入DPE-1感受态细胞，用含有氨苄青霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得工程菌DPE-B2。
对比例1
本实施例中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因来源于瘤胃球菌Ruminococcussp．, 组成型启动子HCE的基因来源于芽孢杆菌Geobacillus sp. WCH70。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列由Genescript公司优化，两端分别引入XbaI和XhoI酶切位点，进行全合成，得到全合成基因片段。分别将全合成基因片段和pET28a载体进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用T4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
将此重组质粒转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得重组表达载体pET28a-DPE。
将重组表达载体pET28a-DPE转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞，用含有卡那霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得工程菌DPE-C。
实施例5 菌株培养及表达
实验菌株：
实施例4构建的工程菌DPE-B1；
实施例4构建的工程菌DPE-B2；
对比例1构建的工程菌DPE-C。
挑取上述工程菌DPE-B1、工程菌DPE-B2和工程菌DPE-C，分别接种在含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.7-0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG，在22℃、150rpm条件下诱导表达过夜。4℃，6000r/min离心10-15min，收集菌体，用缓冲液（20mmol/LTris-HCl，Ph8.0）按照5：1的比例（1克湿菌体添加5mL缓冲液）重悬菌体，超声破碎，10000r/min离心20min，收集上清液，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的粗酶液。
将收集到的三种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的粗酶液进行蛋白电泳验证，结果如图5所示，其中，1工程菌DPE-B1制备出的粗酶液；2为工程菌DPE-B2制备出的粗酶液；3为工程菌DPE-C制备出的粗酶液。蛋白电泳验证结果与目的基因的大小一致，表明上述三种工程菌均成功表达了该目的基因。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶转化率测定：
反应体系如下：10mL反应体积，100μL粗酶液、50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)、700mg/mL D-果糖，60℃条件下反应2、4、8、12、16小时，分别取样，HPLC检测果糖和阿洛酮糖的含量，计算转化率。
HPLC色谱条件如下：
分析柱：ChromCore Sugar-10Ca；
流动相：去离子水
柱温：80℃；
示差检测器温度：50℃；
流速：0.5mL/min；
进样量：10μL。
反应结果如下表1所示，从表1所列出的数据可以看出，实施例4构建的工程菌，的D-阿洛酮糖3-差向异构酶与高浓度的果糖反应时，仅仅经过约18个小时 转化率就达到超过33％的最大转化率：
表1
工程菌 2小时阿洛酮糖转化率，% 4小时阿洛酮糖转化率，% 8小时阿洛酮糖转化率，% 12小时阿洛酮糖转化率，% 16小时阿洛酮糖转化率，%
DPE-B1 11.57 17.35 25.99 27.34 29.25
DPE-B2 11.31 16.45 24.25 26.94 28.82
DPE-C 8.70 14.51 19.53 22.20 24.38
实施例6 制备D-阿洛酮糖
选择实施例5中转化率最好的工程菌DPE-B1为生物合成制备D-阿洛酮糖用菌株，上述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基为酵母浸膏25g/L，大豆蛋白胨8g/L，甘油6g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾15g/L。发酵培养的初始pH为7，培养温度26℃，溶氧控制在20%～30%，培养24h。当发酵培养至OD600大于20后，降温至22℃，开始加入诱导剂，诱导剂选用IPTG，IPTG的加入量为0.25mM终浓度。发酵结束，得到发酵液，6000r/min离心10-15min，获得菌体。
用缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，Ph8.0）按照5：1的比例重悬菌体，得到菌液，在700g/L的D-果糖溶液中加入12 g/L菌液，pH为6，60℃进行生物转化，转化时间为18h，转化结束后，取样进行HPLC测定D-阿洛酮糖含量，计算转化率，结果如图6所示。结果显示，D-阿洛酮糖的峰面积为29.19。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 四川盈嘉合生科技有限公司
<120> 一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用
<130> 20220701
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> Ruminococcus sp．
<400> 1
atgaagtacg gtatctacta tgcttattgg gaaaaggagt ggaacggtga ctacaagtat 60
tacatcgata agattagcaa attgggtttt gacattctgg aaatcagctg tggtgctttc 120
agcgactatt acaccaaaga tcaggaactg atcgacattg gtaaatacgc gaaggaaaag 180
ggtgttacct tgaccgctgg ttacggtccg catttcaacg agagcttgag cagcagcgaa 240
ccgaacaccc aaaagcaggc tattagcttc tggaaggaaa ccttgcgtaa actgaagttg 300
atggacattc atatcgttgg tggtgctctg tacggttatt ggccggttga ttacagcaaa 360
ccgttcgata agaagcgtga cctggaaaac agcatcaaga acatgaaaat tatcagccag 420
tatgcggaag agtacgacat catgatgggt atggaagttt tgaaccgttt cgaaggttac 480
atgctgaaca cctgcgatga agctctggcg tacgttgagg aagttggtag cagcaacgtt 540
ggtgttatgc tggacacctt tcacatgaac attgaggaag acaacattgc tgcggctatt 600
cgtaaggctg gtgaccgtct gtaccacttc cacatcggtg aaggtaaccg taaagttccg 660
ggtaaaggta tgctgccgtg gaacgaaatc ggtcaggctt tgcgtgatat caactaccag 720
catgctgctg ttatggagcc gtttgttatg cagggtggta ccgttggtca cgacatcaaa 780
atttggcgtg acatcattgg taactgcagc gaagttaccc tggatatgga cgctcaaagc 840
gcgttgcatt ttgttaaaca cgttttcgag gtt 873
<210> 2
<211> 218
<212> DNA
<213> Geobacillus sp. WCH70
<400> 2
gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caattaaaac 60
ggcggcatgt ctttctatat tccagcaatg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120
tatcacctta gtaaaaaaaa agaattgcta taagctgctc ttttttgttc gtgatatact 180
gataataaat tgaattttca cacttctgga aaaaggag 218
<210> 3
<211> 1143
<212> DNA
<213> Geobacillus sp. WCH70
<400> 3
atggcgaaac gagattatta cgaaattctc ggagtgagca aaaacgcgac aaaagaagag 60
attaaaaaag cgtaccgaaa actttcgaaa aagtatcatc cagatattaa caaagaacca 120
gatgcggcag aaaaattcaa agaaattaaa gaagcgtatg aagtattaag cgatgatcaa 180
aaacgtgcgc attacgatca gtttgggcat gcggatccaa atcaagggtt cggcgggttc 240
cgcagcgatg attttgactt tggcggtttc agcggcttcg gtggtttcga ggatattttc 300
agcacctttt ttggcggcgg ccgccggcgc gatccaaatg cgccaagagc tggtgccgat 360
ttacaatata cgatgacatt aacatttgaa gaggcggcat tcggaaaaga aacggatatt 420
gaaattccac gggaagaaac gtgtgacaca tgccatggca cgggagcaaa accgggaacg 480
aaaaaagaaa catgttcata ttgtcatgga acaggtcaaa tcagcacaga gcagtccaca 540
ccgtttggcc gcatcgttaa tcgccgcaca tgcccatatt gcggcgggac agggcaatat 600
atcaaagaaa aatgcacaac atgcggcggg actggccgcg tgaaaaaacg gaagaaaatc 660
catgtcaaaa tcccagctgg aattgatgat ggacaacaat tgcgggtcgc tggccaagga 720
gaaccgggaa ttaacggcgg acctccggga gatttatata tcgttttcca tgtggagcca 780
catgagtttt ttgagcgtga tggcgatgat atttactgtg aaataccgct tacatttgct 840
caggctgcgc tcggtgacga aatcgaagtg ccgacgcttc atggcaaagt gaagctgaaa 900
ataccagcag gcactcaaac aggaacaaaa ttccgcttaa aagggaaagg ggtgccgaat 960
gtacgcggct atggctatgg cgaccaacat gtgattgtcc gcgttgtgac gccgacaaaa 1020
ctgacagaaa aacaaaagca attattgcgc gaatttgatc aattaggcgg ttcaagcatg 1080
catcaaggac catacggccg cttttttgac aaggtaaaaa aagcgtttaa aggggaatca 1140
tga 1143
<210> 4
<211> 1830
<212> DNA
<213> Geobacillus sp. WCH70
<400> 4
atgagtaaaa ttatcggtat tgacttaggt acaaccaact catgcgtcgc tgtgctagaa 60
ggcggcgaac caaaagtaat tccaaaccca gaagggaacc gaaccactcc ttctgttgtg 120
gcgtttaaaa acggcgaacg tttagtcgga gaagtcgcca aacgtcaggc aattaccaac 180
ccaaacacca tcatttcgat taaacgccat atgggaacgg attataaggt agaaattgaa 240
gggaaaaaat atacaccaca agaaatttcg gcaattattc tacaatactt aaaatcatat 300
gcagaagact atttaggcga accagtgaca agagcggtaa ttaccgttcc ggcgtacttt 360
aacgatgcgc aacgccaagc gacaaaagac gcagggcgca tcgctggatt ggaagtagaa 420
cggattatta acgagccgac agcagcggcg cttgcgtacg gtttggataa agaagaagat 480
caaacgatcc tcgtttacga cttaggcggc ggtacgtttg acgtatcgat ccttgaactt 540
ggcgacgggg tatttgaagt aaaagcgact gccggcgaca accatcttgg cggcgacgat 600
tttgaccaag tcatcatcga ttacttagta gagcaattca aacaagaaca cggcatcgat 660
ttatccaaag acaaaatggc gttgcaacgc cttaaagatg ctgcggaaaa agcgaaaaaa 720
gaactttccg gcgtaacgca aacgcaaatt tcattgccgt tcattagcgc aaatgaaacg 780
gggccattac acttagaaac gacattaaca agagcgaaat ttgaagagct atccgcccat 840
ctagttgaac ggacaatggg accggtacgt caagcgttgc aagatgcggg attgacgcct 900
tcggatatcg ataaagtgat ccttgtcggc ggttcgacgc gcattccagc ggtacaagaa 960
gcgattaaac gcgagcttgg aaaagagccg cataaaggcg ttaacccaga cgaagtggta 1020
gcgatcggcg cggcgattca aggcggtgtc attgccggtg aagtaaaaga cgtcgttctt 1080
cttgacgtaa cgccgctatc gcttggaatt gaaacaatgg gtggtgtgtt tacaaaatta 1140
attgaacgca acacaacgat tccaacaagt aaatcacaaa ttttcactac ggcagccgat 1200
aaccaaacaa cggttgacat tcatgtgctg caaggcgaac gtccgatggc tgctgacaac 1260
aaaacgctcg gccgtttcca attaacagat atcccacctg caccacgcgg cgtaccgcaa 1320
atcgaagtaa cgtttgacat cgacgccaac ggtattgtcc atgttcgcgc gaaagatttg 1380
ggcacaaaca aagaacaatc cattacgatt aaatcttcat ccggtctttc tgaagaagag 1440
attcaacgaa tgattaaaga agcagaagaa aacgcggaag cggacagaaa acgtaaagaa 1500
gcggcagaac ttcgcaacga agccgaccaa ttagtattca cgaccgaaaa aacattaaaa 1560
gaggtagaag gaaaagtaga cgaagcagaa gtgaaaaaag cgcaagaagc aaaagacgcg 1620
ttaaaagctg cgcttgagaa aaacgacatc gatgacattc gcaaaaagaa agaagcgctt 1680
caagaaatcg tacagcagct ttccatcaag ctatacgaac aagcggcaaa acaagcacaa 1740
gctcagcagc aggcaggagc cggcggcgct gcgaaaaaag acgaaaatgt tgtcgatgca 1800
gaatttgaag aagtaaaaga cgacaaataa 1830
<210> 5
<211> 1620
<212> DNA
<213> Geobacillus sp. WCH70
<400> 5
atggcaaaag aaattaaatt cagcgaagaa gctcgtcgtg cgatgttacg tggtgtggac 60
aaattagctg atgcggtaaa agtaacgtta ggtccaaaag gccgtaacgt cgtattagag 120
aaaaaattcg gttctccatt aattacgaat gacggtgtaa cgatcgcgaa agaaatcgaa 180
ttagaagatc catttgaaaa catgggtgcg aagcttgttg ctgaagttgc aagcaaaaca 240
aacgatgttg ctggggacgg tacaacaacg gcaacagttt tagcgcaagc aatgatccgc 300
gaaggattga aaaacgttac agctggcgct aacccaatgg gcatccgtaa aggtattgaa 360
aaagcggtcg ctgtggcagt agaagaatta aaagcaatct ccaaaccaat caaaggaaaa 420
gaatcgattg ctcaagttgc ggctatctct gcagctgacg aagaagttgg ccaattaatc 480
gcagaagcaa tggaacgcgt tggtaacgac ggtgttatca cattagaaga atcaaaaggc 540
ttcacaacag aattagatgt tgtggaaggt atgcaatttg accgtggtta tgtatctcca 600
tacatgatca cagatacaga aaaaatggaa gcagtgcttg aaaatccata tatcttaatc 660
acagacaaaa aaatctctaa catccaagac atcttgccta tcttagaaca agtagttcaa 720
caaggcaaac cattattaat catcgcagaa gatgtcgaag gcgaagcact tgcgacatta 780
gtagtgaaca aacttcgcgg tacattcact gccgtagcag ttaaagctcc tggcttcggt 840
gatcgtcgta aagcaatgct tgaagacatc gcaatcttaa ctggcggtga agttatctcc 900
gaagaactag gacgtgactt aaaatctaca acaatcgcat cacttggccg cgcttcgaaa 960
gtagtcgtaa caaaagaaaa tacaacaatt gtagatggcg ctggcgactc tgaacgcatt 1020
aaagctcgca tcaaccaaat tcgtgcgcaa ttagaagaaa caacttctga attcgatcgt 1080
gaaaaattgc aagaacgtct agcaaaatta gctggcggcg tagcggtaat caaagttggt 1140
gcagctacag aaacagaatt gaaagaacgc aaattacgca tcgaagacgc gctcaactct 1200
actcgtgccg ctgtggaaga aggtatcgta gccggcggtg gtacagcatt aatgaacgta 1260
tacaataaag ttgctgcgat tgaagcagaa ggcgatgaag caactggtgt gaaaatcgtt 1320
cttcgcgcaa ttgaagagcc agttcgccaa atcgcgcaaa acgctggttt ggaaggctct 1380
gtcattgttg aacgcttaaa aacagaaaaa cctggcatcg gcttcaacgc ggctactggt 1440
gaatgggtag acatgattga agctggtatc gtagacccaa cgaaagtaac tcgttccgca 1500
cttcaaaacg cagcttctgt tgccgctatg ttcttaacaa cagaagcagt tgtcgctgac 1560
aaaccagaag aaaacaaagg cggcaaccca ggcatgcctg acatgggcgg aatgatgtaa 1620
<210> 6
<211> 627
<212> DNA
<213> Geobacillus sp. WCH70
<400> 6
atggaaaaag agcagaaagc agcacaagaa caggctacat acgaacagga accgttaaat 60
acggaaccgc aagaggaaaa agtagagcaa catgaagtaa atgaacatca agaggaaatc 120
gaaatagaag ggcaagaaaa agcacaagaa gagcaaaacg atgaattggc ggcggcaaac 180
gcaaaaattg cggaactaga agcgaaaata aaagaaatgg agaaccgcta tcttcgttta 240
tacgccgatt ttgaaaattt ccgccgtcgt acaaaaatgg aaatggaagc agctgaaaaa 300
tatcgcgccc aaagcttggt tagcgatctt ttgcctgctt tggacaactt tgagcgtgcg 360
ttaaagatag aggctgataa cgaacaagca aaatcgattc tgcaaggaat ggaaatggtg 420
tatcgctccg tgttggatgc gctgaaaaaa gaaggagtag aagcgatcga agcggttggc 480
aaaccgtttg atccgaactt gcatcaagcc gtgatgcaag tagaagacag caattatgag 540
ccgaatacag ttgtggaaga atttcagaaa ggttataaac tgaaagatcg tgtcattcgt 600
ccagcaatgg tgaaagtaag ccaataa 627
<210> 7
<211> 1144
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tctagagatc tctccttcac agattcccaa tctcttgtta aataacgaaa aagcatcaat 60
taaaacggcg gcatgtcttt ctatattcca gcaatgtttt ataggggaca tattgatgaa 120
gatgggtatc accttagtaa aaaaaaagaa ttgctataag ctgctctttt ttgttcgtga 180
tatactgata ataaattgaa ttttcacact tctggaaaaa ggagaataat tttgtttaac 240
tttaagaagg agatatacca tgggcatgaa gtacggtatc tactatgctt attgggaaaa 300
ggagtggaac ggtgactaca agtattacat cgataagatt agcaaattgg gttttgacat 360
tctggaaatc agctgtggtg ctttcagcga ctattacacc aaagatcagg aactgatcga 420
cattggtaaa tacgcgaagg aaaagggtgt taccttgacc gctggttacg gtccgcattt 480
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ggaaaccttg cgtaaactga agttgatgga cattcatatc gttggtggtg ctctgtacgg 600
ttattggccg gttgattaca gcaaaccgtt cgataagaag cgtgacctgg aaaacagcat 660
caagaacatg aaaattatca gccagtatgc ggaagagtac gacatcatga tgggtatgga 720
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taccctggat atggacgctc aaagcgcgtt gcattttgtt aaacacgttt tcgaggttct 1140
cgag 1144
<210> 8
<211> 5405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
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agaagagatt aaaaaagcgt accgaaaact ttcgaaaaag tatcatccag atattaacaa 120
agaaccagat gcggcagaaa aattcaaaga aattaaagaa gcgtatgaag tattaagcga 180
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cgggttccgc agcgatgatt ttgactttgg cggtttcagc ggcttcggtg gtttcgagga 300
tattttcagc accttttttg gcggcggccg ccggcgcgat ccaaatgcgc caagagctgg 360
tgccgattta caatatacga tgacattaac atttgaagag gcggcattcg gaaaagaaac 420
ggatattgaa attccacggg aagaaacgtg tgacacatgc catggcacgg gagcaaaacc 480
gggaacgaaa aaagaaacat gttcatattg tcatggaaca ggtcaaatca gcacagagca 540
gtccacaccg tttggccgca tcgttaatcg ccgcacatgc ccatattgcg gcgggacagg 600
gcaatatatc aaagaaaaat gcacaacatg cggcgggact ggccgcgtga aaaaacggaa 660
gaaaatccat gtcaaaatcc cagctggaat tgatgatgga caacaattgc gggtcgctgg 720
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gctgaaaata ccagcaggca ctcaaacagg aacaaaattc cgcttaaaag ggaaaggggt 960
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gacaaaactg acagaaaaac aaaagcaatt attgcgcgaa tttgatcaat taggcggttc 1080
aagcatgcat caaggaccat acggccgctt ttttgacaag gtaaaaaaag cgtttaaagg 1140
ggaatcatga aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatggg cagcagcatg 1200
agtaaaatta tcggtattga cttaggtaca accaactcat gcgtcgctgt gctagaaggc 1260
ggcgaaccaa aagtaattcc aaacccagaa gggaaccgaa ccactccttc tgttgtggcg 1320
tttaaaaacg gcgaacgttt agtcggagaa gtcgccaaac gtcaggcaat taccaaccca 1380
aacaccatca tttcgattaa acgccatatg ggaacggatt ataaggtaga aattgaaggg 1440
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gaagactatt taggcgaacc agtgacaaga gcggtaatta ccgttccggc gtactttaac 1560
gatgcgcaac gccaagcgac aaaagacgca gggcgcatcg ctggattgga agtagaacgg 1620
attattaacg agccgacagc agcggcgctt gcgtacggtt tggataaaga agaagatcaa 1680
acgatcctcg tttacgactt aggcggcggt acgtttgacg tatcgatcct tgaacttggc 1740
gacggggtat ttgaagtaaa agcgactgcc ggcgacaacc atcttggcgg cgacgatttt 1800
gaccaagtca tcatcgatta cttagtagag caattcaaac aagaacacgg catcgattta 1860
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taattttgtt taactttaag aaggagatat accatgggca gcagcatggc aaaagaaatt 3120
aaattcagcg aagaagctcg tcgtgcgatg ttacgtggtg tggacaaatt agctgatgcg 3180
gtaaaagtaa cgttaggtcc aaaaggccgt aacgtcgtat tagagaaaaa attcggttct 3240
ccattaatta cgaatgacgg tgtaacgatc gcgaaagaaa tcgaattaga agatccattt 3300
gaaaacatgg gtgcgaagct tgttgctgaa gttgcaagca aaacaaacga tgttgctggg 3360
gacggtacaa caacggcaac agttttagcg caagcaatga tccgcgaagg attgaaaaac 3420
gttacagctg gcgctaaccc aatgggcatc cgtaaaggta ttgaaaaagc ggtcgctgtg 3480
gcagtagaag aattaaaagc aatctccaaa ccaatcaaag gaaaagaatc gattgctcaa 3540
gttgcggcta tctctgcagc tgacgaagaa gttggccaat taatcgcaga agcaatggaa 3600
cgcgttggta acgacggtgt tatcacatta gaagaatcaa aaggcttcac aacagaatta 3660
gatgttgtgg aaggtatgca atttgaccgt ggttatgtat ctccatacat gatcacagat 3720
acagaaaaaa tggaagcagt gcttgaaaat ccatatatct taatcacaga caaaaaaatc 3780
tctaacatcc aagacatctt gcctatctta gaacaagtag ttcaacaagg caaaccatta 3840
ttaatcatcg cagaagatgt cgaaggcgaa gcacttgcga cattagtagt gaacaaactt 3900
cgcggtacat tcactgccgt agcagttaaa gctcctggct tcggtgatcg tcgtaaagca 3960
atgcttgaag acatcgcaat cttaactggc ggtgaagtta tctccgaaga actaggacgt 4020
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caaattcgtg cgcaattaga agaaacaact tctgaattcg atcgtgaaaa attgcaagaa 4200
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tctgttgccg ctatgttctt aacaacagaa gcagttgtcg ctgacaaacc agaagaaaac 4680
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taaaagaaat ggagaaccgc tatcttcgtt tatacgccga ttttgaaaat ttccgccgtc 5040
gtacaaaaat ggaaatggaa gcagctgaaa aatatcgcgc ccaaagcttg gttagcgatc 5100
ttttgcctgc tttggacaac tttgagcgtg cgttaaagat agaggctgat aacgaacaag 5160
caaaatcgat tctgcaagga atggaaatgg tgtatcgctc cgtgttggat gcgctgaaaa 5220
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aaggttataa actgaaagat cgtgtcattc gtccagcaat ggtgaaagta agccaataag 5400
gtacc 5405
<210> 9
<211> 5405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
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agaagagatt aaaaaagcgt accgaaaact ttcgaaaaag tatcatccag atattaacaa 120
agaaccagat gcggcagaaa aattcaaaga aattaaagaa gcgtatgaag tattaagcga 180
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tattttcagc accttttttg gcggcggccg ccggcgcgat ccaaatgcgc caagagctgg 360
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gggaacgaaa aaagaaacat gttcatattg tcatggaaca ggtcaaatca gcacagagca 540
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gaaaatccat gtcaaaatcc cagctggaat tgatgatgga caacaattgc gggtcgctgg 720
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ggagccacat gagttttttg agcgtgatgg cgatgatatt tactgtgaaa taccgcttac 840
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gccgaatgta cgcggctatg gctatggcga ccaacatgtg attgtccgcg ttgtgacgcc 1020
gacaaaactg acagaaaaac aaaagcaatt attgcgcgaa tttgatcaat taggcggttc 1080
aagcatgcat caaggaccat acggccgctt ttttgacaag gtaaaaaaag cgtttaaagg 1140
ggaatcatga aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatggg cagcagcatg 1200
agtaaaatta tcggtattga cttaggtaca accaactcat gcgtcgctgt gctagaaggc 1260
ggcgaaccaa aagtaattcc aaacccagaa gggaaccgaa ccactccttc tgttgtggcg 1320
tttaaaaacg gcgaacgttt agtcggagaa gtcgccaaac gtcaggcaat taccaaccca 1380
aacaccatca tttcgattaa acgccatatg ggaacggatt ataaggtaga aattgaaggg 1440
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gttgaacgga caatgggacc ggtacgtcaa gcgttgcaag atgcgggatt gacgccttcg 2100
gatatcgata aagtgatcct tgtcggcggt tcgacgcgca ttccagcggt acaagaagcg 2160
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aaccagaaga aaacaaaggc ggcaacccag gcatgcctga catgggcgga atgatgtaag 5400
gtacc 5405

Claims (4)

1.一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌的底盘菌株中包含重组表达载体和共表达载体；
所述重组表达载体包含表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶是具有SEQ NO：1所示氨基酸序列的蛋白质；所述组成型启动子HCE是具有SEQ NO：2所示核苷酸序列的DNA片段；
所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaJ、dnaK、GroEL和grpE；
所述dnaJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
所述dnaK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
所述GroEL基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
所述grpE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；
将dnaJ、dnaK、GroEL和grpE的基因序列按照dnaJ-dnaK-GroEL-grpE或dnaJ-dnaK-grpE-GroEL的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
2.根据权利要求1所述的一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组表达载体和共表达载体转入底盘菌株中，得到工程菌。
3.根据权利要求1所述的一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的应用，其特征在于，用于胞内生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，催化D-果糖生产D-阿洛酮糖。
4.一种制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将权利要求1所述工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养；
2)在发酵培养基中添加诱导剂进行诱导表达，得到发酵液；
3)分离发酵液，获得菌体，加入缓冲液重悬，得到菌液；
4)向D-果糖溶液中加入菌液进行生物转化，得到D-阿洛酮糖。
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Denomination of invention: An engineered bacterium with efficient expression of D-alodone-3-epimerase and its application

Granted publication date: 20230901

Pledgee: Industrial Bank Limited by Share Ltd. Chengdu branch

Pledgor: SICHUAN INGIA BIOSYNTHETIC Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980008649

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