CN114703301B - 一种鉴定三种鲍特菌的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定三种鲍特菌的引物组、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对和第十引物对中的至少一对，每对所述引物对均包括正向引物和反向引物。本发明提供的引物组具有较高的特异性和稳定性，使用该引物组的试剂盒具有良好的灵敏度、重现率和准确率。所述试剂盒通过引物组检测10个MNP标记位点，能够用于非诊断目的的三种鲍特菌的鉴定、区分、菌株间和菌株内部的遗传变异鉴定、三种鲍特菌的MNP指纹数据库的构建。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鉴定三种鲍特菌的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
鲍特菌属(Bordetella)主要包括：百日咳鲍特菌(B.pertussis)、副百日咳鲍特菌(B.para pertussis)和支气管败血鲍特菌(B.branchiseptica)等。上述三种鲍特菌是比较常见的且都和人类呼吸道感染有关的病原菌。现有的检测方法主要是基于PCR类的技术核检测样本中的16S序列，该方法通常同时检测上述三种菌，但是，百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌在遗传上高度相似，这使得基于16S序列的检测难以准确区分这三种菌。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种鉴定三种鲍特菌的引物组、试剂盒及其应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种鉴定三种鲍特菌的引物组，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对和第十引物对中的至少一对，每对所述引物对均包括正向引物和反向引物，
所述第一引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述第一引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第二引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第二引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述第三引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述第三引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述第四引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述第四引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：8所示，所述第五引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述第五引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：10所示，所述第六引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：11所示，所述第六引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：12所示，所述第七引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：13所示，所述第七引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：14所示，所述第八引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：15所示，所述第八引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：16所示，所述第九引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：17所示，所述第九引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：18所示，所述第十引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：19所示，所述第十引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：20所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种鉴定三种鲍特菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
具体地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
又一方面，本发明实施例提供了一种上述引物组的应用，所述应用包括：利用所述引物组对每个鲍特菌基因组上的10个MNP标记位点中的至少一个进行非诊断目的的三种鲍特菌的区分鉴定、菌株间和菌株内部的遗传变异鉴定以及三种鲍特菌的MNP指纹数据库的构建，所述10个MNP标记位点的序列如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示，所述三种鲍特菌为百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的引物组具有较高的特异性和稳定性，使用该引物组的试剂盒具有良好的灵敏度、重现率和准确率。该试剂盒通过引物组检测10个MNP标记位点，能够用于非诊断目的的三种鲍特菌的鉴定、区分、菌株间和菌株内部的遗传变异鉴定、三种鲍特菌的MNP指纹数据库的构建。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本公开实施例一提供的引物组检测百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌上的MNP_5标记位点的序列相似性图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供的三种鲍特菌的来源均为湖北省疾病预防控制中心赠予。
实施例一
本发明实施例提供了三种鲍特菌的引物组，三种鲍特菌为百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌，该引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对和第十引物对，每对引物对均包括正向引物和反向引物。
第一引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，第一引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：2所示，第二引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：3所示，第二引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：4所示，第三引物对的正向引物如序列表中SEQ IDNO：5所示，第三引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：6所示，第四引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：7所示，第四引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：8所示，第五引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：9所示，第五引物对的反向引物如序列表中SEQ IDNO：10所示，第六引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：11所示，第六引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：12所示，第七引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：13所示，第七引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：14所示，第八引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：15所示，第八引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：16所示，第九引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：17所示，第九引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：18所示，第十引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：19所示，第十引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：20所示。
在实现时，可以对引物组的碱基进行修饰。
本发明实施例提供了一种鉴定三种鲍特菌的试剂盒，该试剂盒包括如表1所示的引物组。
具体地，试剂盒还可以包括多重PCR预混液。
本发明实施例提供的引物具体如表1所示。
表1为引物组的序列
评估该引物组的性能，具体如下：
将拷贝数已知的三种鲍特菌核酸标准品分别加入到人基因组DNA中，该人基因组DNA的来源为本实验室保存的人Huh-7细胞系，制备成三种病原菌分别为1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应的三种鲍特菌混合的模拟样本，同时，设置的等体积的无菌水作为空白对照(即0拷贝/反应的样本)。结果每种鲍特菌共计检测了如表2所示的0拷贝/反应、1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应4个样本，每个样本每天使用本发明实施例提供的试剂盒构建3个重复文库，连续构建4天，即每个样本获得12个文库，4个样本共计获得48个文库。48个文库按照等摩尔量进行混合，混合后进行二代测序，每个样本获得12个测序片段组，4个样本获得共计48个测序片段组。
文库构建时采用本发明实施例提供的试剂盒对样本进行扩增，得到扩增产物，将该扩增产物连接上购买的商业化样本标签，获得适用于高通量测序的文库并对该文库进行高通量测序，测序结果具体如表2所示。
表2为试剂盒的灵敏度及稳定性分析
表2中：0拷贝/反应的样本均为空白对照组，其它3个梯度的样本均为阳性样本组。
针对稳定性和灵敏度评估
结合表2可知，在每个样本的12组重复实验中(每天3个重复，共计重复4天)，空白对照和三种鲍特菌核酸标准品中均稳定地检出数目接近的如序列表中SEQ ID NO：21至SEQID NO：30所示的MNP标记位点，可见本发明实施例提供的试剂盒对三种鲍特菌的扩增稳定，检测三种鲍特菌的稳定性良好。10拷贝/反应的样本能稳定地检出7个以上的MNP标记位点，基因型可比对到三种鲍特菌，可见本发明实施例提供的试剂盒检测三种鲍特菌的灵敏度可低至10拷贝/反应。
针对重现率和准确率的评估
基于每个样本的12次重复实验，任意两次重复实验中，采用共同检出的MNP位点的基因型是否可重现用于评估检测三种鲍特菌的重现率和准确率。具体地，对表2所示的100拷贝/反应的样本的12组数据进行成对比较，同时，基因型存在差异的MNP标记位点数目都为0；依据2次重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则进行评估，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，式中r代表重现率，重现率为基因型可重现的位点数目占共有位点数目的比率。结果如表3所示，具体如下：
表3为重现率和准确率的评估
由表3可知，其重现率实验中每个样本的不同文库间和不同建库批次间MNP标记主基因型的差异对数为0，即重现率r＝100％，准确率a＝100％。
针对污染质控
在1拷贝/反应的样本中能检出三种鲍特菌的序列至少覆盖1个MNP标记位点。由于利用MNP标记位点检测方法的极度灵敏，致使在部分空白对照中也检出了部分鲍特菌的序列，可见该检测过程中的数据污染容易出现假阳性的结果。因此本发明实施例设置了0拷贝/反应的样本的空白对照样本，1个拷贝/反应和10拷贝/反应的弱阳性样本，并进行了连续4天的重复检测，可用于制定质控体系污染和目标病原体检出的阈值和判定标准。
质控方案具体如下：
1)测序数据量大于20兆碱基。根据我们对含一种或三种鲍特菌0拷贝/反应、1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应样本的多次检验，当测序数据量不大于20兆碱基时，含鲍特菌10拷贝/检验及以上的样品会出现检出MNP标记位点不足3个，且增加测序量也不能满足检出MNP标记位点达到3个的情况；而当测序数据量大于20兆碱基时，所有含鲍特菌10拷贝/检验及以上的样品的检出MNP标记位点都不少于3个。
2)根据测试样本中的每种鲍特菌的信号指数ST和空白对照中每种鲍特菌的噪音指数Sc判定污染是否可以接受，其中：
空白对照的噪音指数Sc＝nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中的每种鲍特菌的测序片段的数量和总测序片段的数量。
测试样本的信号指数St＝nt/Nt，其中nt和Nt分别代表测试样本中的每种鲍特菌的测序片段的数量和总测序片段的数量。
根据预期的检测下限，设置含每种鲍特菌的量呈梯度的测试样本，根据测试样本和空白对照中的信噪比R，即St和Sc的比值，设置污染是否可以接受的阈值。
为了保证准确，并兼顾灵敏度，本发明实施例设置的R值至少要达到10，即样本中信号指数至少是空白对照中噪音指数的10倍。
3)计算测试样本中MNP标记位点的检出数目。
在本实施例中，以百日咳鲍特菌为例进行介绍，其中，目标病原体的R值具体如表4所示，在本实施例表4中，信噪比计算中的信号指数和噪音指数均为12组实验数据的平均值。
表4为样本中百日咳鲍特菌的信噪比
结合表4可知，百日咳鲍特菌在1个拷贝的样本和空白对照的信噪比的最大值(最大信号指数5/平均噪音指数0.6)是8.3，平均值是4.7，因此，本发明规定，当信噪比不小于10时，可判定检测体系中的污染是可接受的。为避免少数污染位点过度扩增带来的高噪音比，本发明规定同时加入检出标记位点数目作为待测样本检出某种鲍特菌核酸的判定条件。在1拷贝/反应的样本最多能检出2个MNP标记位点。因此本发明规定：
1、当样本中某种鲍特菌的信噪比不小于10倍，且检出标记位点不小于3个时，判定样本中检出该鲍特菌的核酸。
2、当信噪比不大于1，且检出标记数目为0个时，判定样本中未检出该鲍特菌的核酸；
3、其余情况判为样本中疑似检出该鲍特菌的核酸。
采用上述病原菌检出的判定方法，同样能准确地判出样本中包含的副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌。由此可见，该引物组能灵敏地检测到低至10拷贝/反应的三种鲍特菌，可见具有极高的检测灵敏度和稳定性。
针对特异性的评估
将百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌、支气管败血鲍特菌、结核分枝杆菌、不动杆菌属菌株、霍氏鲍特菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、EB病毒、流感嗜血杆菌、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、人博卡病毒、肺炎克雷伯杆菌、军团菌属、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、立克次氏体属、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌的DNA按照等拷贝数混在一起，制备成混合模板，以空白样本作为对照，采用本发明实施例提供的引物组对混合模板中的三种鲍特菌进行检测，并进行3次重复实验。按照上述质控方案和判定阈值进行分析后，在3次重复实验中检出的测序序列都仅能比对到本发明实施例所提供的10个MNP标记位点；经序列相似性分析，在3个重复实验中都能检出三种鲍特菌属病原菌，在3种鲍特菌分别进行的3次重复实验获得的9个信噪比值中，最小的信噪比值达到402，这表明3次重复中三种鲍特菌的检出率均达到100％，可见本发明实施例提供的引物组在复杂模板中鉴定区分三种鲍特菌的特异性较高。
实施例二
本发明实施例提供了一种引物组的应用，该应用包括：利用引物组对三种鲍特菌基因组上的10个MNP标记位点进行非诊断目的的三种鲍特菌的菌株间的遗传变异检测，10个MNP标记位点的序列如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示。
下面简单介绍一下MNP(多核苷酸多态性)标记位点的制备方法：
基于网上公开的共计898个百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌不同分离株的基因组完整或部分序列，通过序列比对，获得10个MNP标记位点。对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序获得待检测微生物物种代表小种的基因组序列信息，其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10个具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。选择三种鲍特菌的一个代表株的基因组序列作为参考基因组，将该基因组序列和所述参考基因组进行序列比对，获得三种鲍特菌各菌株的单核酸多态性位点；
在候选多核苷酸多态性位点区域中筛选区分度DP≥0.2的区域作为MNP标记位点；其中，DP＝d/t，t是在候选多核苷酸多态性位点区域中所有小种两两比较时的比较对数，d是在候选多核苷酸多态性位点区域中至少两个单核酸多态性差异的样本对数。
作为一种可选的实施方式，在所述参考基因组上，以100～300bp为窗口进行筛选时，也可选用其它步长，本实施例采用步长为1bp，有利于全面的筛选。获得如序列表中SEQID NO：21至SEQ ID NO：30所示的MNP标记位点(MNP_1～MNP_10)，MNP_1～MNP_10在参考序列上的起始位置如表5所示。
表5为MNP标记位点在参考序列上的起始位置
利用本发明实施例提供的引物组对同一个百日咳鲍特菌的不同时期的6份子代菌株进行检测，6份样本依次命名为K-1～K-6，每个样本的测序平均覆盖倍数达1103倍，每个样本均可以检出全部10个MNP标记位点。将6个样本的指纹图谱进行两两比对，结果如表6所示。
表6为6个样本的检测分析
由表6可知，有1份(K-2)和同批次一起检测的5份百日咳鲍特菌均存在部分位点的主基因型差异，可见同一个百日咳鲍特菌的不同时期存在菌株间变异。使用引物组鉴定菌株间遗传变异可以用于保证不同实验室相同命名百日咳鲍特菌菌株的遗传一致性，从而保证研究结果的可比较性，这对于百日咳鲍特菌的科学研究具有重要意义。而在临床上，可针对差异位点是否影响抗药性斟酌诊断方案。
实施例三
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对三种鲍特菌基因组上的10个MNP标记位点进行非诊断目的三种病原菌内部的遗传变异鉴定，10个MNP标记位点的序列如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示。
细菌作为群体生物，在保存和繁殖的过程中，部分个体会发生变异，形成杂合的群体，从而影响试验用菌株表型的稳定性和一致性。这种变异体在对群体进行分子标记检测时，表现为MNP标记位点的主基因型以外的等位基因型。当变异个体占群体的极少部分时，变异个体表现为低频率的等位基因型。低频率的等位基因型和技术错误混在一起，导致现在的技术难以区分，需要判定检测到的次等位基因型的真实性。
本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行：首先按照以下规则排除具有链偏好性(在DNA双链上覆盖的测序序列数的比值)的等位基因型：链偏好性大于10倍，或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。
不存在链偏好性的基因型基于表7提供的测序序列数目和比例判定其真实性。表7列出了在部分测序深度下，在各个位点中次等位基因型的测序序列数目需满足的临界值。
表7为部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值
表7涉及到的参数emax(n＝1)和emax(n≥2)指的是在本实施例调查的930个纯合MNP标记位点中，获得的和主基因型存在n个SNP的次等位基因的频率的最大值。次等位基因型的频率是指该次等基因型的测序序列数占所在MNP标记位点总测序序列数的比例。
具体地，由表7可知，基于BINOM.INV函数计算在α＝99.9999％的概率保障下，emax(n＝1)和emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％时，在各个位点中次等位基因型测序序列数目的临界值，只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等位基因型。当存在多个候选次等位基因时，对各候选等位基因型的P值进行多重校正，FDR(FalseDiscovery Rate，错误发现率)<0.5％的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。
按照上述参数，将表6中提供的主基因型存在差异的两个菌株的核酸分别按照以下8个浓度比例：1/1000、3/1000、5/1000、7/1000、1/100、3/100、5/100和7/100进行混合，得到人工杂合样本，每个人工杂合样本重复检测3次，获得共计24个测序数据。通过和两个菌株的如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示的MNP标记位点的基因型进行精准比对，在24个人工杂合样本中均检测到了存在杂合基因型的位点，这说明本发明实施例提供的如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示的MNP标记位点适用于三种鲍特菌内部的遗传变异鉴定。在本实施例中，采用上述10个MNP标记位点共同进行三种鲍特菌内部的遗传变异鉴定，在其他实施例中，还可以采用上述10个MNP标记位点中的任一个或任意几个的组合进行三种鲍特菌内部的遗传变异鉴定。
实施例四
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用该引物组对每个鲍特菌基因组上的10个MNP标记位点进行检测，根据获得的MNP标记位点的序列进行三种鲍特菌的MNP指纹数据库的构建，10个MNP标记位点的序列如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示。
将实施例二提供的6份拷贝菌株K-1～K-6,利用常规CTAB法提取用于构建百日咳鲍特菌MNP指纹数据库的所有菌株的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳进行收集，得到产物，将产物通过紫外分光光度计检测DNA的质量。若所提取的DNA在230nm与260nm处的吸光度值的比值大于2.0，260nm与280nm吸光度值比值介于1.6与1.8之间，且DNA电泳主带明显，无明显降解和RNA残留，则说明基因组DNA达到相关的质量要求，可进行后续序列比对。
将实施例二提供的6份拷贝菌株K-1～K-6的测序数据进行序列比对后，获得每个菌株的序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示的MNP标记位点的主基因型，从而形成每个菌株的MNP指纹图谱，录入数据库文件，构建成百日咳鲍特菌的MNP指纹数据库。
所构建的每种菌的MNP指纹数据库基于检测的每种菌的基因序列，与所有的高通量测序数据兼容。通过将每次检测获得的菌株的MNP指纹图谱同已构建的MNP指纹数据库进行比对，将主基因型存在差异的菌株的MNP指纹图谱所构建的MNP指纹数据库，实现数据库的共建共享和时时更新。在本实施例中，采用上述10个MNP标记位点共同进行MNP指纹数据库的构建，在其他实施例中，还可以采用上述10个MNP标记位点中的任一个或任意几个的组合进行MNP指纹数据库的构建。
实施例五
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用该引物组对每个鲍特菌基因组上的10个MNP标记位点进行检测，根据获得的MNP标记位点的序列进行三种鲍特菌的区分鉴定的应用，10个MNP标记位点的序列如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示。
如实施例一表2和针对特异性评估的实验所示，获得本发明实施例提供的试剂盒获得含有三种鲍特菌的核酸样本的测序数据和MNP标记位点的基因型，将支持每种基因型的测序序列同三种鲍特菌的基因组序列库进行对比，经序列相似性分析，可以将上述10个MNP标记位点获得基因型匹配到三种鲍特菌中的一种。在表2的48组测序数据，均能同时匹配到三种鲍特菌。根据序列比对的结果，利用本发明实施例一所提供的质控方案，计算每种鲍特菌的信噪比，判定每种鲍特菌是否被检出。
如实施例一的特异性评估实验所示，在含有三种鲍特菌的病原菌的混合模板中，3次重复实验均能分别检出三种鲍特菌，同时，本实施例以MNP_5标记位点为例，验证三种菌在基因组上序列相似性，图1为序列相似性，且由左至右的横线依次为百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌，由图1可见，针对MNP_5标记位点可将百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌进行区分，在本实施例中，MNP_5标记位点这一个MNP标记位点即可检测出上述三种鲍特菌。此外，可以采用上述10个MNP标记位点中的任一个或任几个的组合进行三种鲍特菌的鉴定区分，也可以采用上述10个MNP标记位点共同对三种鲍特菌进行鉴定区分。可见利用该引物组可对三种鲍特菌进行鉴定区分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉明了生物科技有限公司、湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院）
<120> 一种鉴定三种鲍特菌的引物组、试剂盒及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 2
ttggaccgct gcgccaatc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaggccc ccacgctg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 3
cgccacgccc ttcgacat 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 4
cgttgccgga tgcgttgta 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 5
cggcgaagaa gcgagactat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 6
atcggccggc ccttgataaa a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 7
tacgcctggt aagccaaacg 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 8
gcaaagtagt gcccccac 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 9
acagttcctc cagccattgc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 10
atcgagcaga tcacgcatac c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 11
tacatcccgc tactgcaatc caa 23
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 12
cgtcttcccc tctgcgttt 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 13
agaaaccata gccaccgcc 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 14
gggacacgct catcaacgat 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 15
gtcagccagc agactcgc 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 16
ggaccaggct gccatggc 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 17
ggctgaaaat gtgcggcg 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 18
cgtagatctc ggcgcggg 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 19
gaagccgatg agcaccttgg 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 20
ctgcgccatg gcctctac 18
<210> 21
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 21
ttggaccgct gcgccaatcc ggctttttca agctccctca gggagctttt ttttttgccg 60
ccgggccgcc ccaaggcaaa aaagcctcct cggggggcag caagcccgca tagcgggcgc 120
agcgtggggg ccttttt 137
<210> 22
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 22
cgccacgccc ttcgacatca agctgaagga atgcccccag gcgctgggcg cgctcaagct 60
gtatttcgag cccggcatca ccaccaacta cgacacgggc gatctgattg cctacaagca 120
gacctacaac gcatccggca acg 143
<210> 23
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 23
cggcgaagaa gcgagactat agcacagaaa aaattcgtac gctggcgcta tgacaccaat 60
tttgcagttt cattaattat tttgtgcgcc cgcgctgttt tccctctgga atgaaccgcc 120
ccccttttta tcaagggccg gccgat 146
<210> 24
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 24
tacgcctggt aagccaaacg cgtcgtgcca ccgcgcgccg gaacacccgg cgcgcggttt 60
tttttgccgc cgggccgccc caaggcaaaa aagccccctc ggggggcagc aagcccgcat 120
agcgggcgca gcgtgggggc actactttgc 150
<210> 25
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 25
acagttcctc cagccattgc cgattagcgc gcgggtacgc caccttcacc ggcgcttgct 60
catggtgttg catcaccgac tgatgctcca ccgtcgggat gttcttgcgc ttggcttcgg 120
tatgcgtgat ctgctcgat 139
<210> 26
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 26
tacatcccgc tactgcaatc caacacggca tgaacgctcc ttcggcgcaa agtcgcgcga 60
tggtaccggt caccgtccgg accgtgctga cccccctgcc atggtgtgat ccgtaaaata 120
ggcaccatca aaacgcagag gggaagacg 149
<210> 27
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 27
agaaaccata gccaccgccg cccaccgtat tctcgccggc gtgccgtaca tggccggtca 60
gcgtcgcccg gttctcgata cgcgcggcat ccagacgcag atcgccgccc gcccgcacgc 120
tgcccagatc gttgatgagc gtgtccc 147
<210> 28
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 28
gtcagccagc agactcgcgc caatcccaac ccctacacat cgcgaaggtc cgtagcgtcg 60
atcgtcggca cattggtgcg catggcgccg gtgataggcg cttgcatggc gcggcaggcc 120
gaaagctccg aggccatggc agcctggtcc 150
<210> 29
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 29
ggctgaaaat gtgcggcgac tgccgcgtga tcgatctgta ttccgccgaa aacgaaaccc 60
ggatcaccga cctatgaacg tatccgtcac tttcgcctcc atcgccgccc cgggcttcga 120
cgaagaggtc gcccgcgccg agatctacg 149
<210> 30
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 30
gaagccgatg agcaccttgg cgccctttag gtcgtgcttg aggcgcacgc ggtcgatcag 60
gtcggcgtag atccgttcgg tcaatgcttc gccgacggcc atttcggcct ggttcggcgc 120
ttcctcggcc ttgtagaggc catggcgcag 150
Claims (4)
1.一种鉴定三种鲍特菌的引物组，所述三种鲍特菌为百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌，其特征在于，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对和第十引物对，每对所述引物对均包括正向引物和反向引物，
所述第一引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述第一引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第二引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第二引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述第三引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述第三引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述第四引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述第四引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：8所示，所述第五引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述第五引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：10所示，所述第六引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：11所示，所述第六引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：12所示，所述第七引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：13所示，所述第七引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：14所示，所述第八引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：15所示，所述第八引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：16所示，所述第九引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：17所示，所述第九引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：18所示，所述第十引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO：19所示，所述第十引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO：20所示。
2.一种鉴定三种鲍特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
4.一种如权利要求1所述的引物组的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述引物组对三种鲍特菌基因组上的10个MNP标记位点进行检测，根据获得的MNP标记位点的序列进行非诊断目的的三种鲍特菌的鉴定、区分、菌株间和菌株内部的遗传变异鉴定以及三种鲍特菌的MNP指纹数据库的构建，所述10个MNP标记位点的序列如序列表中SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30所示，所述三种鲍特菌为百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌。
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| GR01 | Patent grant | ||
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