CN114544845A - 一种盐酸达泊西汀中r异构体的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱法测定供试品溶液中的盐酸达泊西汀R异构体；所述供试品溶液中使用的溶剂为正己烷、乙醇及二乙胺的混合溶液；所述高效液相色谱法中的检测条件为：色谱柱为纤维素类手性柱；柱温为20～30℃；检测波长为228～232nm或290～294nm。本发明中的测定方法能够实现达泊西汀R异构体与达泊西汀及其他杂质的有效分离，达泊西汀R异构体和达泊西汀出峰时间早，约在6～8min内，具有简单，快速，准确度高等优点；而且能够准确测定达泊西汀R异构体的含量；实现了对原料药中盐酸达泊西汀R异构体的有效控制，有利于控制产品质量。

Description

一种盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法

技术领域

本发明属于测试领域，具体涉及一种盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法。

背景技术

盐酸达泊西汀，化学名为(+)-(S)-N,N-二甲基-(α)-[2-(1-萘氧基)乙基]-苯甲胺盐酸盐，是一种选择性的5-羟色胺再吸收抑制剂。盐酸达泊西汀口服给药迅速吸收，口服后，达泊西汀被迅速吸收，大约在1-2小时后达到最大血浆浓度(C_max)，其绝对生物利用度为42％(范围为15-76％)。空腹状态下单次口服30mg和60mg达泊西汀后，分别在1.01和1.27小时后达到血浆峰值浓度。给药后24小时血药浓度底(不到峰值浓度的5％)，每日服用达泊西汀药物蓄积很小。盐酸达泊西汀的这种药动学特点可以满足按需服用，成为首个获准用于治疗早泄的5-羟色胺再吸收抑制剂。盐酸达泊西汀分子结构中存在一个手性中心碳原子，具有一个对映异构体，临床使用的构型为S构型，药理活性为R构型3.5倍。根据已有文献资料，盐酸达泊西汀的制备方法主要有两种，一种是以手性试剂还原形成达泊西汀手性中心的方法，另一种是拆分方法形成达泊西汀手性中心的方法，无论采用哪一种合成方法，在合成过程中可能存在因杂质去除不完全而影响药物的纯度和质量。目前，已报道的盐酸达泊西汀检测方法存在目标化合物出峰时间较长，色谱峰有拖尾现象，影响产品的检测效率和生产成本，因此，实现盐酸达泊西汀R异构体的分离和有效测定对盐酸达泊西汀原料药及制剂的生产和质量控制具有重要的实际意义。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，该测定方法能够有效、快速、准确和可靠的分离检测出盐酸达泊西汀原料药中R异构体，达泊西汀峰和达泊西汀峰R异构体峰峰型对称，没有拖尾现象，有利于控制盐酸达泊西汀原料药及制剂的产品质量，保障患者用药安全性。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供了一种盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，包括以下步骤：

采用高效液相色谱法测定供试品溶液中的盐酸达泊西汀R异构体；所述供试品溶液中使用的溶剂为正己烷、乙醇及二乙胺的混合溶液；所述高效液相色谱法中的检测条件为：色谱柱为纤维素类手性柱；柱温为20～30℃；检测波长为228～232nm或290～294nm。本发明所采用的测定方法适用于盐酸达泊西汀R异构体的分离和测定，与现有技术相比，本发明中的测定方法更快捷，提高了效率，改善了峰型和拖尾现象，更准确有效。

优选地，所述柱温为22～28℃；进一步优选地，所述柱温为25～28℃；更进一步优选地，所述柱温为25℃。

优选地，所述检测波长为228～232nm；进一步优选地，所述检测波长为230～232nm；更进一步优选地，所述检测波长为230nm。

优选地，所述检测波长为291～293nm；进一步优选地，所述检测波长为292～293nm；更进一步优选地，所述检测波长为292nm。

优选地，所述高效液相色谱法中的流动相为乙醇、正己烷与二乙胺的混合溶液。

优选地，所述流动相中，所述乙醇、正己烷与二乙胺的体积比为1000：(4.9×10⁴～9.9×10⁴)：(0.9～1.1)；进一步优选地，所述流动相中，所述乙醇、正己烷与二乙胺的体积比为1000：(6.0×10⁴～9.9×10⁴)：(0.9～1.1)；更优选地，所述流动相中，所述乙醇、正己烷与二乙胺的体积比为1000：(9.0×10⁴～9.9×10⁴)：1；最优选地，所述流动相中，所述乙醇、正己烷与二乙胺的体积比为1000：9.85×10⁴：1。

优选地，所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min；进一步优选地，所述流动相的流速为1～1.1mL/min；更优选地，所述流动相的流速为1mL/min。

优选地，所述色谱柱的柱长为150～250mm；进一步优选地，所述色谱柱的柱长为200～250mm；更优选地，所述色谱柱的柱长为230～250mm。

优选地，所述纤维素类手性柱为以纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱。

优选地，所述填充剂的粒径为1.8～5μm；进一步优选地，所述填充剂的粒径为2～5μm；更优选地，所述填充剂的粒径为3～5μm。

优选地，所述正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为80：20：(0.1-0.5)；进一步优选地，所述正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为80：20：(0.3-0.5)；更优选地，所述正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为80：20：(0.4-0.5)；最优选地，所述正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为80：20：0.4。

优选地，所述测定方法还包括：以盐酸达泊西汀和盐酸达泊西汀R异构体标准品配制系统适用性溶液，测试并确定达泊西汀和达泊西汀R异构体的保留时间以及分离度的步骤。

优选地，所述系统适用性溶液中，盐酸达泊西汀的浓度为2mg/mL。

优选地，所述系统适用性溶液中，盐酸达泊西汀R异构体的浓度为2μg/mL。

优选地，所述盐酸达泊西汀R异构体含量的计算方法为主成分自身对照法；

优选地，所述盐酸达泊西汀R异构体含量的计算公式为：

式中：A_R为供试品溶液色谱图中达泊西汀R异构体峰面积；As为对照溶液色谱图中达泊西汀峰面积；所述对照溶液为供试品溶液稀释1000倍后的溶液。

本发明的有益效果是：(1)本发明中的测定方法能够实现达泊西汀R异构体与达泊西汀及其他杂质的有效分离，达泊西汀R异构体和达泊西汀出峰时间早，约在6～8min内，具有简单，快速，准确度高等优点；(2)本发明中的测定方法不仅能够实现达泊西汀R异构体与达泊西汀主成分及相关杂质的有效分离，而且能够准确测定达泊西汀R异构体的含量；(3)本发明中的测定方法所采用的溶剂中添加二乙胺，能很好改善峰型，提高分离度，与现有技术相比，本发明中的测定方法能够有效、快速、准确和可靠的分离检测出盐酸达泊西汀原料药中对映异构体，实现了对原料药中盐酸达泊西汀R异构体的有效控制，有利于控制盐酸达泊西汀原料药及制剂的产品质量，保障患者用药安全。

附图说明

图1为实施例1中溶剂的色谱图。

图2为实施例1中系统适用性溶液的色谱图。

图3为图2的放大图。

图4为实施例1中供试品溶液的色谱图。

图5为图4的放大图。

图6为实施例1中对照溶液的色谱图。

图7为实施例3中的选择性溶液的色谱图。

图8为图7的放大图。

图9为实施例3中的溶剂、系统适用性溶液和选择性溶液的色谱图。

图10为图9的放大图。

图11为达泊西汀的线性曲线图。

图12为达泊西汀R异构体的线性曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若为有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

以下实施例中所采用的溶剂均为正己烷、无水乙醇和二乙胺的混合液，正己烷、无水乙醇和二乙胺的体积比为80:20:0.04。

实施例1

本例中的盐酸达泊西汀中R异构体含量的测定方法，采用高效液相色谱法测定盐酸达泊西汀中R异构体的含量，具体包括以下步骤：

(1)溶液配制

分别配制供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，具体配制方法如下：

供试品溶液：取本品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液。

对照溶液：精密移取供试品溶液适量，加溶剂稀释成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0μg的溶液，作为对照溶液。

系统适用性溶液：取盐酸达泊西汀与盐酸达泊西汀的R异构体对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0mg、盐酸达泊西汀R异构体80μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

(2)设置检测条件

色谱柱为Phenomenex

Cellulose-1，规格为4.6mm×250mm，5μm，流动相由正己烷-无水乙醇-二乙胺组成，正己烷与无水乙醇的体积比为98.5：1.5，二乙胺的体积为无水乙醇总量的0.1％；柱温为25℃，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪检测器的检测波长为292nm。

(3)系统适用性要求

系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为达泊西汀R异构体，达泊西汀，达泊西汀与达泊西汀R异构体峰的分离度应符合要求。

(4)检测

取溶剂10μL，注入高效液相色谱仪进行检测，记录色谱图，其色谱图如图1所示。

取系统适用性溶液10μL，注入高效液相色谱仪进行检测，记录色谱图，其色谱图如图2和图3所示，达泊西汀R异构体出峰时间为6.483min，达泊西汀出峰时间为7.157min，达泊西汀R异构体与达泊西汀的分离度为2.82，大于1.5，符合要求。

取对照溶液10μL，注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的20％～50％，其色谱图如图6所示，达泊西汀出峰时间为7.307min，且空白溶剂无干扰；再精密量取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，具体见图4和图5所示。由图4和图5可知，达泊西汀R异构体出峰时间为6.567min，达泊西汀出峰时间为7.263min，达泊西汀R异构体与达泊西汀及其他杂质均能很好分离，分离度为2.85，大于1.5，符合要求，且空白溶剂中无干扰，此检测方法适用。

实施例2

本例中的盐酸达泊西汀中R异构体含量的测定方法，采用高效液相色谱法测定盐酸达泊西汀中R异构体的含量，具体包括以下步骤：

(1)溶液配制

分别配制供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，具体配制方法如下：

供试品溶液：取本品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液。

对照溶液：精密移取供试品溶液适量，加溶剂稀释成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0μg的溶液，作为对照溶液。

系统适用性溶液：取盐酸达泊西汀与盐酸达泊西汀R异构体对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0mg、盐酸达泊西汀R异构体80μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

(2)设置检测条件

色谱柱为Phenomenex

Cellulose-1，规格为4.6mm×250mm，5μm，流动相由正己烷、无水乙醇、二乙胺混合而成，正己烷与无水乙醇的体积比为98.5：1.5，二乙胺的体积为无水乙醇总量的0.1％：柱温为25℃，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪检测器的检测波长为230nm。

(3)系统适用性要求

系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为达泊西汀R异构体，达泊西汀，达泊西汀与达泊西汀R异构体峰的分离度应符合要求。

(4)取对照溶液10μL，注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的20％～50％，再精密量取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。本例中的检测条件下达泊西汀R异构体与达泊西汀及其他杂质能很好分离，分离度大于1.5，且空白溶剂中无干扰。

实施例3

对实施例1中的检测方法进行方法验证，分别从系统适用性、专属性、线性关系、定量限、检测限、精密度、准确度、溶液稳定性、耐用性等几个方面进行验证，下面进行详细的说明。

(1)系统适用性：

取盐酸达泊西汀与盐酸达泊西汀R异构体对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1mL中含盐酸达泊西汀2.0mg、盐酸达泊西汀R异构体80μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

取10μL系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中，检测波长为292nm，记录色谱图，各成分的分离情况见表1。

表1达泊西汀及其R异构体的检测结果

由表1可知，在292nm检测波长下，系统适用性溶液中的出峰顺序为达泊西汀R异构体、达泊西汀，达泊西汀与各杂质之间分离良好，分离度为2.82，溶剂峰不干扰达泊西汀R异构体和主成分测定。

(2)专属性

选择性溶液：精密称取盐酸达泊西汀原料100mg，置50mL容量瓶中，再精密量取R异构体对照品贮备液1mL，置上述容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

精密量取溶剂、系统适用性溶液和选择性溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，具体如图7～10所示，其中图7和图8为选择性溶液的色谱图；图9和图10为溶剂、系统适用性溶液和选择性溶液的色谱图。从图7～10中可以看出，溶剂在达泊西汀峰与达泊西汀峰R异构体峰出峰处无干扰；系统适用性溶液和选择性溶液中达泊西汀峰与达泊西汀峰R异构体峰有明确归属，达泊西汀峰与达泊西汀峰R异构体峰的分离度均大于1.5。

(3)线性关系与校正因子

分别精密称取盐酸达泊西汀对照品和盐酸达泊西汀R异构体对照品各10mg，置于100ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备液。精密量取线性贮备液适量，按表2稀释，配成系列浓度的线性溶液，分别进样，记录色谱图。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标，进行线性回归，结果表明在0.20～6.2μg·mL^-1范围内盐酸达泊西汀浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程y＝0.1835x-0.0025，r＝1.0000，具体见图11所示；在0.20～5.8μg·mL^-1范围内盐酸达泊西汀R异构体浓度与峰面积呈良好的线性关系，回归方程y＝0.1903x-0.0024，r＝1.0000，具体见图12。盐酸达泊西汀R异构体相对盐酸达泊西汀的校正因子为0.96，具体结果见表3所示。

R异构体校正因子K的计算：

式中：S_{盐酸达泊西汀}：盐酸达泊西汀的斜率；S_R异构体：R异构体的斜率。

表2线性溶液配制表

表3线性和范围结果表

(4)检测限和定量限

取线性贮备液，用逐级稀释法测定检测限和定量限，检测限的测试结果见表4所示，定量限的测试结果见表5所示。

表4检测限结果

表5定量限结果

*定量限即线性L1溶液

由表4和表5可知，根据信噪比法，以信噪比(S/N)3:1得盐酸达泊西汀的检测限为0.041μg·mL^-1(相当于0.002％)，盐酸达泊西汀R异构体的检测限为0.040μg·mL^-1(相当于0.002％)；以信噪比(S/N)10:1得盐酸达泊西汀的定量限为0.205μg·mL^-1(相当于0.01％)，盐酸达泊西汀R异构体的定量限为0.195μg·mL^-1(相当于0.01％)。将定量限浓度溶液连续进样6次，盐酸达泊西汀峰面积的RSD为3.8％，盐酸达泊西汀R异构体峰面积的RSD为3.1％，说明定量限溶液的精密度符合要求。

(5)精密度

1)重复性

R异构体对照品贮备液：精密称取盐酸达泊西汀R-异构体对照品10mg，置100mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为R异构体对照品贮备液。

精密称取盐酸达泊西汀原料100mg，置于50ml容量瓶中，加入R异构体对照品贮备液1mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制6份，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算R异构体的RSD值，具体结果见表6所示。

表6重复性结果表

由表6可以看出，测得的盐酸达泊西汀R异构体含量的RSD为0.5％(n＝6)，表明本发明中的检测方法重复性好，稳定性好。

2)中间精密度

由不同的分析员，在不同日期采用不同的仪器，照重复性样品配制方法，取相同批次原料平行配制6份供试品溶液，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以外标法计算盐酸达泊西汀R异构体的RSD值，具体测试结果如表7所示。

表7中间精密度结果表

由表7可知，不同分析员测得6份供试品溶液中盐酸达泊西汀R异构体含量的RSD为1.0％(n＝6)，与重复性测试中6份供试品溶液平行测定结果相比，两人12份供试品溶液的盐酸达泊西汀R异构体含量的RSD为2.6％，结果表明本发明中的检测方法中间精密度良好。

(6)准确度

精密称取盐酸达泊西汀原料100mg，置于50mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为空白供试品溶液，平行配制2份。

精密称取盐酸达泊西汀原料100mg，置于50mL容量瓶中，分别精密量取R异构体对照品贮备液0.5mL、1.0mL、1.5mL至上述容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为50％限度、100％限度、150％限度准确度溶液。每个限度浓度平行配制3份。

精密量取上述溶液10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算回收率，具体结果见表8所示。

表8 R异构体准确度结果表

由表8可以看出，盐酸达泊西汀R异构体的回收率为98.1％～104.2％，平均回收率为100.8％，RSD为2.2％，表明本发明中的检测方法的准确度良好。

(7)溶液稳定性

取线性L3溶液，分别于0、2、6、22、36、42小时进样测试，取100％限度准确度溶液，分别于0、4、8、24、38、45小时进样测试，具体测试结果见表9所示。

表9稳定性结果表

由表9可知，线性L3溶液中，盐酸达泊西汀峰面积和盐酸达泊西汀R异构体峰面积的RSD分别为2.2％和0.8％，表明对照品溶液放置42小时稳定。采用100％限度准确度溶液作为测试溶液，测得盐酸达泊西汀R异构体含量的RSD为1.0％，结果表明100％限度准确度溶液在45小时内盐酸达泊西汀R异构体含量无明显变化，基本稳定。

(8)耐用性

精密称取盐酸达泊西汀原料100mg，置于50ml容量瓶中，加入R异构体对照品贮备液1mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为100％限度浓度加标供试品溶液。

取系统适用性溶液和100％限度浓度加标供试品溶液，在各耐用性条件下(柱温±2℃、流速±0.1ml/min、流动相比例±0.5％、波长±2nm)进样分析，记录色谱图，具体测试结果见表10所示。

表10耐用性结果表(耐用性条件考察)

由表10可知，在柱温±2℃、流速±0.1ml/min、流动相比例±0.5％、波长±2nm范围内，系统适用性溶液中盐酸达泊西汀峰和盐酸达泊西汀R异构体峰之间的分离度均大于1.5；100％限度加标供试品溶液中盐酸达泊西汀R异构体含量的RSD均小于2.0％，结果表明柱温、流速、波长与流动相比例的微小变化对盐酸达泊西汀R异构体的测定结果无显著影响，说明本方法耐用性良好，可重复性好。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

采用高效液相色谱法测定供试品溶液中的盐酸达泊西汀R异构体，所述供试品溶液中使用的溶剂为正己烷、乙醇及二乙胺的混合溶液；所述高效液相色谱法中的检测条件为：色谱柱为纤维素类手性柱；柱温为20～30℃；检测波长为228～232nm或290～294nm。

2.根据权利要求1所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱法中的流动相为乙醇、正己烷与二乙胺的混合溶液。

3.根据权利要求2所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述乙醇、正己烷与二乙胺的体积比为1000：(4.9×10⁴～9.9×10⁴)：(0.9～1.1)。

4.根据权利要求2或3所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min。

5.根据权利要求1所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述色谱柱的柱长为150～250mm。

6.根据权利要求1所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述纤维素类手性柱为以纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱。

7.根据权利要求6所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述填充剂的粒径为1.8～5μm。

8.根据权利要求1所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为80：20：(0.1-0.5)。

9.根据权利要求1所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述测定方法还包括：以盐酸达泊西汀和盐酸达泊西汀R异构体标准品配制系统适用性溶液，测试并确定达泊西汀和达泊西汀R异构体的保留时间以及分离度的步骤。

10.根据权利要求1所述的盐酸达泊西汀中R异构体的测定方法，其特征在于：所述盐酸达泊西汀R异构体含量的计算方法为主成分自身对照法；所述盐酸达泊西汀R异构体含量的计算公式为：

式中：A_R为供试品溶液色谱图中达泊西汀R异构体峰面积；As为对照溶液色谱图中达泊西汀峰面积；所述对照溶液为供试品溶液稀释1000倍后的溶液。

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