CN114796099A - 负载细胞的两性离子微凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供负载细胞的两性离子微凝胶及其制备方法和应用，首先，制备两性离子聚合物大分子单体，然后，将干细胞与两性离子聚合物大分子单体混合溶于水中形成两性离子聚合物大分子单体水溶液，最后，将两性离子聚合物大分子单体的PBS溶液和二巯基聚乙二醇的PBS溶液在微流控芯片中混合通过微流控方法制备得到负载细胞的两性离子微凝胶。本发明所提供的制备方法简单，能够制备尺寸较为均一的微凝胶，同时能够保持包覆在其中的细胞高存活率，对于干细胞包覆在其中时能够保持干细胞的干性。
Description
技术领域
本发明涉及负载细胞的微凝胶制备技术领域，更具体地说涉及负载细胞的两性离子微凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
微凝胶是尺寸在微米级别的水凝胶，其不仅具有一定力学性能且具有高含水量的三维网状结构，能够与周围环境进行营养物质、气体和代谢产物的扩散和交换，有利于负载在其中的细胞的存活。同时由于其尺寸效应，微凝胶能够轻松的通过注射器的针头，具有可注射性。另外微凝胶具有较大的比表面积，可改善细胞-基质相互作用。两性离子材料在同一分子上带有一对正负电荷，并保持整体电中性电荷。两性离子材料具有优异的防污性能。因为它们具有的相反电荷可以静电诱导周围的高水合层，从而建立高能水合屏障以克服非特异性蛋白质吸附。这些特性使得基于两性离子的材料在各个领域得到研究，尤其是干细胞培养。据报道，由纯两性离子聚羧基甜菜碱形成的水凝胶在植入小鼠体内时可抑制异物反应并抵抗胶原包囊，以及保护蛋白质免受血液中的免疫原性反应。此外，干细胞封装在两性离子聚羧基甜菜碱水凝胶中，细胞保持其治疗多能性并避免非特异性分化。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了负载细胞的两性离子微凝胶及其制备方法和应用，在本发明中利用两性离子微凝胶将细胞包覆在其中，既能够保持干细胞干性，同时能够保持细胞的高存活率，且能够注射到病灶部位。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
负载细胞的两性离子微凝胶及其制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，将单体3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯溶于水中，混合均匀后，再加入偶氮类自由基引发剂，在氮气保护氛围下，加热引发聚合反应，即得到两性离子聚合物反应溶液，其中，偶氮类引发剂采用偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐或者偶氮二氰基戊酸，3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯与偶氮类自由基引发剂的用量比例范围为(50-400)：1，聚合反应温度为50-90℃，聚合反应时间为10-36h；
步骤2，将步骤1制备得到的两性离子聚合物反应溶液的温度降低至室温20-25℃后，向上述反应溶液中加入碱的水溶液中和至pH为8-10后，将上述混合溶液置于冰水浴中，再向其中逐滴加入含有双键的酸类单体，反应即得到两性离子聚合物大分子单体溶液，其中，碱采用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或者碳酸氢钾，含有双键的酸类单体采用丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酐或者甲基丙烯酸酐，酸类单体的加入量为5-20ml，反应时间为10-36h；
步骤3，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析，将透析后的溶液冻干，即得到两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)，并将上述两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)和干细胞溶于PBS溶液中，形成两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液，其中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的质量百分数为1％-20％，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中细胞的质量百分数为0-1×109/ml，细胞的质量百分数不等于零，干细胞采用胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞或者胰腺干细胞；
步骤4，将步骤3制备得到的两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液分别装入不同的注射器中，然后通过实验室微量注射泵将上述两种溶液分别引入到微流控芯片当中，作为非连续相，其中，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液中二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的质量百分数为0.5％-10％；
步骤5，向矿物油中加入司盘80，混合均匀后将混有司盘80的矿物油引入到微流控芯片当中，作为连续相，其中，司盘80在混有司盘80的矿物油中的质量百分数为0.5％-5％；
步骤6，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液首先在微流控芯片的微通道中混合，然后在连续相即有司盘80的矿物油的剪切作用下形成单分散的液滴，并随着连续相从导出管流出微通道，其中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液的流速为0.1-20μL/min，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液的流速为0.1-20μL/min，混有司盘80的矿物油的流速为0.1-50μL/min；
步骤7，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)在液滴中反应，即得到负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)。
在步骤1中，偶氮类引发剂采用偶氮二氰基戊酸，3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯与偶氮类自由基引发剂的用量比例范围为175:1，聚合反应温度为70℃，聚合反应时间为24h。
在步骤2中，碱采用碳酸氢钠，含有双键的酸类单体采用丙烯酸酐，反应时间为24h。
在步骤3中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的质量百分数为2％-10％，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中细胞的质量百分数为1×105-1×108/ml。
在步骤4中，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液中二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的质量百分数为1％-5％，优选2％-4％。
在步骤5中，司盘80在混有司盘80的矿物油中的质量百分数为1-3％。
在步骤6中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液的流速为0.5-5μL/min，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液的流速为0.5-5μL/min，混有司盘80的矿物油的流速为0.3-10μL/min。
本发明的有益效果为：本发明的制备方法简单，制备得到的微凝胶尺寸较为均匀，且微凝胶的尺寸可调；细胞负载在微凝胶中能够保持高存活率，长期培养也能够有较高存活率，另外，由于两性离子和聚乙二醇的超亲水性能够抗非特异性蛋白吸附，因此将干细胞包覆在微凝胶中，包覆其中的干细胞能够保持其干性，保留其多系分化的特性。
附图说明
图1是本发明制备得到的两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的制备流程示意图；
图2是本发明制备得到的两性离子微凝胶(PCB-PEG)图片；
图3是本发明制备得到的负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)的图片；
图4是本发明制备得到的负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)的细胞活性检测图片；
图5是本发明制备得到的负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)中的干细胞在成脂诱导分化培养基培养后的油红O染色图和相关基因的PCR表征结果；
图6是本发明制备得到的负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)中的干细胞在成骨诱导分化培养基培养后的茜素红染色图和相关基因的PCR表征结果；
图7是本发明制备得到的负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)中的干细胞在成肌诱导分化培养基培养后的相关基因的PCR表征结果；
图8是本发明制备得到的不同尺寸的两性离子微凝胶(PCB-PEG)图片；
图9是本发明制备得到的不同细胞负载量的负载细胞的两性离子微凝胶图片。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
步骤1，按照图1的反应流程制备PCB-OAA。用天平称量4.9g 3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯，28mg偶氮二氰基戊酸，适量的水放入三口烧瓶中，再抽真空并充氮气多次，加热70℃开始反应，反应时间24h；
步骤2，反应完成后，将反应液降温到室温，加入8.4g碳酸氢钠中和溶液中的酸，将溶液冰水浴30min。再逐滴加入10ml丙烯酸酐，加入后室温反应24h，最终得到两性离子聚合物大分子单体溶液；
步骤3，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到两性离子聚合物大分子单体PCB-OAA；
步骤4，用天平将所制备的两性离子大分子单体PCB-OAA溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为4.5％；
步骤5，用天平称量适量巯基取代的聚乙二醇配置成浓度为2.5％的PBS溶液；
步骤6，将将PCB-OAA溶液和HS-PEG-SH溶液分别装载在注射器中，然后通过实验室微量注射泵将溶液引入到微流控芯片当中，作为非连续相；
步骤7，将矿物油中加入2％的司盘80，将油相装入注射器中，然后通过实验室微量注射泵将溶液引入到微流控芯片当中，作为连续相；
步骤8，将PCB-OAA溶液和HS-PEG-SH溶液均以0.7μL/min的速度在微通道中混合，连续相的速度设置为1.5μL/min，然后在连续相的剪切作用下形成单分散的液滴，并随着连续相从导出管流出微通道。PCB-OAA和HS-PEG-SH在液滴中反应，形成微凝胶，如图2所示；
步骤9，将大量的细胞提前混合在PCB-OAA溶液当中，从而获得负载细胞的微凝胶，如图3所示。以间充质干细胞为例，得到负载间充质干细胞的PCB-PEG微凝胶，PCB-PEG微凝胶能够保持其高存活率和干性；
步骤10，将负载间充质干细胞的PCB-PEG微凝胶培养在完全培养基中，分别在培养1,7,14天后进行细胞存活测试，利用活死细胞染色试剂盒测定。如图4所示，结果显示在连续培养14天内，微凝胶内的间充质干细胞存活较好，存活率高；
步骤11，将负载间充质干细胞的PCB-PEG微凝胶培养在完全培养基中，培养1天后，将成脂分化培养基加入其中进行分化培养，以在组织培养板上的间充质干细胞为对照组。分化21天后通过油红O染色分析和RT-PCR分析测定其分化结果。如图5a所示，结果发现负载在微凝胶内的间充质干细胞基本保持其未分化的状态，而在组织培养板上的间充质干细胞则发生了向成脂方向的分化如图5b所示；PCR结果也显示成脂细胞分化相关RNA被抑制表达，而相应的干性RNA则表达较高。
步骤12，将负载间充质干细胞的PCB-PEG微凝胶培养在完全培养基中，培养1天后，将成骨分化培养基加入其中进行分化培养，以在组织培养板上的间充质干细胞为对照组。分化21天后通过茜素红染色分析和RT-PCR分析测定其分化结果。如图6a所示，结果发现负载在微凝胶内的间充质干细胞基本保持其未分化的状态，而在组织培养板上的间充质干细胞则发生了向成骨方向的分化如图6b所示；PCR结果也显示成骨细胞分化相关RNA被抑制表达，而相应的干性RNA则表达较高。
步骤13，将负载间充质干细胞的PCB-PEG微凝胶培养在完全培养基中，培养1天后，将含有10μM的5-氮杂胞苷的成肌分化培养基加入其中进行分化培养，以在组织培养板上的间充质干细胞为对照组。分化21天后通过PCR分析测定其分化结果。如图7所示，结果发现负载在微凝胶内的间充质干细胞基本保持其未分化的状态，而在组织培养板上的间充质干细胞则发生了向成肌方向的分化。
实施例2
步骤1，按照图1的反应流程制备PCB-OAA。用天平称量4.9g 3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯，28mg偶氮二氰基戊酸，适量的水放入三口烧瓶中，再抽真空并充氮气多次，加热70℃开始反应，反应时间24h；
步骤2，反应完成后，将反应液降温到室温，加入8.4g碳酸氢钠中和溶液中的酸，将溶液冰水浴30min。再逐滴加入10ml丙烯酸酐，加入后室温反应24h，最终得到两性离子聚合物大分子单体溶液；
步骤3，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到两性离子聚合物大分子单体PCB-OAA；
步骤4，用天平将所制备的两性离子大分子单体PCB-OAA溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为4.5％；
步骤5，用天平称量适量巯基取代的聚乙二醇配置成浓度为2.5％的PBS溶液；
步骤6，将将PCB-OAA溶液和HS-PEG-SH溶液分别装载在注射器中，然后通过实验室微量注射泵将溶液引入到微流控芯片当中，作为非连续相；
步骤7，将矿物油中加入2％的司盘80，将油相装入注射器中，然后通过实验室微量注射泵将溶液引入到微流控芯片当中，作为连续相；
步骤8，将PCB-OAA溶液和HS-PEG-SH溶液均以1μL/min的速度在微通道中混合，连续相的速度设置为3μL/min，然后在连续相的剪切作用下形成单分散的液滴，并随着连续相从导出管流出微通道。PCB-OAA和HS-PEG-SH在液滴中反应，形成微凝胶，如图8所示。
实施例3
步骤1，用天平称量4.9g 3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯，28mg偶氮二氰基戊酸，适量的水放入三口烧瓶中，再抽真空并充氮气多次，加热70℃开始反应，反应时间24h；
步骤2，反应完成后，将反应液降温到室温，加入8.4g碳酸氢钠中和溶液中的酸，将溶液冰水浴30min。再逐滴加入10ml丙烯酸酐，加入后室温反应24h，最终得到两性离子聚合物大分子单体溶液；
步骤3，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到两性离子聚合物大分子单体PCB-OAA；
步骤4，用天平将所制备的两性离子大分子单体PCB-OAA溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为4.5％；
步骤5，用天平称量适量巯基取代的聚乙二醇配置成浓度为2.5％的PBS溶液；
步骤6，将将PCB-OAA溶液和HS-PEG-SH溶液分别装载在注射器中，然后通过实验室微量注射泵将溶液引入到微流控芯片当中，作为非连续相；
步骤7，将矿物油中加入2％的司盘80，将油相装入注射器中，然后通过实验室微量注射泵将溶液引入到微流控芯片当中，作为连续相；
步骤8，将少量的细胞提前混合在PCB-OAA溶液当中，从而获得负载细胞的微凝胶，如图9所示。以间充质干细胞为例，得到负载间充质干细胞的PCB-PEG微凝胶，PCB-PEG微凝胶能够保持其高存活率和干性。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.负载细胞的两性离子微凝胶，其特征在于：按照下述步骤进行：
步骤1，将单体3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯溶于水中，混合均匀后，再加入偶氮类自由基引发剂，在氮气保护氛围下，加热引发聚合反应，即得到两性离子聚合物反应溶液，其中，偶氮类引发剂采用偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐或者偶氮二氰基戊酸，3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯与偶氮类自由基引发剂的用量比例范围为(50-400)：1，聚合反应温度为50-90℃，聚合反应时间为10-36h；
步骤2，将步骤1制备得到的两性离子聚合物反应溶液的温度降低至室温20-25℃后，向上述反应溶液中加入碱的水溶液中和至pH为8-10后，将上述混合溶液置于冰水浴中，再向其中逐滴加入含有双键的酸类单体，反应即得到两性离子聚合物大分子单体溶液，其中，碱采用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或者碳酸氢钾，含有双键的酸类单体采用丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酐或者甲基丙烯酸酐，酸类单体的加入量为5-20ml，反应时间为10-36h；
步骤3，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析，将透析后的溶液冻干，即得到两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)，并将上述两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)和干细胞溶于PBS溶液中，形成两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液，其中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的质量百分数为1％-20％，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中细胞的质量百分数为0-1×109/ml，细胞的质量百分数不等于零，干细胞采用胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞或者胰腺干细胞；
步骤4，将步骤3制备得到的两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液分别装入不同的注射器中，然后通过实验室微量注射泵将上述两种溶液分别引入到微流控芯片当中，作为非连续相，其中，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液中二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的质量百分数为0.5％-10％；
步骤5，向矿物油中加入司盘80，混合均匀后将混有司盘80的矿物油引入到微流控芯片当中，作为连续相，其中，司盘80在混有司盘80的矿物油中的质量百分数为0.5％-5％；
步骤6，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液首先在微流控芯片的微通道中混合，然后在连续相即有司盘80的矿物油的剪切作用下形成单分散的液滴，并随着连续相从导出管流出微通道，其中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液的流速为0.1-20μL/min，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液的流速为0.1-20μL/min，混有司盘80的矿物油的流速为0.1-50μL/min；
步骤7，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)在液滴中反应，即得到负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)。
2.根据权利要求1所述的负载细胞的两性离子微凝胶，其特征在于：在步骤1中，偶氮类引发剂采用偶氮二氰基戊酸，3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯与偶氮类自由基引发剂的用量比例范围为175:1，聚合反应温度为70℃，聚合反应时间为24h；在步骤2中，碱采用碳酸氢钠，含有双键的酸类单体采用丙烯酸酐，反应时间为24h。
3.根据权利要求1所述的负载细胞的两性离子微凝胶，其特征在于：在步骤3中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的质量百分数为2％-10％；两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中细胞的质量百分数为1×105-1×108/ml；在步骤4中，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液中二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的质量百分数为1％-5％，优选2％-4％。
4.根据权利要求1所述的负载细胞的两性离子微凝胶，其特征在于：在步骤5中，司盘80在混有司盘80的矿物油中的质量百分数为1-3％；在步骤6中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液的流速为0.5-5μL/min，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液的流速为0.5-5μL/min，混有司盘80的矿物油的流速为0.3-10μL/min。
5.如权利要求1-4任一所述的负载细胞的两性离子微凝胶的制备方法，其特征在于：按照下述步骤进行：
步骤1，将单体3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯溶于水中，混合均匀后，再加入偶氮类自由基引发剂，在氮气保护氛围下，加热引发聚合反应，即得到两性离子聚合物反应溶液，其中，偶氮类引发剂采用偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐或者偶氮二氰基戊酸，3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯与偶氮类自由基引发剂的用量比例范围为(50-400)：1，聚合反应温度为50-90℃，聚合反应时间为10-36h；
步骤2，将步骤1制备得到的两性离子聚合物反应溶液的温度降低至室温20-25℃后，向上述反应溶液中加入碱的水溶液中和至pH为8-10后，将上述混合溶液置于冰水浴中，再向其中逐滴加入含有双键的酸类单体，反应即得到两性离子聚合物大分子单体溶液，其中，碱采用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或者碳酸氢钾，含有双键的酸类单体采用丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酐或者甲基丙烯酸酐，酸类单体的加入量为5-20ml，反应时间为10-36h；
步骤3，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析，将透析后的溶液冻干，即得到两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)，并将上述两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)和干细胞溶于PBS溶液中，形成两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液，其中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的质量百分数为1％-20％，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中细胞的质量百分数为0-1×109/ml，细胞的质量百分数不等于零，干细胞采用胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞或者胰腺干细胞；
步骤4，将步骤3制备得到的两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液分别装入不同的注射器中，然后通过实验室微量注射泵将上述两种溶液分别引入到微流控芯片当中，作为非连续相，其中，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液中二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的质量百分数为0.5％-10％；
步骤5，向矿物油中加入司盘80，混合均匀后将混有司盘80的矿物油引入到微流控芯片当中，作为连续相，其中，司盘80在混有司盘80的矿物油中的质量百分数为0.5％-5％；
步骤6，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液首先在微流控芯片的微通道中混合，然后在连续相即有司盘80的矿物油的剪切作用下形成单分散的液滴，并随着连续相从导出管流出微通道，其中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液的流速为0.1-20μL/min，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液的流速为0.1-20μL/min，混有司盘80的矿物油的流速为0.1-50μL/min；
步骤7，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)和二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)在液滴中反应，即得到负载细胞的两性离子微凝胶(PCB-PEG)。
6.根据权利要求5所述的负载细胞的两性离子微凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤1中，偶氮类引发剂采用偶氮二氰基戊酸，3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯与偶氮类自由基引发剂的用量比例范围为175:1，聚合反应温度为70℃，聚合反应时间为24h；在步骤2中，碱采用碳酸氢钠，含有双键的酸类单体采用丙烯酸酐，反应时间为24h。
7.根据权利要求5所述的负载细胞的两性离子微凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤3中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的质量百分数为2％-10％，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液中细胞的质量百分数为1×105-1×108/ml；在步骤4中，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液中二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的质量百分数为1％-5％，优选2％-4％。
8.根据权利要求5所述的负载细胞的两性离子微凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤5中，司盘80在混有司盘80的矿物油中的质量百分数为1-3％。
9.根据权利要求5所述的负载细胞的两性离子微凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤6中，两性离子聚合物大分子单体(PCB-OAA)的PBS溶液的流速为0.5-5μL/min，二巯基聚乙二醇(HS-PEG-SH)的PBS溶液的流速为0.5-5μL/min，混有司盘80的矿物油的流速为0.3-10μL/min。
10.如权利要求1-4任一所述的负载细胞的两性离子微凝胶在干细胞培养、填充材料和组织工程中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220729 |