CN114716569A

CN114716569A - 一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用

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Publication number: CN114716569A
Application number: CN202210384441.0A
Authority: CN
Inventors: 方卫国; 包玉婷; 张明祥
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2042-04-13
Also published as: WO2023197365A1; CN114716569B

Abstract

本发明提供了一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用，涉及融合蛋白技术领域。本发明所述重组蛋白，从N端至C端，依次包括将所述重组蛋白带入细胞核中的入核信号NLS‑目标蛋白‑具跨越细胞膜能力的短肽AE1。其中AE1无毒高效地带领重组蛋白跨越细胞膜进入细胞内，并由NLS将目标蛋白带入到细胞核中，从而发生作用。本发明还提供了一种能自主进入人类细胞核修复UV辐射诱发的DNA损伤的重组光解酶，以CPD光解酶为目标蛋白，具有修复细胞核DNA上的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)、提高胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，以及降低胞内氧自由基(ROS)和剧毒分子丙二醛(MDA)水平的作用。

Description

一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用

技术领域

本发明属于融合蛋白技术领域，具体涉及一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用。

背景技术

紫外线辐射会对人类产生许多的危害。太阳光中的紫外线按照波长分为 3类，其一是短波紫外线(UVC：200～280nm)，它几乎都被大气臭氧层吸收。其二是中波紫外线(UVB：290～320nm)，它在太阳光中紫外线的占比大概只有5％，包括急性晒伤和色素沉着在内的表皮损伤主要是由UVB引起的。其三是长波紫外线(UVA：320～400nm)，它在太阳光中紫外线的占比高达 95％。长波紫外线穿透能力强，可达到皮肤深层，容易导致皮肤黑化和光老化。有研究表明，皮肤癌是过度暴露于紫外线辐射下的主要病理表现，地表紫外辐射中的UVA、UVB与大多数的皮肤癌相关，包括鳞状细胞癌(SCCs)、皮肤恶性黑色素瘤(CMMs)等，其中非黑色素瘤皮肤癌(NMSCs)占所有皮肤癌的90％以上^[1,2]。

紫外线辐射产生的细胞核DNA光产物(photoproduct)是诱发基因突变和皮肤癌发生的主要原因。UVB辐射是太阳光中最具能量和诱变很强的成分，它直接被DNA吸收，并在相邻的两个嘧啶碱基之间诱导形成二聚体光产物^[3]。紫外辐射主要诱发产生两种类型的DNA二聚体光产物：环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimer，CPD)和(6-4)嘧啶酮光产物(6-4 photoproduct，6-4PPs)。这两种光损伤都会扭曲DNA螺旋，并干扰细胞转录和复制过程，从而引发DNA突变、RNA合成抑制、细胞周期停滞和细胞凋亡等^[4]。紫外线诱导产生的DNA损伤中大约70～80％是CPDs，其余是6-4 PPs和6-4PPs的杜瓦异构体。尽管6-4PPs在大肠杆菌中有明显的致突变性，但哺乳动物细胞修复6-4PPs的速度比CPDs快得多。因此，在哺乳动物细胞中，相对于6-4PPs来说，紫外线诱导产生的CPDs所导致的突变明显更多^[5]。除了6-4PPs和CPDs，紫外线也可能通过产生单线态氧或自由基间接造成DNA损伤，例如通过激活核黄素、色氨酸和卟啉等可以活化细胞氧的小分子产生活性氧(ROS)。ROS可以通过诱导受照射细胞产生氧化性碱基损伤或直接攻击DNA分子的糖磷酸主干，促进DNA单链断裂^[8]。另外，氧自由基可以作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质，后者逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括丙二醛(MDA)，通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，间接地反映出细胞损伤的程度。此外，MDA还是一种剧毒分子，它能够通过与DNA和蛋白质等分子发生反应从而损害人体多种生理机制，如MDA与核酸碱基相互作用形成的加合物中有的具有致突变性、MDA与胶原蛋白交联可能会显著促进心血管组织的硬化^[9]。

光解酶(photolyase)也称光裂合酶，是一种黄素蛋白，它可以通过吸收蓝光修复紫外线辐射所诱发的DNA光产物^[6]。自然界存在两种不同类型的光解酶，分别是修复CPD的CPD光解酶和修复6-4PPs的6-4PP光解酶。尽管这两类光解酶在结构上类似，但它们具有很强的底物特异性^[2]。然而，人类细胞先天并不存在光解酶，针对于紫外辐射造成的DNA光产物，人类只能通过其它的涉及多种蛋白的复杂机制进行修复，如核苷酸切除修复 (NER)途径。相对于其它物种中的光解酶直接修复途径，人类细胞通过 NER修复CPD的效率低下，并且基于NER的CPD修复效率还会随着年龄的增长进一步降低，导致DNA损伤逐渐积累，引发一系列的多种病变，甚至癌症^[7]。

当前，人们采用多种物理方式来防紫外辐射，包括使用遮阳伞和防晒衣等防护用具，涂抹具有适当防晒系数(SPF)和防护光谱的防晒霜，以及通过在洗衣粉中添加紫外吸收剂来提高衣服的紫外线防护系数等。除此之外，有研究表明，在防晒霜中添加含包括上述光解酶在内的DNA修复酶的脂质体，后者可将修复酶转入细胞中以修复紫外线诱发的DNA损伤^[2]。尽管基于脂质体技术的化妆品已有广泛应用，但是它存在制备技术要求高、脂质体稳定性差，与化妆品中其他原料配伍不易等问题，容易出现沉淀、磷脂容易氧化变色、易产生特异性气味等不良现象。

参考文献

[1]Jean Cadet,Thierry Douki,Jean-Luc Ravanat.Oxidatively GeneratedDamage to Cellular DNA by UVB and UVA Radiation[J].Photochemistry andPhotobiology,2015,91:140-155.

[2]Marie-Therese Leccia,Celeste Lebbe,Jean-Paul,et al.New Vision inPhotoprotection and Photorepair[J].Dermatol Ther(Heidelb),2019,9:103-115.

[3]Cadet J,Sage E,Douki T.Ultraviolet radiation-mediated damage tocellular DNA.MutatRes.2005,571:3-17.

[4]George A Garinis,Judith Jans,et al.Photolyases:capturing the lightto battle skin cancer[J].Future Oncol,2006,2(2):191-199.

[5]Silvia Tornaletti,Gerd P.Pfeifer.UV damage and repair mechanismsin mammalian cells[J].BioEssays,1996,18(3):221-228.

[6]Navarrete-Dechent C,Molgo M.The use of a sunscreen containing DNA-photolyase in the treatment ofpatients with field cancerization and multipleactinic keratoses:a case-series[J].Dermatol Online.2017:15-23.

[7]de Laat WL,Jaspers NGJ,Hoeijmakers JHJ.Molecular mechanism ofnucleotide excision repair.Genes Dev.1999,13(7):768-85.

[8]Brem,R.,M.Guven,P.Karran.Oxidatively-generated damage to DNA andproteins mediated by photosensitized UVA.Free Radical Biology andMedicine.2017,107:101-109.

[9]Daniele Del Rio,Amanda J.Stewart,Nicoletta Pellegrini.A review ofrecent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker ofoxidative stress.Nutrition,Metabolism&Cardiovascular Diseases.2005,15: 316-328.

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用，所述重组蛋白能自行进入真核生物的细胞核，直接使功能目标蛋白质在细胞中发挥作用。当目标蛋白为重组光解酶时，进入细胞核的重组光解酶可用于修复紫外线辐射诱导基因组 DNA产生的环丁烷嘧啶二聚体，修复DNA损伤，同时提高胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，以及降低胞内氧自由基(ROS)和剧毒分子丙二醛(MDA) 水平的作用，进而有望降低癌变的几率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白，所述重组蛋白的结构，从N端至C端，依次包括入核信号NLS、目标蛋白和短肽 AE1。

优选的，所述目标蛋白包括CPD光解酶。

本发明还提供了一种能自主进入人类细胞核修复UV辐射诱发DNA损伤的重组光解酶，所述重组光解酶的结构，从N端至C端，依次包括：来源于SV40病毒的入核信号、CPD光解酶和来源于黑腹果蝇的短肽AE1。

优选的，所述入核信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述CPD光解酶包括来源于罗伯茨绿僵菌的CPD光解酶；

所述短肽AE1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述DNA损伤包括环丁烷嘧啶二聚体的DNA损伤。

本发明还提供了表达上述重组蛋白或上述重组光解酶的重组表达载体，所述重组表达载体包括编码所述重组蛋白或所述重组光解酶的基因。

优选的，所述重组表达载体的基础载体包括pET-28a-sumo载体。

本发明还提供了表达上述重组蛋白或上述重组光解酶的重组菌，所述重组菌的基因组中包括编码所述重组蛋白或所述重组光解酶的基因或上述重组表达载体。

优选的，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

本发明还提供了上述重组光解酶在制备用于治疗UV辐射诱发的环丁烷嘧啶二聚体的DNA损伤的药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白，从N端至C端，依次包括将所述重组蛋白带入细胞核中的入核信号NLS、目标蛋白和具跨越细胞膜能力的短肽AE1。其中AE1无毒高效地带领目标蛋白跨越细胞膜进入细胞内，进一步由NLS将目标蛋白带入到细胞核中，从而发生作用。

本发明还提供了一种能自主进入人类细胞核修复UV辐射诱发DNA损伤的重组光解酶，以CPD光解酶为目标蛋白，具有修复细胞核DNA上的 CPD损伤的作用。

附图说明

图1为pET-28a-sumo-SVNLS-GFP-AE1、 pET-28a-sumo-SVNLS-MrPHR1-AE1、pET-28a-sumo-MrPHR1-AE1、 pET-28a-sumo-SVNLS-MrPHR1的载体图谱；

图2为SVNLS::GFP::AE1蛋白表达和纯化的SDS-PAGE分析，M： Marker，1：pET-28a-sumo空载菌株总蛋白粗提液，2： SUMO::SVNLS::GFP::AE1总蛋白粗提液，3：粗提液2的上清，4：纯化的 SUMO::SVNLS::GFP::AE1蛋白液，5：加入ULP1酶切去除SUMO后的 SVNLS::GFP::AE1蛋白液；

图3为使用流式细胞仪分析SVNLS-GFP-AE1蛋白与GFP蛋白进入 HFF-1细胞情况；

图4为使用荧光显微镜观察SVNLS::GFP::AE1蛋白进HFF-1细胞核情况，比例尺10μm；

图5为SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白表达和纯化的SDS-PAGE分析，M： Marker，1：pET-28a-sumo空载菌株总蛋白粗提液，2： SUMO::SVNLS::MrPHR1::AE1总蛋白粗提液，3：粗提液2的上清，4：纯化的SUMO::SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白液，5：加入ULP1酶切去除SUMO 后的SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白液；

图6为MrPHR1::AE1及SVNLS::MrPHR1蛋白表达与纯化的SDS-PAGE 分析，M：Marker，1：pET-28a-sumo空载菌株总蛋白粗提液，2： SUMO::SVNLS::MrPHR1总蛋白粗提液，3：粗提液2的上清，4：纯化的 SUMO::SVNLS::MrPHR1蛋白液，5：加入ULP1酶切去除SUMO后的SVNLS::MrPHR1蛋白液，6：SUMO::MrPHR1::AE1总蛋白粗提液，7：粗提液6的上清，8：纯化的SUMO::MrPHR1::AE1蛋白液，9：加入ULP1酶切去除SUMO后的MrPHR1::AE1蛋白液；

图7为ELISA检测SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白修复细胞核DNA的CPD 损伤的能力；其中1-8表示不同条件处理的HFF-1细胞提取的基因组DNA， 1：未经任何处理的阴性对照；2：UV辐射；3：UV辐射后可见光照射处理； 4：与SVNLS::GFP::AE1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理； 5：与SVNLS::MrPHR1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理；6：与MrPHR1::AE1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理；7：与 SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白共孵育的细胞经UV辐射处理；8：与 SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理；

图8为SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白降低细胞内由UV辐射诱导产生的氧自由基(ROS)的水平，其中1-6表示不同条件处理的HFF-1细胞，1：未经任何处理的阴性对照；2：UV辐射；3：UV辐射后可见光照射处理；4：与SVNLS::MrPHR1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理；5：与MrPHR1::AE1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理；6：与 SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白共孵育的细胞经UV辐射后可见光照射处理；

图9为SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白降低细胞内UV辐射诱导产生的丙二醛(MDA)的水平，其中1-6表示不同条件处理的HFF-1细胞，同图8；

图10为SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白进一步提高UV辐射细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性，其中1-6表示不同条件处理的HFF-1细胞，同图 8。

具体实施方式

本发明对利用所述NLS、目标蛋白和AE1构建融合蛋白的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规融合蛋白构建方法进行构建即可。本发明所述真核细胞优选包括动物细胞和人类细胞，利用本发明所述结构的重组蛋白，可将目标蛋白送进动物或人类的细胞和细胞核中。本发明实施例中以CPD 光解酶为例对所述重组蛋白进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明还提供了一种能自主进入人类细胞核修复UV辐射诱发DNA损伤的重组光解酶(实施例也称融合蛋白SVNL::GFP::AE1)，所述重组光解酶的结构，从N端至C端，依次包括：来源于SV40病毒的入核信号-CPD光解酶-源于黑腹果蝇的短肽AE1。

本发明所述入核信号(简称SVNLS)的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1 所示：PKKKRKV；所述CPD光解酶优选来源于罗伯茨绿僵菌，其Genbank accession number:XP_007821405；所述短肽AE1的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：GRQIKIWFQNRRMKWKK，具有跨细胞膜能力。本发明所述CPD光解酶的来源除实施例中来源罗伯茨绿僵菌外，还可来源于其他来源，如其他菌株中得到的CPD光解酶或经基因编辑或修饰后的CPD光解酶。

在本发明中，所述DNA损伤优选包括环丁烷嘧啶二聚体(CPD)的DNA 损伤，将所述CPD光解酶用AE1送进人类细胞内，并由SVNLS带领进入细胞核内，从而促进外源的CPD光解酶对CPD的DNA损伤进行靶向处理；并提高胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，以及降低胞内氧自由基(ROS) 和剧毒分子丙二醛(MDA)水平。

本发明所述重组表达载体的基础载体优选包括pET-28a-sumo载体。本发明对所述重组表达载体的构建方法并没有特殊限定，优选包括：通过PCR 方法将SVNLS和AE1分别扩增到所述CPD光解酶的N端和C端；且在进行所述PCR扩增时，上游引物从5’端到3’端，依次包括两个保护碱基GG、限制性内切酶BamHI的识别位点、SVNLS的编码序列和CPD光解酶编码序列起始的17个碱基。下游引物从5’端到3’端，依次包括两个保护碱基GG、限制性内切酶XbaI的识别位点、短肽AE1的编码序列和罗伯茨绿僵菌光解酶编码序列最后17个碱基(不含终止密码子)；所得产物克隆进大肠杆菌表达载体pET-28a-sumo。在本发明实施例中，针对所述PCR扩增所设计的引物优选包括：上游引物SVNLS-MrPHR1-5(SEQ ID NO.3)： CGGGATCCATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCAGTCCTGACCACACC AACG；下游引物AE1-MrPHR1-3(SEQ ID NO.4)：CGGAATTCTTATCATTTTTTCCATTTCATGCGGCGGTTCTGAAACCAAAT TTTAATCTGGCGGCCCATGCCATTGGCGATTCC。

本发明所述重组菌的基础菌株优选包括大肠杆菌，实施例中以大肠杆菌 BL21菌株为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明对所述重组菌的构建方法并没有特殊限定，优选利用上述重组表达载体转化大肠杆菌BL21菌株，得到表达生产上述重组光解酶的大肠杆菌重组菌株。

本发明还提供了利用上述重组菌制备所述重组光解酶的方法，优选包括：将上述重组菌的单菌落接种到5mL含卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，得种子液；将种子液接种到含卡那霉素的LB液体培养基中再次培养，利用IPTG诱导，然后于18℃培养12h，收集菌体并破碎，离心收集蛋白粗提液，蛋白粗提液中包含所述重组光解酶。

在本发明中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度优选均为100 μg/mL；利用含卡那霉素的LB培养基进行所述培养时优选在摇床上进行，所述培养的温度优选为37℃，220rpm。

在本发明实施例中，优选取100μL的种子液接种到1000mL的含卡那霉素的LB液体培养基中再次培养，待OD₆₀₀值达到0.6时，于培养液中加入 IPTG进行诱导，所述IPTG的添加终浓度优选为0.8mmol/L。本发明对18℃培养12h后的菌体收集并破碎的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法收集菌体，破碎细胞，并通过离心获得蛋白粗提液。

本发明在得到所述蛋白粗提液后，优选还包括纯化，更优选的包括将所述蛋白粗提液过镍柱，以将带6个组氨酸的SUMO标签标记的重组光解酶吸附在镍柱上；将镍柱上的蛋白洗脱后用ULP1蛋白酶处理以切除带6个组氨酸的SUMO标签，并进一步过镍柱和脱盐后，得到纯化后的重组光解酶。

本发明还提供了上述重组光解酶在制备用于治疗UV辐射诱发的环丁烷嘧啶二聚体的DNA损伤的药物中的应用。在本发明实施例中，利用所述重组光解酶，可以成功入核修复由于紫外辐射产生的CPD损伤。

下面结合实施例对本发明提供的一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

SVNLS和AE1将外源蛋白GFP带入细胞核的能力分析

1)SVNLS::GFP::AE1蛋白表达载体的构建及原核表达。

在用PCR克隆绿色荧光蛋白GFP编码序列时将SVNLS和AE1的编码序列分别接在GFP蛋白的N-端和C-端(其中GFP编码序列中的终止密码子被除去，并在SVNLS的前面添加一个翻译起始密码子ATG)。

PCR扩增所用上游引物SVNLS-GFP-5(SEQ ID NO.5)： CGGGATCCATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGTGAGCAAGGGCGA GGA；下游引物AE1-GFP-3(SEQ ID NO.6)： CGGAATTCTTATCATTTTTTCCATTTCATGCGGCGGTTCTGAAACCAAAT TTTAATCTGGCGGCCCTTGTACAGCTCGTCCA。以含GFP编码序列的 DNA片段为模板，PCR扩增体系(总体积50μL)为：ddH₂O 15μL，2×Phanta Maxbuffer(Vazyme)25μL，dNTP Mix(10μM each，Vazyme)1μL， SVNLS-GFP-52μL(10μM)，AE1-GFP-32μL(10μM)，Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase(Vazyme)1μL，DNA片段模板(GFP)2μL。反应程序为：95℃3min→(95℃15sec→56～72℃15sec→72℃1min/kb)循环30次→72℃5min。

PCR产物连接到载体pET-28a-sumo的BamH I和EcoR I位点，测序验证无突变后得到蛋白SVNLS::GFP::AE1的原核表达载体 pET-28a-sumo-SVNLS-GFP-AE1，并转入大肠杆菌BL21菌株中。

大肠杆菌BL21菌株表达SVNLS::GFP::AE1蛋白由IPTG诱导，将一个重组大肠杆菌菌株菌落接种到5mL含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃培养过夜后，取100μL菌液到1000mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，再次于37℃培养到菌液OD₆₀₀值达到0.6左右，然后于培养液中加入IPTG (终浓度为0.8mmol/L)。18℃继续培养12h以表达重组蛋白。SDS-PAGE分析表明，SVNLS::GFP::AE1蛋白被成功表达，并存在于提取液的上清液中如图2所示。

2)蛋白纯化具体过程：

①按上述方法诱导表达SVNLS::GFP::AE1后，4℃，4500rpm离心20min 收集细胞。使用pH 7.0的lysis buffer重悬菌体细胞，并超声破碎25min (70kHz)。破碎完成后于4℃，12000rpm离心60min。分别收集破碎液、上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测目的蛋白是否大量表达。

②将上清液即蛋白粗提液过镍柱，带6个组氨酸的SUMO标签标记的目的蛋白吸附在镍柱上，使用pH 7.0的washbuffer洗去镍柱上的杂蛋白，再用pH7.0的elute buffer洗脱目的蛋白。洗脱下的目的蛋白用5mg ULP1蛋白酶处理以切除带6个组氨酸的SUMO标签，酶切过夜后使用Amino Ultra-15(10kDa)超滤管离心浓缩蛋白至15mL。将15mL浓缩液再次过镍柱，除去ULP1和sumo标签。使用Amino Ultra-15(10kDa)超滤管离心浓缩，并用pH 7.0的脱盐buffer除去咪唑。最后获得50mg的蛋白(体积为5mL 左右)，加入10％的甘油，利用0.2μm的滤膜过滤除菌，分装后于-80℃保存。

3)SVNLS::GFP::AE1进入HFF-1细胞能力分析

人皮肤成纤维细胞HFF-1在直径100mm培养皿培养4天后，经胰蛋白酶处理后，收集细胞并重悬在1mL的细胞培养基中。然后将100μL上述细胞悬液接种到含2mL培养基的直径为30mm的培养皿中。于37℃培养3-4 天后，向细胞培养基中添加过滤除菌的SVNLS::GFP::AE1蛋白(终浓度为 100ng/μL)，另设一组添加GFP蛋白作为对照。于37℃培养箱中孵育12h后，倒去培养基，并用1×PBS轻轻冲洗3遍除去细胞表面残留蛋白后用于后续实验。

①SVNLS::GFP::AE1入细胞验证

上述HFF-1细胞与SVNLS::GFP::AE1蛋白孵育12h后，用胰蛋白酶消化处理，并用流式细胞仪检测收集的细胞以分析上述蛋白进入细胞的情况及胞内GFP荧光强度。结果如图3所示，与SVNLS::GFP::AE1蛋白共孵育的 HFF-1细胞内GFP荧光强度高于与GFP蛋白共孵育的HFF-1细胞，说明SVNLS::GFP::AE1蛋白与未携带SVNLS和AE1的GFP蛋白相比具有强的进入细胞的能力。

②SVNLS::GFP::AE1入细胞核验证

上述HFF-1细胞与SVNLS::GFP::AE1共孵育12h后，倒去细胞培养基，向培养皿中添加1mL 2μg/mL DAPI染色液(染色细胞核)覆盖细胞，室温避光放置5min，吸去DAPI染色液，用1×PBS洗涤3次，每次5min。封片后利用荧光显微镜观察，荧光观察结果如图4所示，绿色荧光显示的是转运至细胞内的SVNLS::GFP::AE1蛋白，蓝色荧光显示位置是HFF-1细胞的细胞核，图中显示绿色荧光与蓝色荧光重合，则说明SVNLS::GFP::AE1成功进入HFF-1的细胞核。

实施例2

重组蛋白SVNLS::MrPHR1::AE1的表达与制备

为了利用SVNLS和AE1短肽将罗伯茨绿僵菌的CPD光解酶 (MAA_05216，命名为MrPHR1)带入哺乳动物细胞核并修复核DNA上的CPD损伤，本发明构建了融合蛋白SVNLS::MrPHR1::AE1。

为此，在用PCR克隆MrPHR1编码序列(Genbank accession number: XP_007821405)时将SVNLS和AE1的编码序列分别接在MrPHR1蛋白的 N-端和C-端(其中MrPHR1编码序列中的终止密码子被除去，并在SVNLS 的前面添加一个翻译起始密码子ATG)。所用引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，模板为罗伯茨绿僵菌菌丝体的cDNA。扩增体系和扩增程序同实施例 1，其中扩增体系中的上下引物变为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

PCR产物连接到载体pET-28a-sumo的BamH I和EcoR I位点，测序验证无突变后得到SVNLS::MrPHR1::AE1的原核表达载体 pET-28a-sumo-SVNLS-MrPHR1-AE1，并转入大肠杆菌BL21菌株中。

大肠杆菌BL21菌株中SVNLS::MrPHR1::AE1蛋白的IPTG诱导表达和纯化同实施例1。SDS-PAGE分析结果如图5所示，SVNLS::MrPHR1::AE1 蛋白被成功表达和纯化。

利用相同的方法，构建用于作对照的蛋白MrPHR1::AE1和 SVNLS::MrPHR1。构建方法除扩增引物不同外，其余均与实施例2相同；

其中构建蛋白MrPHR1::AE1所用上游引物MrPHR1-5(SEQ ID NO.7) 的序列为CGGGATCCATGGCTCGAAAATCATCG；下游引物 AE1-MrPHR1-3(SEQ ID NO.4)的序列同上。

构建蛋白SVNLS::MrPHR1所用上游引物SVNLS-MrPHR1-5的序列同上(SEQ IDNO.3)；下游引物MrPHR1-3(SEQ ID NO.8)的序列为 CGGAATTCCTACATGCCATTGGCGA。

利用上述相同方法进行原核表达实验，SDS-PAGE分析结果如图6所示， MrPHR1::AE1及SVNLS::MrPHR1蛋白被成功表达和纯化。

实施例3

SVNLS::MrPHR1::AE1入细胞核后修复DNA CPD损伤能力分析

1)光修复UV处理的HFF-1细胞

(1)细胞培养和处理设置

HFF-1细胞传代至直径30mm的Corning培养皿中，在二氧化碳培养箱内于37℃培养3天后进行如下处理：不做任何处理的阴性对照(未处理)，细胞与重组蛋白共孵育(Cell+protein)、UV辐射细胞(UV/cell)，可见光照射UV处理过的细胞(Light+UV/cell)、与重组蛋白共孵育的细胞用UV辐射处理(UV+protein/cell)、与重组蛋白共孵育的细胞经UV辐射后用可见光处理(Light+UV+protein/cell)，每个设置3个重复。

对于与重组蛋白共孵育的细胞经UV辐射后用可见光处理 (Light+UV+protein/cell)这个设置中，重组蛋白有4种 (SVNLS::MrPHR1::AE1，SVNLS::MrPHR1，MrPHR1::AE1或SVNLS::GFP::AE1)，在其它设置中重组蛋白仅为SVNLS::MrPHR1::AE1。

重组蛋白在细胞培养60h后加入到细胞培养基中(蛋白终浓度为 100ng/mL)，于37℃继续培养12h后，进行后续处理。UV处理的剂量1J/m²。

可见光处理过程为：在细胞培养皿上放一块玻璃片(过滤UV和减少培养基蒸发)，在37℃的二氧化碳培养箱用可见光照射3h(光源为10W的日光灯管)。处理后的细胞取出用PBS洗3遍后，分别收集细胞至1.5mL Ep 管中。

(2)提取不同条件处理的HFF-1细胞基因组DNA：

将上述细胞收集进Ep管中，每管中加入200μL的DNA提取液(0.2M pH7.5 Tris，0.5MNaCl，0.01M PH8.0 EDTA，1％SDS)，充分涡旋，再加入 200μL的氯仿(pH 7.0)充分涡旋，14000rpm室温离心8min，取上清液至新的Ep管中，向各管加1.5μLRNase，37℃孵育1h。再加200μL的氯仿(pH 7.0) 充分涡旋抽提一次，14000rpm室温离心8min，取上清液至新的Ep管中。加入500μL无水乙醇，充分涡旋后将Ep管置于-20℃沉淀30min，14000rpm室温离心5min后去上清。添加700μL 75％乙醇，充分涡旋后14000rpm室温离心2min后去上清，Ep管开盖置于37℃烘箱中5min，使Ep管内乙醇完全挥发。添加30μL无菌水充分涡旋溶解沉淀，所得液体即为HFF-1细胞基因组 DNA。用吸光度法测定DNA浓度。

2)ELISA分析DNA中CPD含量：

(1)制备鱼精蛋白预处理的96孔板。将50μL/孔的无菌0.003％(w/v) 鱼精蛋白硫酸盐溶液加入到每个孔中，37℃过夜烘干，再用100μL的ddH₂O 清洗3次后，避光存放。

(2)CPD含量测定。测定过程按照CPD antibody(Cosmo Bio Co.LTD. Japan)的说明书进行。DNA浓度为50ng/μL。(图7)

(3)结果。与阴性对照相比，HFF-1经UV照射后细胞内CPD含量上升约150倍，再将内含UV损伤的HFF-1进行可见光照射后发现，只有 SVNLS::MrPHR1::AE1重组蛋白孵育和可见光照射处理的细胞内CPD含量降低35％，而另外3种重组蛋白(SVNLS::MrPHR1，MrPHR1::AE1和 SVNLS::GFP::AE1)对细胞内CPD含量无明显影响。说明 SVNLS::MrPHR1::AE1可以成功入核修复由于紫外辐射产生的CPD损伤。

实施例4

SVNLS::MrPHR1::AE1入细胞核后降低胞内氧自由基(ROS)水平

1)光修复UV辐射的HFF-1细胞

(1)细胞培养和处理设置。(同实施例3)

(2)细胞样品处理。细胞用一定量的PBS重悬使其浓度为2×10⁷ cells/mL。取600μL 2×10⁷cells/mL的细胞悬液至1.5mL Ep管中，超声破碎 3min(70kHZ)。破碎完成后于4℃，12000rpm离心10min，收集上清液，置于冰上待测。

2)ROS含量测定：测定过程按照Oxiselect in vitro ROS/RNS assay kit (CellBiolabs，USA)试剂盒说明书进行。

3)结果。与阴性对照细胞相比，UV辐射使HFF-1细胞内ROS水平上升2.3倍。再将内含UV损伤的HFF-1进行可见光照射后发现，只有 SVNLS::MrPHR1::AE1重组蛋白孵育的细胞经可见光照射后细胞内ROS水平下降到与阴性对照细胞相当的水平；而另外2种重组蛋白(SVNLS::MrPHR1，MrPHR1::AE1)对细胞内ROS水平无影响。说明 SVNLS::MrPHR1::AE1清除了UV辐射诱发的ROS(图8)。

实施例5

SVNLS::MrPHR1::AE1入细胞核后降低胞内毒性物质丙二醛(MDA)水平

1)光修复UV处理的HFF-1细胞

(1)细胞培养和处理设置。(同实施例3)

(2)细胞样品处理。收集5×10⁷个细胞至1.5mL Ep管中，加入1mL提取液(下述试剂盒提供)涡旋混匀，超声破碎3min(70kHZ)。破碎完成后于4℃，12000rpm离心10min，收集上清液，置于冰上待测。

2)MDA含量测定：测定过程按照丙二醛(MDA)含量检测试剂盒 (Solarbio，中国)说明书进行。

3)结果。与阴性对照细胞相比，UV辐射使HFF-1细胞内MDA含量上升5.4倍。再将内含UV损伤的HFF-1进行可见光照射后发现，只有 SVNLS::MrPHR1::AE1重组蛋白孵育的细胞经可见光照射后细胞内MDA水平下降51％。另外2种重组蛋白(SVNLS::MrPHR1，MrPHR1::AE1)对细胞内MDA水平无影响。说明SVNLS::MrPHR1::AE1清除了UV辐射所诱发的MDA(图9)。

实施例6

SVNLS::MrPHR1::AE1入细胞核后增加胞内超氧化物歧化酶SOD活性

1)光修复UV处理的HFF-1细胞

(1)细胞培养和处理设置。(同实施例3)

(2)细胞样品处理。(同实施例5)

2)SOD活力测定：测定过程按照超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(Solarbio，中国)说明书进行。

3)结果。阴性对照的HFF-1细胞内SOD酶活性处于较低水平，UV 辐射使其中的SOD活性上升2.7倍。再将内含UV损伤的HFF-1进行可见光照射后发现，只有SVNLS::MrPHR1::AE1重组蛋白孵育的细胞经可见光照射处理的细胞内SOD酶活性进一步上升，达到阴性对照的4倍。另外2种重组蛋白(SVNLS::MrPHR1，MrPHR1::AE1)对细胞内SOD酶活性无影响 (图10)，表明SVNLS::MrPHR1::AE1能提高细胞内的SOD酶活性，这可能是该重组蛋白能降低这类细胞内ROS水平的一个原因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccat gccaaaaaag aagagaaagg tcagtcctga ccacaccaac g 51

<210> 4

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggaattctt atcatttttt ccatttcatg cggcggttct gaaaccaaat tttaatctgg 60

cggcccatgc cattggcgat tcc 83

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccat gccaaaaaag aagagaaagg tcgtgagcaa gggcgagga 49

<210> 6

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggaattctt atcatttttt ccatttcatg cggcggttct gaaaccaaat tttaatctgg 60

cggcccttgt acagctcgtc ca 82

<210> 7

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggaattcct acatgccatt ggcga 25

Claims

1.一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的结构，从N端至C端，依次包括入核信号NLS、目标蛋白和短肽AE1。

2.根据权利要求1所述重组蛋白，其特征在于，所述目标蛋白包括CPD光解酶。

3.一种能自主进入人类细胞核修复UV辐射诱发的DNA损伤的重组光解酶，其特征在于，所述重组光解酶的结构，从N端至C端，依次包括：来源于SV40病毒的入核信号、CPD光解酶和来源于黑腹果蝇的短肽AE1。

4.根据权利要求3所述重组光解酶，其特征在于，所述入核信号的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

所述CPD光解酶包括来源于罗伯茨绿僵菌的CPD光解酶；

所述短肽AE1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求3或4所述重组光解酶，其特征在于，所述DNA损伤包括环丁烷嘧啶二聚体的DNA损伤。

6.表达权利要求1或2所述重组蛋白或权利要求3～5任一项所述重组光解酶的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括编码所述重组蛋白或所述重组光解酶的基因。

7.根据权利要求6所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基础载体包括pET-28a-sumo载体。

8.表达权利要求1或2所述重组蛋白或权利要求3～5任一项所述重组光解酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌的基因组中包括编码所述重组蛋白或所述重组光解酶的基因或权利要求6或7所述重组表达载体。

9.根据权利要求8所述重组菌，其特征在于，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

10.权利要求3～5任一项所述重组光解酶在制备用于治疗UV辐射诱发的环丁烷嘧啶二聚体的DNA损伤的药物中的应用。