CN114836537B - Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途 - Google Patents
Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114836537B CN114836537B CN202110137668.0A CN202110137668A CN114836537B CN 114836537 B CN114836537 B CN 114836537B CN 202110137668 A CN202110137668 A CN 202110137668A CN 114836537 B CN114836537 B CN 114836537B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rbm24
- colorectal cancer
- expression
- cells
- treatment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 96
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 82
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- 101000580716 Homo sapiens RNA-binding protein 24 Proteins 0.000 description 86
- 102100027487 RNA-binding protein 24 Human genes 0.000 description 86
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 11
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 7
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 6
- SAWISWWSHNTVLW-LURJTMIESA-N 8-chloro-2-[(1S)-1-[(2,6-diamino-5-chloropyrimidin-4-yl)amino]ethyl]-6-fluoro-3-(1H-pyrazol-5-yl)quinazolin-4-one Chemical compound ClC=1C=C(C=C2C(N(C(=NC=12)[C@H](C)NC1=NC(=NC(=C1Cl)N)N)C1=NNC=C1)=O)F SAWISWWSHNTVLW-LURJTMIESA-N 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 3
- 201000002758 colorectal adenoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000004497 NIR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000000672 surface-enhanced laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000827703 Homo sapiens Polyphosphoinositide phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102100023591 Polyphosphoinositide phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101150117183 RBM24 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100233916 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) KAR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCO DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000005514 radiochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途。
背景技术
结直肠癌的发病率和死亡率位居中国癌症疾病前列，其诊断、分子分型和治疗是临床急需解决的重大问题。目前结直肠癌可以通过包括病理活检、影像学检查、实验室化验以及基因测序等方法获得诊断和辅助诊断。但是早期的结直肠癌症状不明显，患者通常没有就医行为，因此失去了早期诊断和治疗的机会。大多数结直肠癌患者确诊的时候已经处于疾病晚期，并且发生了远处转移。在确诊的患者中，临床上的各种指标不能较好的预测患者的治疗效果以及预后和生存时间，特异性和敏感性较差。因此需要新的指标以协助结直肠癌的分子分型以及预测患者的治疗效果、预后和生存时间。
目前结直肠癌的一线治疗仍旧以手术结合化疗和放疗为主，同时辅以靶向治疗、免疫治疗、生物治疗和姑息治疗等。总的来说，中国的结直肠癌的治疗效果不佳，5年生存率虽然略有上升，但是总体效果仍旧不尽人意，并且副作用发生率较高，严重影响了患者的生存质量，因此开发新的治疗手段迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了用于结直肠癌诊断的标志物Rbm24及其在结直肠癌治疗中的用途。
在一个方面，本发明提供了Rbm24在结直肠癌中作为生物标记物的用途。
在一个具体实施方案中，本发明提供了测定Rbm24水平的物质在制备用于诊断结直肠癌的产品中的用途。具体地，其中所述检测Rbm24表达水平的试剂包括检测Rbm24基因mRNA表达水平的试剂，和/或检测Rbm24蛋白表达水平的试剂。在一个具体实施方案中，所述检测Rbm24基因mRNA表达水平的试剂包括实时定量PCR中使用的引物，和/或探针。在一个具体实施方案中，其中所述检测Rbm24蛋白表达水平的试剂包括针对Rbm24蛋白的抗体。在一个具体实施方案中，所述用于诊断结直肠癌的产品包括试剂盒、芯片或试纸。
在第二个方面，本发明提供了Rbm24在预防和治疗结直肠癌中作为药物靶点的用途。在一个具体实施方案中，本发明提供了上调Rbm24基因表达或Rbm24基因所编码的Rbm24蛋白表达的试剂在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途。
RBM24是一种RNA结合蛋白。本发明人发现：在结直肠癌患者的临床样本中RBM24的表达显著下调，并且高表达RBM24的患者生存时间显著高于RBM24低表达的患者。在小鼠体内的实验证实，RBM24敲除会导致小鼠肠道增生异常，并最终发生自发性的结直肠腺瘤。这些结果提示RBM24可作为结直肠癌的诊断标志物。
本发明的第一目的是提供Rbm24用于结直肠癌诊断的用途。
通过检测RBM24在人类CRC组织和配对的相邻组织中的表达发现：与邻近组织相比，人CRC组织中RBM24的表达显著降低，这与TNM分期和患者的生存时间相关(N＝36)。然而，RBM24与CRC患者的其他临床特征(包括年龄和性别)之间没有关联。免疫组化结果显示RBM24在CRC肿瘤组织中的表达显著降低。qPCR和蛋白印迹结果显示，人CRC肿瘤组织中RBM24的表达显著下调。
构建了条件性的RBM24基因敲除小鼠模型，将他莫昔芬(每天100mg/kg，连续5天)腹腔注射到8周的C57BL/6小鼠(N＝32)中，以诱导全身性RBM24敲除。给WT小鼠注射相同剂量的他莫昔芬作为对照组。使用蛋白质印迹、qPCR分析和免疫荧光验证了敲除效率。结果表明，与WT小鼠相比，RBM24基因敲除小鼠肠道中的BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)阳性细胞显著增加。HE染色结果表明RBM24敲除小鼠结肠上皮增厚。在敲除6个月后，观察到小鼠发生结直肠腺瘤，并且结直肠的长度显著长于野生型小鼠。
本发明的第二目的是提供了Rbm24用于治疗结直肠癌的用途。
为了测试RBM24在CRC细胞增殖中的作用，进行了CCK-8分析。我们发现RBM24的过表达能够抑制细胞增殖。这提示RBM24在体外抑制了CRC细胞的生长。
另外，进行了划痕实验、Transwell迁移和侵袭测定以确定RBM24在CRC细胞迁移和侵袭中的作用。结果证实，与对照细胞相比，RBM24的过表达受抑制结直肠癌细胞系(HCT116)的迁移和侵袭。使用PI3K-IN-6(10nM)或MK-2206(20nM)处理则进一步抑制了细胞增殖迁移和侵袭的能力。
数据证实RBM24过表达增加5-FU或顺铂诱导的细胞凋亡。在RBM24过表达后，再使用PI3K-IN-6或MK-2206治疗进一步促进了5-FU或顺铂诱导的CRC细胞凋亡。
在本申请中，“结肠癌”是指在结肠组织(大肠最长的部分)形成的癌和/或瘤。大多数结肠癌是腺癌(起源于产生和释放粘液和其它液体的细胞中的癌症)。“直肠癌”是指在直肠组织(肛门前大肠最后几英寸的部分)形成的癌和/或瘤。在本发明文中的“结直肠癌”是指在结肠或直肠中出现的癌。
本文中的“样品”是从对象处分离出的生物样品，其可以包括：例如，但不限于，全血、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、组织活检、淋巴液、腹水、间质液(也称为“细胞外液”，包括在细胞间隙中发现的液体)、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液、粘液、痰液、汗液、尿液或任何其它分泌物、排泄物或其它体液。
本发明文中的“受试者”优选哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人的灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人的哺乳动物可以有利地用作代表结直肠癌动物模型的受试者。受试者可以为雄性或雌性。受试者可以是之前诊断或鉴定为患有结直肠癌者，并且任选地，但不必须是已经进行结直肠癌治疗者。受试者还可以是未患结直肠癌者。受试者还可以是诊断或鉴定为患有结直肠癌但是由于接受一种或多种结直肠癌治疗而表现出疾病改善(例如，肿瘤尺寸降低)者。作为另外一种选择，受试者还可以是之前未被诊断或鉴定为患有结直肠癌者。例如，受试者可以是表现出一种或多种结直肠癌风险因素者，或未表现出结直肠癌风险因素的受试者或无结直肠癌症状的受试者。受试者还可以是患有结直肠癌或具有发展结直肠癌风险者。
可以测量测试样品中Rbm24蛋白、肽、核酸、多态性、代谢物或其它分析物的量并与正常对照水平进行比较。术语“正常对照水平”是指通常在如下对象中出现的一种或多种Rbm24蛋白、核酸、多态性、代谢物或其他分析物或Rbm24指数的水平：未患结直肠癌并且不可能患结直肠癌的对象，例如，相对于从年轻对象的纵向研究中所收集的样品，该年轻对象被监测直到高龄并且未发现发展出结直肠癌或相关疾病后遗症，如溃疡性结肠炎、炎症性肠病和/或克罗恩病。正常对照水平可以是范围或指数。作为另外一种选择，正常对照水平可以是之前测试的对象的模式数据库。与正常对照水平相比，来源于对象的一种或多种Rbm24蛋白、核酸、多态性、代谢物或其它分析物样品水平的变化可以表明对象患有结直肠癌或具有发展结直肠癌的风险。相反，当预防性地施用该方法时，与正常对照水平相比，来源于对象的一种或多种Rbm24蛋白、核酸、多态性、代谢物或其它分析物样品具有相似的水平可以表明对象未患有结直肠癌或者无发展结直肠癌的风险或风险很低。
参考值可以指从癌症状态已知(即，诊断或鉴定为患有结直肠癌，或未诊断或鉴定为患有结直肠癌)的对照对象或人群获得的数值。参考值可以是指标值或基准值，例如本文所定义的“正常对照水平”。参考样品或指标值或基准值可以取自或来源于已经接受抗癌治疗、放射治疗或化疗的一个或多个对象；或取自或来源于具有发展结直肠癌低风险的一个或多个对象；或取自或来源于由于接受治疗而表现出结直肠癌风险因素改善的对象。作为另外一种选择，参考样品或指标值或基准值可以取自或来源于未接受过抗癌治疗、放射治疗或化疗的一个或多个对象。例如，样品可以从接受结直肠癌初始治疗和结直肠癌的后续治疗以监测治疗进展的对象中采集。参考值还可以包括来源于结直肠癌人群研究的风险预测算法或计算指数的数值，如本文所公开的那些数值。参考值还可以包括来自已患有息肉、溃疡性结肠炎、炎症性肠病和/或克罗恩病但未患有结直肠癌的对象或人群的数值。
由本发明的方法测量的Rbm24的水平或量(可以是“有效量”)的差异可以包括与正常对照水平、参考值、指标值或基准值相比Rbm24水平或量的升高或降低。相对于参考值，Rbm24量的升高或降低可以表明结直肠癌的进展；结直肠癌的延缓、进展、发展或减轻；发展结直肠癌或其相关并发症风险的升高或降低。升高或降低可以指示一种或多种结直肠癌治疗方案的成功；或可以指示结直肠癌风险因素的改善或消退。升高或降低可以为，例如，参考值或正常对照水平的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
可以使用本领域内已知的任何方法在RNA水平上测量本文所公开的基因表达。例如，使用特异地识别一种或多种这些序列的探针的Northern杂交分析可用于测定基因表达。作为另外一种选择，可以使用逆转录PCR测定法(RT-PCR)测量表达，例如，使用对差异表达序列特异的引物。还可以使用，例如，其它靶扩增法(例如，TMA、SDA、NASBA)或信号扩增法(例如，bDNA)等来定量RNA。优选地，通过实时PCR检测本发明生物标志物的表达水平，如还描述在PCT/US02/38806(以WO03/048377公开；Therianos等人，(2004)Am.J.Pathol.164(3)：795-806，它们的内容以引用方式并入本文)。
作为另外一种选择，可以测量Rbm24蛋白和核酸的代谢物或片段。可以用本领域的技术人员所已知的多种方法检测代谢物，包括：折射率光谱(RI)、紫外光谱法(UV)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(near-IR)、核磁共振光谱(NMR)、光散射分析(LS)、质谱、热解质谱法、比浊法、色散型拉曼光谱(dispersive Raman spectroscopy)、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、表面加强激光解析电离化(SELDI)质谱、结合质谱的离子喷射光谱、毛细血管电泳、NMR和IR检测。(参见，WO 04/056456和WO04/088309，它们的整体以引用方式并入)。在这点上，可以使用上述检测方法或技术人员已知的其它方法测量其它Rbm24分析物。
附图说明
图1：IHC检测结直肠癌患者癌旁组织和肿瘤组织中RBM24的表达的代表性图片。
图2：IHC检测结直肠癌患者癌旁组织和肿瘤组织中RBM24的表达的评分统计结果。
图3：本发明提供的qPCR检测的RBM24在结直肠癌患者肿瘤组织中下调。
图4：本发明提供的qPCR检测的RBM24在结直肠癌患者肿瘤组织中的表达与TNM分期相关。
图5：qPCR检测的RBM24在结直肠癌患者肿瘤组织中的表达与患者生存时间相关。
图6：蛋白印迹检测的RBM24在结直肠癌患者肿瘤组织中下调。
图7：WB检测RBM24敲除小鼠敲除效率。
图8：qPCR检测RBM24敲除小鼠敲除效率。
图9：RBM24敲除之后，HE染色表明肠道显著增生。
图10：RBM24敲除之后，肠道长度显著增加。
图11：RBM24敲除之后，HE染色表明肠道出现自发性肿瘤结节。
图12：RBM24抑制人结直肠癌细胞HCT116的增殖。
图13：RBM24与小分子抑制剂协同抑制人结直肠癌细胞HCT116的增殖。
图14：在人结直肠癌细胞中过表达RBM24提升5-Fu诱导的细胞凋亡比例。
图15：在人结直肠癌细胞中过表达RBM24提升顺铂诱导的细胞凋亡比例。
图16：RBM24过表达后，小分子抑制剂处理协同提升药物诱导的细胞凋亡比例。
图17：RBM24抑制人结直肠癌细胞HCT116的迁移和侵袭。
图18：RBM24与小分子抑制剂协同抑制人结直肠癌细胞HCT116的迁移。
图19：RBM24与小分子抑制剂协同抑制人结直肠癌细胞HCT116的迁移和侵袭。
具体实施方式
本文使用的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一种”，“一个”和“该”的术语不旨在仅指单数实体，而是包括特定实施例可以用于说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的用法不限制本发明，除非在权利要求中概述。
实施例
实施例1.临床结直肠癌患者样本中RBM24的表达。
1.1临床样品收集。
方法：在提前获得医院伦理委员会批准和患者知情同意的情况下，在厦门大学附属第一医院收集来自36名受试者的肿瘤样本和对应的癌旁样本(临床信息如表1所示)。为了有资格纳入本研究，每一位患者都被单独评估，且必须符合以下条件方可被纳入本研究：1)手术前未经过临床放疗或化疗等处理；2)经过临床病理诊断为结直肠癌；3)先前没有其他重大疾病史；4)患者基本资料齐全，包括性别、年龄、吸烟史、家族史、手术时间、手术方式、病理诊断、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况、目前状况、无病生存时间、总生存时间等临床病例参数。要求进行手术切除，获取临床样本后，马上进行液氮速冻，随后将样品储存在-80℃冰箱中直到使用。
结果：总共获得符合入组标准的临床结直肠癌患者36例，详细临床信息如表1所示。
表1：36例结直肠癌患者的临床病理特征。
1.2免疫组化结果显示，与邻近组织相比，人CRC组织中RBM24的表达显著降低。
方法：将肠道组织放入4％的多聚甲醛中固定48小时以上。PBS冲洗3次，每次5分钟。然后用10％蔗糖溶液脱水，随后依次使用20％和30％蔗糖溶液梯度脱水。OCT包埋后，使用液氮速冻。使用冰冻切片机(Leica)切片，厚度5um，切好的玻片暂存于-80℃冰箱保存。如前所述获取组织切片后，添加H2O2常温孵育10分钟。PBS冲洗后进行抗原修复，使用山羊血清封闭1h。加入特异性一抗(RBM24抗体，abcam：ab94567，1：300，4℃孵育过夜。随后加入HRP偶联的二抗，室温孵育1小时。PBS冲洗后，加入DAB显色液，室温反应5分钟。苏木素染色液复染30秒后梯度酒精脱水并封片拍照。
结果：免疫组化结果显示，与邻近组织相比，人CRC组织中RBM24的表达显著降低(图1；图2)。
1.3 RBM24的mRNA在结直肠癌组织中显著下调
方法：取适量的组织或细胞样本，按照试剂盒说明书添加TRIzol试剂，并进行后续的抽提操作，获取总RNA。使用紫外分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，A260/A280的比值为1.6-2.0视为质量合格。随后使用逆转录试剂盒合成cDNA，并按照qPCR的荧光染料试剂盒说明书进行操作，添加相应的引物检测靶基因的相对表达量。最终结果GAPDH基因作为内参进行标准化。
结果：我们发现RBM24的mRNA在结直肠癌组织中显著下调(图3)。
1.4 RBM24表达越低，TNM分期越高。
方法：如上所述搜集临床样本及相对应的临床信息后，检测RBM24在每一位患者中的表达水平，将不同TNM分期的患者的RBM24表达水平整理后进行统计分析。
结果：TNM分期为I/II期的患者组织中RBM24的表达水平显著高于TNM分期为III/IV期的患者(N＝36)，即TNM分期越高，则RBM24表达越低(图4)。
1.5 RBM24低表达的患者生存时间更短。
方法：如上所述搜集临床样本及相对应的临床信息后，检测RBM24在每一位患者中的表达水平，将所有患者分为RBM24高表达或低表达两组。使用K-M统计方法分析RBM24表达水平和生存时间之间的关系。
结果：RBM24的表达水平与患者的生存时间相关(N＝36)，即RBM24高表达的患者生存时间更长，RBM24低表达的患者生存时间更短(图5)。
1.6蛋白检测RBM24在结直肠癌组织中显著下调。
方法：将适量组织放入300ul裂解液中(提前加入1％的PMSF)，剪碎组织，研磨，超声破碎后12000×g离心15分钟，取上清。使用BCA法检测蛋白浓度后，加入5×的LoadingBuffer，100℃煮沸10分钟，放入-20℃保存。配制SDS-PAGE积层胶和分离胶。每孔加载的30ug蛋白样品，在适宜的条件下进行电泳分离。随后将蛋白通过湿转法转移至PVDF膜上，5％的脱脂牛奶封闭1小时后，进行一抗孵育，4度摇床过夜。抗体浓度为RBM24抗体(Abcam：ab94567，1:1000)；β-actin抗体：santa cruz，SC-47778，1：3000)。TBST洗膜后使用HRP偶联的二抗常温孵育1小时。二抗为羊抗鼠(博士德生物，BA1075，1：2000)或羊抗兔(博士德生物，BA1054，1：2000)。洗膜后添加化学发光试剂盒工作液进行曝光，获取蛋白条带。β-actin或者GAPDH视为内参。
结果：我们发现RBM24在结直肠癌组织中显著下调(图6)。
实施例2.Rbm24敲除小鼠发生自发性结直肠癌。
2.1 RBM24敲除小鼠构建。
方法：通过在RBM24基因的第二和第三外显子两端插入Loxp位点，进一步使用Cre-Loxp系统，在C57BL/6背景上构建他莫昔芬诱导的全身RBM24敲除小鼠。通过使用RBM24的特异性引物对基因组DNA进行PCR反应，证实了他莫昔芬诱导后RBM24的遗传破坏，通过qPCR和蛋白印迹分析显示了结肠组织中RBM24的mRNA和蛋白水平显著降低。将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下，以12:12小时的明/暗周期进行饲养，并接受常规食物和随意饮水。所有涉及动物水平的实验程序均按照厦门大学实验动物中心批准的动物规程进行操作。
结果：基因组PCR结果显示RBM24的基因组受到破坏，初步证实RBM24敲除小鼠构建成功。后续证实RBM24的mRNA和蛋白在敲除小鼠中显著下调(图7；图8)。
2.2 HE染色证实RBM24敲除后小鼠肠道异常增生。
方法：用颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠结肠和直肠取出，20ml注射器抽取PBS冲洗3次，确保肠内容物冲洗干净，将肠道放在操作台上，用剪刀沿肠道长径剪开，展平肠道，观察肠道肿物，拍照存档。将肠道组织放入4％的多聚甲醛中固定48小时以上。PBS冲洗3次，每次5分钟。然后用10％蔗糖溶液脱水，随后依次使用20％和30％蔗糖溶液梯度脱水。OCT包埋后，使用液氮速冻。使用冰冻切片机(Leica)切片，厚度5um，切好的玻片暂存于-80℃冰箱保存。如前所述获取组织切片后，苏木素染液染色(60℃)60s，1％盐酸乙醇处理3s。自来水冲洗15分钟，切片返蓝后使用伊红液染色60s，蒸馏水冲洗2s，进一步使用乙醇二甲苯依次脱水，中性树胶封片拍照。
结果：HE染色结果表明，RBM24敲除小鼠结肠上皮增厚。在敲除6个月后，我们观察到小鼠发生结直肠腺瘤，并且结直肠的长度显著长于野生型小鼠(图10；图11)。
实施例3.Rbm24过表达抑制结直肠癌细胞恶性表型。
3.1 RBM24过表达抑制HCT116细胞增殖。
方法：人结直肠癌HCT116细胞购自中国科学院上海细胞库，并由本实验室进行冻存。细胞培养在含有10％的FBS和1％青链霉素混合液的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％的CO2和饱和湿度的条件中。
为了构建RBM24过表达的细胞株，我们扩增了RBM24的CDS区并克隆进入pcDNA3.1质粒的多克隆位点，构建RBM24瞬时表达的质粒。同时我们将RBM24的CDS区克隆进入慢病毒包装的核心质粒中，并包装成为了慢病毒颗粒。使用慢病毒颗粒感染细胞48h后，使用1ug/ml的嘌呤霉素筛选72h，获得纯净的RBM24过表达细胞株。使用qPCR和蛋白印迹检测RBM24的表达水平以确定过表达效率。
各组细胞按照1×105个细胞每孔的密度接种至96孔板中，过夜培养后，在相应的时间内添加体积分数为10％的CCK-8试剂，继续孵育2h后，使用酶标仪在450nm处检测溶液的吸光度值，无细胞的培养基和CCK-8试剂作为阴性对照，绘制细胞增值曲线。
结果：我们发现RBM24的过表达能够抑制细胞增殖。这提示RBM24在体外抑制了CRC细胞的生长(图12)。使用PI3K-IN-6或MK-2206处理则进一步抑制了细胞增殖的能力(图13)。
3.2 RBM24过表达提升化疗药物诱导的HCT116的细胞凋亡。
方法：将各组细胞培养至对数生长期，以每孔5×105个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中适应培养过夜后，继续培养细胞至汇合度为50％-60％。使用顺铂或者不使用顺铂处理相应时间后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，弃上清。使用75％的乙醇固定细胞30min，洗涤并重悬细胞后，使用PI染料和RNA酶A避光处理细胞30min，再次洗涤细胞，重悬细胞时将细胞密度调整至1×106个细胞/ml。使用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡比率，用FlowJo软件对结果进行分析。结果：数据证实RBM24过表达增加5-FU或顺铂诱导的细胞凋亡(图14；图15)。在RBM24过表达后，再使用PI3K-IN-6或MK-2206治疗进一步促进了5-FU或顺铂诱导的CRC细胞凋亡(图16)。
3.3 RBM24过表达抑制HCT116迁移和侵袭。
方法：如上所述培养各组细胞，为了进行迁移实验，各组细胞使用无血清培养基重悬后，调整细胞密度为5×105个/ml。将200ul细胞悬液添加到Transwell小室的上腔，在下腔添加500ul的完全培养基。上下腔组装完成后，培养板置于细胞培养箱中继续孵育12h。取出上腔后，使用棉签擦除聚碳酸酯膜上层未迁移的细胞，使用75％的乙醇固定细胞10min。使用0.1％的结晶紫染液于37℃染色30min后，对迁移细胞进行拍照。每组至少选取个5个视野进行迁移细胞数目的统计分析。
为了进行侵袭实验，预先在Transwell小室的上腔中添加100ul浓度为5mg/ml的基质胶溶液，37℃至少孵育30min后，吸弃上清，将细胞悬液添加进入基质胶上，随后进行上述操作，获取细胞侵袭的结果。
结果：与对照细胞相比，RBM24的过表达抑制结直肠癌细胞系(HCT116)的迁移和侵袭(图17)。使用PI3K-IN-6或MK-2206处理则进一步抑制了细胞增殖迁移和侵袭的能力(图18；图19)。
Claims (6)
1.检测Rbm24表达水平的试剂在制备用于诊断结直肠癌的产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述检测Rbm24表达水平的试剂包括检测Rbm24基因mRNA表达水平的试剂，和/或检测Rbm24蛋白表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述检测Rbm24基因mRNA表达水平的试剂包括实时定量PCR中使用的引物，和/或探针。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述检测Rbm24蛋白表达水平的试剂包括针对Rbm24蛋白的抗体。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。
6.上调Rbm24基因表达或Rbm24基因所编码的Rbm24蛋白表达的试剂在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110137668.0A CN114836537B (zh) | 2021-02-01 | 2021-02-01 | Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110137668.0A CN114836537B (zh) | 2021-02-01 | 2021-02-01 | Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114836537A CN114836537A (zh) | 2022-08-02 |
| CN114836537B true CN114836537B (zh) | 2024-07-02 |
Family
ID=82561195
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110137668.0A Active CN114836537B (zh) | 2021-02-01 | 2021-02-01 | Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114836537B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109402253A (zh) * | 2018-08-22 | 2019-03-01 | 余时沧 | Aldh18a1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用 |
| CN109839508A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-06-04 | 华中农业大学 | Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007122369A2 (en) * | 2006-04-13 | 2007-11-01 | Oncomethylome Sciences Sa | Novel tumour suppressor |
| WO2015017537A2 (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-05 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Colorectal cancer recurrence gene expression signature |
| KR101925125B1 (ko) * | 2016-06-16 | 2018-12-04 | 울산대학교 산학협력단 | Nckap1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물 |
| CN112266961B (zh) * | 2020-10-29 | 2023-05-12 | 中山大学附属第六医院 | Tsg-6基因在预测结直肠癌转移及预后方面的应用 |
-
2021
- 2021-02-01 CN CN202110137668.0A patent/CN114836537B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109402253A (zh) * | 2018-08-22 | 2019-03-01 | 余时沧 | Aldh18a1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用 |
| CN109839508A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-06-04 | 华中农业大学 | Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114836537A (zh) | 2022-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | FTO expression is associated with the occurrence of gastric cancer and prognosis | |
| Kang et al. | Growth differentiation factor 15 is a cancer cell-induced mitokine that primes thyroid cancer cells for invasiveness | |
| Zhao et al. | S100A14 promotes the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma | |
| Yang et al. | Long non-coding RNA SNHG1 predicts a poor prognosis and promotes colon cancer tumorigenesis | |
| Saleh et al. | Expression of therapy-induced senescence markers in breast cancer samples upon incomplete response to neoadjuvant chemotherapy | |
| Zheng et al. | CXCL6 fuels the growth and metastases of esophageal squamous cell carcinoma cells both in vitro and in vivo through upregulation of PD‐L1 via activation of STAT3 pathway | |
| Zhou et al. | N6-methyladenosine modification of REG1α facilitates colorectal cancer progression via β-catenin/MYC/LDHA axis mediated glycolytic reprogramming | |
| CN104267191B (zh) | 口腔鳞状细胞癌的生物标志物及其应用 | |
| Sun et al. | Actin-like protein 6A is a novel prognostic indicator promoting invasion and metastasis in osteosarcoma | |
| CN108315414A (zh) | 一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物 | |
| Yang et al. | TMEM44-AS1 promotes esophageal squamous cell carcinoma progression by regulating the IGF2BP2-GPX4 axis in modulating ferroptosis | |
| Chen et al. | WISP1 silencing confers protection against epithelial–mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells in rats via inactivation of the wnt/β‐catenin signaling pathway in uremia | |
| Wang et al. | Role and mechanism of FLNa and UCP2 in the development of cervical cancer | |
| Zhang et al. | METTL1 coordinates cutaneous squamous cell carcinoma progression via the m7G modification of the ATF4 mRNA | |
| Wang et al. | Renal lipid accumulation and aging linked to tubular cells injury via ANGPTL4 | |
| Zhang et al. | Coronin 6 promotes hepatocellular carcinoma progression by enhancing canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway | |
| CN114836537B (zh) | Rbm24在结直肠癌的诊断和治疗中的用途 | |
| CN115449551B (zh) | Tff1和tff3在肺癌骨转移早期诊断中的应用 | |
| Zhang et al. | PIWI interacting RNA-13643 contributes to papillary thyroid cancer development through acting as a novel oncogene by facilitating PRMT1 mediated GLI1 methylation | |
| Hu et al. | HKDC1 in gastric cancer: A new diagnostic, prognostic biomarker, and novel therapeutic target | |
| Sun et al. | Targeting CircAURKA prevents colorectal cancer progression via enhancing CTNNB1 protein degradation | |
| CN115074445A (zh) | Eno3在肾癌诊断及治疗中的应用 | |
| Luan et al. | SNHG8 promotes cell proliferation, migration, and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells as an oncogene through miR-588/HMGA2 axis | |
| CN114582509A (zh) | 一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型及其应用 | |
| CN116463424B (zh) | 生物标志物在黑色素瘤治疗、预防或预后预测中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |