CN114836525A - 一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法 - Google Patents
一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114836525A CN114836525A CN202110137807.XA CN202110137807A CN114836525A CN 114836525 A CN114836525 A CN 114836525A CN 202110137807 A CN202110137807 A CN 202110137807A CN 114836525 A CN114836525 A CN 114836525A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- unknown
- dna
- dna fragment
- cleavage pattern
- endonuclease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，先将未知核酸内切酶切割得到的DNA片段经过处理后连入T载体，测序引物分别向连接产物的连接位点方向进行测序，使得测序结果覆盖底物DNA的断裂位置，然后根据外源DNA片段(即原始DNA片段)序列与紧邻的T载体边界的序列信息，经过序列比对分析，即可准确推断出底物DNA片段的断裂位置以及断裂方式，因而可用于未知核酸酶的识别位点测定，具有操作简单快速、结果准确、成本低、耗时短等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别是快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法。
背景技术
核酸酶广泛存在于生物体内，它在核酸代谢中起着重要的作用，也广泛作为分子生物学的重要工具酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶(nuclease)。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease)。20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，简称限制酶)。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快，已提纯的限制性核酸内切酶有100多种，许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。核酸内切酶作用于双链DNA的磷酸二酯键，能识别特定的碱基序列，并且有特定的切割位点，未知核酸内切酶切割特异性的确定对于其研究利用具有重要意义。因此，为了更好地研究未知核酸酶的功能特性，准确获得其切割模式至关重要。
现有技术中，中国专利CN109207571A公开了一种检测核酸内切酶酶切位点的方法，主要是利用芯片上数以十亿计的核酸序列来高通量系统性的检测核酸内切酶对DNA的识别切割位点及核心序列特征，采用两次测序分别获取碱基序列及正常的双链DNA，同时根据酶切前后荧光信号的改变，运用生物信息分析方法得到内切酶的识别切割位点；通过对内切酶识别切割位点的研究，可检测内切酶的识别切割位点的倾向性，并且可以提前预测内切酶的星号活性及基因组编辑技术中内切酶的脱靶效应。该方法虽然具有通量高的优点，但存在技术难、成本高、耗时长、操作较为复杂等不足。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，利用该方法可以准确推断出未知核酸内切酶的切割位置以及切割模式，用于未知核酸酶的识别位点测定，具有操作简单快速、结果准确、成本低、耗时短等优点。具体通过以下技术实现。
一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，包括以下步骤：
S1.将DNA底物用未知核酸酶特异性切割，得到若干原始DNA片段，并进行切胶回收；
S2.对步骤S1中回收得到的原始DNA片段进行末端平齐化和去磷酸化处理；
S3.将步骤S2中处理得到的DNA片段连入T载体，并将连接有T载体的DNA片段转化到宿主菌中；
S4.筛选得到阳性重组子，利用T载体上的测序引物分别向连接位点方向进行测序；根据T载体边界序列以及与之紧邻的DNA片段序列，推断出原始DNA片段的断裂位置和断裂方式，即得到未知核酸内切酶的切割模式；
所述测序引物为T载体上的任一段序列，且所述测序引物的第一个碱基与所述连接位点之间的距离为50-800bp，以所述测序引物的第一个碱基距离所述连接位点的碱基起止。
该方法的原理为：(1)采用未知核酸酶切割DNA底物，得到切割后的若干原始DNA片段，并进行切胶回收，原始DNA底物的断裂位置即为未知核酸酶的切割位点；(2)为获得未知核酸酶的切割模式，对切胶回收得到切割后的DNA片段进行末端平齐化和去磷酸化处理，然后分别连入T载体；(3)将连接产物(含有处理后的DNA片段的T载体)转化到宿主菌(如大肠杆菌)中，挑取单克隆，用T载体上的扩增引物(如M13F和M13R)进行PCR扩增检测，以筛选出阳性重组子；(4)再用T载体上的测序引物(如M13F和M13R)分别向连接位点(即T载体与处理后的DNA片段的连接位置，也即底物DNA的断裂位置)方向进行测序，根据DNA片段序列与紧邻的T载体序列的信息，经过序列比对分析，即可推断出未知核酸内切酶的断裂位置以及切割模式。
优选地，所述测序引物的第一个碱基与所述连接位点之间的距离为100-600bp。现有的一代测序对于距离在0-50bp和800bp以上的碱基的测序结果不准确，存在一定的错误。本发明将距离限制在上述范围内，可避开上述区域，保证断裂位置的序列信息位于测序结果的100-600bp范围内，结果更精确；避免目前一代测序技术缺陷导致的误差。
优选地，步骤S1中所述DNA底物的长度为300-2000bp。作为切割底物的DNA片段可根据需要选择，但一般以300-2000bp左右为宜，片段过长或过短都不利于切胶回收和连接效率。进一步的，选择的切割底物DNA片段最好只包含一个切割位点，且切割后要得到2个或2个以上大小可明显区分的DNA片段，以减少工作量，有效地进行切胶回收，有利于得到结果。
采用本发明的上述技术方案：所述测序引物为T载体上的序列(如M13F和M13R)，当切割后得到的原始DNA片段的长度为100-800bp时，一个测序反应可得到连入T载体的外源DNA片段(即原始DNA片段)两端的序列；当切割后得到的原始DNA片段的长度＞800bp时，一个测序反应只能确保得到连入T载体的外源DNA片段一端的序列。
更优选地，步骤S1中所述DNA底物的最佳长度为600-1200bp。此时可以将筛选阳性克隆子用的扩增引物和检测断裂位置用的测序引物设定为M13F、M13R，一个测序反应即可得到连入T载体的外源DNA片段(即原始DNA片段)两端的序列，以简化程序，使操作更简单，并降低成本。
优选地，在完成步骤S1和步骤S2后，分别对步骤S1中回收得到的DNA片段和步骤S2中处理得到的DNA片段进行DNA纯化处理。DNA纯化处理采用DNA纯化试剂盒或乙醇沉淀法。
优选地，步骤S2中，末端平齐化处理采用快速末端平齐化试剂盒。将不平齐DNA的5'或3'突出末端转变为带有5'磷酸的平末端。快速末端平齐化试剂盒中的T4 DNA聚合酶同时具有3′→5′外切酶活性和5′→3′聚合酶活性，可使DNA末端平齐化；当末端为5'端突出末端时，T4 DNA聚合酶可以利用其5'→3'DNA聚合酶活性将末端补平；当末端为3'端突出末端时，T4 DNA聚合酶可以利用其3'→5'DNA外切酶活性将末端削平。快速末端平齐化试剂盒为目前行业内常见市售的试剂盒，例如NEB(美国New England Biolabs,Inc.)生产的快速末端平齐化试剂盒(#E1201)。
优选地，步骤S2中，去磷酸化处理采用去磷酸化酶。
优选地，步骤S3的T载体采用TOPO克隆试剂盒。
优选地，步骤S3中，采用TOPO克隆试剂盒将步骤S2中处理得到的DNA片段连入T载体。
优选地，步骤S4中，筛选阳性克隆子的具体步骤为：挑取步骤S3中的单克隆，用T载体上的扩增引物(例如M13F、M13R)进行PCR扩增检测，得到阳性重组子。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种判断未知核酸内切酶的切割位点和切割模式的全新方法，目前未发现有其他国内外科研单位采用该方法。将未知核酸内切酶切割得到的DNA片段经过处理后连入T载体，测序引物分别向连接产物的连接位点方向进行测序，使得测序结果覆盖底物DNA的断裂位置，然后根据外源DNA片段(即原始DNA片段)序列与紧邻的T载体边界的序列信息，经过序列比对分析，即可准确推断出底物DNA片段的断裂位置以及断裂方式，因而可用于未知核酸酶的识别位点测定，具有操作简单快速、结果准确、成本低、耗时短等优点。
附图说明
图1为实施例1的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法的流程示意图Ⅰ；
图2为实施例1中检测未知核酸内切酶切割模式的方法的流程示意图Ⅱ；
图3为实施例1中未知核酸内切酶切割模式的测序结果。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例采用一种切割模式未知的核酸内切酶，它可将一个955bp的DNA片段(DNA底物)切割为372bp和583bp的2个原始DNA片段。为获得该核酸内切酶切割模式，先将切割得到的2个原始DNA片段进行切胶回收，再进行末端平齐化和去磷酸化处理，再连入T载体，得到连接产物，再将连接产物(即含有处理后的DNA片段的T载体)转化到再转化到大肠杆菌，挑取单克隆，用T载体上的扩增引物进行PCR扩增检测，以筛选出阳性重组子，然后选取10-20个阳性重组子再用T载体上测序引物进行测序，得到与T载体衔接处的序列信息，再与底物DNA进行序列比对，即可准确得出该核酸内切酶的切割位点和切割模式。本实施例流程如附图1、2所示，具体步骤如下：
S1.将长度为955bp的DNA底物用未知核酸酶特异性切割，得到长度分别为372bp和583bp的2个原始DNA片段，并进行切胶回收；
S11、利用PCR扩增已知序列的DNA片段，长度为955bp，然后纯化扩增产物，具体使用NEB(美国New England Biolabs,Inc.)生产的DNA纯化试剂盒(#T1030)进行DNA纯化；
S12、将S11的DNA片段作为反应底物，用未知核酸酶进行切割，得到2个分别为372bp和583bp的特异性DNA片段，分别进行切胶回收并纯化；
S2.对步骤S1中回收得到的原始DNA片段采用NEB生产的快速末端平齐化试剂盒(#E1201)进行末端平齐化，反应在室温下进行，反应时间为15min，反应体系如下表1所示；然后采用与S11相同的方法进行DNA纯化；
表1末端平齐化和磷酸化反应体系
| DNA | 19μL(1μg) |
| 10×Blunting Buffer | 2.5μL |
| 1mM dNTP Mix | 2.5μL |
| Blunt Enzyme Mix | 1.0μL |
| 总体积 | 25μL |
再采用NEB生产的去磷酸化酶(#M0525)进行去磷酸化处理，反应37℃下进行，反应时间为10min，反应体系如表2所示；然后采用与S11相同的方法进行DNA纯化；
表2去磷酸化反应体系
| DNA | 1pmol of DNAends |
| 10×CutSmart Buffer | 2μL |
| Quick CIP | 1μL |
| 总体积 | 20μL |
S3.将步骤S2中处理得到的DNA片段连入T载体，采用诺维赞公司生产的第二代TOPO克隆试剂盒(#C601-01)进行连接反应，反应体系如下表3所示，反应在室温下(20-37℃)进行，反应时间为5min，得到连接产物，并将连接产物(连接有T载体的DNA片段)转化到大肠杆菌DH5α中；
表3连接反应体系
| 5×Blunt Clonging Mix | 1μL |
| 步骤S2中得到的DNA片段 | 1μL |
| Nuclease-free Water | 3μL |
| 总体积 | 5μL |
S4.挑取步骤S3中的单克隆，用扩增引物(本领域通用的M13F/M13R引物对，核苷酸序列已知)进行PCR扩增后跑胶检测，筛选出阳性重组子，再利用测序引物M13F向连接位点方向进行测序，根据已知序列与紧邻的质粒序列得出原始DNA片段的切割位置与切割方式。
本实施例中的测序引物选择为M13F，测序结果如附图3所示。除此以外，本领域的技术人员公知的是，所述测序引物并非只能选用M13F、M13R，还可以为T载体上的任一段序列，只要满足使用该测序引物得到的测序结果能够覆盖所述T载体与连接的DNA片段的衔接处，且能够保证该衔接处附近的碱基序列的准确性，则该测序引物皆可实现本发明的技术方案。
在进行步骤S2的原始DNA片段末端平齐化时，不同的切割方式也会有不同的平齐化方式，5’突出末端时，DNA末端会被补齐；3’突出末端，DNA末端会被削平，平末端则无变化；这三种情况可根据所获得的T载体与外源DNA衔接处的序列信息加以确认。通过挑取不同的克隆去测序，图3示例性地展示了本实施例的未知核酸内切酶产生5’突出末端的测序结果，图3中标注的加粗序列分别对应测序反应得出的连入T载体的外源DNA上的序列。根据上述结果，可以得到本实施例中所用未知核酸内切酶的切割模式为：正链5’…AATAACC/CGGATATT…3’，负链5’…AATATCC/GGGTTATT…3’，切割造成DNA双链断裂，断口为5’端一个核苷酸突出。采用本发明的方法检测未知核酸内切酶切割模式时，检测结果准确，操作简单快速。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将DNA底物用未知核酸酶特异性切割，得到若干原始DNA片段，并进行切胶回收；
S2.对步骤S1中回收得到的原始DNA片段进行末端平齐化和去磷酸化处理；
S3.将步骤S2中处理得到的DNA片段连入T载体，并将连接有T载体的DNA片段转化到宿主菌中；
S4.筛选得到阳性重组子，利用T载体上的测序引物分别向连接位点方向进行测序；根据T载体边界序列以及与之紧邻的DNA片段序列，推断出原始DNA片段的断裂位置和断裂方式，即得到未知核酸内切酶的切割模式；
所述测序引物为T载体上的任一段序列，且所述测序引物的第一个碱基与所述连接位点之间的距离为50-800bp。
2.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，所述测序引物的第一个碱基与所述连接位点之间的距离为100-600bp。
3.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S1中所述DNA底物的长度为300-2000bp。
4.根据权利要求3所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S1中所述DNA底物的最佳长度为600-1200bp。
5.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，在完成步骤S1和步骤S2后，分别对步骤S1中回收得到的DNA片段和步骤S2中处理得到的DNA片段进行DNA纯化处理。
6.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S2中，末端平齐化处理采用快速末端平齐化试剂盒。
7.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S2中，去磷酸化处理采用去磷酸化酶。
8.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S3的T载体采用TOPO克隆试剂盒。
9.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S3中，采用TOPO克隆试剂盒将步骤S2中处理得到的DNA片段连入T载体。
10.根据权利要求1所述的快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，其特征在于，步骤S4中，筛选阳性克隆子的具体步骤为：挑取步骤S3中的单克隆，用T载体上的扩增引物进行PCR扩增检测，得到阳性重组子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110137807.XA CN114836525A (zh) | 2021-02-01 | 2021-02-01 | 一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110137807.XA CN114836525A (zh) | 2021-02-01 | 2021-02-01 | 一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114836525A true CN114836525A (zh) | 2022-08-02 |
Family
ID=82560780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110137807.XA Pending CN114836525A (zh) | 2021-02-01 | 2021-02-01 | 一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114836525A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1995384A (zh) * | 2006-01-06 | 2007-07-11 | 王铸钢 | 一种快速方便转基因插入位点鉴定技术 |
| CN102140501A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-08-03 | 江南大学 | 一种t载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法 |
| CN103146686A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-06-12 | 新疆农垦科学院 | 一种批量获得基因组dna中差异位点及其侧翼序列的方法 |
| CN109207571A (zh) * | 2017-06-30 | 2019-01-15 | 深圳华大基因研究院 | 一种检测核酸内切酶酶切位点的方法 |
| CN110029149A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-19 | 中山大学 | 一种鉴定碱基修饰的方法 |
-
2021
- 2021-02-01 CN CN202110137807.XA patent/CN114836525A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1995384A (zh) * | 2006-01-06 | 2007-07-11 | 王铸钢 | 一种快速方便转基因插入位点鉴定技术 |
| CN102140501A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-08-03 | 江南大学 | 一种t载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法 |
| CN103146686A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-06-12 | 新疆农垦科学院 | 一种批量获得基因组dna中差异位点及其侧翼序列的方法 |
| CN109207571A (zh) * | 2017-06-30 | 2019-01-15 | 深圳华大基因研究院 | 一种检测核酸内切酶酶切位点的方法 |
| CN110029149A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-19 | 中山大学 | 一种鉴定碱基修饰的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230212661A1 (en) | Enhanced nucleic acid identification and detection | |
| US20230086170A1 (en) | Method of nucleic acid enrichment using site-specific nucleases followed by capture | |
| CN107002292A (zh) | 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂 | |
| EP3225721B1 (en) | Method and reagent for constructing nucleic acid double-linker single-strand cyclical library | |
| EP3625356A1 (en) | In vitro isolation and enrichment of nucleic acids using site-specific nucleases | |
| EP3674413A1 (en) | Probe and method for high-throughput sequencing targeted capture target region used for detecting gene mutations as well as known and unknown gene fusion types | |
| CN107058573B (zh) | 一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法 | |
| JP2023519782A (ja) | 標的化された配列決定の方法 | |
| EP3674419A1 (en) | Probe and method applying the same for enriching target region in high-throughput sequencing | |
| WO2024112441A1 (en) | Double-stranded dna deaminases and uses thereof | |
| CN112941635A (zh) | 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 | |
| WO2025002001A1 (zh) | 低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法 | |
| EP3643787A1 (en) | Pcr primer pair and application thereof | |
| CN110468179B (zh) | 选择性扩增核酸序列的方法 | |
| CN113817803B (zh) | 一种携带修饰的小rna的建库方法及其应用 | |
| WO2022144003A1 (zh) | 一种用于高通量靶向测序的多重pcr文库构建方法 | |
| CN114836525A (zh) | 一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法 | |
| EP3208335B1 (en) | Method for breaking nucleic acid and adding adaptor by means of transposase, and reagent | |
| CN103866025A (zh) | 一种核酸预扩增方法及其应用 | |
| CN109988817B (zh) | 一种随机打断dna的方法 | |
| CN116790733A (zh) | 一种脱氨酶辅助的rna中n6-甲基腺嘌呤的定位分析方法 | |
| CN111133135B (zh) | 用于高通量测序的快速文库构建 | |
| CN118166070A (zh) | 一种新型染色体结构变异检测的ngs建库方法 | |
| CN119307571A (zh) | 全基因组甲基化建库和测序方法 | |
| EP4623076A1 (en) | Double-stranded dna deaminases and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |