CN114601019A

CN114601019A - 胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的应用

Info

Publication number: CN114601019A
Application number: CN202210324482.0A
Authority: CN
Inventors: 许超
Original assignee: Guangzhou Ruiplatinum Health Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruiplatinum Health Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明公开了胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的应用。所述应用包括如下步骤：在胎盘水溶性提取液溶液中逐滴加入原花青素溶液，搅拌混匀，热变性处理，获得微胶囊壁材；将益生菌菌液与微胶囊壁材混合，加入转谷氨酰胺酶并使其分散均匀，将此混合液加入预热的大豆油中，然后使该体系在搅拌状态下反应；待液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后，离心收集微胶囊颗粒，获得益生菌微胶囊。本发明提出的胎盘水溶性提取物‑花青素作为壁材，针对益生菌存活率降低的问题，添加原花青素，显著提高益生菌在保存时间内的存活率以及原花青素的生物利用率，同时可以发挥胎盘水溶性提取物的活性，增加单一壁材的活性，提高壁材生物活性利用的功能。

Description

胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的应用

技术领域

本发明涉及微胶囊技术领域，特别涉及胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的应用。

背景技术

微胶囊技术是一种将对周围环境敏感的固体、液体或气体物质包埋在胶囊中，并在特定的环境中能够控制释放的技术。微胶囊颗粒的大小一般会因加工工艺的不同而异，其粒径范围一般在0.1～1000μm。微胶囊分为壁材和芯材两部分，在微胶囊内部被包埋的物质称之为芯材，外面包埋的物质则为壁材，壁材一般为天然高分子材料、半合成高分子材料、全合成高分子材料和无机材料。微胶囊技术在各个领域都有广泛的应用，成为一直以来的研究热点。

近年来，随着人们对环境、生态和可持续发展等问题的意识不断增强，使用环保型微胶囊壁材成为当今重要的研究方向。在食品行业中，微胶囊技术有独特的作用和性能，占很显著的优势。壁材的选取对于微胶囊的性能和用途有至关重要的作用，一般选择能够降解的天然高分子，糖类、蛋白质和新兴的生物多聚物实现如今应用比较广泛的三大类壁材。壁材应具有良好的成膜性、无毒以及良好的生物相容性，同时不影响芯材的性能。

人胎盘又称紫河车，为祖国医学传统中药，具有温肾补精、益气养血的功能，民间传统常用紫河车煮烂食用，以增强机体抵抗力，治疗体虚、哮喘等多种病症。

益生菌在维护健康和预防疾病方面有着重要的作用，它发挥作用的关键在于益生菌存活的数量和到达特定部位后的繁殖能力，它们决定着其对宿主提供益处的力度或效果。由于益生菌对外界环境比较敏感，从加工到最终食用的过程中会有很多的因素影响益生菌的存活率。有越来越多的技术被用来提高益生菌的耐受性，最终产品能够保证益生菌的代谢稳定且具有活性，在通过宿主上的消化系统后，有大量存活的菌体，且能够在宿主的肠道内释放和增值，从而发挥益生菌的益处，实现其功能，微胶囊技术能够很好地解决这个问题。

原花青素具有抗氧化、抗血栓形成，调借血管细胞等作用。国内外对原花青素的性能研究较多，并广泛用于食品、化妆品及保健品等领域。另外，原花青素水溶性较好，但稳定性较差，易被氧化，对温度，pH较为敏感，限制其使用。

专利CN106723233B公开了一种利用米糠蛋白-多糖作为壁材的益生菌制备微胶囊的方法。该壁材：以米糠蛋白聚集体–多糖混和凝胶为壁材的微胶囊产品具有很好的耐酸性和肠溶性，可延缓芯材在模拟胃消化环境中释放即在模拟胃液消化环境中由于带正电荷的蛋白质可通过静电吸引作用吸附一层带负电的多糖形成的聚合物能够有效地阻止胃蛋白酶向微胶囊内部的扩散，这样就起到了对某些有效成分的保护作用。但是，双歧杆菌的存活率却会随着时间的增加慢慢降低。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，用以解决现有技术益生菌包埋后存活率降低的问题和提供多活性的包埋益生菌产品。

本发明的另一目的在于提供通过上述方法制备得到的益生菌微胶囊。

本发明的再一目的在于提供上述益生菌微胶囊的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，包括如下步骤：

S1、胎盘水溶性提取物的制备：将获取的胎盘清洗干净，冻干，磨粉，溶于生理盐水，离心收集上清，过滤除菌，获得胎盘水溶性提取物；

S2、微胶囊壁材的制备：在质量百分比为8％～12％，优选为10％的胎盘水溶性提取液溶液中逐滴加入2％～4％，优选3％的原花青素溶液，搅拌混匀，热变性处理，获得微胶囊壁材；

S3、益生菌微胶囊的制备：将益生菌菌液与微胶囊壁材混合，加入转谷氨酰胺酶(TGase)并使其分散均匀，将此混合液加入预热的大豆油中，然后使该体系在搅拌状态下反应；待液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后，离心收集微胶囊颗粒，即获得益生菌微胶囊。

进一步地，步骤S1中所述的清洗的具体操作为：将胎盘泡在水中，用手捏住胎盘边缘，顺着大血管的方向，将大血管的血液向剪掉脐带的开口挤出，清洗干净后，将清洗好的胎盘沥干。

进一步地，步骤S1中所述的胎盘在冻干前需剪成0.5～1.5cm的小块。

进一步地，步骤S1中所述的生理盐水的用量按冻干粉：生理盐水＝1g：30～70ml计；优选按1g：50ml计。

进一步地，步骤S1中所述的离心收集上清的具体操作为：第一次8000～9000g，25～35min离心收集上清，第二次27000～29000g，110～130min离心收集上清；优选为第一次7000g，30min离心收集上清，第二次28000g，2h离心收集上清。

进一步地，步骤S1中所述的过滤所用的滤膜孔径为0.22μm。

进一步地，步骤S2中所述的搅拌为磁力搅拌。

进一步地，步骤S2中所述的热变性处理的条件为温度75～85℃、时间20～40min；优选为温度80℃、时间30min。

进一步地，步骤S3中所述的益生菌为乳杆菌类和双歧杆菌类益生菌中的一种或多种组合；其中，乳杆菌类益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌等，双歧杆菌类益生菌包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌等；优选指植物乳杆菌。

进一步地，步骤S3中所述的益生菌菌液的浓度为10⁸～10¹¹CFU/mL；优选为10⁹CFU/mL。

进一步地，步骤S3中所述的益生菌菌液、微胶囊壁材、转谷氨酰胺酶、大豆油的配比为2mL：18～22mL：0.1～0.3g：140～160g；优选为2mL：20mL：0.2g：150g。

进一步地，步骤S3中所述的转谷氨酰胺酶的用量按计

进一步地，步骤S3中所述的大豆油的预热温度为38～42℃；优选为40℃。

进一步地，步骤S3中所述的搅拌的转速为800～1000r/min；优选为900r/min。

进一步地，步骤S3中所述的反应的条件为：温度38～42℃、时间170～190min；优选为温度40℃、时间180min。

进一步地，步骤S3中所述的离心的条件为：转速400～600r/min，时间55～65s；优选为转速500r/min，时间60s。

进一步地，步骤S3中获得所述的益生菌微胶囊后，加入林格氏试剂，在700r/min条件下离心5min，重新收集胶体颗粒，以进行清洗。

一种益生菌微胶囊，通过上述制备方法得到。

上述益生菌微胶囊的应用，用于制备食品、饲料、药品、化妆品或日用品。

本发明相较于现有技术具有如下的优点和有益效果：

本发明提出的胎盘水溶性提取物-花青素作为壁材，针对益生菌存活率降低的问题，添加原花青素，显著提高益生菌在保存时间内的存活率以及原花青素的生物利用率。

本发明采用胎盘水溶性提取物聚合物可以发挥胎盘水溶性提取物的活性，增加单一壁材的活性，提高壁材生物活性利用的功能。

附图说明

图1不同微胶囊对双歧杆菌贮藏稳定性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

下述实施例中所用胎盘水溶性提取物的制备方法如下：获取无菌胎盘组织，将胎盘泡在在水中，用手捏住胎盘边缘，顺着大血管的方向，将大血管的血液向剪掉脐带的开口挤出，清洗干净后，将清洗好的胎盘沥干，剪成1cm左右的小块，冻干，磨粉，将以上冻干的胎盘粉5g溶于250ml生理盐水，第一次8500g，30min离心收集上清。28000g，2h离心，收集上清，0.22um滤膜过滤除菌获得胎盘水溶性提取物。

下述实施例中所用原花青素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，商品型号CAS:4852-22-6。

下述实施例中所用MRS液体培养基购于广东环凯微生物科技有限公司，商品型号SR0370。

下述实施例中所用转谷氨酰胺酶(TGase，酶活力1000U/g)购于苏州嘉叶生物科技有限公司，商品型号：80146-85-6

实施例1

1.菌种培养及样品准备

将双歧杆菌(两歧双歧杆菌B.bifidum)按1∶10(V/V)的接种量接种于无菌MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧培养24h。活化3次后，按1∶10(V/V)的接种量接种于无菌MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧培养24h。4000r/min离心5min收集菌体，用无菌生理盐水(0.85％NaCl)洗涤2次并重悬后，将浓缩菌液的浓度调节至10⁹CFU/mL。

2.微胶囊壁材的制备

在质量百分比为10％的胎盘水溶性提取液溶液中逐滴加入3％的原花青素溶液，在磁力搅拌器中搅拌混匀；

3.微胶囊的制备

3.1胎盘提取物微胶囊的制备

将2mL浓缩菌液与20mL热变性(80℃、0.5h)的微胶囊壁材(10％的胎盘水溶性提取液+3％的原花青素)混合后，快速加入0.2g TGase(10U/g)并漩涡振荡使其分散均匀，将此混合液加入到250mL锥形瓶中，该锥形瓶中盛有150g预热的(40℃)大豆油，然后使该体系在磁力搅拌器的作用下(900r/min，40℃)反应180min，待液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后离心(500r/min，1min)，收集微胶囊颗粒并用林格氏试剂清洗2次，在700r/min条件下离心5min，重新收集胶体颗粒，贮存于4℃备用。

3.2海藻酸钠微胶囊的制备

首先将2mL浓缩菌液与20mL 2.0g/100mL的海藻酸钠溶液混合，之后将CaCO₃微晶均匀地分散到该混合溶液中，其中CaCO₃的加入量是海藻酸钠质量的7.3％，然后再将此混合液乳化到100mL含有体积分数1.0％Span80大豆油中(300r/min)，15min后，加入20mL含有冰醋酸的大豆油，冰醋酸和CaCO₃的物质的量比值为3.5，持续搅拌，以促进CaCO3微晶和冰醋酸的接触反应，30min后，向该体系加入120mL的醋酸盐溶液(pH 5.5)并缓慢搅拌，待凝胶成型的微胶囊都沉降到醋酸盐溶液底部后，吸去油相，过滤收集AM，洗涤2次以去除剩余油相。最后让过滤收集得到的微胶囊在4℃条件下存放于0.2g/100mLNaCl溶液中。

4.包埋益生菌的计数

准确称取3种湿微胶囊样品各1g，加入9mL解囊液(将NaHCO₃溶于0.1mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中(NaHCO₃的终浓度为0.2mol/L)，过滤除菌)中，振摇10min至完全解囊。取一定量的液体，经稀释后，涂布于MRS琼脂培养基上，然后让平板在37℃、厌氧条件下培养48h后计数，并计算包埋效率。包埋效率计算公式：N/N0×100％。式中：N为包埋于微胶囊中的活细胞总数/CFU；N0为浓缩菌液中的总菌数/CFU。

5.微胶囊的粒径分析

微胶囊的粒径分布是通过激光粒度分析仪来测定，平均粒径表示为体积平均粒径D，表示的是微胶囊粒径对体积的加权平均值。

6.益生菌在模拟胃液和高胆盐溶液中的存活

模拟胃液的配制：用浓盐酸溶液将0.2g/100mL NaCl溶液的pH值调节至2.0，然后加入一定量的胃蛋白酶并使其终质量浓度为0.3g/L，最后用0.22μm的膜进行过滤灭菌；高胆盐溶液的配制：将胆盐均匀地分散于磷酸盐缓冲液中，它的终质量浓度为4.5g/L，然后用0.1mol/LNaOH溶液将此混合液的pH值调至7.4并灭菌。

0.5g微胶囊加入到4.5mL在37℃条件下预热的模拟胃液或高胆盐溶液中，用漩涡振荡器充分振荡10s，然后在37℃、100r/min条件下温育2h。在5、30、60、120min时，用高速均质器对样品溶液进行破碎，并按照上述方法进行计数。

7.不同微胶囊对双歧杆菌贮藏稳定性的影响

将冷冻干燥后的微胶囊放置于无菌的西林瓶中，然后在抽真空的情况下进行热封口，把封口好的西林瓶放置于常温条件下贮藏1个月，每隔15d从西林瓶中取样并按对双歧杆菌进行计数。

实验结果：

1.不同壁材双歧杆菌微胶囊的粒径大小和包埋效率

粒径和包埋效率是评价微胶囊的重要指标，不同壁材对微胶囊的粒径和包埋效率均有显著的影响。由表1可知，海藻酸钠制备得到的微胶囊粒径为125.2μm，且该微胶囊对双岐杆菌的包埋效率为58.6％，而通过胎盘提取物制备得到的微胶囊粒径则在此基础上增加了76.3μm，并且对双歧杆菌的包埋效率高达86.4％。

表1不同壁材双歧杆菌微胶囊的粒径大小和包埋效率

2.不同包埋壁材对双歧杆菌保护效果的影响

2.1不同微胶囊在模拟胃液中对双歧杆菌保护效果的影响

表2双歧杆菌在模拟胃液(pH 2.0，37℃，2h)中的存活情况

D值(在一定的处理条件下，杀灭90％细菌所需要的时间)

由表2可知，相比于未经包埋的双歧杆菌，在模拟胃液中的存活率都有不同程度的增加，胎盘提取物包埋后的双歧杆菌的存活量提高了7(lg(CFU/g)。通过D值发现在低酸环境中，胎盘提取物(D值＝114.4min)对双歧杆菌的保护作用要好于海藻酸钠(D值＝20.3min).2.2不同微胶囊在高胆盐环境中对双歧杆菌保护效果的影响

表3双歧杆菌在模高胆盐溶液(pH 7.4，37℃，2h)中的存活情况

由表3可知，用高胆盐环境处理2h后，未经包埋处理的双歧杆菌死亡了大约3(lg(CFU/mL))，而经过包埋处理的双歧杆菌却只死亡了大约1(lg(CFU/mL))。海藻酸钠和胎盘提取物的在高胆盐环境中对双歧杆菌的保护效果上并没有显著差异，两者的D值处于同一显著水平上。

3.不同微胶囊对双歧杆菌贮藏稳定性的影响

由图1可知，在常温条件下贮藏30d后发现，三种微胶囊中双歧杆菌的存活量都有不同程度的下降，胎盘提取液微胶囊从7.59(lg(CFU/g))下降到6.71(lg(CFU/g))，海藻酸钠微胶囊下降的趋势更为明显，在1个月的贮藏期里，双歧杆菌的致死量接近2(lg(CFU/g))。胎盘提取液微胶囊联合花青素，从7.69(lg(CFU/g))下降到7.04(lg(CFU/g))总的来说，包埋于胎盘提取物微胶囊中的双歧杆菌的贮藏稳定性要好于包埋于海藻酸钠微胶囊中的双歧杆菌，胎盘提取液微胶囊联合花青素中的双歧杆菌贮藏稳定性最好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S2、微胶囊壁材的制备：在质量百分比为8％～12％的胎盘水溶性提取液溶液中逐滴加入3％的原花青素溶液，搅拌混匀，热变性处理，获得微胶囊壁材；

S3、益生菌微胶囊的制备：将益生菌菌液与微胶囊壁材混合，加入转谷氨酰胺酶并使其分散均匀，将此混合液加入预热的大豆油中，然后使该体系在搅拌状态下反应；待液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后，离心收集微胶囊颗粒，即获得益生菌微胶囊。

2.根据权利要求1所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S3中所述的益生菌为乳杆菌类和双歧杆菌类益生菌中的一种或多种组合；其中，乳杆菌类益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和詹氏乳杆菌，双歧杆菌类益生菌包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S1中所述的生理盐水的用量按冻干粉：生理盐水＝1g：30～70ml计；

步骤S1中所述的离心收集上清的具体操作为：第一次8000～9000g，25～35min离心收集上清，第二次27000～29000g，110～130min离心收集上清。

4.根据权利要求1或2所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S1中所述的清洗的具体操作为：将胎盘泡在水中，用手捏住胎盘边缘，顺着大血管的方向，将大血管的血液向剪掉脐带的开口挤出，清洗干净后，将清洗好的胎盘沥干；

步骤S1中所述的胎盘在冻干前需剪成0.5～1.5cm的小块；

步骤S1中所述的生理盐水的用量按1g：50ml计；

步骤S1中所述的离心收集上清的具体操作为：第一次7000g，30min离心收集上清，第二次28000g，2h离心收集上清；

步骤S1中所述的过滤所用的滤膜孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1或2所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S2中所述的热变性处理的条件为：温度75～85℃、时间20～40min。

6.根据权利要求1或2所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S2中所述的胎盘水溶性提取液溶液的浓度为10％，所述的原花青素溶液的浓度为3％；

步骤S2中所述的搅拌为磁力搅拌；

步骤S2中所述的热变性处理的条件为温度80℃、时间30min。

7.根据权利要求1或2所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S3中所述的益生菌菌液的浓度为10⁸～10¹¹CFU/mL；

步骤S3中所述的益生菌菌液、微胶囊壁材、转谷氨酰胺酶、大豆油的配比为2mL：18～22mL：0.1～0.3g：140～160g；

步骤S3中所述的大豆油的预热温度为38～42℃；

步骤S3中所述的搅拌的转速为800～1000r/min；

步骤S3中所述的反应的条件为：温度38～42℃、时间170～190min；

步骤S3中所述的离心的条件为：转速400～600r/min，时间55～65s。

8.根据权利要求1或2所述的胎盘水溶性提取物作为壁材制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于：

步骤S3中所述的益生菌菌液的浓度为10⁹CFU/mL；

步骤S3中所述的益生菌菌液、微胶囊壁材、转谷氨酰胺酶、大豆油的配比为2mL：20mL：0.2g：150g；

步骤S3中所述的大豆油的预热温度为40℃；

步骤S3中所述的搅拌的转速为900r/min；

步骤S3中所述的反应的条件为：温度40℃、时间180min；

步骤S3中所述的离心的条件为：转速500r/min，时间60s；

步骤S3中获得所述的益生菌微胶囊后，加入林格氏试剂，在700r/min条件下离心5min，重新收集胶体颗粒，以进行清洗。

9.一种益生菌微胶囊，通过权利要求1～8任一项中所述的制备方法得到。

10.权利要求9中所述的益生菌微胶囊的应用，其特征在于：用于制备食品、饲料、药品、化妆品或日用品。