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CN114681600A - 通用性多肽疫苗及其在制备治疗/预防胰腺癌药物中的应用 - Google Patents

通用性多肽疫苗及其在制备治疗/预防胰腺癌药物中的应用 Download PDF

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CN114681600A
CN114681600A CN202111665972.9A CN202111665972A CN114681600A CN 114681600 A CN114681600 A CN 114681600A CN 202111665972 A CN202111665972 A CN 202111665972A CN 114681600 A CN114681600 A CN 114681600A
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CN
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polypeptide
tumor
pancreatic cancer
vaccine
cells
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CN202111665972.9A
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周秀卿
林志伟
陈荣昌
马治明
刘慧敏
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Original Assignee
Hangzhou Neoantigen Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种通用性多肽疫苗，包括KRAS‑G12R突变；该通用性多肽疫苗能用于制备治疗/预防癌症(胰腺癌)的药物。本发明的通用性多肽疫苗对胰腺癌具有较好的免疫治疗效果。

Description

通用性多肽疫苗及其在制备治疗/预防胰腺癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种适用于胰腺癌治疗及预防的通用性多肽疫苗。
背景技术
胰腺癌(PAAD)是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。其发病率 和死亡率近年来明显上升，是预后最差的恶性肿瘤之一。与其他恶性肿瘤相比，胰腺癌是新 发病例和死亡病例最接近的癌种，间接表明胰腺癌的难治性。另一方面，统计报告中明确指 出，随着近年来肿瘤诊疗水平的普遍提高，多数恶性肿瘤的生存率呈现逐年稳步上升趋势， 唯独胰腺癌和肺癌的生存率却上升的非常缓慢，即使在美国，胰腺癌的五年相对生存率也只 有8％。
目前，胰腺癌根本的治疗原则仍然是以外科手术治疗为主，放疗、化疗为辅。胰腺癌的 早期诊断困难，手术切除率低，术后五年生存率也低并且对放疗敏感性较低；化疗药物对杀 灭肿瘤细胞并无特异性，在杀死癌细胞的同时也会大量杀死正常细胞现，使人体出现恶心、 呕吐、脱发、白细胞减少等毒、副作用，常常使病人难以耐受；强大的毒副作用使化疗难以 执行，过度化疗可能缩短患者的存活期。当传统的治疗方法不能够带来最好的治疗获益，靶 向药治疗也作为一种可选的治疗方法，目前经中国CFDA批准的胰腺癌常用药物包括 Gemcitabine,Capecitabine和Erlotinib。但靶向药治疗也同样存在副作用较大的问题，而且随 着用药时间的加长，病人很容易出现耐药性，从而对靶向药不敏感。相较于上述方法的弊端， 免疫治疗显示出光明前景，但却只有一小部分人有效。以pembrolizumab为例，在黑色素瘤 中有效率只有33％，在其它肿瘤中的有效率大多也在10-30％之间。
在此背景下，肿瘤疫苗开始受到重视，利用肿瘤多肽疫苗诱导机体免疫应答从而消灭癌 细胞的方法更为安全，有效。肿瘤多肽疫苗是一种精准的医疗策略，它可以特异性靶向癌细 胞，理论上可以做到消除所有肿瘤及其转移灶。近年来，由于肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗 原的发现，以及人们对肿瘤诱导免疫应答和肿瘤逃避免疫监视机制的深入研究和理解，肿瘤 多肽疫苗的研究已经取得了可喜的成就。2008年，Yang B等人利用KRASG12V突变多肽负 载树突状细胞，在小鼠体内引起了强烈的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，能够特异性的杀 伤胰腺癌细胞。2010年，Synne Wedén等人研究发现，KRAS氨基酸序列上第5-21位，长度 为17且其中第12位氨基酸发生突变的多肽序列，在胰腺癌患者体内能够引起强烈的免疫反 应，并且能够有效的延长胰腺癌患者的生存周期。多项研究表明，肿瘤多肽疫苗在肿瘤治疗 甚至治愈方面有着特殊的优势和光明的前景。
个体化多肽疫苗的一般设计流程，是根据肿瘤患者的个体遗传基因结构和功能差异，找 出患者肿瘤组织特有的体细胞突变，分析出这些突变产生的新生抗原，用化学合成方法制备 能够被患者组织相容性复合体(MHC)特异识别的多肽疫苗，注入患者体内，激活特异性T细 胞应答和免疫风暴。然而，如果按照目前的个体化设计方法，必须针对每一位患者单独制备 一组疫苗序列和治疗方案，这些序列和方案的普适性极低。目前从患者样本采集，到遗传信 息检测，再到多肽疫苗制备完成，整个过程需要花费大概70-90天左右的时间。期间，患者 不仅要遭受身体不适的煎熬，而且一旦病情有所恶化，就会错过最佳的治疗时机。虽然，有 研究报道过部分可以用于治疗胰腺癌的多疫苗肽，但这些研究的重点在于某一条或某几条疫 苗肽的免疫效果，并没有考虑到疫苗肽的适用范围，研究成果只能覆盖一小部分患者。
此外，鉴于胰腺癌诊断难，治疗难，死亡率高的现状，提前做到有效预防就显得尤其重 要。而目前，尚没有针对胰腺癌的有效预防措施。因此，针对这些问题，我们开发了一种兼 具胰腺癌治疗性及预防性的通用型多肽疫苗。
所涉及的参考文献如下：
1.Balachandran VP,et al.Identification of unique neoantigen qualitiesin long-term survivors of pancreatic cancer[J].Nature,2017,551:512–516(Balachandran VP等，长期存活的胰腺癌患者 中发现了独特的新生抗原性质。Nature，2017,551:512-516)；
2.Wood MA,et al.Population-level distribution and putativeimmunogenicity of cancer neoepitopes[J].BMC Cancer,2018,18:414(Wood MA等，肿瘤新抗原表位的群体水平分布及免 疫原性猜想。BMC Cancer,2018,18:414)；
3.Pinku M,et al.Progression of Pancreatic Adenocarcinoma IsSignificantly Impeded with a Combination of Vaccine and COX-2Inhibition[J].JImmunol.,2009,182(1):216-224(Pinku M等， 疫苗和COX-2抑制剂的联合使用有效的抑制了胰腺癌的进展。J Immunol., 2009,182(1):216-224)；
4.Ribas A,et al.Association of pembrolizumab with tumor response andsurvival among patients with advanced melanoma[J].Jama,2016,315(15):1600-1609(Ribas A等，晚期黑色素瘤 患者中，伊匹单抗与肿瘤相应和生存周期的关系。Jama,2016,315(15):1600-1609)；
5.Yang B,et al.Specific immune against pancreatic cancer induced bydendritic cells pulsed with mutant K-ras peptide[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2008,88(28):1956-1960(杨波等，K-ras突 变多肽负载树突状细胞诱导抗胰腺癌特异性免疫。中华医学杂志,2008,88(28):1956-1960)；
6.Zhou Z,et al.TSNAD:an integrated software for cancer somaticmutation and tumour-specifc neoantigen detection[J].R Soc Open Sci.,2017,4(4):170050(Zhou Z等，TSNAD： 肿瘤体细胞突变及肿瘤特异性新生抗原检测的综合软件。RSoc Open Sci.,2017,4(4):170050)；
7.Hundal J,et al.pVAC-Seq:A genome-guided in silico approach toidentifying tumor neoantigens[J].Genome Med.,2016,8(1):11(Hundal J等，pVACSeq：鉴定肿瘤基因组新生抗原 的生物信息学方法。Genome Med.,2016,8(1):11)；
8.Wedén S,et al.Gaudernack G et al.Long-term follow-up of patientswith resected pancreatic cancer following vaccination against mutant K-ras[J].International Journal of Cancer.2011,128(5):1120-1128(Wedén S等，长期随访手术切除后注射针对K-ras突变的疫苗 的胰腺癌患者。International Journal ofCancer.2011,128(5):1120-1128)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能有效应用于治疗及预防癌症(特别是胰腺癌)的通 用性疫苗。为了解决上述技术问题，本发明提供一种通用性多肽疫苗，包含针对以下6个突变 中的至少一个：KRAS-G12R、KRAS-G12V、CDKN2A-H83Y、KRAS-Q61H、TP53-R248W、CDKN2AP94L。
注：具体如表1所述。
作为本发明的通用性多肽疫苗的改进：包含针对所述6个突变的多肽序列中的至少一个。
作为本发明的通用性多肽疫苗的进一步改进：由针对所述6个突变组成。
作为本发明的通用性多肽疫苗的进一步改进：由针对所述6个突变的多肽序列组成。
作为本发明的通用性多肽疫苗的进一步改进，所述6个突变对应的多肽序列为：
KRAS-G12R：TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLIQNHK；
KRAS-G12V：TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHK；
CDKN2A-H83Y：AEPNCADPATLTRPVYDAAREGFLDTLKKK；
KRAS-Q61H：KKKTCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGE；
TP53-R248W：KNYMCNSSCMGGMNWRPILTIITLEDSSGN；
CDKN2A-P94L：APRRGAQLRRPRHSHLTRARRCPGGLPGHA。
本发明还同时提供了上述通用性多肽疫苗的用途：用于制备治疗/预防癌症的药物。
作为本发明的通用性多肽疫苗的用途的改进：所述癌症为胰腺癌。
本发明，具体如下表1所示。
表1
Figure BDA0003451843490000041
注：带下划线的字体表示突变氨基酸。
本发明的发明过程如下：
肿瘤基因组图谱(TCGA)计划利用高通量测序技术已获取了大量的肿瘤基因组、转录组等 一系列信息，大大促进了人们对肿瘤分子机制的认识。目前，TCGA数据库是最大的肿瘤数 据库，包含了33种癌症类型、多于11000例癌症患者数据。另外，TCGA数据库的数据质量 较高，背景误差较小，因此，通过该数据库的大样本量的分析，所得结果比较符合临床中的 真实情况且具有统计学意义。
本发明从TCGA数据库中提取并下载了所有胰腺癌患者的肿瘤体细胞突变数据(182例)和肿瘤基因read counts数据(178例)。Read counts数据包含了所有基因在不同患者中reads丰 度的信息；体细胞突变数据包括染色体，位置，基因，功能，蛋白变化及突变样品等信息。 本发明首先对体细胞突变数据进行突变功能的过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的能 够改变蛋白氨基酸序列的突变。
进一步，利用read counts数据计算所有基因的表达量(rpkm)，过滤掉所在基因无表达的 突变位点。另外，本发明还过滤掉了出现样品数小于等于2的突变位点，因为这些位点很可 能只是随机产生，在胰腺癌中并不高发。同时，本发明还利用3款亲和力分析软件netMHC, netMHCpan和PickPocket综合分析了突变位点产生的突变多肽，以及对应的野生型多肽与高 频HLA的亲和力情况，保留了突变多肽免疫原性强的并且比野生型多肽亲和力更强的位点。
然后，通过构建有权重的二部图来存储突变信息及对应样本信息，并利用优化后的匈牙 利算法计算得出本发明中的6个体细胞突变的组合，能够覆盖最高比例患者人群，达到46.2％ (84/182)。除本发明的组合外，其他任意的突变位点组合(但不包括本发明中的所有位点)能够 覆盖的胰腺癌患者人群比例均小于46.2％(图1)。
最后，通过iNeo算法设计相应的疫苗多肽序列，作为一种胰腺癌多肽疫苗疗法。在疫苗 多肽设计过程中，本发明考虑了抗原表位分布，多肽的长度、疏水率等影响氨基酸合成效率 的因素，以及多肽的毒性、同源性等影响多肽安全性的因素。本发明的疫苗多肽组合由包含 以下6个突变的多肽序列组成：KRAS-G12R；KRAS-G12V；CDKN2A-H83Y；KRAS-Q61H；TP53-R248W；CDKN2A-P94L，具体如表1所示。
在治疗胰腺癌的实际应用过程中，通过快速的Sanger测序方法对患者肿瘤DNA中上述 6个突变位点进行检测，若患者携带一个或多个突变，即可直接使用本发明多肽疫苗。疫苗肽在体内被酶切成很多短多肽，这些短多肽有些可以被I型HLA递呈，有些可以被II型HLA 递呈，理论上都能够被不同分型的HLA呈递，并且具有协同增效作用。
本发明具有如下技术优势：
1.本发明提供的胰腺癌多肽疫苗组合由针对以下6个突变的多肽序列组成：KRAS-G12R； KRAS-G12V；CDKN2A-H83Y；KRAS-Q61H；TP53-R248W；CDKN2A-P94L，这6个位点 覆盖了TCGA数据库中胰腺癌约46.2％(84/182)的患病人群，具有普适性和通用性。除本发 明的组合外，其他任意的突变位点组合(不包括本发明中的所有位点)能够覆盖的胰腺癌患者 人群比例均小于46.2％(图1)。
2.相比个体化定制的多肽疫苗，本发明提供的胰腺癌多肽疫苗组合疗法，不需要经过基 因组测序、数据分析及疫苗定制等步骤，而只需要简单的个别突变位点检测，就能够直接用 于携带有突变的患者，将患者等待治疗的时间从70-90天缩短到1-2天，能够使患者不错过 最佳治疗的时间窗口，也可以大幅度降低医疗成本。
3.本发明给出的组合疫苗肽的免疫效果要强于单条疫苗肽的免疫效果。疫苗肽在体内被 酶切成的短多肽，有些可以被I型HLA递呈刺激CD8+细胞的产生，有些可以被II型HLA递 呈刺激CD4+细胞的产生。CD4+细胞分泌的细胞因子会刺激更多的CD8+细胞产生并聚集，从 而更有效的杀伤肿瘤细胞。CD4+细胞和CD8+细胞与HLA之间的协同增效作用，能够产生 更强的免疫反应(如实验2所述)。
4.目前针对癌症治疗的靶向药大多数是靶向单个靶点，长时间的用药容易产生耐药性。 本发明提供的6条多肽疫苗最多可以同时靶向6个靶点，多靶点的治疗方案可以有效降低肿 瘤的耐药发生概率，使得治疗效果更佳更持久(如实验3，4，6所述)。
5.本发明给出的组合疫苗肽不仅可以用于治疗胰腺癌，而且还可以用于预防胰腺癌的发 生和复发。当未患胰腺癌的健康人或手术后的胰腺癌患者注射本发明的组合疫苗后，体内会 产生靶向本发明中6个突变的特异性杀伤性T细胞和记忆T细胞。在正常细胞癌变过程中， 若产生6个突变中的一个或者多个，体内已存在的T细胞能够迅速识别并清除携带突变的细 胞，从而有效的预防胰腺癌的发生。理论上按照本发明中的6个突变所覆盖人群比例，本发 明的多肽疫苗对胰腺癌的预防率可以达到46.2％(如实验5所述)。
在本发明中，6个突变各自占胰腺癌患者比例见表2。
表2
突变 覆盖样品比例
KRAS-G12R 15.38％
KRAS-G12V 22.53％
CDKN2A-H83Y 2.20％
KRAS-Q61H 3.30％
TP53-R248W 2.75％
CDKN2A-P94L 3.30％
采用本发明的6个位点，6个位点的组合最大能覆盖46.2％的患者。本发明的通用性多 肽疫苗对胰腺癌具有较好的免疫治疗效果。
附图说明
图1为不同个数位点组合覆盖患者比例图；
横坐标表示不同个数的位点组合，纵坐标表示覆盖患者的比例，箱线图中间加粗黑线表 示中位数，横向虚线代表覆盖率为46.2％。每种位点组合的箱线图代表随机抽取1000次的结 果。
图2为各多肽表达框的氨基酸序列；
其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
图3为多肽的免疫原性检测；
1为对照组，2为PHA组，3-8为6个单条多肽组，9为6条多肽混合组，10为未入选位点KRAS-G12D对应多肽组，a,b代表每组随机选择2只小鼠，每只小鼠3个重复。
图4为多肽诱导的细胞毒性实验；
A为BxPC-3(wild)诱导的细胞毒性实验图；B为BxPC-3(mut6)诱导的细胞毒性杀伤实验 图；E:T代表效应T细胞个数:靶细胞个数，纵坐标表示细胞裂解率；peptide i(i＝1…6)分别 代表本发明中的6条多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组。
图5为多肽疫苗在小鼠体内对胰腺癌的抑制效果；
横坐标表示疫苗注射后的天数，纵坐标表示相对肿瘤体积。peptide i(i＝1…6)分别代表 本发明中的6条多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组。
图6为多肽疫苗在小鼠体内对胰腺癌的预防效果；
横坐标表示疫苗注射后的天数，纵坐标表示肿瘤体积；peptide i(i＝1…6)分别代表本发明 中的6条多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组。
图7为单条多肽疫苗在小鼠体内对胰腺癌的抑制效果；
横坐标表示疫苗注射后的天数，纵坐标表示相对肿瘤体积；peptide 1代表突变对应的多 肽，peptide 3代表突变无关多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、
一种通用性多肽疫苗，针对如下6个突变：KRAS-G12R；KRAS-G12V；CDKN2A-H83Y；KRAS-Q61H；TP53-R248W；CDKN2A-P94L。针对所述6个突变的多肽序列，具体如表1所述。
对比例1、
以“KRAS-G12D”替代实施例1中的“KRAS-G12V”，6个位点的组合最大能覆盖53.8％的患者。KRAS-G12D对应的多肽序列为：TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNH，带下划 线的字体表示突变氨基酸。
但是对比例1的免疫效果远不如实施例1；下文中的实验2证明KRAS-G12D免疫原性极其微弱。
对比例2、
在所有候选位点中，随机抽取1个位点、2个位点组合、3个位点组合……9个位点组合 各1000次，每次抽取结果覆盖患者比例如图1所示。从图中可以看出，6个位点的组合已经 可以达到46.2％的患者覆盖，多于6个位点的组合覆盖患者比例不超过46.2％。
实验1：构建含特定突变位点的稳转细胞系
实验目的：为了验证本发明中胰腺癌多肽疫苗的治疗及预防效果，因此需要构建一套含 本发明中特定突变位点的稳转细胞系。
a.构建突变位点真核表达质粒
采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部6条疫苗多肽的mini-gene，由以 下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associated membrane glycoprotein1，LAMP1)，6条突 变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，6条突变多肽之间用柔性连接肽 GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入 CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为mut6-pcDNA3.1 (+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为wild6-pcDNA3.1(+)。为了验证靶的特异性， 另设计了只含有本发明中的1个突变位点—KRAS-G12R的突变多肽，命名为mut1- pcDNA3.1(+)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建，氨基酸序列见图 2。
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系
人胰腺癌细胞株BxPC-3以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别 将2.5μg mut6-pcDNA3.1(+)质粒、2.5μg wild6-pcDNA3.1(+)质粒和2.5μg mut1-pcDNA 3.1(+)质粒稀释于3份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μlPLUSTMReagents， 室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTMLTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合， 室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于3份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转 染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h 后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性 筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释 法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B 的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入 24孔板培养。同时转染pcDNA3.1(+)-Hygro空载体质粒作同法抗性筛选，作为对照细胞，命 名为BxPC-3(含有pcDNA3.1(+))。上述方法中，用mut6-pcDNA3.1(+)质粒，wild6-pcDNA3.1(+)质粒和mut1-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名为mut6-BxPC-3(含有 mut6-pcDNA3.1(+))、wild6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))，mut1-BxPC-3(含有mut1- pcDNA3.1(+))。
实验2：多肽的免疫原性测定
实验目的：通过ELISpot实验，验证本发明中6条多肽在人源化小鼠体内均能引起免疫 反应，且6条多肽混合的免疫效果强于单条多肽的免疫效果；并且，对比例1中的未入选位 点KRAS-G12D几乎不能引起免疫反应。
实验方法：
为了检测多肽的免疫反应，实施IFN-γ酶联免疫吸附(ELISpot)测定法。详细的实验过程 如下：选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)27只，随机分为9组，每组3只。适应一周后， 分为阴性对照组编号1、6个单条多肽组编号3-8(共6组)、6条混合多肽组编号9、未入选位 点KRAS-G12D对应多肽组编号10。采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只,再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，共三周，第三次免疫后10天，取的小鼠脾脏，制备小鼠淋巴细胞悬液，用于ELISpot检测。留取编号3-9部分小鼠淋巴细胞悬液用于实验3。
ELISpot检测结果中，IFN-γ呈阳性结果的多肽，即判定为阳性候选多肽。将小鼠淋巴细 胞稀释成浓度为1-2*106/mL，铺24孔板，每孔1mL，分为对照组(与多肽相同浓度的DMSO)、 6个单条多肽组、6条多肽混合组、对比例1中KRAS-G12D对应的多肽组，PHA阳性对照组编号2(PHA组淋巴细胞来源于阴性对照组)，共计10组，分别加入相应的多肽(10μg/mL)，预孵育72h后离心分离细胞，调整细胞浓度为2*106/mL，上IFN-γElispot板，按照IFN-γELISpot试剂盒的说明书方法进行显色，运用CTL-ImmunoSpotS5系列酶联斑点分析仪读取产 生的斑点数。IFN-γ阳性结果表明有抗原特异性T细胞产生，视为多肽能引起机体的免疫反 应，斑点数的多少反映其免疫的强弱。
实验结果：
实验结果如图3所示，每百万个细胞中，6个单条多肽组都能产生约30-150个斑点，说 明6条多肽单独都能引起免疫反应。对比例1中KRAS-G12D对应多肽组基本无斑点产生，说明该多肽几乎不能引起免疫反应；同时，6条多肽混合组诱导产生的斑点数平均达400个以上，显著高于6个单条多肽组，说明其组合能引起更强的免疫反应。
实验3：体外细胞杀伤实验
实验目的：验证6条多肽在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果，且6条多肽混 合之后的杀伤效果强于单条多肽的杀伤效果。
实验方法：
(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步 骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记mut6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))和wild6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。
(2)杀伤实验
a.准备效应细胞：
将实验2中留取的7组小鼠淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。
b.效应细胞CTL的诱导培养：
分别将7组淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％ FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essentialamino acids+1mM sodium pyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往 每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和 rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。
1)将mut6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与7种效应细胞CTL按照1:5、 1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。
2)将wild6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与7种效应细胞CTL按照1:5、 1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组， 每个对照组设置三个平行对照孔。
3)将96孔板放在37℃培养箱培养4h。
4)将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用 碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检 测。
实验结果：
如图4所示，实验组(图4B)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-80％不等，杀伤效率 明显高于对照组(图4A)，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效 靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，且对比单条多肽，混合多肽的杀伤效率更高，当 效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达90％以上。该实验说明6条突变多肽及其混合组均 能有效地激活特异性T细胞免疫应答，且6条多肽混合的杀伤效率明显高于单条多肽引起的 杀伤效率。
实验4：人源化小鼠模型中本发明疫苗对肿瘤治疗效力的评价
实验目的：验证6条多肽在体内能够激发T细胞对肿瘤细胞的杀伤，且6条多肽混合的 杀伤效果强于单条多肽的杀伤效果。
实验过程：
选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)24只，适应一周后，收集对数生长期的BxPC-3(mut6)细胞，制备成5*106/mL细胞悬液，以0.2mL种于小鼠左前肢腋下。以皮下肿瘤结节直径达5mm左右为成瘤标准，9-12天内成瘤，选择无出血、无坏死、无感染的小鼠，随机分为 8组，每组3只，分6个单条多肽组，6条多肽混合组和空白组(PBS)，分组之后当天免疫， 采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只，再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为 阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，免疫三次。第28天处 死小鼠，用游标卡尺日测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积；
TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长径和短径，根据测量结果计算出相对肿瘤体积 (relative tumor volume,RTV)，RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼时(即d0)测量所得肿瘤体积， Vt为每次测量时的肿瘤体积，绘制相对肿瘤体积曲线，并记录各组动物体重。
实验结果：
分组处理之前各组移植瘤的生长情况基本一致，体积大小无明显差异(P>0.05)。
如图5所示，免疫后1周，各组移植瘤生长与对照组相比，其体积大小无明显差异(P>0.05)， 随着免疫次数增多和时间的延长，实验组与对照组相比，瘤体大小受抑程度越来越明显，说 明6条多肽均能在小鼠体内起到抑制肿瘤生长的作用。同时，从第二周起，6条多肽混合组 比每条多肽单独引起的抑制效率显著提高(P<0.01)，说明各多肽之间存在协同增效作用。免 疫后2周，其肿瘤已出现缩小的情况，说明疫苗激发的免疫响应对肿瘤细胞产生了杀伤作用。
实验5：人源化小鼠模型中本发明疫苗对肿瘤预防效力的评价
实验目的：验证6条多肽在人源化小鼠上安全有效且能有效预防肿瘤的发生。
实验过程：
选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)24只，随机分为8组，每组3只，适应一周后，采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只，再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为 阴性对照，分6个单条多肽组，6条多肽混合组和空白组(PBS)，四次于颈背部右胸皮下免 疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，免疫三次。第三次免疫后1周，收集对数生长期的BxPC-3(mut6)细胞，制备成5*106个/mL细胞悬液，以0.2mL种于小鼠左前肢腋下。
每天记录各组动物的肿瘤发生情况，肿瘤长出来后，用游标卡尺日测量肿瘤长径和短径， 计算肿瘤体积；
TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长径和短径，并记录各组动物体重。评价：接种肿 瘤四周后，处死所有小鼠，终止实验，计算抑瘤率并进行评价。
抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100％。
数据处理：采用SPSS软件进行统计学分析，采用单因素方差分析进行比较，P<0.05为 差异有统计学意义。
实验结果：
如图6所示，接种肿瘤10天之后，对照组肿瘤开始缓慢增大，各实验组肿瘤体积抑制明 显。与对照组相比，第16天时，各实验组仍无肿瘤形成。随着时间的延长，各实验组瘤体大 小缓慢增大，但增长速度明显低于对照组。同时，自接种肿瘤23天起，6条多肽混合组比每 条多肽单独引起的抑制效率显著提高(P<0.01)，且在接种肿瘤28天时，6条多肽混合组的瘤 体几乎无增长。本试验证实了6条多肽及其混合均能预防特异肿瘤发生，且6条多肽混合的 预防效果显著优于每条多肽单独引起的预防效果。
实验6：人源化小鼠模型中本发明疫苗对单个位点突变肿瘤的治疗效力的评价。
实验目的：为了更真实的模拟现实中的临床情况，即多数患者一般只携带本发明中的1 个突变(例如在我们分析的患者人群中，本发明6个突变覆盖的84位患者中，93％的患者(78 位)都只携带1个突变)，验证6条多肽混合对单突变肿瘤的治疗效果要优于对应的单条多肽 治疗效果。
实验过程：
选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)15只，适应一周后，收集对数生长期的BxPC-3(mut1)细胞，制备成5*106个/mL细胞悬液，以0.2mL种于小鼠左前肢腋下。以皮下肿瘤结节直径达5mm左右为成瘤标准，9-12天内成瘤，选择无出血、坏死、感染的小鼠进行组，随机 分为4组，每组3只，分多肽组1(相关多肽)，多肽组3(无关多肽)，6条多肽混合组和空 白组(PBS)，分组之后当天免疫，采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只，再与弗氏不 完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完 全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/ 只，1周一次，免疫三次。第28天处死小鼠，用游标卡尺日测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤 体积；
TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长径和短径，根据测量结果计算出相对肿瘤体积 (relative tumor volume,RTV)，RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼时(即d0)测量所得肿瘤体积， Vt为每次测量时的肿瘤体积，绘制相对肿瘤体积曲线，并记录各组动物体重。
实验结果：
分组处理之前4组移植瘤的生长情况基本一致，体积大小无明显差异(P>0.05)。如图7所示，免疫后1周，各组移植瘤生长与对照组相比，其体积大小无明显差异(P>0.05)，随着 免疫次数增多和时间的延长，多肽组1和6条多肽混合组的瘤体大小受抑越来越明显，而对 照组和不相关多肽组3的肿瘤生长相近，证明了该多肽诱导的杀伤T细胞具有特异性。自21 天起，6条多肽混合组比多肽组1单独引起的抑制效率显著提高(P<0.01)，免疫后2周，其肿瘤已出现缩小的情况。说明各多肽之间存在协同作用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离 本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一 点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求 而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括 在本发明内。
序列表
<110> 杭州纽安津生物科技有限公司
<120> 通用性多肽疫苗及其在制备治疗/预防胰腺癌药物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Lys
20 25
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Lys
20 25
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val Tyr
1 5 10 15
Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Lys Lys Lys
20 25 30
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Lys Lys Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu
20 25 30
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Trp Arg
1 5 10 15
Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn
20 25 30
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Pro Arg Arg Gly Ala Gln Leu Arg Arg Pro Arg His Ser His Leu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Arg Arg Cys Pro Gly Gly Leu Pro Gly His Ala
20 25 30

Claims (2)

1.通用性多肽疫苗，其特征是包括KRAS-G12V突变；
所述KRAS-G12V突变的多肽序列为：TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHK。
2.如权利要求1所述的通用性多肽疫苗的用途，其特征是：用于制备治疗/预防胰腺癌的药物。
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