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CN114903987A - 一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114903987A
CN114903987A CN202210610751.XA CN202210610751A CN114903987A CN 114903987 A CN114903987 A CN 114903987A CN 202210610751 A CN202210610751 A CN 202210610751A CN 114903987 A CN114903987 A CN 114903987A
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lnp
21mrna
lipid
gene
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CN202210610751.XA
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谢幼华
刘晶
张继明
沈忠良
章申琰
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Original Assignee
Fudan University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物及其制备方法和应用，所述mRNA药物为脂质纳米颗粒LNP‑IL‑21，其由用于表达IL‑21蛋白或其突变体的IL‑21mRNA和用于递送mRNA的脂质制成，具体为：根据IL‑21基因制备IL‑21mRNA；将IL‑21mRNA与脂质混合，制得LNP‑IL‑21。本发明制备的LNP‑IL‑21脂质纳米颗粒能成功递送至小鼠体内且能在体内表达IL‑21，其通过活化CD8T细胞免疫和体液免疫达到完全清除体内HBV的免疫效果，且在血清中IL‑21为短时表达，具有更好的治疗安全性，一定程度上规避爆发性肝炎发生的可能性，具有良好的应用前景。

Description

一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及mRNA药物技术领域，尤其涉及一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物及其制备方法和应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球一个公共卫生问题，约有2.5亿人感染慢性乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B，CHB)，每年死于CHB相关的疾病的人数高达60万。目前临床上用于治疗CHB的药物主要包括干扰素和核苷酸类似物，但是这些药物不能治愈CHB，因此急需研发新的抗病毒治疗策略。前期研究将白介素21基因(IL-21)克隆至腺相关病毒载体(AAV)，构建AAV-IL-21基因治疗性载体；随后将AAV-IL-21注射入多种慢乙肝小鼠模型中，发现AAV-IL-21可以清除体内HBV，达到彻底治愈CHB的功能。但是上述AAV-IL-21的应用具有较大的局限性，(1)AAV虽然是一种目前临床上可用的基因治疗传输载体，但是AAV具有诱导肿瘤发生、较强免疫原性、诱导外源DNA整合于宿主染色体、长时表达外源基因等危害；(2)该方法在清除HBV过程中主要是通过IL-21活化CD8 T细胞免疫，通过细胞杀伤功能(CTL)发挥作用的，具有较大的治疗风险，如引发爆发性肝炎。综合上述风险因素，急需建立一个基于IL-21的新的更具安全性的治疗方式。
mRNA疫苗主要包含目标基因RNA和传输系统，如纳米脂质颗粒(lipidnanoparticle，LNP)。目前mRNA疫苗已成功运用于如新冠疫苗的研发、基于CAR-T的肿瘤治疗等方面。但在慢性乙型肝炎病毒感染的治疗方面，目前并未涉及mRNA治疗药物的研究。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明提供一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物及其制备方法和应用，进一步提高慢性乙型肝炎病毒治疗性药物的安全性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其包括由IL-21mRNA和脂质制成的脂质纳米颗粒LNP-IL-21；其中，所述IL-21mRNA用于表达IL-21蛋白或其突变体，所述脂质用于递送mRNA。
进一步地，所述IL-21基因为编码IL-21蛋白或其突变体的人源或鼠源基因序列。具体地，所述IL-21基因为人源IL-21基因；或，所述IL-21基因为鼠源IL-21基因；或，所述IL-21基因为用于编码所述人源或鼠源IL-21蛋白突变体的基因序列。
进一步地，所述IL-21基因为GenBank Accession Number：NP_068575.1；具体地，所述IL-21mRNA为人源IL-21mRNA。
进一步地，所述IL-21基因为GenBank Accession Number：NM_021782.2；具体地，所述IL-21mRNA为鼠源IL-21mRNA。
可理解的是，上述“IL-21蛋白突变体”可为各种形式的IL-21分子的任何突变体形式，包括全长IL-21、IL-21的截短形式和IL-21与另一分子连接(如通过融合或化学缀合进行)的形式。上述“全长”是指成熟的、天然长度的IL-21分子。上述IL-21蛋白突变体为IL-21蛋白的功能等同物，其是在不改变所述IL-21蛋白特性的前提下，对IL-21蛋白的个别氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰，所述IL-21蛋白突变体的氨基酸序列与IL-21蛋白的氨基酸序列具有至少85％的同一性(例如88％，90％，95，99％等)。
进一步地，所述脂质包括阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和磷脂酰胆碱。
进一步地，所述阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和二饱和磷脂酰胆碱的摩尔比为40～50：1～2：38～48：6～12；优选，摩尔比为45～50：1.5～1.8：40～45：8～10。在一具体实施方案中，其摩尔比为46.3：1.6：42.7：9.4。
进一步地，在所述LNP-IL-21中，所述IL-21mRNA和脂质的质量配比为1：5～35；优选为1：10～30；更优选为1：25。
进一步地，所述阳离子脂质可为常规使用的脂质，例如DOTAP、DOTMA、DC-chol、DOSPA、Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA、DlinDMA、SM-102、ALC-0315中的至少一种，具体地可为ALC-0315。
进一步地，所述修饰的PEG为脂质锚定PEG(lipid-anchored PEG)，其可为常规使用的脂质锚定PEG，例如DMA-PEG2000、PEG2000-Ceramide-C14、M-DMG-2000，优选DMA-PEG2000。
进一步地，所述磷脂酰胆碱为二硬脂酰磷脂酰胆碱(1,2-Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine，DSPC)。
进一步地，所述mRNA药物可为治疗性mRNA乙型肝炎病毒疫苗，其还包括其他佐剂(其可为本领域可接受的佐剂，例如用于提高IL-21免疫治疗效果、提高体内抗HBV免疫反应的佐剂)。
进一步地，所述mRNA药物可制备成注射剂、口服剂等常规剂型。
本发明的第二个方面是提供一种如本发明的第一个方面中任一所述的用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物的制备方法，其包括步骤：
步骤1)IL-21mRNA的制备：根据IL-21基因制备IL-21mRNA；
步骤2)LNP-IL-21的制备：将所述IL-21mRNA与脂质混合，制得LNP-IL-21。
进一步地，在上述制备方法中，所述步骤1)中，所述IL-21mRNA的制备具体包括步骤：将IL-21基因克隆至体外转录质粒，将所构建的线性化的重组质粒进行体外转录获得IL-21mRNA。
进一步地，在上述制备方法中，所述体外转录质粒为pCZ质粒，所述pCZ质粒包含5'非翻译区、3'非翻译区(UTR)以及polyA尾；采用BspQI将pCZ质粒线性化，并使用T7聚合酶在体外转录合成IL-21mRNA。具体地，所述polyA尾的长度为120个核苷酸。
进一步地，在上述制备方法中，所述IL-21mRNA包含替换UTP的1-甲基假UTP(1-methylpseudo UTP)，并添加帽结构，从而提高IL-21mRNA的翻译效率。即，体外转录IL-21mRNA的原料包括ATP、CTP、1-methylpseudo UTP、GTP和帽结构，上述帽结构可采用本领域常规使用的帽结构，例如：7-甲基化鸟苷酸帽结构、ARCA等。
进一步地，在上述制备方法中，使用氯化锂纯化加帽的IL-21mRNA，并使用Nanodrop确定其浓度，对纯化的IL-21mRNA进行琼脂糖电泳以测定片段的大小。
可理解的是，上述体外转录制备IL-21mRNA中采用的质粒、转录原料等均可采用其他任一合适的类型。还可理解的是，除了上述体外转录制备方法外，也可采用其他任一合适的制备方法来生产IL-21mRNA。
进一步地，在上述制备方法中，所述步骤2)中，LNP-IL-21的制备具体包括步骤：将预定摩尔比的阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和二饱和磷脂酰胆碱溶解在乙醇中，获得乙醇相；将IL-21mRNA溶解在柠檬酸盐缓冲液，获得水相；使用微流体混合器以预定的流速比及总流速混合所述乙醇相和水相，实现IL-21mRNA的LNP包装；使用超滤离心管对LNP-IL-21进行渗滤，收集样品，用PBS缓冲液稀释并储存。
进一步地，所述微流体混合器中，所述乙醇相和水相的流速比为1：1～7，总流速为9～18mL/min；优选，乙醇相和水相的流速比为1：2～5，总流速为10～15mL/min；更优选，乙醇相和水相的流速比为1：3，总流速为12mL/min。
进一步地，所述微流体混合器选择INanoL；所述超滤离心管选择Millipore，15mL/10kD。
进一步地，采用PBS缓冲液稀释后的LNP-IL-21的浓度为50～200μg/mL；优选80～120μg/mL；更优选100μg/mL。
本发明的第三个方面是提供一种如本发明的第一个方面中任一所述的mRNA药物、或者由本发明的第二个方面中任一所述的制备方法制得的mRNA药物的应用，其选自以下应用中的至少一种：LNP-IL-21在制备治疗性mRNA乙型肝炎病毒疫苗中的应用、LNP-IL-21在制备治疗慢性乙型肝炎病毒感染的产品中的应用。
进一步地，所述LNP-IL-21用于制备血清中短时表达IL-21、完全清除体内HBV的制剂。具体可为，清除血清中HBV的各种抗原和肝组织内的HBV DNA；IL-21为短时表达，通过活化CD8 T细胞免疫和体液免疫(血清中可检测到乙肝表面抗原的抗体)发挥抗乙肝功能。
本发明的第四个方面是提供一种治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方法，其在治疗对象中施用有效量的如本发明的第一个方面中任一所述的mRNA药物、或者由本发明的第二个方面中任一所述的制备方法制得的的mRNA药物。
进一步地，所述治疗对象为人，施用的mRNA药物为LNP-IL-21，其根据表达人源IL-21蛋白或其突变体的基因序列制备。
在一具体实施方案中，在验证性实验中，所述治疗对象选用慢乙肝小鼠，其通过尾静脉注射的方式施用10μg LNP-IL-21(以鼠源IL-21基因制备)，施用频率为两周一次。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明将IL-21和LNP用于包装制备治疗性mRNA乙肝药物，其可用于进一步制备成治疗性mRNA乙肝疫苗，能够有效诱导体内抗HBV免疫反应。本发明通过优化制备方法构建了携带IL-21mRNA的LNP颗粒LNP-IL-21，将LNP-IL-21注射入慢乙肝小鼠模型中，发现(1)LNP-IL-21能够完全清除体内的HBV，包括血清中HBV的各种抗原和肝组织内的HBV DNA；(2)血清中IL-21为短时表达，通过活化CD8 T细胞免疫和体液免疫(血清中可检测到乙肝表面抗原的抗体)发挥功能，具有更好的治疗安全性，一定程度上规避爆发性肝炎发生的可能性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明一实施例中采用原代小鼠肝细胞验证IL-21mRNA表达的结果示意图；
图2是本发明一实施例中施用LNP-IL-21后小鼠血清中HBsAg的结果示意图；
图3是本发明一实施例中施用LNP-IL-21后小鼠血清中HBsAg抗体的结果示意图；
图4是本发明一实施例中施用LNP-IL-21后小鼠血清中HBeAg的结果示意图；
图5是本发明一实施例中施用LNP-IL-21后小鼠血清中HBV DNA拷贝数的结果示意图；
图6是本发明一实施例中施用LNP-IL-21后小鼠血清中ALT拷贝数的结果示意图；
图7是本发明一实施例中施用LNP-IL-21后小鼠血清中IL-21水平的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1-LNP-IL-21mRNA药物的构建包装
本实施例为一较佳形式的LNP-IL-21mRNA药物的制备方法，其中IL-21基因为编码人源或鼠源IL-21蛋白的基因序列、或为用于编码人源或鼠源IL-21蛋白突变体的基因序列，下述以鼠源IL-21基因为例进行实验说明：将鼠源IL-21基因(GenBank AccessionNumber:NM_021782.2)克隆至体外转录质粒pCZ(购自深圳吉瑞生物)，将所构建的重组质粒进行体外转录获得IL-21mRNA。随后将所获得的mRNA采用LNP进行包装(上海Micro&Nano生物科技公司)获得脂质纳米颗粒LNP-IL-21。
上述制备方法的具体步骤简述如下：
(1)IL-21mRNA的合成；
将鼠源IL-21基因插入质粒载体pCZ(吉瑞生物技术，深圳，中国)中，该质粒载体包含5'和3'非翻译区(UTR)，并包含一个长度为120个核苷酸的polyA尾。用BspQI将质粒线性化酶切，并使用T7聚合酶在体外合成mRNA。UTP被1-甲基假UTP(1-methylpseudo UTP)取代并添加帽结构(7-甲基化鸟苷酸帽结构)以提高IL-21mRNA的翻译效率。使用氯化锂纯化加帽的mRNA，然后使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)确定其浓度。对纯化的IL-21mRNA进行1％琼脂糖电泳以测定片段的大小。
本步骤还对合成的IL-21mRNA进行体外细胞表达验证，其使用TurboFect转染试剂将0.3μg IL-21mRNA转染24孔板中培养的原代小鼠肝细胞，未转染mRNA的细胞作为阴性对照。在转染后2天，使用ELISA测量培养基中的IL-21。由图1可知，IL-21mRNA在体外转染原代小鼠肝细胞后IL-21蛋白表达情况较好。
(2)LNP-IL-21的制备；
使用微流体混合步骤制备脂质纳米颗粒LNP-IL-21。将包含预定摩尔比的阳离子脂质(具体为ALC-0315)、脂质锚定PEG(具体为DMA-PEG2000)、胆固醇和磷脂酰胆碱(具体为二硬脂酰磷脂酰胆碱)的脂质溶解在乙醇中，获得乙醇相。将步骤(1)合成的IL-21mRNA溶解在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中，形成水相。将上述含有脂质的乙醇相与含有IL-21mRNA的水相混合，具体为使用微流体混合器INanoL(微纳科技有限公司，上海，中国)以1：3的流速比以及12mL/min的总流速混合乙醇相和水相，实现IL-21mRNA的LNP包装；使用超滤离心管(Millipore，15ml/10kD)对制得的LNP-IL-21进行渗滤；收集样品，用1×PBS缓冲液稀释(稀释至预定浓度，例如100μg/mL)并储存在4℃以供进一步分析。
通过下述表格的脂质成分摩尔比、IL-21mRNA与脂质的质量配比(通过调整乙醇相及水相的浓度，例如，乙醇相脂质浓度为6mg/mL，水相mRNA浓度为0.08mg/mL)分别制备LNP-IL-21。
Figure BDA0003671918510000071
上述制备-1～制备-4均能成功制得LNP-IL-21脂质纳米颗粒，其粒径约在80～140nm之间，均能一定程度包裹IL-21mRNA，具备一定的体内递送效果，其中制备-3制得的LNP-IL-21的包封效果最好。
本实施例还采用DlinDMA、PEG2000-Ceramide-C14、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰胆碱作为脂质成分进行脂质纳米颗粒LNP-IL-21的制备，但其粒径均相对较大(约为200nm)，包封率也均相对较低(约在60％左右)，其效果在一定程度上不如制备-1～制备-4制得的LNP-IL-21。
实施例2-LNP-IL-21治疗慢性乙型肝炎病毒的效果评价
本实施例通过构建慢乙肝小鼠模型，施用实施例1中制备-3制得的浓度为100μg/mL的LNP-IL-21，以获得小鼠检测样本，进行LNP-IL-21治疗慢性乙型肝炎病毒感染的效果评价，其具体步骤简述如下：
(一)小鼠检测样本；
1)pBPS质粒构建：将HBV准株BPS(GenBank Accession Number:AF100309.1)的1.3倍体基因组克隆到骨架质粒pUC18上，即获得pBPS质粒；
2)将10μg pBPS质粒通过尾静脉高压的方式注射入6-8周雄性BALB/c小鼠，共计12只小鼠，参照现有技术Nat Commun.2017Dec 14；8(1):2119.doi:10.1038/，在pBPS注射后4周采取小鼠眼眶血，检测血清中HBV抗原，抗原检测阳性，即为慢乙肝小鼠模型；
3)pBPS注射后4周，通过尾静脉注射的方式将10μg LNP-IL-21或者空白对照LNP分别注射慢乙肝小鼠(每组6只)，2周后再次注射。
4)分别于LNP-IL-21和LNP注射后第0，1，2，3，4，6和8周采取小鼠的眼眶血，作为检测样本。
(二)检测步骤及检测结果；
1)抗体抗原检测
采用免疫酶联(ELISA)方法检测血清中HBsAg、HBsAg抗体和HBeAg抗原水平，将步骤(一)获取的2组小鼠血清(LNP-IL-21和LNP对照组)按照10倍稀释于磷酸盐缓冲液中(PBS)，然后再用上海科华生物技术有限公司的ELISA试剂盒检测血清中HBsAg或HBsAb或HBeAg水平。检测光波450nm处的相对吸光值(OD450)可以反应出抗原和抗体的相对水平。每组6只小鼠。
具体方法简述如下：将稀释后的血清加入ELISA的酶联板中，每孔50uL，随后添加酶反应液，37℃放置30min，随后倒掉反应液，用洗涤液洗5遍后，加入反应液A和B，随后37℃放置10min，加入终止液，采用分光仪读取450nm处的吸光值。其检测结果如图2～图4所示。
图2中，左图表示血清中HBsAg，左图中的虚线代表检测下限。右图表示HBsAg的阳性率曲线。从图上可以看出LNP-IL-21组小鼠血清中HBsAg的含量明显低于LNP对照组小鼠。
图3中，左图表示血清中HBsAg抗体，左图中的虚线代表检测下限。右图表示HBsAg抗体的阳性率曲线。从图上NP-IL-21组小鼠血清中HBsAg的抗体含量明显高于LNP对照组小鼠。
图4中，左图表示血清中HBeAg，左图中的虚线代表检测下限。右图表示HBeAg的阳性率曲线。从图上可以看出LNP-IL-21组小鼠血清中HBeAg的含量明显低于LNP对照组小鼠。
2)HBV DNA拷贝数检测；
采用实时荧光定量PCR检测血清中HBV DNA拷贝数，血清直接送上海艾迪康医学检测中心检测，采用实时荧光定量PCR方法检测血清中HBV DNA拷贝数，检测方法参考先有技术Nat Commun.2017Dec 14；8(1):2119.doi:10.1038/s41467-017-02304-7。其检测结果如图5所示。
图5中，图中虚线代表检测下限，从图中可以LNP-IL-21组小鼠血清中HBV DNA拷贝数明显低于LNP对照组。
3)丙转氨酶检测；
检测血清中谷丙转氨酶(ALT)水平，血清直接送上海艾迪康医学检测中心检测，检测方法参考先有技术Nat Commun.2017Dec 14；8(1):2119.doi:10.1038/s41467-017-02304-7。其检测结果如图6所示。
图6中，图中虚线代表检测下限，LNP-IL-21组小鼠血清中ALT明显高于LNP对照组。
4)血清中IL-21检测；
采用免疫酶联(ELISA)方法检测血清中IL-21水平，将步骤(一)获取的2组小鼠血清采用武汉博士德生物技术有限公司的ELISA试剂盒检测血清中IL-21水平。检测光波450nm处的相对吸光值(OD450)可以反应出IL 21相对水平。每组6只小鼠。
具体方法简述如下：将稀释后的血清加入ELISA的酶联板中，每孔50uL，随后添加酶反应液，37℃放置30min，随后倒掉反应液，用洗涤液洗5遍后，加入反应液A和B，随后37℃放置10min，加入终止液，采用分光仪读取450nm处的吸光值。其检测结果如图7所示。
图7中，图中虚线代表检测下限，LNP-IL-21组小鼠血清中IL-21明显高于LNP对照组。
将上述检测结果与先前研究中的AAV-IL-21进行对比，发现采用AAV-IL-21，只观察到ALT升高，没有检测到HBsAg抗体，具体地，在AAV-IL-21治疗的效果中HBsAg清除同HBsAg抗体出现没有相关性，即：所有HBV清除的小鼠体内并不是所有小鼠都产生抗体。而采用LNP-IL-21的治疗方案中，所有HBV清除的小鼠都检测到HBsAg抗体，其同时观察到体液免疫和CD8 T免疫(即HBsAg抗体和ALT)，具有较好的安全性。这表明，LNP-IL-21注射治疗分别利于清除HBsAg，HBSAg抗体转换，HBeAg清除，HBV DNA清除，激活CD8 T细胞免疫，且为短时表达IL-21，更具安全性。
本发明还采用上述实施例1中制备-2制得的LNP-IL-21进行治疗慢性乙型肝炎病毒感染的效果评价，其相关结果均与上述制备-3制得的LNP-IL-21所具有的效果类似。
由上述实施例可知，本发明制备的LNP-IL-21脂质纳米颗粒能成功递送至小鼠体内且能在体内表达IL-21，通过活化CD8 T细胞免疫和体液免疫达到完全清除体内HBV的免疫效果，且在血清中IL-21为短时表达，具有更好的治疗安全性，一定程度上规避爆发性肝炎发生的可能性，具有良好的应用前景。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其特征在于，所述mRNA药物包括由IL-21mRNA和脂质制成的脂质纳米颗粒LNP-IL-21；其中，所述IL-21mRNA用于表达IL-21蛋白或其突变体，所述脂质用于递送mRNA。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其特征在于，所述IL-21基因为编码IL-21蛋白或其突变体的人源或鼠源基因序列。
3.根据权利要求2所述的一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其特征在于，所述IL-21基因为人源基因，其序列为GenBank Accession Number：NP_068575.1；或，所述IL-21基因为鼠源基因，其序列为GenBank Accession Number：NM_021782.2。
4.根据权利要求1所述的一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其特征在于，所述脂质包括阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和磷脂酰胆碱。
5.根据权利要求4所述的一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其特征在于，所述阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和磷脂酰胆碱的摩尔比为40～50：1～2：38～48：6～12；和/或，所述IL-21mRNA和脂质的质量配比为1：5～35。
6.根据权利要求4所述的一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物，其特征在于，所述阳离子脂质为ALC-0315，所述修饰的PEG为DMA-PEG2000，所述磷脂酰胆碱为二硬脂酰磷脂酰胆碱；所述阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和磷脂酰胆碱的摩尔比为46.3：1.6：42.7：9.4，所述IL-21mRNA和脂质的质量配比为1：25。
7.一种如权利要求1～6中任一项所述的用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的mRNA药物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
步骤1)IL-21mRNA的制备：根据IL-21基因制备IL-21mRNA；
步骤2)LNP-IL-21的制备：将所述IL-21mRNA与脂质混合，制得LNP-IL-21。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述IL-21mRNA的制备具体包括步骤：将IL-21基因克隆至体外转录质粒，将所构建的线性化的重组质粒进行体外转录获得IL-21mRNA；
和/或，所述步骤2)中，所述LNP-IL-21的制备具体包括步骤：将预定摩尔比的阳离子脂质、修饰的PEG、胆固醇和二饱和磷脂酰胆碱溶解在乙醇中，获得乙醇相；将IL-21mRNA溶解在柠檬酸盐缓冲液，获得水相；使用微流体混合器以预定的流速比及总流速混合所述乙醇相和水相，实现IL-21mRNA的LNP包装；使用超滤离心管对LNP-IL-21进行渗滤，收集样品，用PBS缓冲液稀释并储存。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述体外转录质粒为pCZ质粒，所述pCZ质粒包含5'非翻译区、3'非翻译区以及polyA尾；采用BspQI将pCZ质粒线性化，并使用T7聚合酶在体外转录合成IL-21mRNA；和/或，所述IL-21mRNA采用1-甲基假UTP取代UTP，并添加帽结构。
10.一种如权利要求1～5中任一项所述的mRNA药物、或者由权利要求6～9中任一项所述的制备方法制得的mRNA药物的应用，其特征在于，所述应用选自以下应用中的至少一种：LNP-IL-21在制备治疗性mRNA乙型肝炎病毒疫苗中的应用、LNP-IL-21在制备治疗慢性乙型肝炎病毒感染的产品中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024159517A1 (zh) * 2023-02-03 2024-08-08 南方科技大学 一种乙型肝炎mRNA及其疫苗与用途
CN119791062A (zh) * 2023-10-11 2025-04-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 戊型肝炎病毒感染动物模型的构建方法及应用
CN119791061A (zh) * 2023-10-11 2025-04-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种甲型肝炎病毒感染动物模型的构建方法及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018237369A2 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 Vical Incorporated Lipid nanoparticle (lnp)-mediated delivery of a crispr-expressing plasmid dna for treating chronic hepatitis b virus infection
US20220142923A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi LIPID NANOPARTICLES FOR DELIVERING mRNA VACCINES
CN114480442A (zh) * 2020-10-27 2022-05-13 深圳吉诺因生物科技有限公司 一种mRNA及包含其的新型冠状病毒mRNA疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018237369A2 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 Vical Incorporated Lipid nanoparticle (lnp)-mediated delivery of a crispr-expressing plasmid dna for treating chronic hepatitis b virus infection
CN114480442A (zh) * 2020-10-27 2022-05-13 深圳吉诺因生物科技有限公司 一种mRNA及包含其的新型冠状病毒mRNA疫苗
US20220142923A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi LIPID NANOPARTICLES FOR DELIVERING mRNA VACCINES

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDALEEB SAJID等: "mRNA vaccination induces tick resistance and prevents transmission of the Lyme disease agent", SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 13, 17 November 2021 (2021-11-17), pages 8 *
ZHONGLIANG SHEN等: "IL-21-based therapies induce clearance of hepatitis B virus persistence in mouse models", THERANOSTICS, vol. 9, no. 13, 31 May 2019 (2019-05-31) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024159517A1 (zh) * 2023-02-03 2024-08-08 南方科技大学 一种乙型肝炎mRNA及其疫苗与用途
CN119791062A (zh) * 2023-10-11 2025-04-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 戊型肝炎病毒感染动物模型的构建方法及应用
CN119791061A (zh) * 2023-10-11 2025-04-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种甲型肝炎病毒感染动物模型的构建方法及其用途

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