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CN114787199A - 硫醇修饰的透明质酸和包含交联透明质酸的水凝胶 - Google Patents

硫醇修饰的透明质酸和包含交联透明质酸的水凝胶 Download PDF

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Abstract

硫醇修饰的透明质酸，其中所述硫醇修饰的透明质酸包含在透明质酸侧链中的多个具有硫醇基团的修饰基团，其中所述修饰基团包含具有碱性侧链的氨基酸残基和缀合的末端天然存在的氨基‑硫醇，以及包含交联聚合物的无菌水凝胶组合物，其中所述交联聚合物是所述硫醇修饰的透明质酸的氧化产物，以及所述组合物的用途。

Description

硫醇修饰的透明质酸和包含交联透明质酸的水凝胶
技术领域
本发明涉及硫醇修饰的透明质酸，包含交联聚合物的无菌水凝胶组合物，其中所述交联聚合物是所述硫醇修饰的透明质酸的氧化产物，以及其用途及其制备方法。
技术领域
透明质酸(Hyaluronan)，简称HA，也称为透明质酸(hyaluronic acid)及其盐(例如透明质酸钠)，是一种天然存在的阴离子非硫酸化糖胺聚糖，具有由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成的重复二糖。
高分子量透明质酸天然存在于皮肤中，并以其粘弹性和非常高的吸水倾向而闻名。其特性在很大程度上有助于皮肤的弹性。鉴于其特性及其生物相容性、耐受性和无毒性的品质，因此10多年来，这种化合物已在医学和美容领域的许多应用中发挥了优势，特别是美容手术。例如，将透明质酸用于通过直接注射到所考虑区域的真皮中来填充皱纹(用作真皮填充剂)。
生物发酵来源的高度纯化的未修饰的HA具有完美的生物相容性，并且与内源性透明质酸相同。然而，HA虽然具有与人体组织高度相容、具有高亲水性和表现出强保湿功能的优点，但其生物力学特性不足。当HA注射到皮肤组织中时，被人体组织中存在的透明质酸酶(酶降解)和自由基(化学降解)二者在体内快速降解。
已经提出了许多解决方案来减缓HA的体内降解并改变其化学、物理和生物学特性，额外地提供制剂对储存期间的降解、对热且因此对灭菌的增强的抵抗力。
这些方法通常涉及HA的化学修饰，包括例如通过化学、酶促或光化学方式使HA交联。这些交联的透明质酸凝胶可以通过各种制备方法获得。通常，这些方法需要两个主要步骤，第一步包括将透明质酸水合以将其转化为水溶液，第二步旨在在能够诱导其交联的试剂(也称为“交联剂”)的存在下使所述水溶液的HA分子交联。交联剂的实例包括甲醛、二乙烯基砜、双碳二亚胺和环氧化物。
对于真皮填充剂的生产，交联剂最常选自环氧化物，例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、醛或聚乙烯基砜，例如二乙烯基砜(DVS)，因此在本质上是合成的。
不幸的是，化学修饰会导致副作用和异物反应，而这在利用具有天然的低免疫原性和无毒性的未经修饰的HA时未观察到。在大多数市售的HA软组织填充剂中，使用BDDE作为交联剂。由于BDDE中存在的环氧基团的反应性，真皮填充剂中残余的未反应的BDDE可能具有遗传毒性作用。因此，需要将真皮填充剂中的BDDE保持在痕量(<百万分之2份)，因此在生产过程中需要昂贵的额外纯化和测试程序。尽管BDDE交联的填充剂的安全性得到了长期临床经验的支持(De Boulle,Glogau等人,2013,Areview of the metabolism of1,4-butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acid dermal fillers,Dermatol Surg(39):1758-1766)，BDDE仍可能引起一些安全问题(Choi,Yoo等人,2015,Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels bycrosslinking agents,J Biomed Mater Res Part A(103A):3072-3080)。
由于与BDDE相关的遗传毒性风险，可在患者一生中施用的真皮填充剂产品(例如
Figure BDA0003683782420000021
)的年剂量被限制为每年20mL。市售真皮填充剂产品
Figure BDA0003683782420000022
的施用被限制为每次施用6mL。类似的限制适用于包含DVS交联透明质酸的真皮填充剂。
化学修饰的另一个问题是需要苛刻的反应条件，例如碱性pH值和高温度(高于50℃)，这是透明质酸在交联反应期间为了实现期望的交联度需要经受的。众所周知，HA的分子量会因暴露于酸性(pH低于4)或碱性pH(pH高于10)时的水解降解而降低。此外，透明质酸在高于40℃的较高温度下降解(Troncoso等人,2016,A kinetic study of thedegradation of Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide,学生论文,可通过http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf在线访问；Stern等人,2007.The many ways to cleave hyaluronan,BiotechnologyAdvances(25):537-557；Tokita和Okamoto,1996,Degradation of hyaluronic acid–kinetic study and thermodynamics,Eur.Polym.J.(32):1011-1014)。进一步已知，分子量小于约200kDa的低分子量透明质酸片段具有促炎作用(Naor,2016,Editorial:Interaction Between Hyaluronic Acid and Its Receptors(CD44,RHAMM)Regulatesthe Activity of Inflammation and Cancer,Frontiers in immunology 7:39；Monslow等人,2015,Hyaluronan–a functional and structural sweet spot in the tissuemicroenvironment,Frontiers in immunology 6:231)。
Shu等人(Biomacromolecules 3,1304-1311,2002)首次描述了二硫键交联的透明质酸水凝胶。
硫醇修饰的透明质酸(HA-SH)的二硫键交联衍生物可以通过自交联机制获得。在硫醇基团之间形成二硫键(HA-S-S-HA)后，就会建立交联透明质酸聚合物的网络。形成二硫键的硫醇基团可以连接共同的HA主链分子或相邻的HA分子的侧基，即交联可以分别是分子内的或分子间的。由游离硫醇基团形成二硫键是一种氧化反应，其可以自发发生，例如由于无处不在的氧气，或在添加氧化剂后发生。
WO 2004/037164进一步研究了用3,3'-二硫代双(丙酸二酰肼)(DTP)或4,4'-二硫代双(丁酸二酰肼)(DTB)修饰的透明质酸。评估了通过二硫化物形成和使用硫醇反应剂例如聚乙二醇二(甲基)丙烯酸进行交联获得的凝胶在组织工程中的潜力，即作为用于移植的细胞生长和培养的支架。在WO2005/056608中，使用相同的技术来交联硫醇化酰肼修饰的羧甲基透明质酸以获得大分子细胞支架。Serban等人描述了2-乙硫醚透明质酸衍生物的合成(Biomaterials 29,1388-1399；2008)，然而它不适合通过所研究的交联剂进行交联。EP 2103 631描述了其中通过酰肼偶联方法引入硫醇基团的硫醇修饰的大分子，包括透明质酸，及其交联产物。交联产物用交联剂或通过二硫化物形成获得。
Kafedjiiski等人(Int J Pharm 343,48-58；2007)也描述了硫醇化透明质酸的合成及其在药物递送、伤口愈合和组织修复中的潜在用途。CN101367884A公开了包含游离硫醇基团和二硫化物基团二者的HA-半胱胺缀合物的合成。EP 2 614 828描述了具有低修饰度的硫醇修饰的生物相容性聚合物衍生物及其交联材料。WO 2008/077172描述了用于组织增强的硫醇化透明质酸。在一个实例中，WO 2008/077172描述了无菌水凝胶制剂的皮内施用，该制剂具有2g含硫醇基团的透明质酸(硫醇修饰的透明质酸)，其中由含硫醇基团的透明质酸形成的贮库可以在两周中通过凭感觉地检测到；然而，该文件未提及该实例中使用的硫醇修饰的透明质酸的具体特征。
本发明的发明人进一步研究了自交联硫醇修饰的透明质酸水凝胶作为软组织填充剂的潜力。对于软组织填充剂，希望植入的水凝胶在延长的时间段内保持在植入部位，因此由于缓慢降解而达到可持续的效果。
然而，与利用外部交联剂的真皮填充剂相比，基于自交联硫醇修饰的透明质酸的水凝胶组合物的初步体内研究显示出植入后更快的降解行为。此外，关于优化特定施用的停留时间，期望获得具有不同流变特性的水凝胶。因此，本发明的一个目的是提供用于包含二硫键交联的聚合物的组合物的硫醇修饰的透明质酸(HA-SH)，其允许优化组合物的特性，尤其是关于作为软组织填充剂的应用。
发明内容
本发明提供了硫醇修饰的透明质酸，其中所述硫醇修饰的透明质酸在透明质酸侧链中包含多个具有硫醇基团的修饰基团，并且其中所述修饰基团包含具有碱性侧链的氨基酸残基和缀合的末端天然存在的氨基-硫醇，优选地所述氨基-硫醇选自由半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸或高半胱氨酸的酯组成的组。
在另一个方面，本发明提供了包含交联聚合物的无菌水凝胶组合物，其中所述交联聚合物是根据本发明的硫醇修饰的透明质酸的氧化产物。根据本发明的无菌水凝胶组合物是基于具有硫醇基团的修饰的透明质酸(HA-SH)的水凝胶，其中透明质酸通过修饰的透明质酸的硫醇基团之间的二硫键交联(硫醇修饰的透明质酸的氧化产物)。氧化产物是由未修饰的透明质酸部分和修饰的透明质酸部分组成的共聚物，该修饰的透明质酸通过二硫键连接。
硫醇修饰的透明质酸的修饰基团包含以下或由以下组成：衍生自具有碱性侧链的氨基酸、优选蛋白质氨基酸的残基，以及天然存在的氨基-硫醇，其在末端位置缀合，使得硫醇基团保持游离。因此，硫醇修饰的透明质酸和组合物可以有利地由高度生物相容性且无毒的组分组成，例如硫醇修饰的透明质酸HA-LYSC，其中修饰基团由赖氨酸和半胱胺组成。
水凝胶不含任何额外的外部双官能交联剂，例如二乙烯基砜。使用多个具有游离硫醇基团的修饰基团，硫醇修饰的透明质酸可以通过氧化交联，并且表明根据本发明的硫醇修饰的透明质酸允许制备包含二硫键交联的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶组合物(实施例7至10)。根据本发明的组合物在软组织中的停留时间和生物相容性方面显示出良好的体内性能(实施例12和13)。
具有碱性侧链的氨基酸是弱碱性的，并且其侧链可以带正电荷。因此，新硫醇修饰的透明质酸(HA-SH)包含碱性侧链，以及因此除了远端硫醇基团外的正离子化特征。发明人发现根据本发明的硫醇修饰的透明质酸以及包含二硫键交联的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶组合物具有许多令人惊讶的流变特性。
例如，本发明人发现，与用在其侧链中包含中性或带负电荷的修饰基团的硫醇修饰的透明质酸制备的溶液相比，包含带正电荷的赖氨酸修饰基团的硫醇修饰的透明质酸的溶液显示出显著降低的粘度(参见实施例14，表7)。不希望受理论束缚，假设观察到的流变效应是由通过带正电荷的赖氨酸残基使透明质酸的刚性氢键网络扭曲引起的。包含带正电荷的赖氨酸修饰基团的硫醇修饰的透明质酸水溶液的较低粘度进而提供了获得更高浓度溶液的可能性，这导致交联的水凝胶具有更自然、更低的弹性模量和可接受的挤出力。
在比较基于具有相似修饰度的交联硫醇修饰的透明质酸的水凝胶的体内停留时间时，发现包含较高浓度的交联硫醇修饰的透明质酸的水凝胶的平均相对贮库体积下降较慢(实施例12，表6)。然而，由于包含常规硫醇修饰的透明质酸的组合物的非常高的弹性模量(超过1000m Pa)，因此进一步增加浓度以增加植入物的停留时间存在限制。因此，对于常规硫醇修饰的透明质酸聚合物，交联组合物中的最大浓度限制似乎在20mg/mL的范围内。
除了硫醇修饰的透明质酸的浓度之外，决定真皮填充剂停留时间的第二个关键参数可以是其弹性模量G’(Guarise等人,2019,HA-based dermal filler:downstreamprocess comparison,impurity quantitation by validated HPLC-MS analysis,and invivo residence time study,Journal of Applied Biomaterials&FunctionalMaterials,173:1-9)。具有不自然的高弹性模量的高度交联的透明质酸填充剂倾向于更容易引发不良反应(Keizers等人,2018,A high crosslinking grade of hyaluronic acidfound in a dermal filler causing adverse effects,Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis,159:173-178)。
在将包含交联的透明质酸-赖氨酰-半胱胺聚合物的无菌水凝胶组合物与包含相同浓度的常规硫醇修饰的透明质酸(透明质酸-半胱胺)的无菌水凝胶组合物进行比较时，包含透明质酸-赖氨酰-半胱胺聚合物的组合物具有显著较低的弹性模量G’(参见实施例11，表5)。令人惊讶的是，这些组合物显示的体内降解速率与植入包含交联的常规硫醇修饰的透明质酸的组合物后观察到的降解速率相当(参见实施例12，表6)。
在使用具有包含赖氨酸的修饰基团的硫醇修饰的透明质酸时，可以产生包含甚至更高浓度的硫醇修饰的透明质酸衍生物的组合物，这最终允许在每次植入中施用增加量的交联的硫醇修饰的透明质酸以进一步延长体内停留时间。
在一个实施方案中，硫醇修饰的透明质酸显示低于300mPa*s的动态粘度，其中动态粘度为基于浓度为按重量计1.2％的硫醇修饰的透明质酸的水溶液，优选酸性溶液，在25℃的温度和5/s的恒定剪切速率下使用锥板系统测定，例如使用锥板流变仪如Anton PaarMCR102流变仪。优选地，如上定义的动态粘度低于250mPa*s，更优选低于200mPa*s。
在硫醇修饰的透明质酸的优选实施方案中，修饰基团通过羧酰胺与透明质酸连接，其中羧酰胺的酰基基团来源于透明质酸中葡萄糖醛酸部分的羧基基团。换言之，修饰基团与透明质酸的羧基基团缀合形成羧酰胺。优选地，羧酰胺与氨基酸的氨基基团一起形成，该氨基基团可以是其羧基基团的α位的氨基基团或氨基酸残基的碱性侧链中的氨基基团。
修饰基团包含缀合的末端天然存在的氨基-硫醇，即具有氨基基团和(游离)硫醇基团的部分。在优选的实施方案中，氨基-硫醇选自由半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸或高半胱氨酸的酯组成的组。
优选地氨基-硫醇的氨基基团与氨基酸的羧基基团缀合以形成羧酰胺。
因此，在一些实施方案中，修饰基团的组分通过酰胺键连接并且修饰基团通过酰胺键与透明质酸连接。优选酰胺键，因为它们具有稳定且生物相容的性质。
具有碱性侧链的氨基酸残基优选地衍生自α氨基酸，例如蛋白质氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，最优选地，其衍生自赖氨酸。
例如，修饰基团包含基于赖氨酸的氨基酸残基和氨基-硫醇半胱胺，其中半胱胺的氨基基团与赖氨酸的羧基基团缀合。在本文中具有这种修饰基团的相应硫醇修饰的透明质酸被称为HA-LYSC。硫醇修饰的透明质酸HA-LYSC具有根据式(I)或式(II)或两者的亚结构
Figure BDA0003683782420000061
在优选的实施方案中，硫醇修饰的透明质酸具有根据式(II)的亚结构。本文研究的某些硫醇修饰的透明质酸中赖氨酸的结合方式的分析表明，赖氨酸通过胺在α-CH处结合(实施例16)。
在另一个优选的实施方案中，硫醇修饰的透明质酸具有大于约80μmol/克聚合物、优选大于约105μmol/克聚合物、更优选大于约120μmol/克聚合物的硫醇基团修饰度，并且硫醇修饰的透明质酸具有小于约320μmol/克聚合物，优选小于约290μmol/克聚合物，更优选小于250μmol/克聚合物的硫醇基团修饰度。
发明人进一步发现，透明质酸的硫醇基团修饰度是影响无菌水凝胶体内停留时间的另一个重要特征。
“硫醇基团修饰度”表示每克(g)硫醇修饰的透明质酸中硫醇基团的初始量(通常以μmol给出)并且可以缩写为DoM。硫醇基团的该量是硫醇修饰的透明质酸原料的特征，并且表示在组合物的生产过程中可用于交联的硫醇基团的量。硫醇基团或部分也可称为巯基或巯氢基。基于透明质酸-半胱胺的各种实例，发明人确定了在约80μmol/g聚合物至约320μmol/g聚合物之间的修饰度的最佳范围。在一方面，大于80μmol/g聚合物的修饰度对于生产植入后具有超过12周的增容效果的组合物是必要的。在另一方面，使用具有更高修饰度的硫醇修饰的透明质酸不会导致所生产的水凝胶的增容效果，即贮库体积的增加(例如，≥335μmol/g聚合物，数据未示出)。
除了修饰度之外，显著影响水凝胶的流变学和体内特性的参数是透明质酸链的分子量分布、交联度和交联的硫醇修饰的透明质酸的浓度。
优选地，硫醇修饰的透明质酸具有至少约400kDa、优选至少约500kDa、更优选至少约600kDa，例如约700kDa的平均分子量(MMW)。
另一方面，硫醇修饰的透明质酸优选具有至多约4,500kDa的平均分子量(MMW)，特别是至多4,000kDa至4,200kDa范围内的平均分子量。发现具有甚至更高分子量规格的透明质酸原料对于制备适于以工业规模制备无菌水凝胶组合物和/或作为真皮填充剂的硫醇修饰的透明质酸所需的数量和质量是不可用的。更优选地，硫醇修饰的透明质酸具有至多3,500kDa或至多2,000kDa的平均分子量。例如，硫醇修饰的透明质酸的平均分子量可以在约700kDa至约2,000kDa的范围内。
高交联度(通过硫醇基团的氧化)有利于获得具有适用于增容软组织填充剂的弹性特性的水凝胶组合物。为了使水凝胶组合物具有可再现和稳定的特性，例如流变特性，硫醇修饰的透明质酸的交联(即二硫键的形成)需在水凝胶进一步加工(即，经历进一步的加工步骤，如筛分、均质化、填充到注射器中和灭菌)之前基本上完成。然而，由于诸如空间位阻等因素，某些少量的硫醇基团可能无法用于二硫键形成。
根据本发明的无菌水凝胶组合物具有相对于硫醇修饰的透明质酸的修饰度小于20％的残余硫醇含量。这对应于硫醇修饰的透明质酸的超过80％的可用硫醇基团在水凝胶生产过程中被氧化。交联聚合物中未交联硫醇基团的分数可以通过以μmol/g聚合物表示的残余硫醇含量来确定。高且均匀的氧化速率和因此无菌水凝胶组合物中可再现的低残余硫醇含量可通过在生产方法的氧化步骤中使用氧化剂(例如，过氧化氢)来获得。
在根据本发明的水凝胶组合物中，相对于硫醇修饰的透明质酸的修饰度，优选地残余硫醇含量小于15％。
优选的浓度被确定为约4mg/mL至约50mg/mL。一方面，硫醇修饰的透明质酸可以以至多50mg/mL、优选至多35mg/mL、更优选至多25mg/mL、特别是至多18mg/mL的浓度包含在组合物中。另一方面，硫醇修饰的透明质酸可以以至少4mg/ml、更优选至少5mg/ml、更优选至少7mg/ml的浓度包含在组合物中。
优选地，水凝胶组合物包含浓度为约7mg/mL至约35mg/mL，更优选约13mg/mL至约25mg/mL，例如18mg/mL或22mg/mL的硫醇修饰的透明质酸的氧化产物。
以mg/mL为单位的硫醇修饰的透明质酸的浓度以相对于无菌水凝胶组合物的体积的重量给出。浓度优选是指盐(例如交联的硫醇修饰的透明质酸的钠盐)的浓度。因此，提供等量的硫醇修饰的透明质酸用于制备。更高的浓度被认为是不合适的，因为它们导致水凝胶组合物具有高粘度而没有可接受的可注射性。然而，由于根据本发明的硫醇修饰的透明质酸的低粘度，较高的浓度是可能的，使得组合物可以包含高达50mg/mL的硫醇修饰的透明质酸。发现包含浓度高达35mg/mL的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶显示出对于真皮注射可接受的挤出力。4mg/mL或更低的浓度被认为是不合适的，因为对于这样的水凝胶组合物观察到低弹性模量G’，导致较快的体内降解。在约5mg/mL至约25mg/mL的范围内，例如7或18mg/mL，观察到良好的流变特性。
在另一个方面，本发明提供了根据本发明的组合物用于作为药物使用，特别是用于在治疗和预防软组织病症中使用。此外，本发明涉及根据本发明的组合物的美容用途。这样的用途(治疗或美容)可指根据本发明的组合物作为软组织填充剂或用于组织增强的用途。这样的用途优选地包括例如通过注射或植入施用于人类，而适用性不限于人类物种。
在另一个方面，本发明涉及一种方法，其中该方法包括在特定的软组织部位引入根据本发明的组合物，例如通过注射器注射。该方法涉及该组合物作为软组织填充剂或用于治疗目的以及美容目的的组织增强的用途。
在一个实施方案中，根据这些方面的用途或方法包括通过从注射器皮内、骨膜上或皮下注射到人类而将水凝胶组合物引入到组织部位。
具体实施方式
“硫醇修饰的透明质酸”(HA-SH)是透明质酸(HA)的含硫醇基团的衍生物。根据本发明，硫醇修饰的透明质酸包含多个与透明质酸连接的包括碱性基团的修饰基团。其可以通过已知的合成方法从可具有不同分子量(或分子量范围)的透明质酸开始而获得。在科学和专利文献中可以找到许多用含硫醇基团的修饰基团进行HA修饰的实例：
Griesser等人综述了硫醇化透明质酸聚合物(Griesser等人,Polymers 10(2018)243)。Aeschlimann(EP 1 115 433B1)描述了HA的官能化方法，该方法不损害HA的分子量，并进一步提供体内耐受性良好且可生物降解的HA分子。该方法用于产生具有用于交联的不同末端官能团(例如硫醇基团)的HA。这些侧链通过使用活性酯中间体将含伯(受保护)硫醇基团的胺或含二硫键的二氨基配体或二酰肼配体与葡糖醛酸部分的羧基基团进行碳二亚胺介导的偶联而引入到HA。然后将具有二硫键的中间产物还原，然后通过除去保护基团使具有受保护的硫醇基团的中间产物去保护。Bulpitt等人(US 6,884,788)等人描述了另一种方法，其包括使HA羧基基团与含二硫键的碳二亚胺(例如2,2'-二硫代双(N-乙基-(N'-乙基碳二亚胺))直接反应，然后用还原剂还原二硫键。WO 2008/008857 A2公开了2-乙硫醚衍生的透明质酸的合成方法。EP 0 587 715公开了如何经由如下合成水不溶性阴离子多糖：将至少一种聚阴离子多糖(例如HA)溶解在水性混合物中；用活化剂(例如二亚胺，例如EDC或ETC或BOP)活化聚阴离子多糖；用修饰化合物(例如1-羟基-苯并三唑水合物(HOBt)或1-羟基-苯并三唑一水合物)修饰活化的聚阴离子多糖；以及使活化的聚阴离子多糖与合适的亲核试剂(例如氨基硫醇)反应以形成期望的不溶性组合物。发明人指出，聚阴离子多糖的BOP活化的一个主要优点是聚阴离子多糖的分子量在与亲核试剂偶联后不降低。EP 1 790665B1描述了水溶性修饰的透明质酸，其通过在非质子极性溶剂中使用BOP缩合剂通过酰胺键将取代基引入透明质酸的葡糖醛酸的羧基基团而产生。具有二硫键的二胺在列出的取代基中。Borke等人描述了用DMT-MM进行三嗪介导的酰胺化，以有效且可控地用半胱胺对透明质酸进行官能化，其中温和的反应条件和多糖链的最小降解被列为使用该组偶联剂与其它偶联剂(例如EDC介导的取代)相比的优点(Borke等人,Carbohydrate Polymers 116(2015)42–50)。Liang等人描述了在CDMT和NMM的存在下通过侧羧酸酯与胱胺的酰胺化反应将硫醇基团引入HA，然后与DTT进行还原反应(Liang等人Carbohydrate Polymers 132(2015)472–480)。Kafedjiiski等人描述了通过双催化体系——碳二亚胺/N羟基琥珀酰亚胺用l-半胱氨酸乙酯盐酸盐对HA进行硫醇修饰(Int J Pharm 343,48-58；2007)。在WO 2004/037164中，用3,3'-二硫代双(丙酸二酰肼)(DTP)或4,4'-二硫代双(丁酸二酰肼)(DTB)对透明质酸进行修饰。用还原剂如DTT还原后，得到相应的硫醇化HA衍生物HA-DTPH和HA-DTBH。EP 2103 63还描述了通过酰肼偶联方法通过HA的羧基基团引入带有硫醇基团的配体。合成了不同的硫醇化HA聚合物(HA-DGDTPDH、HA-DPDTPDH、HA-DSCDH)。
在根据本发明的硫醇修饰的透明质酸的制备过程中，修饰基团通过修饰剂引入。在优选的实施方案中，修饰剂与透明质酸中的葡萄糖醛酸部分的羧基基团反应，使得修饰基团通过羧酰胺键与透明质酸连接。因此，根据本发明的用于合成硫醇修饰的透明质酸的修饰剂优选地包含至少一个能够与透明质酸中的葡糖醛酸部分的羧基基团形成酰胺键的氨基基团，并且所述修饰剂包含硫醇基团。
优选地，修饰剂是氨基-硫醇的衍生物，例如半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸或高半胱氨酸的酯，其中N-末端(氨基)与氨基酸(例如氨基酸赖氨酸)的羧基基团偶联。这些修饰剂优选通过使用常规肽偶联试剂使N-保护的赖氨酸与半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸或高半胱氨酸的酯的酰胺化来合成，所述肽偶联试剂优选能够容易进行产物纯化的那些，例如通过在反应建立后通过水性萃取去除反应物和副产物(参见实施例15)。替代地，半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸或高半胱氨酸的酯与N-保护的赖氨酸的相应活性酯在有机溶剂例如琥珀酰亚胺酯中反应。在优选的实施方案中，硫醇修饰的透明质酸是透明质酸-赖氨酰-半胱胺，其中赖氨酸部分通过酰胺键与透明质酸连接。因此，合适的修饰剂可以是N-保护的双(赖氨酰)-胱胺。
通过酰胺键形成将氨基酸与透明质酸连接的偶联反应的区域选择性可以被控制，例如通过修饰剂的适当N-保护。如实施例16中所述，使用未保护的双(赖氨酰)-胱胺(实施例15A)实现与透明质酸的区域选择性偶联。显然，酰胺偶联期间的反应条件(例如水性体系的pH控制)保证反应的区域选择性。在实施例15B中，描述了双(ε-叠氮基-L-赖氨酰)-胱胺二盐酸盐的制备，该修饰剂具有掩蔽ε-氨基基团的叠氮保护基团，使得仅游离的α-氨基基团在酰胺化条件下是反应性的。随后，通过应用过量的还原剂，可以在二硫键还原的同时对被掩蔽的氨基基团进行去保护。替代地，通过合成双(α-叠氮基-L-赖氨酰)-胱胺二盐酸盐可实现ε-氨基基团的区域选择性偶联，其可以通过与所述方案类似用市售N-ε-叔-丁氧羰基-α-叠氮基-L-赖氨酸与胱胺的酰化来制备。
根据本发明的硫醇修饰的透明质酸以及水凝胶组合物的性质受到硫醇修饰的透明质酸的“修饰度”的显著影响。确定修饰度的既定方法包括Ellman方法或测量2,2’-二硫代联吡啶与含硫醇试剂反应时发色硫酮的释放(参见实施例1)。本领域技术人员还将知道产生相似值的替代方法。在本文中，修饰度以μmol硫醇基团/克聚合物给出。替代地，修饰度可表示为百分比，其中修饰的重复单元的量除以聚合物中HA重复单元(D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺)的总量。考虑到HA重复单元的分子量为400g/mol，可以将μmol硫醇基团/克聚合物的修饰度换算成百分比。在这种转化中，由修饰引入的分子量变化通常被忽略。
如本文所用，术语“无菌”根据本领域进行理解，规定了符合美容或药品定义的微生物标准的组合物，例如在美国药典(USP)、欧洲药典(Ph.Eur.)或其它国家标准中。传统上，透明质酸凝胶在装入注射器后进行灭菌。使用高压灭菌器进行湿热灭菌是标准方法之一，其包括将HA凝胶置于121℃的高压饱和蒸汽中约15-20分钟。较短时间(例如，约1分钟至5分钟)和较高温度(例如，约130℃至135℃)的高压灭菌可以使得更好地保持凝胶中HA分子的分子量(参见M.L.Bernuzzi,A.Giori,“An innovative way to thermally sterilizehyaluronic acid pre-filled syringes”,2016年白皮书，由https://www.fedegari.com/wp-content/uploads/2019/03/WP-Fedegari-Thermal-sterilization-PFS-with-Hyaluronic-Acidv-2.pdf,US 2016/0220729可获得)。其它高压灭菌参数的优化(例如确保产品的快速冷却)还可以有利地保持聚合物的分子量(http://www.steriflow.com/en/news/Sterilization-hyaluronic-acid)。
如本文所用，术语“水凝胶”理解为描述具有固体和流体(液体)特性二者的组合物。一方面，水凝胶可以是可注射的，即它表现出类似流体的行为。另一方面，水凝胶可能足够坚硬(或刚性)以维持某种形式，例如水凝胶可以以预制植入物、线或细丝的形式提供。因此，单独的术语水凝胶不以定量方式限制组合物的流变性质。
本发明还提供了一种用于生产根据本发明的水凝胶组合物的方法，包括以下步骤：
a)提供硫醇修饰的透明质酸的水溶液，其中
所述硫醇修饰的透明质酸包含在透明质酸侧链中的多个具有硫醇基团的修饰基团，其中所述修饰基团包含具有碱性侧链的氨基酸残基和缀合的末端天然存在的氨基-硫醇，
b)通过将先前获得的水溶液暴露于允许硫醇修饰的透明质酸形成二硫键交联的聚合物的条件来氧化所述硫醇修饰的透明质酸，其中或由此所述水溶液变为水凝胶，其中所述水凝胶具有相对于所述硫醇修饰的透明质酸的修饰度小于20％的残余硫醇含量，
任选地c)将选自生物相容性多糖的组的未修饰的聚合物添加到先前获得的水凝胶或先前获得的溶液中，
任选地d)筛分先前获得的水凝胶以获得具有特定粒度分布的水凝胶，
e)将先前获得的水凝胶填充到容器中，优选注射器中，并将填充的容器暴露于允许水凝胶灭菌的条件，
f)获得在容器中的包含交联聚合物的无菌水凝胶组合物。
在用于生产水凝胶的方法中，这些步骤可以以不同的顺序进行。特别是交联(氧化)、添加未修饰的聚合物和筛分的步骤可以以不同的顺序进行，而不会必然地影响水凝胶的质量。优选地，步骤以a)、c)、b)、d)、e)和f)的顺序进行，其中溶液的制备(步骤a)和未修饰的聚合物的添加(步骤c)可以同时进行并且任选地可以同时添加另外的组分(例如局部麻醉剂)。
二硫键的形成(交联)在生理pH值下在氧气(例如通过周围空气供应或溶解在水溶液中)的存在下自然发生。然而，优选添加氧化剂以确保步骤b)中的条件足以达到确保水凝胶具有相对于硫醇修饰的透明质酸的修饰度小于20％的残余硫醇含量的氧化程度。氧化剂的主动添加加速并完成二硫化物的形成，以获得期望的低残余硫醇含量。此外，事实证明，在步骤b)中添加氧化剂对于确保工业过程(即包括较大的总体积)中的可重复且均匀的结果特别相关。
因此，在优选实施方案中，在步骤b)中，将氧化剂添加到先前获得的水溶液中。
合适且公认的氧化剂是例如过氧化氢(或其它过氧化物)、脱氢抗坏血酸、二甲基亚砜和次氯酸(次氯酸钠)。在超压条件下，纯氧气或高氧气混合物可用于增加聚合物水溶液中可用作氧化剂的氧气浓度。优选的添加量取决于氧化剂和硫醇修饰的透明质酸中硫醇基团的量。示例性地，对于过氧化氢，在步骤b)中，硫醇修饰的透明质酸的游离硫醇基团与过氧化氢的摩尔比应优选为至多4:1；更优选至多2:1。
在水凝胶的情况下，水凝胶组合物的弹性模量G’通常用于表征其弹性特性，并表示剪切储能模量，如通过施加剪切力(例如通过旋转(锥)板)以流变仪测定的。用于确定弹性模量G’的标准方法是本领域已知的(Stocks D.,Sundaram H.,Michaels J.,DurraniM.J.,Wortzman M.S.,Nelson D.B.,Rheological Evaluation of the PhysicalProperties of Hyaluronic Acid Dermal Fillers,2011,Journal of Drugs inDermatology,10(9),974-980)。弹性模量G’用于表征凝胶的坚度(硬度)或柔软度。同时它也是凝胶抗变形能力的量度。因此，具有高G’值的真皮填充剂水凝胶有望在植入后提供更好的支撑和增容(Stocks等人,2011)。除了旋转板的温度和频率外，其它可变测试条件也会影响弹性模量G’的定量可比性。重复测试通常会导致平均值的约±10％的标准偏差，例如8％。在一些情况下，观察到在通过针或无针挤出提供水凝胶时，弹性模量变化高达20％。因此，建议与下文实施例4中概述的方案保持接近，以评估弹性模量G’。
在优选的实施方案中，该组合物还包含选自生物相容性多糖的组的未修饰的聚合物。优选地，未修饰的多糖是未修饰的透明质酸(HA)。未修饰的(非交联)或也称为游离透明质酸可以补充水凝胶组合物。未修饰的HA通常作为润滑剂添加到软组织填充剂中，以通过降低通过针或套管注射产品所需的挤出力来确保良好的可注射性。优选地，用于生产组合物的游离透明质酸原料具有约500kDa至约3,500kDa范围内的分子量。然而，由于不稳定的透明质酸的快速降解，本领域技术人员将理解组合物作为软组织填充剂的体内性能主要受交联聚合物和潜在硫醇修饰的透明质酸的性质驱动。优选地，未修饰多糖以低于交联聚合物的浓度包含在内。示例性地，未修饰透明质酸以3mg/mL至7mg/mL、例如5mg/mL的浓度包含在组合物中，其中浓度优选是指盐(例如透明质酸钠)的浓度。
水凝胶组合物可以包含局部麻醉剂和/或一种或多种选自多种其它组分的组分，例如生长因子、维生素、多元醇、碱金属卤化物、矿物质、抗氧化剂、氨基酸、辅酶、陶瓷颗粒(例如羟基磷灰石钙颗粒)、聚合物颗粒、聚合物(例如聚乙二醇、糖胺聚糖、润滑素、多糖及其衍生物)、蛋白质(例如弹性蛋白、胶原蛋白、角蛋白、丝素蛋白)、抗脂肪团剂、抗疤痕剂、抗炎剂、抗刺激剂、血管收缩剂、抗出血剂(例如止血剂和抗纤维蛋白溶解剂)、张力剂、抗痤疮剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、消炎剂、抗风湿剂、抗病毒剂、抗感染剂、防腐剂、化学治疗剂、细胞生长抑制剂、抗过敏剂、抗静脉曲张剂、镇痛剂、抗生素、抗真菌剂、解痉剂、抗组胺剂、痔疮治疗剂、皮肤治疗剂和保湿剂。
鉴于其减轻注射时疼痛的能力，向水凝胶组合物中添加局部麻醉剂是特别理想的。优选地，麻醉剂是利多卡因，例如酸加成盐的形式，例如盐酸利多卡因。
在用于生产水凝胶的方法中，局部麻醉剂和/或一种或多种组分可以在不同的生产步骤中添加，即在一个实施方案中，局部麻醉剂和/或一种或多种组分在任选的步骤c)期间添加或在另一个实施方案中，独立于添加未修饰的聚合物，将局部麻醉剂和/或一种或多种组分例如添加到步骤a)期间的溶液中或添加到步骤c)或d)中获得的水凝胶中。在优选的实施方案中，在步骤a)期间或在步骤c)期间添加麻醉剂，例如盐酸利多卡因。在实施方案中，其中步骤c)在步骤b)之前，即其中在交联之前添加未修饰的透明质酸，优选在交联步骤之前还包括局部麻醉剂和/或一种或多种其它组分。
此外，应当理解，水凝胶组合物的主要成分是水。优选使用注射用水或纯化水来生产组合物。此外，将承认该组合物可被缓冲以表现出在6.7至7.8范围内的生理可接受的pH。合适的缓冲剂是本领域技术人员已知的并且包括例如磷酸盐缓冲剂。该组合物还表现出生理上可接受的同渗重摩(osmolality)，其类似于待治疗的受试者(例如人类)中细胞外液的正常的同渗重摩。因此，该组合物可以具有在250-350mOsmol/kg范围内的同渗重摩，并且可以包括用于调节同渗重摩的额外溶质，例如氯化钠、氯化钙和/或氯化钾。
水凝胶组合物是无菌的并且可以(在方法中)使用，其中水凝胶组合物是药物、美容或医疗装置。优选通过针或套管注射将水凝胶植入施用部位，优选软组织。替代地，可以通过外科手术植入水凝胶。一旦施用，水凝胶可称为(水凝胶)植入物或贮库。根据本发明的水凝胶组合物是生物相容的并且形成可吸收的(即生物可降解的)植入物。因此，根据本发明的水凝胶组合物可用作软组织填充剂。根据本发明的特征性水凝胶组合物在植入大鼠的软组织后确实显示出良好的耐受性和体内增容效果。这些研究支持水凝胶是用于多种应用的有价值的软组织填充剂。
将包含生物材料(例如稳定的透明质酸)的软组织填充剂递送到组织部位，在该处期望通过可注射的水凝胶组合物进行增强。涉及软组织填充的用途或方法的目的包括增强软(真皮)组织、纠正先天性异常、后天缺陷或美容缺陷。
水凝胶组合物的主要作用是纯物理的，因为它具有基于植入物的原始体积和膨胀的填充作用。因此，在不存在任何生理学或药理学相互作用的情况下，该用途可以归类为美容，并且该组合物可以被认为是美容或医疗装置。其中根据本发明的水凝胶组合物的用途可被视为美容的应用包括例如减少年龄痕迹，例如
-施用到外阴和阴道组织中以用于非手术女性生殖器年轻化目的
-施用到真皮、皮下或骨膜上应用。
示例性地，水凝胶组合物可以(在方法中)用于美容目的，例如用于填充皱纹，用于治疗皮肤缺陷，用于恢复面部或身体(例如乳房、耳垂)的失去的体积，用于减少蜂窝组织炎中的酒窝，用于治疗泪槽畸形，用于塑造面部或身体的轮廓(例如臀部增强、臀部增大、小腿增大)，用于阴茎增大(阴茎周长增大、龟头增大)。
在其它情况下，软组织的填充和增大可导致疾病的治疗或预防，即其中疾病的症状降低、减轻和/或防止(再次)发生。由软组织缺陷引起的疾病可以受益于应用水凝胶对周围组织的临时和/或局部结构填充、阻尼(damping)、支撑或增强。其中水凝胶组合物可用于治疗或预防的疾病包括例如
-跖骨痛，前脚掌脂肪垫的疼痛疾病，对于该用途，可以将根据本发明的水凝胶组合物施用在前脚掌软组织的脂肪垫处，
-尿失禁或大便失禁，对于该适应症，可以将根据本发明的水凝胶组合物施用在限定括约肌的组织处，
-外阴阴道萎缩(也称为更年期泌尿生殖系统综合症)，对于该适应症，可以将根据本发明的水凝胶组合物通过注射到阴道粘膜和前庭中和/或用于大阴唇增大而施用到外阴阴道区域，其中大阴唇的重建将确保两个大阴唇之间的紧密接触，以保护外阴的内部结构，
-声带损伤，
-静脉瓣膜功能不全，或
-面部脂肪萎缩、使人衰弱的疤痕或形态不对称或变形(先天性或由于例如胸部或面部的创伤或手术的结果)，对于该适应症，施用水凝胶用于重建目的。
在另一方面，本发明提供了用于注射的施用单元，其包括注射器，其中所述注射器填充有根据本发明的水凝胶组合物并且还包括至少一个皮下注射针。在优选的实施方案中，该单元包括至少两个皮下注射针，它们的内腔彼此不同。在施用单元的另一个实施方案中，至少一个皮下注射针被表征为以至少27G，优选27G至32G的量规(G)测量的内腔。
这样的施用单元对于使用和施用根据本发明的组合物具有实际优势，无论是用于美容目的还是医疗目的。
实施例
实施例1–修饰度的确定
用作制备水凝胶组合物的原材料的硫醇修饰的透明质酸(HA-SH)中的硫醇基团的定量基于采用2,2’-二硫代联吡啶(DTDP)的湿化学方法。与聚合物骨架共价结合的游离硫醇部分经受与DTDP的硫醇-二硫化物交换反应，而释放出一当量的发色硫酮。在经缓冲的酸性介质(pH＝4)中，所得硫酮的吸收可以在343nm处用光度计测量。
准确称取约420mg硫醇修饰的透明质酸，在连续磁力搅拌下溶解在30g 0.01N HCl中持续2-3小时，制成储备溶液。然后，准确称取约310mg储备溶液，并在eppendorf管中与4200mg乙酸盐缓冲液pH 4混合以制备样品溶液。由每个储备溶液制备三个样品溶液。准确称取25.0mg N-乙酰半胱氨酸并溶解在25.0mL乙酸盐缓冲液(pH 4)中。然后用乙酸盐缓冲液(pH 4)进一步稀释该溶液以制备校准曲线。乙酸盐缓冲液用于空白值。将500μL在乙酸盐缓冲液(pH 4)中含0.125mg/mL DTDP的溶液添加到500μL每个样品溶液(校准曲线、样品溶液和空白值)中。将溶液短暂均质化并在室温下孵育30分钟。最后，将每个样品(校准曲线、样品溶液和空白值)转移到微量比色皿中，并在分光光度计中相对于空白值在342nm处测量。
实施例2–残余硫醇含量的测定
为了测定水凝胶组合物中交联聚合物(即交联和产生组合物后的HA-SH聚合物)中的残余硫醇含量，使用了与上述类似的方法。
准确称取约50mg每种样品凝胶，并与1.3mL的在乙酸盐缓冲液(pH 4)中含0.125mg/mL DTDP的溶液混合。准确称取25.0mg N-乙酰半胱氨酸并溶解在200.0mL乙酸盐缓冲液(pH4)中。然后用乙酸盐缓冲液(pH 4)进一步稀释该溶液以制备校准曲线。乙酸盐缓冲液用于空白值。将500μL的在乙酸盐缓冲液(pH 4)中含0.125mg/mL DTDP的溶液添加到校准曲线和空白的500μL每个样品中。所有样品在室温下连续搅拌孵育120分钟。将所有样品离心后，用500μL乙酸盐缓冲液进一步稀释500μL每种上清液，并在分光光度计中相对于空白值在342nm处测量。
实施例3–生产水凝胶的方法
方法A
溶解：将硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因同时溶解在水溶液中。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：任选地将包含交联的硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法B
溶解：将硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因同时溶解在酸性水溶液中。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：任选地将包含交联的硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法C
溶解：将硫醇修饰的透明质酸溶解在水溶液中；制备在磷酸盐缓冲液(pH 6.8-7.6)中包含未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的单独溶液。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
均质化：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶和包含未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的溶液均质化并任选地挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法D
溶解：将硫醇修饰的透明质酸溶解在水溶液中；制备在磷酸盐缓冲液(pH 6.8-7.6)中包含未修饰的透明质酸)和盐酸利多卡因的单独溶液。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
均质化：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸的水凝胶和包含未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的溶液均质化并任选地挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法E
溶解：将硫醇修饰的透明质酸和盐酸利多卡因溶解在水溶液中；制备在磷酸盐缓冲液(pH6.8-7.6)中包含未修饰透明质酸的单独溶液。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
均质化：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶和包含未修饰的透明质酸的溶液均质化并任选地挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法F
溶解：将硫醇修饰的透明质酸和盐酸利多卡因溶解在酸性水溶液中；制备在磷酸盐缓冲液(pH 6.8-7.6)中包含未修饰透明质酸的单独溶液。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
均质化：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶和包含未修饰的透明质酸的溶液均质化并任选地挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法G
溶解：将硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因相继地溶解在水溶液中。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：任选地将包含交联的硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法H
溶解：将硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因相继地溶解在酸性水溶液中。
交联：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：任选地将包含交联的硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法I
溶解溶液1：将硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因同时溶解在水中。
交联溶液1：在将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
溶解溶液2：将硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和任选的盐酸利多卡因同时溶解在水中。
交联：将溶液2的pH调节至约6.8至7.6，然后立即将等量份的交联溶液1与溶液2混合。通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：任选地将包含交联的硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法J
溶解：将硫醇修饰的透明质酸和未修饰的透明质酸溶解在水溶液中；制备包含盐酸利多卡因的单独溶液。
交联：在将pH调节至约6.7至7.8后，通过氧气将硫醇基团氧化成二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和未修饰的透明质酸的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
均质化：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和未修饰的透明质酸的水凝胶和包含盐酸利多卡因的溶液均质化并任选地挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
方法K
溶解：将硫醇修饰的透明质酸和未修饰的透明质酸溶解在水溶液中；制备包含盐酸利多卡因的单独溶液。
交联：在将pH调节至约6.7至7.8后，通过氧化剂和氧气将硫醇基团氧化为二硫键而使硫醇修饰的透明质酸交联。
筛分：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和未修饰的透明质酸的水凝胶挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
均质化：将包含交联的硫醇修饰的透明质酸和未修饰的透明质酸的水凝胶和包含盐酸利多卡因的溶液均质化并任选地挤压通过具有限定网孔尺寸的滤板(一次或多次)。
灭菌：将水凝胶装入注射器后进行高压灭菌。
实施例4–弹性模量G’的测定
使用具有锥板系统的Anton Paar MCR 102流变仪对所有组合物进行振荡流变测量。将组合物通过27G针(或没有针，如果指明的话)注射转移到流变仪。在25℃的温度和1Hz的频率下以水凝胶的线性粘弹性区域内的恒定变形在频率测试期间获得弹性模量。
实施例5–分子量的测定
使用包含串联的高灵敏度检测器——光电二极管阵列UV、光散射(RALS和LALS)、折射率和粘度计的Viscotek TDAmax温控多检测器SEC系统进行测量。折射率检测器记录样品的浓度，形成相应的分布曲线。结合光散射检测器，测定分子量(MW)。对于尺寸排阻色谱(SEC)分析，样品用PBS稀释，得到0.1mg/mL的最终聚合物浓度。
在此测试期间发生的错误或波动通常会导致约10％的偏差。
实施例6–挤出力的测量
将27G或30G的针连接到包含水凝胶组合物的1mL注射器上。使用Mecmesin力测试系统和12mm/min的挤出速率测量挤出力。至少一式两份地进行测量。显示了所研究的水凝胶组合物的计算平均挤出力(EF)。
实施例7-包含7mg/mL交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的水凝胶组合物的制备和表征
根据方法B在不添加盐酸利多卡因的情况下制备包含0.7％交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺钠盐(HA-LYSC)和0.3％未修饰的透明质酸钠的水凝胶。简而言之，在室温下机械搅拌下将525mg HA-LYSC(干重，MMW 590kDa，修饰度149μmol/g聚合物)和225mg透明质酸钠(干重，MMW 2.4MDa)溶解在66.2g 0.01M HCl(包含540mg NaCl)中约3小时。向62.33g该溶液中添加包含0.018％H2O2的6.925ml 100mM磷酸盐缓冲液pH 11.74，从而将溶液的pH调节至约pH 7.2。将混合物在5℃下放置66小时以进行交联，然后挤压通过200μm筛，填充到1mL玻璃注射器中并通过高压灭菌器灭菌。无菌水凝胶具有约7.1的pH和309mOsm/kg的同渗重摩。
修饰度(DoM)、MMW、残余硫醇含量、弹性模量G’和挤出力如上所述测定，并总结在表1中。为了测量挤出力，将30G针连接到注射器上。为了测定弹性模量G’，将水凝胶直接从注射器(未连接针)施加到流变仪上。
表1：水凝胶组合物的特性
Figure BDA0003683782420000201
实施例8-包含17.9mg/mL交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的水凝胶组合物的制备和表征
根据方法B在不添加盐酸利多卡因的情况下制备包含1.79％交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺钠盐(HA-LYSC)和0.5％未修饰的透明质酸钠的水凝胶。简而言之，在室温下机械搅拌下将1.34g HA-LYSC(干重，MMW 590kDa，修饰度149μmol/g聚合物)和375mg透明质酸钠(干重，MMW 2.4MDa)溶解在65.2g 0.01M HCl(包含458mg NaCl)中约4小时。向62.30g该溶液中添加包含0.045％H2O2的6.92ml 100mM磷酸盐缓冲液pH 11.90，从而将溶液的pH调节至约pH 7.2。将混合物在5℃下放置66小时以进行交联，然后挤压通过200μm筛，填充到1mL玻璃注射器中并通过高压灭菌器灭菌。无菌水凝胶具有约7.2的pH和303mOsm/kg的同渗重摩。
修饰度(DoM)、MMW、残余硫醇含量、弹性模量G’和挤出力如上所述测定，并总结在表2中。为了测量挤出力，将27G针连接到注射器上。为了测定弹性模量G’，将水凝胶直接从注射器(未连接针)施加到流变仪上。
表2：水凝胶组合物的特性
Figure BDA0003683782420000202
Figure BDA0003683782420000211
实施例9-包含9mg/mL交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的水凝胶组合物的制备和表征
根据方法B在不添加盐酸利多卡因的情况下制备包含9mg/mL交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺钠盐(HA-LYSC)和3mg/mL未修饰的透明质酸钠的水凝胶。简而言之，在室温下机械搅拌下将450mg HA-LYSC(干重，MMW 505kDa，修饰度158μmol/g聚合物)和150mg透明质酸钠(干重，MMW 2.4MDa)溶解在44g 0.01M HCl(包含NaCl)中约5小时。向39.82g该溶液中添加包含0.024％H2O2的4.425ml 100mM磷酸盐缓冲液pH 12，从而将pH调节至约pH 7.4。将混合物在环境温度下均质化15分钟，然后放置过夜以完成交联。将交联凝胶填充到1mL玻璃注射器中并通过高压灭菌进行灭菌。无菌凝胶具有约7.5的pH和315mOsm/kg的同渗重摩。
修饰度(DoM)、MMW、残余硫醇含量和弹性模量G’如上所述测定并总结在表3中。为了测定弹性模量G’，将水凝胶直接从注射器(未连接针)施加到流变仪。
表3.水凝胶组合物的特性
Figure BDA0003683782420000212
实施例10-包含35mg/mL交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的水凝胶组合物的制备和表征
根据方法B在不添加盐酸利多卡因的情况下制备包含35mg/mL交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺钠盐(HA-LYSC)和3mg/mL未修饰的透明质酸钠的水凝胶。简而言之，在室温下机械搅拌下将700mg HA-LYSC(干重，MMW 590kDa，修饰度149μmol/g聚合物)和60mg透明质酸钠(干重，MMW 2.4MDa)溶解在17g 0.01M HCl(包含NaCl)中约5小时。向16.28g该溶液中添加包含0.089％H2O2的1.81ml 100mM磷酸盐缓冲液pH 12，从而将溶液的pH调节至约pH 7.1。将混合物在室温下均质化15分钟，然后放置18小时以完成交联。将交联凝胶填充到1mL玻璃注射器中并通过高压灭菌进行灭菌。无菌凝胶具有约7.0的pH和334mOsmol/kg的同渗重摩。
修饰度(DoM)、MMW、残余硫醇含量、弹性模量G’和挤出力如上所述测定并总结在表4中。为了测量挤出力，将27G针连接到注射器上。为了测定弹性模量G’，将水凝胶直接从注射器(未连接针)施加到流变仪。
表4.水凝胶组合物的特性
Figure BDA0003683782420000221
实施例11-各种无菌水凝胶组合物的比较
各种组合物及其特性列于表5。对比组合物ID 1至ID 8的主要区别在于交联聚合物的浓度和分子量特征，交联聚合物是HA-半胱胺的氧化产物。通过使HA-赖氨酰-半胱胺交联制备水凝胶组合物INVENT1和INVENT2。用类似的方法(比较上述方法A、B和I)生产包含交联硫醇修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸钠和3mg/mL盐酸利多卡因的无菌水凝胶组合物。
水凝胶组合物ID 1至ID 4由具有150kDa的MMW和118μmol/g的修饰度的透明质酸-半胱胺聚合物制备。水凝胶组合物ID 1至ID 3分别包含3mg/mL未修饰的透明质酸钠以及6mg/mL(ID 1)、9mg/mL(ID 2)和13mg/mL(ID3)交联透明质酸-半胱胺。水凝胶组合物ID 4包含4mg/mL未修饰的透明质酸钠和13mg/mL交联透明质酸-半胱胺。
水凝胶组合物ID 5和ID 6用具有730kDa的MMW和151μmol/g的修饰度的透明质酸-半胱胺聚合物制备。水凝胶ID 5和ID 6分别包含3mg/mL未修饰的透明质酸钠(MMW2.41MDa)以及5mg/mL(ID 5)和9mg/mL(ID 6)交联透明质酸-半胱胺钠盐。
水凝胶组合物ID 7和ID 8由具有780kDa的MMW和149μmol/g的修饰度的透明质酸-半胱胺聚合物制备。水凝胶组合物ID 7包含3mg/ml未修饰的透明质酸钠(MMW 1.94MDa)和7mg/ml交联透明质酸-半胱胺钠盐。水凝胶组合物ID 8包含3mg/ml未修饰的透明质酸钠(MMW 1.94MDa)和13mg/ml交联透明质酸-半胱胺钠盐。
水凝胶组合物ID 9根据方法B由具有720kDa的MMW和146μmol/g的修饰度的透明质酸-半胱胺聚合物制备。水凝胶组合物ID 9包含3mg/ml未修饰的透明质酸钠(MMW 1,94MDa)和17.9mg/ml交联透明质酸-半胱胺钠盐。
水凝胶组合物INVENT1(实施例7)和INVENT2(实施例8)由具有590kDa的MMW和149μmol/g的修饰度的透明质酸-赖氨酰-半胱胺聚合物制备。水凝胶组合物INVENT1包含3mg/ml未修饰的透明质酸钠(MMW 1.94MDa)和7mg/ml交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺钠盐。水凝胶组合物INVENT2包含5mg/ml未修饰的透明质酸钠(MMW 1.94MDa)和17.9mg/ml交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺钠盐。
如上所述测定无菌水凝胶组合物的硫醇修饰的透明质酸MMW及其修饰度(DoM)、弹性模量G’和挤出力(EF)以及无菌水凝胶组合物中交联聚合物的残余硫醇含量。
所有无菌水凝胶组合物的pH在6.7至7.8的范围内，并且同渗重摩在250至350mOsm/kg的范围内。
表5:包含交联聚合物的无菌水凝胶组合物的特性
Figure BDA0003683782420000231
星号(*)表示那些不属于权利要求范围但被包含以用于比较的实例。缩写n.d.代表“未测定到”。a为了测定弹性模量G’，将水凝胶组合物直接从注射器(未连接针)施加到流变仪上。b不含盐酸利多卡因。
通过测量交联聚合物的残余硫醇含量并与硫醇修饰的透明质酸的初始修饰度进行比较来监测二硫键的形成。发现根据本发明的所有水凝胶组合物具有相对于硫醇修饰的透明质酸的修饰度小于15％的残余硫醇含量。
令人惊讶地发现，水凝胶的弹性性能不仅受交联聚合物的浓度影响，还受硫醇修饰的透明质酸的MMW和添加至含硫醇修饰剂的赖氨酸的影响。
比较水凝胶组合物ID 3*和ID 8*的弹性模量表明用于交联的硫醇修饰的透明质酸的MMW对无菌组合物的弹性性能具有积极影响。水凝胶组合物ID 3*的硫醇修饰的透明质酸具有150kDa的MMW，而水凝胶组合物ID 8*的硫醇修饰的透明质酸具有780kDa的MMW。除此之外，两种水凝胶组合物均包含13mg/ml交联透明质酸-半胱胺、3mg/ml未修饰的透明质酸钠和3mg/ml盐酸利多卡因，并且这两种水凝胶组合物均通过相同的生产方法生产。
比较水凝胶组合物ID 7*和INVENT1的弹性模量表明包含交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的组合物的弹性低于包含交联透明质酸-半胱胺的组合物的弹性。两种水凝胶组合物均包含7mg/ml交联硫醇修饰的透明质酸、3mg/ml未修饰的透明质酸钠和3mg/ml盐酸利多卡因，这两种水凝胶组合物均通过相同的生产方法(B)生产。在比较水凝胶组合物ID 9*和INVENT2的弹性模量时看到相同的效果。
实施例12–植入水凝胶组合物的体内表征
利用磁共振成像(MRI)研究了根据本发明的各种组合物以及对比组合物在通过注射皮内植入后平均贮库体积随时间的发展。
详细地，计算相对于起始点的以％为单位的贮库体积，以补偿施用体积中的潜在差异。t＝0(植入后直接)的贮库体积对应于100％。例如可以通过磁共振成像(MRI)扫描来监测贮库体积。
应当理解，优选地在动物模型中确定的作为生物参数的贮库体积经受很大的个体差异。因此，单个数据点的信息量较少，只有平均值(考虑到多个施用部位和/或多个研究对象)才提供结论性数据。当然，性能将进一步取决于诸如植入部位的组织类型、用于测量贮库体积的方法以及所研究生物的物种等因素。数据的定量可转移性(例如对于在人类中的施用)可能会受到限制。然而，在另一项小鼠体内研究中观察到与大鼠数据相当的结果(数据未示出)。因此，体内表征为评估和比较各个水凝胶组合物彼此提供了有价值的工具。
停留时间可用作描述在一段时间内平均贮库体积的存在，优选地在一段时间内约100％(或甚至更大)的贮库体积的存在的参数。增容效果可以被定义为在施用水凝胶后的某个时间点，例如在植入后的第5周(例如在第30天)或在另一个实施方案中在第12周(例如在第81至84天)以及最终甚至在第24周(例如在第165至168天测量)测量的约100％(或更大)的贮库体积。
测试了十一种不同的无菌水凝胶组合物(水凝胶特性见表6)和用于细纹治疗的两种市售真皮填充剂
Figure BDA0003683782420000241
soft(COMP1)和
Figure BDA0003683782420000242
(COMP2)。COMP1包含在磷酸盐缓冲溶液中的20mg/mL BDDE交联透明质酸和3mg/mL盐酸利多卡因。COMP2包含在磷酸盐缓冲溶液中的16mg/mL高MW透明质酸和16mg/mL低MW透明质酸。
将组合物皮内注射到雌性Sprague Dawley大鼠的背部皮肤中。注射体积为约50μL。每只大鼠施用最多8个贮库，每种组合物ID 5、ID 6、ID 7、ID 8和ID 9总共施用12次，每种组合物ID 1、ID 2和COMP1总共施用14次，每种组合物ID 3和ID 4总共施用5次，每种INVENT1和INVENT2总共施用16次，每种COMP2总共施用8次。通过MRI(Siemens Espree 1.5TMRT装置)在不同时间点监测皮内水凝胶贮库的体积，总时间期高达170天。根据MRI扫描计算单个贮库体积(mm3)并随着时间进行监测。计算的体积相对于在第0天(施用后立即)获得的结果进行归一化，并以百分比(％)表示。不同组合物在不同时间点的平均相对贮库体积列于表6。每个时间点允许一定的天数范围。对于每种水凝胶组合物，所有贮库体积均在同一天确定。
表6：平均相对贮库体积(％)随时间的发展
Figure BDA0003683782420000251
星号(*)表示那些不属于权利要求范围但被包含以用于比较的实例。缩写n.d.代表“未测定到”。
对比水凝胶组合物ID 1*至ID 4*以及COMP1和COMP2在施用后不到2个月内迅速降解。在一些情况下，植入后2周(COMP1和组合物ID 1*)和约3周(COMP2和组合物ID 2*)检测不到水凝胶贮库。通过初始MMW在730至780kDa范围内的硫醇修饰的透明质酸的交联制备的水凝胶组合物ID 5*、ID 6*、ID 7*和ID 8*显示出超过1个月和长达5个月的延长停留时间。水凝胶组合物ID 3*和ID 8*的停留时间的比较表明，用于交联的硫醇修饰的透明质酸的MMW对无菌组合物的停留时间有积极影响。水凝胶组合物ID 3*的硫醇修饰的透明质酸具有150kDa的MMW，并且在植入后3个月检测不到水凝胶组合物ID 3*的贮库。组合物ID 8*的硫醇修饰的透明质酸具有780kDa的MMW，并且在整个研究期间检测到水凝胶组合物ID 8*的贮库。这两种水凝胶组合物在其它方面是可比较的；它们包含13mg/ml交联透明质酸-半胱胺、3mg/ml未修饰的透明质酸钠和3mg/ml盐酸利多卡因，这两种组合物均采用相同的生产方法生产。
水凝胶组合物ID 7*和INVENT1的平均相对贮库体积的比较表明，与包含相同浓度的交联透明质酸-半胱胺的组合物相比，包含7mg/ml的相对低浓度的交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的组合物显示出更快的平均贮库体积减少。这两种水凝胶组合物均包含7mg/ml交联硫醇修饰的透明质酸和3mg/ml未修饰的透明质酸钠，并且这两种水凝胶组合物均通过相同的生产方法(B)生产。
在将包含17.9mg/ml的浓度的交联透明质酸-赖氨酰-半胱胺的水凝胶组合物(INVENT2)与包含17.9mg/ml的相同浓度的交联透明质酸-半胱胺的水凝胶组合物(ID 9*)进行比较时，得到相同的观察结果。24周后，水凝胶组合物INVENT2的平均相对贮库体积为约50％。
根据本发明的水凝胶组合物显示出有望用作例如人类中的可生物降解的软组织填充剂的期望的体内性能。此外，交联聚合物的性质提供了良好的毒理学安全性，并且可以施用相比于其它稳定透明质酸填充剂的更高体积(每次施用超过50mL)。
实施例13–植入的水凝胶组合物的生物相容性研究
为了研究组合物的生物相容性，对来自植入水凝胶的水凝胶植入部位的样品进行组织学研究。
从植入后28天的两种不同的本发明水凝胶(INVENT1和INVENT2)的植入部位制备苏木精和伊红(H&E)染色的组织切片。组织学评估显示，植入物位于真皮(皮内；i.d.)、肌肉(肌肉内；i.m.)或皮下(皮下；s.c.)的组织中。
定性地，在所有检查的植入部位，植入的材料(测试项目)本身呈现为在真皮、肌肉或皮下组织内形成网络的略带蓝色、均匀染色的无定形块。局部宿主反应可以描述为在有/没有多核巨细胞的情况下多形核细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞的不同程度的浸润，以及纤维化(包括成纤维细胞或纤维细胞的增殖)。与i.d.和i.m.部位相比，s.c.部位处的局部宿主反应稍微更显著，尽管在多个位置之间的整体反应没有定性差异。在本实验条件下检查的任何植入部位均未出现意外的宿主反应。
为了量化植入部位的影响，应用了ISO 10993-6:2016(E)描述的评分系统，其中评分越高表明宿主反应越明显。基于根据改编的ISO 10993-6:2016(E)评分系统确定的宿主反应评分，组合物INVENT1具有9.6的合并组织(i.d.、i.m.和s.c.)的平均宿主反应评分，组合物INVENT2具有12.3的平均宿主反应。
在本研究的条件下，与组合物INVENT1的水凝胶植入物相比，包含2.5倍高浓度的透明质酸-赖氨酰-半胱胺的组合物INVENT2的水凝胶植入物被认为在组织反应中表现出最小差异或没有差异。
实施例14–不同硫醇修饰的透明质酸的流变学表征
使用不同的带有硫醇基团的修饰剂生产三种不同的硫醇修饰的透明质酸。HA-赖氨酰-半胱胺的修饰剂根据实施例15A(见下文)制备。HA-半胱胺如前所述制备并且DGDTPDH修饰剂根据PCT/EP2019/065755实施例12制备，其通过引用并入本文。
评估了溶液中硫醇修饰的透明质酸(没有预先交联)的流变特性。首先，通过在0.01N HCl中连续搅拌2至4小时制备硫醇修饰的透明质酸的1.2％(m/m)溶液，然后过滤(10μm)。在过滤后30分钟内使用带有锥板系统的Anton Paar MCR 102流变仪在25℃的温度和5/s的恒定剪切速率下测定动态粘度。
表7：不同硫醇修饰的透明质酸溶液的动态粘度
Figure BDA0003683782420000271
实施例15–具有碱性侧链的带硫醇基团的修饰剂的合成
A.双(赖氨酰)-胱胺二盐酸盐的制备：
向胱胺二盐酸盐(842mg，3.74mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.36mL，7.85mmol)在无水THF(10mL)中的混合物中滴加Nα,Nε-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸羟基琥珀酰亚胺酯(3.32g,7.48mmol)在无水THF(10mL)中的溶液。将反应在环境温度下搅拌18小时，然后再添加0.7mL DIPEA，然后添加水(1mL)并继续搅拌24小时。
将混合物倒在200mL水上并用乙酸乙酯(500mL)萃取。有机层用1n HCl(100mL)、半饱和NaHCO3(100mL)和水(50mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，在减压下蒸发挥发物，得到作为无色泡沫的N-Boc保护的双(赖氨酰)-胱胺。
产量：2.2g(73％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.11(br,1H,-NH),5.53(br,1H,-NH),4.74(br,1H,-NH),4.15(br,1H,α-CH-NH),3.70-3.45(m,2H,CH2 -NH-),3.17-3.03(m,2H,ε-CH2 -NH),2.80(t,J＝6.6Hz,2H,-CH2 -S-),1.94-1.21(m,24H,β,γ,δ-CH2,2xt-Bu),1.77-1.67(m,2H,-CH2 ),1.52-1.42(m,2H,-CH2 ).m/z＝809.4[M+H]+,831.3[M+Na]+。
向N-保护的双(赖氨酰)-胱胺(1.03g,1.273mmol)在MeOH(25mL)中的溶液中添加乙酰氯(500μL,7mmol)。将反应在配备有回流冷凝器的烧瓶中在70℃搅拌5小时，然后在减压下蒸发挥发物并通过与甲苯(2×mL)共蒸发除去残余盐酸。将粗产物吸收在水(10mL)中，用甲苯(5mL)洗涤并将水层冻干，得到作为无色泡沫的标题化合物。
产量：669mg(95％).1H NMR(400MHz,D2O)δ3.99(t,J＝6.3Hz,1H,α-CH-NH3),3.72-3.62(m,1H,-NH-CH2A ),3.59-3.50(m,1H,-NH-CH2B ),3.01(t,J＝8.0Hz,2H,ε-CH2 -NH3),2.97-2.83(m,2H,-CH2 -S-),1.97-1.87(m,2H,β-CH2 ),1.77-1.67(m,2H,δ-CH2 ),1.52-1.42(m,2H,γ-CH2 )。
B.双(ε-叠氮基-L-赖氨酰)-胱胺二盐酸盐的制备：
向胱胺二盐酸盐(591mg，2.62mmol)和N-α-叔丁氧羰基-ε-叠氮基-L-赖氨酸(1.5g，5.50mmol)在无水二氯甲烷:DMF＝1:1(20mL)中的混合物，添加DIPEA(914μL,5.25mmol)，然后在冰冷却下15分钟的时期内添加EDC*HCl(1.06g,5.50mmol)在二氯甲烷中的溶液。将反应在环境温度下搅拌5天；然后在减压下蒸发挥发物。将残余物吸收在乙酸乙酯(150mL)中并用1N HCl(50mL)洗涤，随后用半饱和NaHCO3(50mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥并在减压下蒸发挥发物。粗产物通过硅胶快速色谱法纯化：环己烷/乙酸乙酯＝70:30至50:50。得到作为无色油状物的化合物，静置后结晶。
产量：125mg(7％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(br,1H,NH),5.54(br,1H,NH),4.21(br,1H,α-CH),3.74–3.43(m,2H,-CH2 -NH-),3.28(t,J＝6.8Hz,2H,ε-CH2 -N3),2.80(at,J＝6.3Hz,2H,CH2 -S),1.9–1.39(m,15H,-CH2,CH3 t-Bu).m/z＝661.3[M+H]+,683.3[M+Na]+。
向制备的双(N-α-叔丁氧羰基-ε-叠氮基-L-赖氨酰)-胱胺(256mg，0.39mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中添加乙酰氯(250μL，3.5mmol)。将反应在配备有回流冷凝器的烧瓶中在70℃搅拌3小时；然后在减压下蒸发挥发物。将粗产物吸收在水(15mL)中，用EtOAc(5mL)洗涤，并且将水层冻干，得到作为无色泡沫的化合物(12)。
产量：174mg(84％).1H NMR(400MHz,D2O)δ3.97(t,J＝6.6Hz,1H,α-CH-NH3),3.75(ddd,Jgem＝14.1Hz,Jvic1＝7.4Hz,Jvic2＝5.5Hz,1H,-NH-CH2A ),3.48(dt,Jvic＝5.8Hz 1H,-NH-CH2B ),3.35(t,J＝6.6Hz,2H,ε-CH2 -NH3),2.97-2.81(m,2H,-CH2 -S-),1.95-1.85(m,2H,β-CH2 ),1.69-1.59(m,2H,δ-CH2 ),1.55-1.38(m,2H,γ-CH2 ).m/z＝461.2[M+H]+,483.2[M+Na]+。
实施例16-硫醇修饰的透明质酸中赖氨酸修饰基团的结合方式的测定
由于赖氨酸具有两个氨基基团，对于与透明质酸的羧酸酰胺偶联，两种可选的结合方式是可能的(即，如上文所讨论的根据式(I)或式(II)的亚结构)。结合方式可以通过1H和13C-NMR以及组合的2D NMR技术(HSQC,HMBC)确定。
与合成的赖氨酸衍生物中的α或ε氨基基团相邻的CH2基团可以通过1H-NMR光谱中的不同化学位移清楚地区分。如果氨基基团被酰化，由于吸电子酰基部分，相邻-CH2基团的信号以约0.1-0.2ppm的量级向低场移动。在游离双(赖氨酰)-胱胺中，α氨基基团的信号出现在δ＝3.99ppm，而ε氨基基团的信号出现在δ＝3.01ppm。在一种衍生物中，其中两个氨基基团都被BOC(叔丁氧羰基)保护，这些信号分别转移到4.15ppm和3.10ppm。
对于相应的13C信号(α-CH基团：δ＝53.19至54.40ppm；ε-CH2基团：δ＝39.06至40.09ppm)也发现了类似的低场移动。
用于制备水凝胶组合物INVENT1、INVENT2和INVENT4的硫醇修饰的透明质酸透明质酸-赖氨酰-半胱胺的HSQC光谱显示了δ＝4.24/57.45ppm的α-CH基团的1H/13C交叉峰，而ε-CH2基团发现于δ＝3.00/41.62ppm处。α-CH基团发现了低场移动，而ε-CH2基团没有。因此，NMR数据表明赖氨酸接头通过α-CH基团与透明质酸结合，而不是通过ε-CH2基团。

Claims (17)

1.硫醇修饰的透明质酸，其中所述硫醇修饰的透明质酸包含在透明质酸侧链中的多个具有硫醇基团的修饰基团，
其特征在于，
所述修饰基团包含具有碱性侧链的氨基酸残基和缀合的末端天然存在的氨基-硫醇，所述氨基-硫醇优选地选自由半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸和半胱氨酸或高半胱氨酸的酯组成的组。
2.根据权利要求1所述的硫醇修饰的透明质酸，其中所述修饰基团通过羧酰胺与所述透明质酸连接，其中所述羧酰胺的酰基基团来源于所述透明质酸中的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，并且优选地，所述羧酰胺的氨基基团来源于所述氨基酸残基的氨基基团。
3.根据权利要求1或2所述的硫醇修饰的透明质酸，其中所述氨基-硫醇的氨基基团与所述氨基酸残基的羧基基团缀合以形成羧酰胺。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的硫醇修饰的透明质酸，其中所述修饰基团包含衍生自氨基酸赖氨酸的氨基酸残基和氨基-硫醇半胱胺，其中所述半胱胺的氨基基团与所述赖氨酸的羧基基团缀合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的硫醇修饰的透明质酸，其中所述硫醇修饰的透明质酸具有根据式(I)或式(II)或两者的亚结构：
Figure FDA0003683782410000011
Figure FDA0003683782410000021
6.根据权利要求1至5中任一项所述的硫醇修饰的透明质酸，其中
所述硫醇修饰的透明质酸具有大于约80μmol/克聚合物、优选大于约105μmol/克聚合物、更优选大于约120μmol/克聚合物的硫醇基团修饰度，和
所述硫醇修饰的透明质酸具有小于约320μmol/克聚合物、优选小于约290μmol/克聚合物、更优选小于250μmol/克聚合物的硫醇基团修饰度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的硫醇修饰的透明质酸，其中所述硫醇修饰的透明质酸具有至少400kDa、优选至少500kDa、更优选至少600kDa的平均分子量。
8.无菌水凝胶组合物，包含交联聚合物，其中所述交联聚合物是根据权利要求1至7中任一项所述的硫醇修饰的透明质酸的氧化产物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物具有相对于所述硫醇修饰的透明质酸的修饰度小于20％、优选小于15％的残余硫醇含量。
10.根据权利要求8至9中任一项所述的组合物，其中所述硫醇修饰的透明质酸以至多50mg/mL、优选至多35mg/mL、更优选至多25mg/mL、甚至更优选至多18mg/mL的浓度包含在所述组合物中。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述硫醇修饰的透明质酸以至少4mg/ml、更优选至少5mg/mL、更优选至少7mg/mL的浓度包含在所述组合物中。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含局部麻醉剂，优选利多卡因。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含选自生物相容性多糖的组的未修饰的聚合物，优选未修饰的透明质酸。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的组合物的美容用途。
15.根据权利要求14所述的组合物的美容用途，其中所述组合物作为软组织填充剂施用。
16.根据权利要求8至13中任一项所述的组合物用于作为药物使用。
17.根据权利要求16使用的所述组合物，其中所述组合物作为软组织填充剂施用。
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