CN114636739A - 一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，采用了共价修饰的方法对纳米孔内表面改性。首先将PET膜进行化学刻蚀，得到内表面带有羧基的多孔锥形纳米通道，因此在中性条件下会带有负电荷，而三胜肽分子上带有一个胺基封端的之链，因此三胜肽可通过共价反应的方法修饰到纳米孔的内表，得到三胜肽修饰的纳米孔。而且由于二价铜离子的高亲和性使它能够与三胜肽络合而形成GHK‑Cu，从而导致生成蓝铜胜肽，使三胜肽修饰的纳米通道呈现出对铜离子的超衡量检测。用化学方法进行修饰，从而避免了三胜肽分子在固态多孔纳米孔上修饰的不稳定性，而导致无法得到固态多孔纳米孔上具有铜离子超衡量检测的纳米流体二极管。

Description

一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的 方法

技术领域

本发明属于水溶液中金属离子的检测技术领域，涉及一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的的方法，该方法是通过将三胜肽分子修饰到固态纳米孔内表面，三胜肽可以络合铜离子实现的。

背景技术

三胜肽(GHK)是由三个氨基酸(甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸)通过肽键彼此连结而成的小分子化合物。三胜肽的作用是促进细胞生长，有放松肌肉的效果，改善动态性皱纹，从细胞层面有效阻止皱纹产生，还可以修复创伤，消炎等作用。胜肽有改善微循环，加强血液循环，改善眼部水肿，消除炎症；抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素向角质层传递；促进毛发生长、促进真皮修复、促进伤口愈合。并且三胜肽分子上带有胺基，能通过与纳通过米孔道内的羧基共价反应从而修饰到纳米孔内表面，这为本发明在纳米孔道内的三胜肽改性提供了可能。三胜肽与二价铜离子有很强的亲和力，能自发地形成络合物蓝铜胜肽(GHK-Cu),GHK-Cu以铜离子为中心，周围被三个氨基分子包围。这为本发明进行同离子的检测提供了可能。

铜离子作为重金属离子，它也是动植物和人类必须的微量元素，微量元素的铜能促进动植物的生长。铜在人体中的含量比铁少得多，仅为100-200mg，铜主要功能是辅助造血，铜不足就影响铁的吸收，缺铜会使人体内重要的酶活性降低，从而导致骨骼生成障碍，造成骨质疏松，缺铜还可发生脱发症及白化病等，常见的白癜风和血清中缺少铜离子有关系，缺铜会影响脑发育。但当在生物体内累计到一定数量后，就会出现受害现象，胜利受阻，发育停滞，整个水生态系统结构，功能受损。因此，迫切需要开发方便且灵敏的方法来检测环境中的Cu²⁺的传感器。本发明成功的实现了对铜离子的超衡量检测并且可以成功实现自来水中铜离子的检测。

纳米流体二极管具有类似于生物体离子通道的对离子选择性通过和对外界环境刺激产生反应的特性，并且其物理化学性质稳定，对温度、酸碱性有良好的容忍性。离子选择性通过的现象也被称为整流现象，是一种物理现象，是指在相同的驱动力推动下正向和逆向的电流幅值大小不同。近年来，纳米流体二极管的研究取得了重要进展，并在DNA测序、纳流控芯片等多个领域展现出了一定的应用前景。研究人员已经通过各种方法对纳米孔进行修饰，得到能对外界刺激进行响应的纳米流体二极管。目前，通过在纳米孔内表面修饰的方法制备纳米流体二极管仍有较多困难，如下：(i)纳米孔道尺寸较小，修饰的物质难进入，使得修饰的物质在纳米孔上的密度不够；(ii)纳米孔表面修饰后不稳定，修饰物易脱落，使得纳米流体二极管的重复性不好；而本方法用共价修饰的方法很好的克服了以上困难，得到了操作简单、成本低廉、修饰密度高、重复性好的修饰纳米孔的方法。本发明成功的构建了固态多孔纳米孔上的对铜离子进行超衡量检测的纳米流体二极管，填补了研究上的空白。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，该方法通过共价修饰的方法构建了固态多孔纳米孔上的铜离子检测的纳米流体二极管，为改性的固态多孔纳米孔构建铜离子超衡量检测的纳米流体二极管提供了一种新的方法。

技术方案

一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：将多孔PET膜表面处理干净，用化学刻蚀的方法刻蚀纳米孔，得到内表面带有羧基的多孔锥形纳米通道，在中性条件下会带有负电荷；

步骤2：将刻蚀好的纳米孔分别在0.2M NHS、0.1M EDC溶液中浸泡24h，取出用二次水冲洗；

步骤3：再将多孔PET膜在0.1mg/mL的三胜肽水溶液中浸泡24h，将得到三胜肽修饰的固态多孔纳米孔；

步骤4：以三胜肽修饰的固态多孔纳米孔与二价铜离子的高亲和性，能够与三胜肽络合而形成GHK-Cu，导致生成蓝铜胜肽，使三胜肽修饰的纳米通道呈现出对铜离子的超衡量检测，即制备了具有铜离子检测的纳米流体二极管。

所述的三胜肽结构为：

所述的蓝铜肽的结构为：

三胜肽分子上支链上有氨基，可以与羧基通过共价修饰的方法把三胜肽固定到固态纳米孔内表面，由于三胜肽与二价铜离子的高亲和性使其能够与铜离子络合而形成GHK-Cu，导致生成蓝铜胜肽，从而使三胜肽修饰的纳米通道呈现出对铜离子的超衡量检测。

有益效果

本发明提出的一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，构建固态多孔纳米孔上的纳米流体二极管的方法，巧妙的采用了共价修饰的方法对纳米孔内表面改性。首先将PET膜进行化学刻蚀，得到内表面带有羧基的多孔锥形纳米通道，因此在中性条件下会带有负电荷，而三胜肽分子上带有一个胺基封端的之链，因此三胜肽可通过共价反应的方法修饰到纳米孔的内表，得到三胜肽修饰的纳米孔。而且由于二价铜离子的高亲和性使它能够与三胜肽络合而形成GHK-Cu，从而导致生成蓝铜胜肽，使三胜肽修饰的纳米通道呈现出对铜离子的超衡量检测。用化学方法进行修饰，从而避免了三胜肽分子在固态多孔纳米孔上修饰的不稳定性，而导致无法得到固态多孔纳米孔上具有铜离子超衡量检测的纳米流体二极管。

附图说明

图1为本发明内容。首先将PET膜进行化学刻蚀，得到锥形多孔纳米孔，纳米孔内表面带羧基负离子。再用共价修饰的方法修饰纳米孔，得到GHK修饰的纳米孔。而二价铜离子的高亲和性使它能够与三胜肽络合而形成GHK-Cu，从而导致生成蓝铜胜肽，使三胜肽修饰的纳米通道呈现出对铜离子的超衡量检测，即制备了具有铜离子检测的纳米流体二极管。

图2为刻通的锥形多孔纳米孔、三胜肽改性的纳米孔、10^-3M Cu²⁺溶液存在的纳米孔、EDTA洗脱过的纳米孔在0.1M KCl中的电化学表征的I-V曲线图数据。未修饰的多孔锥形纳米孔的电化学表征，是为了证明刻通的纳米孔有整流效应且内表面带有羧酸根负离子。三胜肽改性的纳米孔的电化学表征，是为了证明改性后的纳米孔内表面有效电荷减少，即证明在纳米孔内表面修饰了带有胺基的三胜肽。10^-3M Cu²⁺溶液存在的纳米孔的电化学表征，是为了证明铜离子能与纳米孔内表面的三胜肽分子发生络合。EDTA洗脱过的纳米孔的电化学表征，是为了证明EDTA能把络合的铜离子洗去。

图3为修饰三胜肽与金属离子络合的示意图。

图4为修饰三胜肽的多孔锥形纳米孔在10^-3M的KCl、LiCl、NaCl、MgCl₂、CuCl₂、NiCl₂、FeCl₃溶液中的电化学表征的I-V曲线图数据，是为了证明了修饰三胜肽的多孔纳米孔对铜离子具有最强的选择性。

图5为修饰三胜肽后的多孔纳米孔的铜离子检测的原理示意图。

图6(a)为修饰三胜肽的多孔锥形纳米孔在不同浓度的CuCl₂溶液中的电化学表征的I-V曲线图数据，是为了证明三胜肽改性的纳米孔能检测超衡量的铜离子；(b)为GHK修饰纳米通道中的Cu²⁺浓度的对数与+1V时的电流的关系数据；(c)为三胜肽改性的纳米孔在纯水和自来水中的电化学表征的I-V曲线图数据，是为了证明三胜肽改性的纳米孔能检测自来水中的铜离子。

图7中为膜表面修饰三胜肽前后以及铜离子与EDTA处理的XPS数据。

具体实施方式

现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：

实施例

1.在PET上制备单锥形纳米孔

首先将重离子辐照过的多孔PET膜在二次水中浸泡3分钟，除去膜表面的灰尘和杂质，晾干，待用。再在紫外灯下每面辐照1.5h，待用。

配制9mol/L的NaOH溶液250mL，其中加入NaOH的质量为90.0g储存在250mL容量瓶中，1mol/L HCOOH和KCl混合溶液250mL，其中加入HCOOH 9.5mL，KCl18.6g储存在250mL容量瓶中。接下来通过化学刻蚀的方法进行纳米孔的刻蚀。多孔锥形纳米通道的制备用的是不对称刻蚀法：即在辐照过的薄膜两侧施加跨膜电压，薄膜的一侧加刻蚀液即9mol/L的NaOH溶液，一侧加入阻止液即1mol/L HCOOH和KCl混合溶液，使用电流测量装置检测刻蚀过程，一旦离子电流增大2个数量级则说明纳米孔已刻通。此时，得到PET多孔锥形纳米孔，为修饰实验做好准备。

2.PET多孔纳米孔的电化学表征

由于多孔锥形纳米孔道结构的不对称性，并且在纳米孔内表面带有羧酸根负离子，因此在外加电压的情况下存在整流效应，因此检测已刻蚀好的多孔锥形纳米孔的整流效应。配制0.1mol/L的KCl溶液100mL，其中加入KCl的质量为0.74g储存在100mL容量瓶中。在薄膜的两侧施加跨膜电压，薄膜两侧都加0.1mol/L的KCl溶液，使用电流检测装置检测整流过程。从I-V曲线数据可以看出，单锥形纳米孔在外加电压的情况下具有整流效应，并且负向电流比正向电流大，因此可证明制备的单锥形纳米孔内表面带有负电荷。

3.在纳米孔内表面修饰三胜肽分子

配置0.1mg/mL的三胜肽水溶液，其中加入质量为0.01mg的三胜肽，二次水10mL储存在离心管中待用。配制0.1mol/L的EDC溶液100mL，其中加入EDC的质量为1.55g储存在100mL容量瓶中。配制0.2mol/L的NHS溶液100mL，其中加入NHS的质量为2.3g储存在100mL容量瓶中。将0.1mol/L的EDC溶液10mL与0.2mol/L的NHS溶液10mL加入25mL的烧杯中混合均匀，再将刻蚀好的多孔锥形纳米孔放入烧杯，静置，24h。取出用二次水冲洗，吹干，待用。再将10mL的0.1mg/mL的三胜肽水溶液置于25mL的烧杯中，将多孔锥形纳米孔置于烧杯，静置，24h。取出用二次水冲洗，吹干，待用。

4.三胜肽改性的纳米孔的电化学表征

分别配制10^-3M KCl、LiCl、NaCl、MgCl₂、CuCl₂、NiCl₂、FeCl₃溶液100mL，分别储存在100mL容量瓶中备用。配置0.001M的EDTA溶液100mL，储存在100mL容量瓶中备用。

在改性的多孔锥形纳米孔薄膜两侧加0.1mol/L的KCl溶液，薄膜的两侧施加跨膜电压，使用电流检测装置检测整流过程。见图2红线，从图中可看出与改性前(黑线)相比电流减小，说明将三胜肽修饰到了纳米孔内表面，使得纳米孔的内表面有效电荷减少。

再将改性的多孔锥形纳米孔薄膜两侧加0.1M KCl与10^-3M CuCl₂的混溶液，薄膜的两侧施加跨膜电压，使用电流检测装置检测整流过程。见图2蓝线，从图中可看出与改性后(红线)相比电流减小，说明纳米孔内表面的三胜肽能与铜离子络合，使得纳米孔的内表面有效电荷再次减少。

将完成测试铜离子的纳米孔薄膜取出，用二次纯水洗净。取15mL的0.001MEDTA溶液置于25mL，将薄膜置于EDTA溶液中0.5h。取出用二次水冲洗，吹干，待用。再将改性的多孔锥形纳米孔薄膜两侧加0.1M KCl溶液，薄膜的两侧施加跨膜电压，使用电流检测装置检测整流过程。见图2，从图中可看出电流恢复到改性后(红线)，说明纳米孔内表面与三胜肽络合的铜离子能通过EDTA洗脱，使得纳米孔的内表面有效电荷恢复。

将改性的多孔锥形纳米孔两端施加电压，依次在膜的两端加入10^-3M的KCl、LiCl、NaCl、MgCl₂、CuCl₂、NiCl₂、FeCl₃溶液，用电流检测装置进行电流检测，作I-V曲线图。可以看出纳米孔在CuCl₂溶液中的电流与整流比都是最大的，说明三胜肽改性的的多孔锥形纳米孔是一个具有铜离子检测性能的纳米流体二极管。

将改性的多孔锥形纳米孔两端施加电压，依次在膜的两端加入10^-15M、10^-13M、10^{- 11}M、10^-9M、10^-7M、10^-5M、10^-3M CuCl₂溶液，用电流检测装置进行电流检测，作I-V曲线图。可以看出随着CuCl₂溶液的浓度增大，纳米孔中的电流增大，说明三胜肽改性的的多孔锥形纳米孔是一个具有铜离子超衡量检测性能的纳米流体二极管。

将改性的多孔锥形纳米孔两端施加电压，依次在膜的两端加入二次纯水、自来水，用电流检测装置进行电流检测，作I-V曲线图。可以看出三胜肽改性的纳米孔在自来水中能检测到电流，说明三胜肽改性的的多孔锥形纳米孔是一个能检测自来水中的铜离子的纳米流体二极管。

5.修饰前后以及铜离子与EDTA处理后的纳米孔的XPS表征

将4个清洗过的PET膜分别浸泡在9mol/L的NaOH溶液中，并在60℃的温度下加热1h。然后取其中3个按上述3的方法进行修饰三胜肽分子。接下来取2个改性的PET薄膜浸入10^-3M CuCl₂溶液0.5h，取出，洗净吹干。再取1个CuCl₂溶液处理过的PET薄膜浸入0.001M的EDTA溶液中0.5h，取出，洗净吹干。

将上述处理过的的PET膜分别裁成0.5×0.5mm的小片，进行XPS测试，得到XPS数据。从XPS数据可看出，三胜肽改性的PET膜与未修饰的PET膜相比，疏水性增强，说明修饰三胜肽的过程确实把三胜肽分子修饰到了PET膜上。可以看出铜离子处理后，PET膜疏水性有所减弱，说明修饰的三胜肽与铜离子进行了络合。

Claims (3)

1.一种基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：将多孔PET膜表面处理干净，用化学刻蚀的方法刻蚀纳米孔，得到内表面带有羧基的多孔锥形纳米通道，在中性条件下会带有负电荷；

步骤2：将刻蚀好的纳米孔分别在0.2M NHS、0.1M EDC溶液中浸泡24h，取出用二次水冲洗；

步骤3：再将多孔PET膜在0.1mg/mL的三胜肽水溶液中浸泡24h，将得到三胜肽修饰的固态多孔纳米孔；

步骤4：以三胜肽修饰的固态多孔纳米孔与二价铜离子的高亲和性，能够与三胜肽络合而形成GHK-Cu，导致生成蓝铜胜肽，使三胜肽修饰的纳米通道呈现出对铜离子的超衡量检测，即制备了具有铜离子检测的纳米流体二极管。

2.根据权利要求1所述基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，其特征在于：所述的三胜肽结构为：

3.根据权利要求1所述基于三胜肽修饰的固态多纳米孔的铜离子超痕量检测的方法，其特征在于：所述的蓝铜肽的结构为：

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