CN114699538A - 一种核-壳式高效基因药物递送系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效基因药物递送系统及其制备方法。该递送系统由鱼精蛋白吸附基因形成的内核和酶敏感磷脂外壳所组成。鱼精蛋白吸附基因形成稳定的正电性内核，在负电性或中性磷脂层中插入酶敏感多肽形成负电性或中性外壳，构建的核‑壳纳米系统有助于基因药物的高效递送和转染。同时，此基因递送系统的磷脂外壳亦可以根据需要载入疏水性药物，实现基因药物和疏水性药物的高效联合治疗作用。本发明的核‑壳式高效基因递送系统原辅料生物安全性高且易获得，制备过程简单，易于产业化，经济成本低，绿色环保，且有效提升了基因药物的高效负载、稳定转运、靶向递送和高效转染，具有良好的安全性和有效性，同时赋予其和化学药物联合共递、协同治疗的可能性。
Description
技术领域
本发明属于药物基因载体材料技术领域，具体涉及一种高效基因药物递送系统及制备方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们对身体健康的要求也越来越高。但随之而来的各种疾病如癌症的发病率居高不下，在目前的临床治疗中，化学药物治疗依旧占据核心地位，但很多疾病仅依赖于化学治疗效果有限。
近年来，基因治疗在难治性疾病临床治疗中日益受到关注。该治疗方式是将外界正常基因或治疗基因，导入人体的靶细胞改善疾病的一种根本性的治疗手段。基因药物既可以单独使用，亦可以和其他不同治疗机制的化学药物联合使用，发挥其临床治疗作用。然而，基因药物大都由分子量大的刚性聚阴离子分子组成，不易透过生物膜，且极易被核酸酶降解，需要采用富含正电荷的载体对其进行有效压缩和高效转染，才能有效发挥其疗效。CN113683780A公开了一种侧链胍基化的聚氨基酸类阳离子基因递送载体，虽能有效压缩基因，但存在载体合成工艺复杂、正电荷载体体内具有较大毒性问题。WeiweiWan等(Journalof Controlled Release：242(2016):71-79)报道了一种在聚[(e-己内酯)-共糖苷](CG)上接枝25kDa聚乙烯亚胺(PEI25)和聚乙二醇(PEG)，将两亲性PEI-CG-PEI和PEG-CG嵌段共聚物用于通过PEI-CG-PEI的自组装或两种共聚物的共组装来形成胶束，用于DNA和siRNA递送。然而，选用高分子量25kDa的阳离子材料PEI构建载体存在诸多严重问题，如较强的正电荷带来的细胞毒性、高分子量PEI体内不易降解带来的安全性问题。
在高效递送基因的基础上，载体若能同时负载化学药物，将为实现基因药物和化学药物的稳定共递、协同治疗提供可行性。然而，基因药物为水溶性生物大分子药物，而化学药物相当一部分是疏水性小分子，存在溶解度差、吸收率低的问题，实现二者的有效共递往往具有更大的挑战性。Guan等(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,162(2018):326-334)报道了一种基于壳聚糖接枝聚(N-3-碳苄氧基赖氨酸)(CPCL)并修饰有细胞穿膜肽(CPP)的阳离子胶束，用于化学药物阿霉素(DOX)和基因药物p53质粒的共同递送，该递送系统虽可有效促进靶细胞的摄取，但存在载体合成工艺复杂、药物与基因药物入胞后释药速度不可控、阳离子载体存在一定毒性等问题。中国专利CN104758952A亦公开了一种三苯基膦衍生物-氯尼达明前药载体(TCPL)-siRNA-含有靶向配基的聚乙二醇/聚丙烯酸(TCPL-siRNA-PPX)纳米递送系统用于药物与基因的共递送。该递送系统虽可以将基因药物与化疗药物靶向递送至目标部位，但其存在前药化学偶联量有限、合成工艺十分繁琐、负电荷的载体细胞摄取效率低等缺陷。
鱼精蛋白(protamine)作为一种天然的基因药物递送材料，具有较强的基因吸附能力和高效的转染效率。此外，作为临床使用药物，鱼精蛋白毒副作用低，且不会引起外源性过敏反应。但鱼精蛋白吸附基因后形成的纳米粒带有强正电荷的特性易吸附非特异性蛋白，在血液循环中极不稳定，易被单核吞噬系统(MPS)识别和清除，导致其无法达到作用位点。Ke Men等(RSC Advances,8(2018):12104-12115)报道了一种以阳离子脂质材料DOTAP制备的阳离子脂质体与鱼精蛋白构成复合物用于VSVMP mRNA(CLPP/mRNA)的递送。该体系具有非常高的正电荷密度，虽然能够有效压缩基因，但同时大量的正电荷在体内亦会带来较大的毒副作用，且基因由于和载体材料强烈的电荷相互作用造成释放过慢、疗效难以发挥的问题。P.Vader等(Journal of Controlled Release,160(2012):211-216)报道了一种类似的阳离子脂质材料DOTAP和鱼精蛋白形成的复合物用于DNA和siRNA混合物的递送，为了遮蔽其正电荷，进一步采用RGD-PEG-DSPE和PEG-DSPE进行表面修饰，虽PEG可部分遮蔽其正电荷，但仍未解决基因药物释放缓慢的问题。
基于以上，本专利开发了一种新型的核-壳式高效基因递送系统，其由鱼精蛋白吸附基因形成的内核和酶响应磷脂外壳组成。该体系的优势在于：1)所有用的原辅料易获得，且具有生物相容性好、生物可降解及无免疫原性的特点；2)该体系采用核-壳结构，其正电荷的内核可以高效压缩基因；中性或负电性的外壳可有效遮蔽内核的正电荷，并保护基因达到体内稳定运输的作用；3)该体系抵达靶部位，其外壳能够响应靶点存在的酶解体，暴露出正电性内核，使其易被靶细胞摄取，有效提高基因的转染能力，发挥疗效；4)可根据需要进一步在该体系的磷脂外壳负载疏水性药物，且疏水性药物可随磷脂外壳的酶触发解体而快速释放，达到实现基因药物和疏水性药物的稳定共载及高效联合治疗的目的。该递送系统不仅为基因的高效递送和有效转染创造了平台，亦为基因药物和化学药物的高效联用创造了平台，可大大提升临床治疗效果，其制备工艺简单，质量可控，且安全性良好，具有较高临床转化潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种核-壳式高效基因药物递送系统，该递送系统由鱼精蛋白吸附基因形成的内核和酶敏感磷脂外壳组成。其中该递送系统使用天然基因递送材料鱼精蛋白压缩基因，与化学合成阳离子载体相比具有更好的可降解性和更低的免疫源性。同时，使用中性或负电性的酶敏感载药磷脂包被带正电荷内核，屏蔽基因载体的正电荷作用，降低制剂在血液系统中的非特异性吸附，实现稳定输运，抵达作用部位，磷脂外壳可响应靶点的酶解体，暴露出正电荷内核，有助于其被靶细胞摄取，发挥更好地基因沉默效果。此外，该基因递送系统的磷脂外壳还可以根据需要负载疏水性药物，在作用靶点存在的酶刺激下，磷脂外壳可响应性解体并快速释放出疏水性药物，实现疏水性药物和基因药物的精准共递，达到高效协同治疗。该核-壳式高效基因药物递送系统具有制备工艺简单，质量可控，可利用符合cGMP生产的在线脂质体挤出器制备实现放大生产，具有较好的商业转化前景的优点。
本发明的第二个目的是提供上述核-壳式高效基因药物递送系统的制备方法。
技术方案：本发明的提供一种高效基因药物共递送系统，该递送系统由鱼精蛋白吸附基因形成的内核和酶敏感磷脂外壳组成。
具体地，上述鱼精蛋白吸附基因形成的内核由鱼精蛋白和基因组成。
上述酶敏感磷脂外壳由酶敏感多肽、胆固醇和中性或负电性磷脂组成。
上述酶敏感磷脂外壳可以根据需要进一步载入疏水药物。
上述基因是DNA、siRNA、shRNA、mRNA、miRNA和CRISPR中的任一或多种。
上述酶敏感多肽是基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、成纤维细胞激活蛋白酶、组织蛋白酶B、分泌型磷脂酶A2、α-淀粉酶、赖氨酰基氧化酶、β-葡萄糖醛酸苷酶敏感多肽中的任一或多种。
上述中性或负电性磷脂为天然磷脂、甘油-3-磷酸胆碱(PC)、甘油-3-磷酸乙醇胺(PE)、甘油-3-磷酸-L-丝氨酸钠盐(PS)、磷脂酰-DL-甘油(PG)、甘油-3-磷酸钠盐(PA)类磷脂及其衍生物中的任一或多种。
上述酶敏感磷脂外壳与鱼精蛋白吸附基因形成的内核的质量比在10:1-2000:1之间。
上述鱼精蛋白与基因的质量比在1:1-50:1之间。
上述中性或负电性磷脂与胆固醇的质量比在之间1:1-100:1。
上述中性或负电性磷脂与酶响应多肽的质量比在2:1-100:1之间。
上述一种核-壳式高效基因递送系统的粒径为10-1000nm。
本发明提供上述高效核-壳式基因药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
1)称取鱼精蛋白粉末，用HEPES溶液溶解完全后与基因药物溶液混合均匀制得鱼精蛋白吸附基因的内核；
2)称取中性或负电性磷脂、胆固醇和疏水性药物(可无)，并用有机溶剂溶解完全后置于反应瓶中，再加入酶敏感多肽溶解完全后，减压蒸发有机溶剂得到均匀的薄膜层；加入磷酸盐缓冲溶液水化一段时间，得到的混悬液挤压过膜，所得液体再加入鱼精蛋白吸附基因的内核混合均匀，再次挤压过膜，最后制得核-壳式高效基因递送系统或疏水性药物和基因药物共递送系统；
步骤2)中使用有机溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺或正己烷中的任一或多种。
更具体地，上述核-壳式高效基因药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
1)精密称取鱼精蛋白粉末，使用HEPES溶液(10mM，pH 7.2)充分溶解，同时根据不同基因药物选择使用恰当的溶液配置基因药物溶液，两者按照一定的比例混合均匀后制得鱼精蛋白吸附基因的内核；
2)精密称取中性或负电性磷脂磷脂、胆固醇和疏水性药物(可无)，使用适量有机溶剂溶解完全后，置于反应瓶中，再加入一定量酶敏感多肽溶解完全后，在达到有机溶剂减压沸点温度条件下减压蒸发有机溶剂使在瓶壁上形成均匀的薄膜层。向磷脂膜中加入适当体积PBS(pH 7.4)水化30min。将得到的混悬液先后使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器各来回挤压10-30次。然后再按照一定质量比加入鱼精蛋白吸附基因的内核溶液混合均匀，再次使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器各来回挤压10-30次，最终制得到具有核-壳式高效基因递送系统或疏水性药物和基因药物共递送系统。
本发明提供上述核-壳式高效基因药物递送系统的另一种制备方法，包括以下步骤：
1)称取鱼精蛋白粉末，用HEPES溶液溶解完全后与基因溶液混合均匀制得鱼精蛋白吸附基因的内核；
2)称取中性或负电性磷脂、胆固醇和疏水性药物(可无)，并用有机溶剂溶解完全后置于反应瓶中，再加入酶敏感多肽溶解完全后，减压蒸发有机溶剂得到均匀的薄膜层；加入鱼精蛋白吸附基因的内核溶液水化一段时间，挤压过膜，最后制得到核-壳式基因药物递送系统或疏水性药物和基因药物共递送系统。
步骤2)中使用有机溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺或正己烷中的任一或多种。
更具体地，上述高效核-壳式基因药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
1)精密称取鱼精蛋白粉末，使用HEPES溶液(10mM，pH 7.2)充分溶解，同时根据不同基因药物选择使用恰当的溶液配置基因溶液，两者按照一定的比例混合均匀后制得鱼精蛋白吸附基因的内核；
2)精密称取中性或负电性磷脂磷脂、胆固醇和疏水性药物(可无)，使用适量有机溶剂溶解完全后，置于反应瓶中，再加入一定量酶敏感多肽溶解完全后，在达到有机溶剂减压沸点温度条件下减压蒸发有机溶剂使在瓶壁上形成均匀的薄膜层。向磷脂膜中加入适当体积鱼精蛋白吸附基因的内核溶液水化30min后先后使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器来回挤压10-30次，最后制得到具有核-壳式基因药物递送系统或疏水性药物和基因药物共递送系统。
本发明作用原理：
本发明所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统的作用原理如下：经静脉注射给药后，该递送系统由于其纳米级结构及表面中性或负电性特征而在体内稳定输运，到达靶组织，在靶组织特有酶的刺激下，外层磷脂解体暴露出富含正电荷的基因内核，有助于其被靶细胞摄取，有效提高基因转染能力，发挥疗效。同时，该基因递送系统磷脂外层可根据需要负载疏水性药物，在靶点酶刺激下，磷脂层解体的同时会快速释放出疏水性药物发挥其药理活性，和基因药物发挥最大的协同治疗效果。该递送系统可有效实现基因药物的稳定负载和高效转染，并为基因药物和疏水性药物联合递送、协同增效提供可能性。
有益效果
如何将基因药物有效高效递送至靶部位一直是本领域技术的问题，现有技术解决方法采用的纳米递送系统仍存在以下问题：1)采用正电荷辅料压缩基因，若正电荷过强，虽能有效压缩并能高效转染，但在体内存在较大的毒性，且易被吞噬系统清除；若正电荷过少，基因则负载不稳定，在血液循环中易被体内核酸酶、酯酶等降解，半衰期短；2)若采用负电荷辅料掩盖载体的强正电荷，虽然能提高安全性，但其载体的负电性表面会造成入胞困难、基因转染效率偏低的问题；3)目前的基因递送系统无法有效负载性质迥异的疏水性药物，难以满足联合治疗的要求。本发明的具有核-壳式高效基因药物递送系统是全新的一种递送系统，可有效解决以上问题，且相关体外、细胞、动物实验均有效证明该递送系统在血液循环中具有优异的稳定性、可有效的将基因稳定递送至靶部位、并实现高效转染，同时还可以根据需要负载疏水性药物进行有效的联合治疗。
1、本递送系统由鱼精蛋白构成的内核和负电性或中性磷脂构成的外壳组成，阳离子内核可实现基因药物的有效压缩和负载，中性或负电性磷脂外壳可遮蔽内核正电荷且可保护内核基因药物的稳定负载和体内稳定转运。
2、在作用靶点存在的酶刺激下，磷脂外壳可响应性解体，同时暴露出富含正电荷的基因内核，有助于其被靶细胞摄取，有效提高基因的转染。
3、本递送系统可以根据联合用药需要，在其磷脂外壳负载疏水性药物，并可实现疏水性药物和基因在靶点的有效释放及高效转染，最大程度发挥二者的协同增效作用，大大提升临床治疗效果，为探究更多的药物组合模式提供了新的设计思路。
4、本发明的核-壳式高效基因递送系统原辅料生物安全性高且易获得，制备过程简单，易于产业化，经济成本低，绿色环保。
附图说明
图1为MSL/Pro-siPD-L1递送系统的透射电镜图，A为原图，B为局部放大图；
图2为MSL/Pro-siPD-L1递送系统响应性形形态学变化图，其中A为在未使用MMP2酶孵育的情况下电镜图，B为在使用MMP2酶孵育的情况下电镜图；
图3为MSL/Pro-siPD-L1递送系统响应性电荷翻转图；
图4为MSL/Pro-siPD-L1递送系统血清稳定性结果图；
图5为MSL/Pro-siNC递送系统的细胞毒性结果；
图6为MSL/Pro-sicy5递送系统的细胞摄取结果图；
图7为MSL/Pro-siLuc递送系统基因转染效率的结果图；
图8为MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统响应性体外药物释放图；
图9为MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统治疗乳腺癌荷瘤小鼠后的肿瘤图；
图10为MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统治疗乳腺癌荷瘤小鼠后的肿瘤体积-时间图；
图11为MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统治疗乳腺癌荷瘤小鼠后的肿瘤瘤重图；
图12为MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统治疗乳腺癌荷瘤小鼠后肿瘤PD-L1蛋白表达结果图，其中A为肿瘤组织PD-L1蛋白免疫组化图，B为肿瘤组织PD-L1蛋白半定量结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1
以沉默PD-L1蛋白的siRNA(siPD-L1)为例，构建一种核-壳式高效基因药物递送系统MSL/Pro-siPD-L1，其制备和表征如下：
(1)核-壳式高效基因递送系统的制备
1)称取鱼精蛋白粉末适量，使用HEPES溶液(10mM，pH 7.2)溶解，同时使用DEPC溶液配置20mM浓度的siPD-L1溶液，两者按照3:1质量比涡旋混合5min，制得鱼精蛋白吸附PD-L1 siRNA的纳米核(Pro-siPD-L1)
2)按照1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC):胆固醇(w:w:)＝10:1的质量比精密称取各组分，使用二氯甲烷溶解完全后，加入2mg miniPEG-G(C14)PLGIAGQ(C14)-miniPEG(MMP2酶响应多肽)。在37℃条件下，减压除去有机溶剂，使溶液在瓶壁上形成均匀的薄膜层。向磷脂膜中加入pH 7.4磷酸盐缓冲液水化30min。将得到的混悬液先后使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器来回挤压各20次，然后按照MSL:Pro-siPD-L1(w:w)＝200:1的质量比加入Pro-siPD-L1纳米核溶液混合均匀，再次使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器来回挤压各20次，最终制得具有核-壳式结构的高效基因药物递送系统MSL/Pro-siPD-L1。
(2)递送系统的表征
使用Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instrument，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光条件下测定样品粒径及电位，结果见表1。
表1MSL/Pro-siPD-L1纳米递送系统的表征
取1滴MSL/Pro-siPD-L1溶液，滴在铜网上，并使用2％磷酸钨溶液进行复染，室温下晾干，使用透射电镜(TEM)拍摄粒子形态。如图1所示，MSL/Pro-siPD-L1纳米粒呈现典型的“核-壳”形态，中间为类球形的Pro-siPD-L1纳米核，外层为白色的磷脂外壳，且外层磷脂厚度约为10nm，与TEM中观察Pro-siPD-L1纳米核的大小相比，MSL/Pro-siPD-L1所增加的厚度刚好为磷脂层的厚度。这也与二者在溶液状态中所测量的粒径大小一致，表明载有siPD-L1的高效核-壳式基因药物递送系统成功构建。
实施例2
MSL/Pro-siPD-L1递送系统的体外响应性形态学变化评价
将实施例1制备得到的MSL/Pro-siPD-L1递送系统，分别使用PBS(pH 7.4)、MMP2酶溶液(pH 7.4)孵育6h。随后将制剂滴在铜网上，并使用2％磷酸钨复染，在室温下静置晾干，使用透射电镜观察粒径形态变化。
如图2所示，在未使用MMP2酶孵育的情况下，响应性MSL/Pro-siPD-L1的外壳清晰可见(图2A)，但是使用MMP2酶孵育后磷脂外壳解离，暴露出带正电荷的纳米核(图2B)。以上结果进一步表明在MMP2酶的孵育下，MSL/Pro-siPD-L1递送系统具有酶响应脱去磷脂外壳的能力。
实施例3
MSL/Pro-siPD-L1递送系统的体外响应性电荷翻转评价
为了深入考察实施例1制备得到的MSL/Pro-siPD-L1递送系统的酶响应能力。将与MSL/Pro-siPD-L1与MMP2酶进行孵育，在0、1、2、4、6h分别检测纳米递送系统的Zeta电位。
如图3所示，响应性MSL/Pro-siPD-L1纳米递送系统表面电荷为-3.8mV，该zeta电位有助于纳米粒在体内的稳定运输。将该纳米系统在与MMP2酶孵育6h内，电荷从-3.8mV逐渐升高到+13.2mV，表明在MMP2酶的作用下，MSL/Pro-siPD-L1实现了电荷的翻转，表明在MMP2酶的孵育下，MSL/Pro-siPD-L1纳米递送系统具有快速酶响应脱去磷脂外壳的能力，并暴露出带有正电荷的纳米内核，有利于提高细胞摄取纳米内核的能力，增强基因药物的递送效率。
实施例4
MSL/Pro-siPD-L1递送系统血清稳定性考察
将MSL/Pro-siPD-L1与10％血清(FBS)分别孵育2、4、6、8、12、16和24h，在不同时间点，取溶液测量粒径和电位，评价递送系统的血清稳定性。
如图4所示，MSL/Pro-siPD-L1递送系统与10％FBS孵育时，粒径和电位24h内都未发生明显变化，表明其具有较好的血清稳定性。
实施例5
MSL/Pro-siNC递送系统细胞毒性考察
按照实施例1中的制备方法，将siPD-L1替换成siNC制备得到MSL/Pro-siNC递送系统，以考察空白基因递送系统的细胞毒性。将鼠源乳腺癌4T1细胞和小鼠成纤维NIH 3T3细胞按照5000个/孔的密度各种植于96孔板，待细胞过夜贴壁后，弃去培养基，加入新鲜完全培养基，加入MMP2酶孵育4h后加入不同浓度的MSL/Pro-siNC，并设置对照组，各组均设置6个重复，于二氧化碳培养箱中培养48h。培养终止时，向每孔中加入20μL MTT溶液，于培养箱中继续培养4h，然后弃去各孔溶液，加入150μL DMSO溶液，将孔板置于水平摇床以800rpm混匀4min促进结晶紫溶解，使用酶标仪在570nm处测量每孔吸光度，以计算细胞存活率。
如图5结果显示，MSL/Pro-siNC递送系统对两种细胞均无明显毒性，显示其优越的安全性。
实施例6
MSL/Pro-siCy5递送系统细胞摄取能力考察
按照实施例1中的制备方法，将siPD-L1替换成siCy5制备得到带荧光的酶响应MSL/Pro-siCy5递送系统。将miniPEG-G(C14)PLGIAGQ(C14)-miniPEG(MMP2酶响应多肽)替换成miniPEG-G(C14)GGPALIQ(C14)-miniPEG(非MMP2酶响应多肽)制备得到带荧光的非酶响应MNL/Pro-siCy5递送系统。
将4T1细胞按照1×106个/孔的密度种植于共聚焦皿中，待细胞过夜贴壁后，弃去培养基，加入不含血清的1640培养基。然后分别加入MSL/Pro-siCy5和MMP2酶预处理过MSL/Pro-sicy5和MNL/Pro-sicy5与细胞共孵育4h。4h后，使用预冷的PBS清洗细胞三次，使用4％的多聚甲醛固定细胞10min，结束后再次使用PBS进行清洗，使用DAPI染色液对细胞核进行避光染色10min，随后使用PBS清洗，使用CLSM观察Cy5荧光强度。
如图6所示，使用MMP2酶预处理后，细胞对MSL/Pro-siCy5的摄取量大大增加，且MSL/Pro-siCy5的摄取量高于MNL/Pro-siCy5组，这是因为MMP2酶孵育后，MSL/Pro-Cy5可酶响应性脱去外壳，暴露出带有正电荷的Pro-siCy5纳米核，细胞对Pro-siCy5纳米核的细胞摄取能力显著提高，而MNL/Pro-siCy5无法实现酶响应性脱去外壳，细胞对其摄取能力较弱。以上结果证明本实施例构建的MMP2酶响应核-壳递送系统展现了良好的MMP2酶响应脱壳能力，受益于这种MMP2酶的快速响应裂解外壳，细胞摄取纳米内核的能力提高，预示着较高的基因转染效率。
实施例7
MSL/Pro-siLuc递送系统基因转染效率的考察
按照实施例1中的制备方法，将siPD-L1替换成siLuc制备得到带荧光的酶响应MSL/Pro-siLuc递送系统。将miniPEG-G(C14)PLGIAGQ(C14)-miniPEG(MMP2酶响应多肽)替换成miniPEG-G(C14)GGPALIQ(C14)-miniPEG(非MMP2酶响应多肽)制备得到带荧光的非酶响应MNL/Pro-siLuc递送系统。
荧光素酶报告基因是一种常用的阳性基因，在荧光素酶的作用下，催化底物氧化，生成氧化荧光素，因此可以通过沉默荧光素酶报告基因来验证载体转染siRNA的有效性。双荧光素酶检测试剂盒，可分别检测萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶发光强度，使用海参荧光素酶发光强度为内参，可消除因细胞数量的不同带来的误差。将4T1-Luc生物素荧光细胞按照1×104个/孔的密度接种于12孔板，12～18h细胞贴壁后，更换新鲜培养基以及药物，设置空白组、MSL/Pro-siNC组、游离的siLuc组(Naked siLuc)、MNL/Pro-siLuc组、MSL/Pro-siLuc组。MMP2响应组在给药前均使用MMP2酶预处理4h，各组中siLuc的终浓度为100nM，在培养箱中培养48h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒，裂解细胞后，取20μL裂解液于避光96孔板中，加入萤火虫荧光素酶底物，使用酶标仪在560nm处检测萤火虫荧光素报告基因活性，然后在上述反应液中加入100μL新鲜配置的海肾荧光素酶底物，使用酶标仪在465nm处检测海肾荧光素报告基因活性。以海参荧光素酶活力为内参，计算萤火虫荧光素酶相对表达强度。
图7实验结果表明，转染阴性基因的MMP2响应性MSL/Pro-siNC和游离的siLuc均不能沉默荧光素酶报告基因。MNL/Pro-siLuc对荧光素酶报告基因的沉默效果只有31.2％左右，这可能是由于其在MMP2酶的作用下，缺少酶响应多肽无法实现响应性脱壳，释放出递送基因的纳米核较少，限制了其基因沉默效果，而转染阳性基因的MMP2响应性MSL/Pro-siLuc对荧光素酶报告基因的沉默效应达到了72.1％。从结果可知，本实施例构建的MMP2酶响应核-壳递送系统能够在MMP2酶的作用下，提高细胞摄取载有基因的内核的能力，拥有较高的基因转染效率，能够发挥优异的基因沉默效果。
实施例8
以沉默PD-L1蛋白的siRNA(siPD-L1)和TGF-β小分子抑制剂LY3200882为例，在磷脂外壳负载疏水性药物LY3200882，制备高效核-壳式疏水性药物和基因药物共递送系统MSL-LY/Pro-siPD-L1，其制备和体外响应性释药评价如下：
(1)递送系统的制备
1)称取鱼精蛋白粉末适量，使用HEPES溶液(10mM，pH 7.2)溶解，同时使用DEPC溶液配置20mM浓度的siPD-L1溶液，两者按照5:1质量比涡旋混合5min，制得鱼精蛋白吸附PD-L1 siRNA的纳米核(Pro-siPD-L1)
2)按照1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC):胆固醇:LY3200882(w:w:w)＝50:4:1的质量比精密称取各组分，使用二氯甲烷溶解完全后，加入3mg miniPEG-G(C14)PLGIAGQ(C14)-miniPEG(MMP2酶响应多肽)。在37℃条件下，减压除去有机溶剂，使溶液在瓶壁上形成均匀的薄膜层。向磷脂膜中加入pH 7.4磷酸盐缓冲液水化30min。将得到的混悬液先后使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器来回挤压各20次，然后按照MSL-LY:Pro-siPD-L1(w:w)＝500:1的质量比加入Pro-siPD-L1纳米核溶液混合均匀，再次使用0.4μm和0.2μm孔径刻蚀孔膜的脂质体挤出器来回挤压各20次，最终制得具有核-壳式疏水性药物和基因药物共递送系统MSL-LY/Pro-siPD-L1。
(2)体外响应性释药评价
按照上述制备方法，将miniPEG-G(C14)PLGIAGQ(C14)-miniPEG(MMP2酶响应多肽)替换成miniPEG-G(C14)GGPALIQ(C14)-miniPEG(非MMP2酶响应多肽)制备得到非酶响应MNL-LY/Pro-siPD-L1递送系统。将MSL-LY/Pro-siPD-L1与MNL-LY/Pro-siPD-L1纳米递送系统分别装入透析袋中(MWCO＝3500D)，并加入终浓度为10μM的MMP2酶，尽量排除透析袋中空气，并放入到50mL装有透析介质(含有0.3％Tween 20的PBS溶液，pH＝7.4)广口瓶中，打开水平摇床，设置温度为37℃，转速为100±5rpm，并在不同的时间点(0、1、2、4、6、12、24h)取释放介质1mL，并加入等量的新鲜配置的释放介质，以恢复原有体积。测定释放介质中LY3200882的含量，通过计算并制作累积释放曲线。
如图8所示，非酶响应MNL-LY/Pro-siPD-L1递送系统在24h内也仅仅只有35％的LY释放量，并不能实现LY的快速释放，而酶响应MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统在6h内就有63.1％的LY3200882释放出来，实现了LY3200882的快速响应释放。结果表明MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统具有快速酶响应释药能力。
实施例9
MSL-LY/Pro-siPD-L1纳米递药系统的联合治疗药效学评价
按照实施例8中的制备方法，将miniPEG-G(C14)PLGIAGQ(C14)-miniPEG(MMP2酶响应多肽)替换成miniPEG-G(C14)GGPALIQ(C14)-miniPEG(非MMP2酶响应多肽)得到非酶敏感对照共递送载体MNL-LY/Pro-siPD-L1递送系统。
将雌性小鼠按照1×106个鼠源乳腺癌4T1细胞和5×105个成纤维NIH/3T3细胞的剂量接种于小鼠左侧乳腺脂肪垫中，即建立小鼠原位乳腺癌肿瘤模型。当肿瘤体积增长至200mm3时，随机分成4组，每组5只，分别尾静脉注射生理盐水、MSL/Pro-siPD-L1、MNL-LY/Pro-siPD-L1和MSL-LY/Pro-siPD-L1，其中PD-L1 siRNA的剂量为1mg/kg，LY3200882的含量为20mg/kg，每3天给药一次，连续给药6次。定期用游标卡尺测定肿瘤的长径a(mm)与短径b(mm)，并采用公式Tumor volume(mm3)＝a×b2/2计算原位肿瘤体积(Tumor volume，mm3)从给药开始，每3天监测并及记录一次小鼠原位肿瘤体积，并绘制肿瘤体积(Tumor volume，mm3)-时间(Time，day)曲线。最后一次给完药后处死小鼠，解剖肿瘤组织，称重并拍照。
如图9-11所示，MSL/Pro-siPD-L1由于只能靶向递送基因沉默PD-L1的表达，并不能起到很好的抑瘤效果。当高效核-壳式基因药物递送系统负载上疏水性药物LY3200882后，非酶敏感MNL-LY/Pro-siPD-L1和敏感组MSL-LY/Pro-siPD-L1组均呈现了较好的抑瘤效果，且得益于基因治疗与疏水性药物的联合治疗，响应性MSL-LY/Pro-siPD-L1递送系统展现了最强抗肿瘤药效，肿瘤体积增长速度最慢，肿瘤体积最小且瘤重最小。其原因是响应性MSL-LY/Pro-siPD-L1可快速释放出TGF-β受体抑制剂LY3200882削弱肿瘤基质屏障，重塑肿瘤免疫抑制微环境，脱下酶敏感磷脂外壳后显露出带有正电荷的基因内核，从而进一步增强Pro-siPD-L1纳米核的渗透，有效发挥两者显著的协同抗肿瘤药效。
将解剖得到的肿瘤组织进一步进行PD-L1蛋白免疫组化分析。由图12所示，受益于中性或负电性磷脂外壳对内核正电荷的屏蔽，内核基因药物可稳定负载和在体内稳定转运，使得MSL/Pro-siPD-L1、MNL-LY/Pro-siPD-L1和MSL-LY/Pro-siPD-L1均可有效降低PD-L1的表达，但MNL-LY/Pro-siPD-L1由于不能有效实现酶响应性细胞外脱壳，LY3200882无法快速释放发挥重塑肿瘤微环境药效，且无法暴露出正电荷基因内核促进摄取，使得基因内核摄取依旧受到阻碍，基因转染效率较MSL-LY/Pro-siPD-L1低下，而MSL-LY/Pro-siPD-L1受益于核-壳纳米系统对LY3200882和PD-L1 siRNA的有效共递送，可显著性降低肿瘤组织中PD-L1蛋白的表达。
Claims (10)
1.一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于，该递送系统由鱼精蛋白吸附基因药物形成的内核和酶敏感磷脂外壳组成。
2.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于：鱼精蛋白吸附基因药物形成的内核由鱼精蛋白和基因药物组成。
3.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于：酶敏感磷脂外壳由酶敏感多肽、胆固醇和中性或者负电性磷脂组成。
4.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物共递送系统，其特征在于：酶敏感磷脂外壳可以根据联合用药的需要载入疏水性药物。
5.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物共递送系统，其特征在于：基因药物是DNA、siRNA、shRNA、mRNA、miRNA或CRISPR中的任一或多种。
6.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于：酶敏感多肽是基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、成纤维细胞激活蛋白酶、组织蛋白酶B、分泌型磷脂酶A2、α-淀粉酶、赖氨酰基氧化酶、β-葡萄糖醛酸苷酶敏感多肽中的任一或多种。
7.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于：中性或者负电性磷脂为天然磷脂、甘油-3-磷酸胆碱、甘油-3-磷酸乙醇胺、甘油-3-磷酸-L-丝氨酸钠盐、磷脂酰-DL-甘油、甘油-3-磷酸钠盐类磷脂及其衍生物中的任一或多种。
8.根据权利要求1所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于，所述酶敏感磷脂外壳与鱼精蛋白吸附基因形成的内核的质量比为10:1-2000:1；所述的鱼精蛋白与基因的质量比为1:1-50:1；所述的中性或负电性磷脂与胆固醇的质量比为1:1-100:1；所述的中性或负电性磷脂与酶响应多肽的质量比为2:1-100:1。
9. 根据权利要求1-7任意一项所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统，其特征在于递送系统粒径为10-1000 nm。
10.根据权利要求1-7任意一项所述的一种核-壳式高效基因药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
1）称取鱼精蛋白粉末，用HEPES溶液溶解完全后与基因药物溶液混合均匀制得鱼精蛋白吸附基因的内核；
2）称取中性或负电性磷脂、胆固醇和疏水性药物（可无），并用有机溶剂溶解完全后置于反应瓶中，再加入酶敏感多肽溶解完全后，减压蒸发有机溶剂得到均匀的薄膜层；加入磷酸盐缓冲溶液水化一段时间，得到的混悬液挤压过膜，所得液体再加入鱼精蛋白吸附基因的内核混合均匀，再次挤压过膜，最后制得核-壳式基因药物递送系统或疏水性药物和基因药物的共递系统；
步骤2）中使用有机溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺或正己烷中的任一或多种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220705 |
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