CN114908170A

CN114908170A - 用于检测口腔癌及其预后的基因标志物、引物及其试剂盒

Info

Publication number: CN114908170A
Application number: CN202210503161.7A
Authority: CN
Inventors: 王丹玲; 万正卿; 龚茜; 朱琳; 陈雯
Original assignee: University of South China
Current assignee: University of South China
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2022-08-16

Abstract

本发明公开了一种用于检测口腔癌及其预后的基因标志物EYA2基因并针对该标记物设计了引物和检测用试剂盒，本发明根据患者肿瘤组织中EYA2基因的表达水平，即可快速准确的判断受测组织是否为肿瘤组织，并判断患者的预后情况，以协助临床决策。该基因的表达在所有患者中都可以检测，不受特定患者的限制。采用本发明的检测试剂盒判断肿瘤组织的准确度为100％，特异度为80％。

Description

用于检测口腔癌及其预后的基因标志物、引物及其试剂盒

技术领域

本申请涉及口腔癌检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测口腔癌及其预后的基因标志物、引物及其试剂盒。

背景技术

口腔癌是指发生于口腔部位的恶性肿瘤，在所有头颈部恶性肿瘤中最为常见。口腔癌发病机制复杂，是一个多因素、多步骤、多阶段的过程，涉及遗传因素和环境因素的共同作用。老龄、吸烟、饮酒及不良的饮食习惯，如咀嚼槟榔，是口腔癌发病的重要风险因素。目前认为，癌基因的激活和抑癌基因的失活，导致细胞正常生理过程及大分子代谢紊乱、信号传导受阻、细胞结构改变及免疫调节紊乱等，是口腔细胞癌变的分子基础之一。然而，至今为止，口腔癌发病的分子机理仍不完全清楚，相关的分子标记物也极为缺乏。

临床现有方法主要是根据患者的临床分期分级来判断。目前能找到的分子标记物有专利申请CN110499368A中公开的一种与口腔癌预后预测相关的snp标志物及其应用，该专利申请中采用PCR反应检测一种与口腔癌预后有关的snp标志物。但是，该方法必须要检测到特定的SNP，而实际上不是所有人都携带该SNP，因此该检测方法只适用于一小部分人。

EYA(Eyes absent)家族蛋白是一种高度保守的转录辅助因子，包括EYA1～EYA4。EYA家族蛋白主要通过调控细胞增殖、决定细胞命运从而参与视网膜的早期发育，是视网膜决定基因网络(Retinal Determination Gene Network，RDGN)信号传导通路的重要组成部分。最近的研究表明，EYA家族蛋白可能参与肿瘤的发生发展。

发明内容

发明人通过综合口腔癌组织RNA测序结果及甲基化芯片结果意外的发现，口腔癌组织中EYA家族蛋白EYA2的表达量相较癌旁组织显著降低，且低表达EYA2的肿瘤患者预后也相对较差，提示EYA2在口腔癌进程中可能发挥肿瘤抑制因子的功能。

基于此，本发明提供了一种EYA2基因作为标志物在制备检测口腔癌及其预后相关试剂中的应用。

本发明还提供一种用于检测口腔癌及其预后的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明还提供一种用于检测口腔癌及其预后的试剂盒，包括前述的引物对。

进一步的，所述试剂盒还包括内参基因GAPDH的检测引物对。

所述内参基因GAPDH的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。

更进一步的，所述试剂盒还包括含有核酸染料的DNA聚合酶预混试剂。所述含有核酸染料的DNA聚合酶预混试剂可以为含有SYBR green染料的DNA聚合酶预混试剂。

本发明的试剂盒可用于cDNA样品的qPCR扩增，并根据每个样品的标准化Ct值，判断受测样品是否为口腔癌组织样品或判断其可能的预后情况；

所述标准化Ct值的计算公式如下：

标准化Ct＝Ct_(EYA2)-Ct_(GAPDH)

其中，Ct_(EYA2)为EYA2基因的Ct值，Ct_(GAPDH)为内参基因GAPDH的Ct值。

若标准化Ct值>7.152为正常组织，若标准化Ct值<7.152为肿瘤组织。优选的，所述样品的起始RNA量为1ug，逆转录完成后取1ul cDNA产物的5倍稀释液进行qPCR扩增。

本发明的引物或试剂盒的具体使用方法如下：

1.组织样品采集：

当受检者被怀疑有口腔癌发生时，通过组织活检的方式，采集少量疑似口腔肿瘤的组织样品。

2.组织RNA提取：

将采集的组织样品充分匀浆，使用Trizol裂解细胞，随后用氯仿萃取并去除蛋白，并依次使用异丙醇及乙醇沉淀和清洗RNA，最终获得组织样品中的总RNA。

3.RNA逆转录：

使用逆转录酶及Oligo(dT)引物，对样品的RNA进行逆转录，获得样品的cDNA。

4.qPCR检测：

使用本发明提供的引物对及含有核酸染料的DNA聚合酶预混试剂，对样品cDNA进行qPCR，得到该样品的标准化Ct值。

5.结果判读：

根据样品标准化Ct值结果判断受测样品是否为肿瘤组织，以及判断患者可能的预后情况。

本发明的有益效果包括：本发明可用于口腔癌的早期诊断和预后判断，提高病例检测的可重复性和准确性，通过组织活检采集患者的肿瘤组织，根据患者肿瘤组织中EYA2基因的表达水平，即可快速准确的判断受测组织是否为肿瘤组织，并判断患者的预后情况，以协助临床决策。该基因的表达在所有患者中都可以检测，不受特定患者的限制。采用本发明的检测试剂盒判断肿瘤组织的准确度为100％，特异度为80％。

附图说明

图1为各基因在口腔癌组织和癌旁组织中表达差异的火山图；

图2为TCGA数据库中EYA2基因在口腔癌组织和正常组织中表达水平的差异分析；

图3为EYA2基因不同表达量的口腔癌患者的预后统计分析；

图4为qPCR扩增曲线图；

图5为采用本发明提供的试剂盒检测EYA2基因在口腔癌组织和正常组织中实际表达水平的差异；

图6为采用本发明提供的试剂盒检测EYA2基因ROC曲线分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、口腔癌相关基因的筛选

采集口腔癌患者手术中切下的配对肿瘤组织和癌旁组织样品17对(共34例样品)，Trizol法提取组织中的总RNA，构建RNA文库并进行RNA测序。将RNA测序结果比对到人类参考基因组，获得各样品中不同基因的表达量数据。将肿瘤组织样品组和癌旁组织样品组各个样品的基因表达水平用DESeq2分析工具进行统计分析，获得各个基因表达差异的火山图(图1)，图1中横轴为LOG₂转化的表达量改变倍数值(fold change,FC)，纵轴为LOG₁₀转化的检验统计值(false discovery rate,FDR)，图中虚线划定的阈值为：表达量改变倍数大于4倍，FDR小于0.05。从中筛选得到了一些可能在口腔癌中显著差异表达的基因，其中，EYA2是显著低表达的基因之一。

通过GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)在线分析工具，获得TCGA(The Cancer Genome Atlas Program)数据库中口腔癌相关的公共数据，提取其中EYA2在口腔癌组织和正常对照组织中的转录本表达量，进行统计分析(结果如图2所示)发现，EYA2基因的表达水平在口腔癌组织(519例)中确实显著低于正常对照组织(44例)，p值小于0.05。

通过GEPIA在线分析工具，获得TCGA数据库中口腔癌相关的公共数据，提取所有患者的预后数据，并根据不同患者肿瘤组织中EYA2基因的表达量将患者分为两组，其中，EYA2基因表达量大于上四分位数(75％)的患者编为高表达组(130例)，EYA2基因表达量小于下四分位数(25％)的编为低表达组(130例)。对两组患者进行Kaplan-Meier生存分析(结果如图3所示)发现，EYA2基因高表达组的患者总体生存期显著高于低表达组的患者，其HazardRatio(风险比)为0.63，即高表达EYA2的患者死亡风险仅为低表达患者的63％。

上述分析说明在口腔癌组织中EYA2基因的表达普遍降低，EYA2基因高表达预示口腔癌预后较好。

实施例2、一种口腔癌及其预后检测用试剂盒及其检测方法

该试剂盒包括EYA2基因的检测引物对和含有核酸染料的DNA聚合酶预混试剂，EYA2基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。试剂盒还包括内参基因GAPDH的检测引物对，内参基因GAPDH的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。利用本发明提供的试剂盒，通过qPCR方法，检测不同患者肿瘤组织中该基因的表达水平，根据检测结果判断口腔癌及预后。

检测方法具体包括如下步骤：

(一)待测组织样本采集及RNA提取：

1、用活检针采集受检者的待测组织样品约10mg，置于液氮中迅速冷冻。

2、向80mm外径的研钵中加入约3mL液氮预冷，将待测组织样品置入预冷好的研钵中，迅速加入约3ml液氮并研磨，注意勿将组织溅出研钵。

3、研磨至液氮气化后，再加入一次液氮约3mL，继续研磨至液氮气化。

4、向研钵中加入1mL Trizol，在研钵中Trizol会与研碎的组织混合成糊状，继续碾磨该糊状混合物，直至充分混匀。

5、待Trizol融化后，用1000uL移液器吹打混匀，尽量吸取所有Trizol至1.5mL离心管(约能吸出500uL～600uL)；再向碾钵中重新加入500uL Trizol，用1000uL移液器混匀并将碾钵上沾的组织都洗下来，吸至1.5mL离心管中。

6、用1mL注射器反复吹打10次以协助裂解细胞，至手感吸取有轻微阻力说明裂解充分。

7、4℃，2000g离心5min，以去除未裂解的组织碎片。将上清液1mL吸取至新的1.5mL离心管。

8、加入200uL氯仿，充分振荡混匀，室温静置3min，4℃，12000g离心15min。

9、将上层水相转移500uL到另一干净的1.5mL离心管中，加入20ug糖原，混匀后再加入500uL异丙醇，混匀，-80℃放置30min。

10、4℃，12000g离心10min，去上清留沉淀。

11、加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，震荡混匀5s。

12、4℃，12,000g离心10min，去上清留沉淀。

13、加入1mL无水乙醇洗涤，震荡混匀5s，4℃，12,000g离心10min，去废液留沉淀。

14、在超净工作台中将沉淀晾干。

15、加入50uL无核酸酶水(Nuclease-free Water)溶解沉淀，获得组织样品的RNA。

(二)提取得到的总RNA进行逆转录

本实施例中采用商业供应的逆转录试剂盒(Thermo Fisher RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit)进行RNA逆转录。亦可采用其他基于逆转录酶的方法进行RNA逆转录。

1、用无核酸酶水将提取的总RNA稀释成100ng/uL的浓度，按以下比例配制逆转录体系，并充分混匀。逆转录反应体系见下表1。

表1逆转录反应体系

2、将配好的逆转录混合物置于PCR仪上进行反应，反应条件为：

反应温度反应时间

42℃ 60min

70℃ 5min

(三)逆转录得到的样品cDNA文库进行qPCR检测

本实施例中采用商业供应的含有核酸染料SYBR Green的qPCR预混液(ThermoFisher Maxima SYBR Green qPCR Master Mix)进行检测。亦可采用其他基于核酸染料或探针的方法进行qPCR检测。

1、吸取1ul cDNA，用超纯水1:5稀释成模板cDNA，并配制qPCR体系如下，每个样品分别配制检测EYA2和内参基因GAPDH的重复孔各3份：qPCR反应体系见下表2。

表2 qPCR反应体系

模板cDNA	1μL
		含有核酸染料SYBR Green的qPCR预混液(2X)	5μL
正向引物(10μM)	1μL
		反向引物(10μM)	1μL
无核酸酶水	2uL
		总体积	10uL

如下表3所示，SEQ ID NO.1和2构成一对引物，用于检测EYA2基因表达量，SEQ IDNO.3和4构成一对引物，用于检测内参基因GAPDH表达量。

表3引物对及其核苷酸序列

SEQ ID NO.	序列
		1	5’-CAGTGCAACCAAGACAGGGA-3’
2	5’-TGTGCTTTTTCGCTCCTTGC-3’
		3	5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’
4	5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’

2、将配好的qPCR混合物置于qPCR仪上进行反应，反应条件见下表4。

表4 qPCR反应条件

3、读取qPCR获得的每个样品的Ct值，包括EYA2基因的Ct值Ct_(EYA2)以及内参基因GAPDH的Ct值Ct_(GAPDH)。用以下公式计算标准化Ct值：

标准化Ct＝Ct_(EYA2)-Ct_(GAPDH)

4、根据样品的标准化Ct值，判断受测样品是否为口腔癌组织样品。其中，若标准化Ct值>7.152为正常组织，若标准化Ct值<7.152为肿瘤组织。

实施例3、临床样本检测

纳入10名口腔癌的患者，采集他们的口腔癌组织(C1-C10)和癌旁组织(N1-N10)样品各约10mg。按实施例2的方法，检测患者的癌组织和癌旁组织样品的标准化Ct值如下表5所示。由表5可知每位患者的肿瘤组织标准化Ct值均低于对应的癌旁组织标准化Ct值。其中一对样本(肿瘤组织C6与癌旁组织N6)的扩增曲线如图4所示。从图4可以看出，肿瘤组织的扩增曲线起峰循环数确实明显晚于癌旁组织，且每个样本的3个重复孔扩增曲线接近甚至部分重叠，而无模板的阴性对照孔中未见扩增，可知采用本发明的检测方法扩增的结果一致性好。将每位患者的癌旁组织的标准化Ct值作为1，对其对应癌组织做归一化处理，得到每患者的癌组织中EYA2的相对表达量，结果如图5所示。从图5中可以看出，每位患者的癌组织中EYA2的相对表达量均低于癌旁组织。

表5癌组织和癌旁组织样品的标准化Ct值

表6本发明的检测方法判断肿瘤阳性的ROC曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)统计值

对这些样品检测得到的标准化Ct值进行ROC曲线分析(结果见图6和表6)得到：本发明的检测方法的ROC曲线下面积为0.920。当阈值为7.152时，采用本发明的检测方法判断肿瘤组织的准确度为100％，特异度为80％。

序列表

<110> 南华大学

<120> 用于检测口腔癌及其预后的基因标志物、引物及其试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtgcaacc aagacaggga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgcttttt cgctccttgc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaggtcatc catgacaact ttg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtccaccacc ctgttgctgt ag 22

Claims

1.EYA2基因作为标志物在制备检测口腔癌及其预后相关试剂中的应用。

2.一种用于检测口腔癌及其预后的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

3.一种用于检测口腔癌及其预后的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因GAPDH的检测引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因GAPDH的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有核酸染料的DNA聚合酶预混试剂。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述含有核酸染料的DNA聚合酶预混试剂为含有SYBR green染料的DNA聚合酶预混试剂。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于cDNA样品的qPCR扩增，并根据每个样品的标准化Ct值，判断受测样品是否为口腔癌组织样品或判断其可能的预后情况；

所述标准化Ct值的计算公式如下：

标准化Ct＝Ct_(EYA2)-Ct_(GAPDH)

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，若标准化Ct值>7.152为正常组织，若标准化Ct值<7.152为肿瘤组织。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述样品的起始RNA量为1ug，逆转录完成后取1ul cDNA产物的5倍稀释液进行qPCR扩增。