CN114501999A

CN114501999A - 生物杀虫剂和生物肥料组合物

Info

Publication number: CN114501999A
Application number: CN202080068753.XA
Authority: CN
Inventors: I·M·阿尔瓦雷兹卢格; I·桑切兹奥尔迪兹; I·翁帕迪亚; D·索曼特斯桑切斯; R·莫兰瓦尔迪维雅; L·加尔道斯拜他尔特兹; L·C·道敏圭兹拉比乐罗; A·诺尔德罗瓦尔迪维亚
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2022-05-13
Also published as: EP4005387A2; US20220272986A1; WO2021018321A3; WO2021018321A2; AR119504A1; BR112022001668A2; MX2022001282A; CU20190071A7

Abstract

生物杀虫剂和生物肥料组合物，其包含印度假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas indica)或所述细菌的代谢物以及赋形剂或稀释剂。印度假黄单胞菌或所述细菌的代谢物用于制备生物杀虫剂或生物肥料组合物的用途。用于控制植物病原体和动物线虫的方法，其包括向有此需要的植物或动物施加有效量的印度假黄单胞菌或其代谢物。用于刺激植物生长的方法，其包括向土壤或基质、植物或种子施加有效量的印度假黄单胞菌或所述细菌的代谢物。

Description

生物杀虫剂和生物肥料组合物

技术领域

本发明涉及农业领域，并且基于将印度假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas indica)作为对于农业有益的微生物进行施加。如在本发明中所显示的，该微生物物种的细菌在植物中具有杀线虫、杀真菌、诱导防御反应和促进生长的活性，并且在不影响周围环境的情况下发挥这些效应。

现有技术

植物与发挥生物肥料和生物防治作用的微生物相关联。这些具有其生物肥料效应的微生物通过增加营养物的可利用性、氮固定和增加共生而有利于植物中的良好状态。生物防治表现为植物生长的增加，这归因于致病生物的控制。该效应通过诸如抗生素、铁载体、细菌和真菌的拮抗物质、细胞外酶的产生以及对于生物和非生物胁迫的抗性的增加的机制而得到发展。通常，在该类型的细菌类别中包括假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)和黄单胞菌属(Xanthomonas)，和在真菌中可以提及木霉属(Trichoderma)(Mabood,Zhou和Smith 2014,Can.J.Plant Sci.94:1051-1063)。

特别地，最常见的植物病原体之一是线虫，因为它们是热带、亚热带和温带地区的农业中最重要的有害生物之一。在线虫物种之中，根结线虫属物种(Meloidogyne ssp.)在许多热带地区中引起估计为11-25％的收成损失。与该概念相关的年损失在全世界据估计为大约870亿。由于其速度和功效，化学杀线虫剂是最常用于控制线虫的方法。但是，熏蒸剂(例如，溴代甲烷)由于其对于哺乳动物的高毒性、其臭氧层还原作用和其残留效应而在许多国家已被禁用。考虑到这些前提，目前鼓励使用拮抗植物线虫的有益微生物以获得生物产品(Jones等人,2013,Mol Plant Pathol 14(9),946-961)。

在线虫的天敌中，包括丁香拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、厚壁孢子轮枝孢(Verticillium chlamydosporium)、少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)这些真菌。也有细菌，例如侵入巴斯德氏芽菌(Pasteuriapenetrans)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(Dong和Zhang 2006,Plant and Soil288(1):31-45)和微代谢冢村氏菌(Tsukamurella paurometabola)菌株C924(专利EP 0774906 B1)。更近期，色杆菌属(Chromobacterium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)和黄杆菌属(Flavobacterium)的菌株获得了专利权用于调节线虫侵染。

但是，直至目前还没有完全有效的生物产品，因此存在拥有这样的有益微生物的需要，即植物的病原体未对其发展出抗性，并且其具有最小的环境影响。

发明描述

本发明通过提供生物杀虫剂或生物肥料组合物而解决了上面提及的问题，所述组合物包含印度假黄单胞菌或所述细菌物种的代谢物，以及赋形剂或稀释剂。在本发明中首次证明，该物种可以用作广谱杀线虫剂和杀真菌剂，其能够在主要农作物中控制植物致病性线虫和真菌群体。本发明的实验证明，包含印度假黄单胞菌的生物杀虫剂组合物降低了根结线虫属的卵的“体外”孵化，相对于在未用所述细菌进行处理的卵中所观察到的孵化而言；并且提高了线虫幼虫的死亡率。向土壤施加该细菌减小了在番茄中的根结线虫属物种侵染指数，并且以高的技术效率(TE)降低了根部虫瘿的数目。

在本发明的情景下，“生物杀虫剂”是指用于通过特异性生物学效应来控制农业有害生物的产品。这将它们与具有更宽的作用的化学杀虫剂相区分。如本领域技术人员所知的，生物杀虫剂产品包含生物防治试剂，即生物、其基因或其代谢物，用于控制有害生物(Lacey和Sporleder,2013,第16章，Biopesticides,Insect Pests of Potato,第463-497页)。在本发明的生物杀虫剂组合物中，生物防治效应由细菌或它所产生的化合物来发挥。

在本发明的情景下，“生物肥料”是指包含有利于植物的生长和发育的有益生物的产品，作为对于化学肥料的替代物，对于生态系统没有不利效应。如本领域技术人员所知的，生物肥料产品促进营养物的可利用性和吸收，以及植物激素的产生。此外，它们赋予植物以针对胁迫的耐受性，并且提高对于病原体的抗性，这导致作物的改善(Bhardwaj等人,2014Microbial Cell Factories 13:66)。

根据所显示的实验证据，本发明提供了经处理的植物的防御反应诱导剂和生长促进剂。这包含微生物印度假黄单胞菌，它是一种革兰氏阴性的、能动的、过氧化氢酶和氧化酶阳性的细菌，并且在胰胨豆胨琼脂培养基上在28℃下生长24小时后形成黄色的菌落。在本发明中，所述细菌获得自来自用根结线虫属物种侵染的栽培室的健康番茄植物的根际，并且通过常规生物化学和分子生物学技术被鉴定为印度假黄单胞菌。该细菌物种不是新的，已从世界其他地区的土壤中分离到。该物种的代表性菌株(命名为P15)分离自在印度在室外的六氯环己烷垃圾场的土壤，并且于2011年报告(Kumari等人,2011,Int J Syst EvolMicrobiol 61:2107-2111)。该物种在已知的微生物保藏中心是商购可得的。

在本发明的一个实施方案中，所述生物杀虫剂或生物肥料组合物包含活的或灭活的印度假黄单胞菌。在本发明中证明，培养物上清液以及活的细菌及其挥发性或可溶性化合物(代谢物)都具有杀线虫和/或杀真菌活性。

在本发明的情景下，“代谢物”是指这样的由印度假黄单胞菌产生的物质或化合物，其能够控制植物中的有害生物和动物线虫，和/或具有刺激植物生长的活性。在本发明的一个实施方案中，通过天然方式、通过重组方式或通过化学合成来获得最初由印度假黄单胞菌产生的代谢物。在一个特别的实施方案中，所述代谢物为挥发性或可溶性化合物。

由印度假黄单胞菌释放到培养基中的代谢物以及它产生的挥发性化合物对于下列植物致病性真菌具有“体外”活性：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、稻帚枝杆孢(Sarocladium oryzae)、茄匍柄霉(Stemphylium solani)、烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)、稻离孺孢(Bipolaris oryzae)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)。此外，它们还具有刺激植物生长的活性，并且增加植物的长度和重量、主根的长度以及侧根和根毛的数目。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物另外还包含稳定化合物、增强剂、杀线虫活性的激发物或种子包衣。在本发明的一个实施方案中，所述细菌的浓度为1×10⁸至1×10¹⁰菌落形成单位(CFU)/ml组合物。所述生物杀虫剂组合物对于直接地或间接地控制植物病原体和动物线虫来说是有用的。

在另一个方面，本发明包括印度假黄单胞菌或该细菌的代谢物用于制备生物杀虫剂或生物肥料组合物的用途。在本发明的一个实施方案中，对于所述用途，所述细菌的浓度为1×10⁸至1×10¹⁰cfu/ml组合物。在本发明的一个实施方案中，将所述生物肥料组合物配制为预包装土壤、粉剂、液体、悬浮液、颗粒剂、喷雾剂或包囊产品。

另一方面，本发明揭示了用于控制植物病原体和动物线虫的方法，其包括向有此需要的植物或动物施加有效量的印度假黄单胞菌或其代谢物。在本发明的一个实施方案中，在所述方法中，所述细菌作为活的或灭活的菌株的悬浮液或浓缩物来进行施加。在一个特别的实施方案中，在所述方法中，将所述细菌配制为预包装土壤、粉剂、液体、悬浮液、颗粒剂、喷雾剂或包囊产品。在一个实施方案中，在本发明的方法中，所述菌株对于降低在植物中由植物致病性线虫或真菌造成的侵染程度来说是有用的。

本发明的目标还在于用于刺激植物生长的方法，其包括向土壤、基质、植物或种子施加有效量的印度假黄单胞菌或其代谢物。在所述方法中，任选地，将所述细菌配制为预包装土壤、粉剂、液体、悬浮液、颗粒剂、喷雾剂或包囊产品。

附图简述

图1.根据基于编码16s核糖体核糖核酸(rRNA)的基因的序列的邻接法而得到的菌株H32的系统发生树，其显示了菌株H32与假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)的代表性成员的关系。作为该群组之外的微生物，使用恶臭藤黄色单胞菌(Luteimonas mephitis)B1953/27、东海沙单胞菌(Arenimonas donghaensis)HO3-R19、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)DSM 2043T和溶血嗜热单胞菌(Thermomonas haemolytica)A50-7-3。在分支节点处出现大于70％的重采样值(这些以1000次重复的％表示)。条状物表示每100个核苷酸两个置换。

图2.挥发性有机化合物(缩写为VOC)对于真菌稻离孺孢的生长的影响。H32、H36和H42：所研究的细菌菌株。对照：未处理的组。不同的字母指明了在统计学上显著的差异，根据Duncan检验，p<0.05。

图3.在暴露于印度假黄单胞菌菌株H32的VOC(H32)或胰胨豆胨肉汤培养基(对照)14天之后，拟南芥(Arabidopsis thaliana)的枝条长度(A)和植株重量(B)。星号指示指明了在统计学上显著的差异，根据Student检验，p<0.05。

图4.在与印度假黄单胞菌菌株H32、H36和H42或者与作为阴性对照的MgSO₄(10mmol/L)(对照)共培养八天后，在拟南芥植物中的主根长度。不同的字母指明了在统计学上显著的差异，根据Duncan检验，p<0.05。

图5.在暴露于印度假黄单胞菌菌株H32、H36和H42或者暴露于作为阴性对照的MgSO₄(10mmol/L)(对照)的拟南芥植物中的侧根数目。不同的字母指明了在统计学上显著的差异，根据Duncan检验，p<0.05。

图6.在暴露于印度假黄单胞菌菌株H32、H36和H42或者暴露于作为阴性对照的MgSO₄(10mmol/L)(对照)的拟南芥植物的1cm主根中的根毛数目。不同的字母指明了在统计学上显著的差异，根据Duncan检验，p<0.05。

图7.施加至根的印度假黄单胞菌菌株H32对于拟南芥叶中的防御基因PR1和PDF1.2的表达的影响。实验组：用水进行处理的对照植物(C)，和用细菌菌株H32进行处理的植物(H32)。不同的字母指明了在统计学上显著的差异，根据Duncan检验，p<0.05。

图8.施加至根的印度假黄单胞菌菌株H32对于下列防御基因的表达的影响：渗透蛋白(图版A)、氢过氧化物裂合酶(HPL)(图版B)、壳多糖酶(图版C)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)(图版D)、PR-1(图版E)、环丙烯合酶(AOS)(图版F)和苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)(图版G)。不同的字母指明了在统计学上显著的差异，根据Duncan检验，p<0.05。在番茄叶中，在全株水平上测量所述基因的表达。

实施方案的详细描述/实施例

实施例1.具有杀线虫特性的细菌菌株的分离和保存

为了分离具有杀线虫特性的细菌菌株，在谢戈德阿维拉在具有高的根结线虫属物种侵染的栽培室中采集了较少被影响的番茄植物的根际土壤样品。首先，进行选择性预富集。为此，取一克的根际土壤，并且在包含作为唯一碳源和能源的100枚根结线虫卵/mL培养物的M9基本培养基中在30℃下温育48小时。从该制备物开始，制作系列稀释物，将其接种在具有有着0.05％壳多糖的M9基本培养基的皮氏培养皿中，以进行菌株的筛选。选择具有显示出不同形态学特征的晕圈的菌落，并且将它们命名为H加上分离的连续编号。接着，通过测定脱硫酶和明胶酶活性来进行第二次菌落选择。通过放置在具有胰胨豆胨琼脂的皮氏培养皿中的菌落之上的浸泡有乙酸铅的滤纸由于所述菌落产生氢硫酸而变黑来观察脱硫酶活性。通过在具有0.5％的明胶并添加有Frazier试剂的营养琼脂上生长24小时后观察水解晕圈来评价明胶酶活性。

在胰胨豆胨琼脂培养基上在30℃下温育24小时后，菌株H32、H36和H42显示出3至5mm的、不透明的、淡黄色的、圆形的且凸状升高的菌落。这些菌落的边缘是完整的，具有光滑和发亮的表面，并且其黏稠度是奶油状的。为了保存分离物，使菌落在胰胨豆胨肉汤中生长12小时，添加甘油作为冷冻保护剂(以20％的最终浓度(v/v))，并且将这些样品在-70℃下冷冻。

实施例2.所分离出的细菌的分类学鉴定

为了进行鉴定，按照《伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual of SystematicBacteriology)》(Vos等人，2009,Springer Dordrecht Heidelberg London New York,第2版,第3卷,第1450页，ISBN:978-0-387-95041-)进行革兰氏染色，氧化酶和过氧化氢酶试验，和Hugh Leifson试验。确定菌株H32、H36和H42为革兰氏阴性的、能动的、需氧的并具有氧化代谢的杆菌。通过API 20NE试剂盒(Biomeriux)进行的常规试验显示出不与所述试剂盒的鉴定目录中的任一个相符的特性谱。生物化学试验的结果显示在表1中。

表1.通过API 20NE进行的生物化学试验的结果

还通过对编码16S rRNA的基因的片段进行测序用分子生物学来表征在实施例1中所提到的菌株。用作用于聚合酶链式反应的引物的寡核苷酸为63F和1387R(Marchesi等人,1998Applied and Environmental Microbiology 64(2):795-9)。通过生物信息学程序包MEGA 7.0(分子进化遗传学分析软件7.0版，Center for Evolutionary FunctionalGenomics,The Biodesign Institute,Arizona State University)，将所述序列与在美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库中可得的序列进行比较。通过邻接法获得的在图1中所呈现的系统发生树确证，菌株H32、H36和H42与拟杆菌门(Bacteroidetes)的假黄单胞菌属的成员一起形成一个连贯的群组，和与印度假黄单胞菌一起形成一个属内分支。使用恶臭藤黄色单胞菌B1953/27、东海沙单胞菌HO3-R19、产酶溶杆菌DSM 2043T和溶血嗜热单胞菌A50-7-3作为该群组之外的微生物。在分支节点处出现大于70％的重采样值。在图1中仅显示了与菌株H32相关的信息。通过最大概率法获得的系统发生树具有与邻接法相似的拓扑学。

距离矩阵分析使得能够确定在用印度假黄单胞菌P15(EF424397.1)的研究中所述菌株的16S rRNA基因的序列的最大邻近性。根据系统发生分析的结果，推断所研究的菌株属于印度假黄单胞菌这一物种，并且其生物化学试验的结果符合对于该细菌物种所描述的主要特征。

实施例3.相应于所选择的菌株的细菌的“体外”杀线虫活性

用根结线虫属物种的植物线虫的卵和幼体进行体外测定法，并且测定印度假黄单胞菌的活细胞的杀线虫活性。为此，从被该有害生物影响的番茄植物的根提取卵块，用0.5％的次氯酸钠使卵块解聚，并且为每一个待检定的样品安排(100枚卵的)三次重复。为了获得幼虫，在无菌的去离子水中在28-30℃的温度下将卵孵化6天。用仅包含在1ml的无菌的具有蛋白胨(以1％(w/v))的水中的该线虫的100枚卵和100只幼虫同等地制备参照样品。作为针对根结线虫属物种的卵的活性的标准，测定卵孵化抑制百分比。作为针对该线虫的幼虫或幼体的活性的标准，计算其存活降低百分比。

从每个菌株的新鲜培养物开始制备印度假黄单胞菌的完整活细胞样品，对其将细菌浓度测定为cfu/ml。以一式两份取1ml的培养物，通过离心分离开细胞，并且用在水中的蛋白胨(1％)进行洗涤。然后，在所述测定法中所使用的相同溶液之中进行1:100的三个系列稀释。表2和3显示了所述印度假黄单胞菌稀释物中的两个对于线虫的卵和幼虫的效应。

表2.在两种浓度的印度假黄单胞菌的活细胞下，根结线虫属物种的线虫的卵孵化抑制百分比

表3.在两种浓度的印度假黄单胞菌的活细胞下，根结线虫属物种的线虫的幼虫存活降低百分比

因此，证明了印度假黄单胞菌抑制根结线虫属物种的卵孵化。也降低该线虫的幼虫存活。

实施例4.印度假黄单胞菌的碳水化合物利用和酶促活性的特性谱

为了确定印度假黄单胞菌的菌株H32所利用的碳水化合物(作为唯一碳源和能源)，使用Biomeriux公司的CH50试剂盒。印度假黄单胞菌的菌株H32的细菌氧化下列碳水化合物：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蔗糖，如对于该物种的典型菌株(印度假黄单胞菌P15)所报告的。

对于印度假黄单胞菌的所述菌株的酶特性谱的测定，通过在具有0.5％的胶体壳多糖的M9培养基中的生长来检测壳多糖酶的产生。而通过在具有营养琼脂和0.5％的明胶的平皿中接种并且随后用Frazier试剂进行揭示来检测蛋白酶的产生。此外，使用APIZYM^TM试剂盒来检测磷酸酶、酯酶、脂肪酶、葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、甘露糖苷酶、芳基酶、N-乙酰-β-葡糖苷酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶。

这些测定的结果显示在图4中，并且证明印度假黄单胞菌的菌株H32的细菌具有氧化代谢，并且它们能够降解许多的有机化合物和其他复杂的化学化合物。

表4.由印度假黄单胞菌的菌株H32所释放的酶

+：存在-：不存在

实施例5.在西红柿(Solanum lycopersicum)中印度假黄单胞菌对于根结线虫属物种侵染的效应

进行测定法以评价在番茄(西红柿)植物中印度假黄单胞菌的“体内”杀线虫活性。将番茄植物移植到具有1kg基质的花盆中，并且用500枚根结线虫属物种的卵进行侵染。让所述细菌在胰胨豆胨肉汤培养基中生长24小时，并且在去离子水中进行系列稀释，以用于以4×10⁷至2×10⁴cfu/g基质的浓度向植物进行施加。所使用的计划方案为两次施加。在用线虫侵染基质3天时进行一次施加，并且在7天后移植番茄幼苗。第2次施加在移植后14天时进行。作为阳性对照，使用细菌菌株C-924，其具有已知的作为杀线虫剂的特性(欧洲专利EP0774906B1)。在该实验中，使用去离子水作为参照(阴性对照)。

在移植35天时，提取番茄植物，并且用0至10级的Bridge和Page量表来测定根的侵染程度。从这些结果开始，测定菌株H32的每个浓度的TE(Wong等人,(2017)BiotecnologíaAplicada,34:4301-43)。在所评价的所有处理中，所述细菌针对根结线虫属的线虫是有效的，如在表5中所显示的。

表5.西红柿根的侵染程度和用印度假黄单胞菌进行的处理的TE。

^*TE：技术效率

因此，印度假黄单胞菌这一物种的细菌以超过50％的TE降低了根结线虫属物种的侵染指数。

实施例6.释放至印度假黄单胞菌的培养基的代谢物的抗真菌活性

为了测定释放至印度假黄单胞菌菌株H32的培养基的代谢物的抗真菌活性，首先在具有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的皮氏培养皿的中央放置大约7mm的包含真菌的培养基的圆片。在两侧以线的形式置放10μL的在胰胨豆胨肉汤中的菌株H32的细菌悬浮液。在对照处理中，仅放置同样的培养基。在每种情况下进行2次重复。在28℃下温育5天时，测量真菌菌落的直径，并且测定相对于对照而言的生长百分比，如下：

％生长抑制＝((对照菌落的直径–具有处理的菌落的直径)/(对照菌落的直径–7))^*100。

结果显示在表6中，其表明印度假黄单胞菌阻止了一个群组的影响具有重大经济重要性的作物的植物致病性真菌的发展。

表6.由印度假黄单胞菌所释放的代谢物抑制植物致病性真菌的生长

实施例7.由印度假黄单胞菌所产生的挥发性有机化合物的抗真菌活性

组装一个具有两个皮氏培养皿底的系统。在具有PDA培养基的下面部分中，放置大约7mm的具有真菌稻离孺孢的圆片。在具有胰胨豆胨琼脂的上面部分中，给予100μL的在胰胨豆胨肉汤中的细菌菌株H32、H36和H42的12小时培养物。在对照处理中，仅给予100μL的胰胨豆胨肉汤。在每种情况下进行2次重复。将该系统用Parafilm^TM薄膜进行密封，并且在28℃下进行温育。在5天时，测量真菌菌落的直径。测定相对于对照处理而言的生长抑制，如下：

％生长抑制＝((对照菌落的直径–经处理的菌落的直径)/(对照菌落的直径–7))^*100。

所研究的三个菌株抑制稻离孺孢的生长超过50％，而不存在与该病原体的物理接触，如在图2中所看见的。因此，印度假黄单胞菌的挥发性化合物具有抗真菌活性。

实施例8.由印度假黄单胞菌这种细菌产生促进植物生长的挥发性化合物

为了证明在植物中促进生长的活性，将拟南芥的种子(大约100粒种子/处理)用由1mL的次氯酸钠(2％(v/v))和3μL的Triton X100(1％(v/v))构成的混合物进行消毒，然后在37℃下放置8分钟，伴随摇动。接着，将它们用无菌蒸馏水洗涤大约5次，并且在4℃下存放4天。将它们放置在具有MS培养基的直径为150mm的皮氏培养皿中，向其向中心放一个具有胰胨豆胨琼脂的小的皮氏培养皿(直径为50mm)。在植物发芽两天时，用10μL的所研究的微生物的培养物(其事先在37℃下在胰胨豆胨肉汤中生长了12小时)接种所述胰胨豆胨琼脂培养基。将该系统用Parafilm^TM薄膜进行密封，并且在20±2℃下进行温育，具有16小时光照和8小时黑暗的光周期。

在14天时取样品，以评价枝条的长度和重量以及叶的数目。在包含印度假黄单胞菌的皮氏培养皿中温育14天后，拟南芥植物显示出比没有细菌的对照更好的生长(图3)。这证明了由所述细菌所产生的挥发性化合物对于所述植物的生长的刺激。

实施例9.由印度假黄单胞菌所释放的可溶性化合物对于根形态学的效应

将拟南芥变种Col 0的种子暴露于由印度假黄单胞菌释放到培养基中的可溶性化合物。事先，通过在摇动下在37℃下浸没在包含1mL的次氯酸钠(2％(v/v))和3μL的TritonX100(1％(v/v))的溶液中8分钟来对种子进行消毒。将种子用无菌蒸馏水洗涤五次，并且在4℃下维持4天。

将10粒种子以直的且等距的线置放在包含MS培养基的100mm的皮氏培养皿的上端。将平皿垂直放置在照明室中，在22±2℃的温度下和在16小时光照和8小时黑暗的光周期下。在植物发芽4天时，在离根下端2-3cm的距离处，向培养基上添加240μL的菌株H32、H36和H42的细菌悬浮液。这些悬浮液从在胰胨豆胨肉汤培养基中在28℃下生长18小时的培养物开始来进行制备，将所述培养物进行离心并且重悬浮在10mmol/L MgSO₄中。将该系统用Parafilm^TM进行密封，并且在照明室中在同样条件下进行温育。作为阴性对照，使用10mmol/L MgSO₄溶液。在每种情况下配置3次重复。

在共培养8天时，评价主根的长度、侧根的数目和在1cm主根中的根毛的数目(从下至上)。为了进行该评价，使用体视镜和倒置显微镜。相比于对照组而言，与所述细菌菌株一起共培养的植物的根呈现出不同的形态学。这证明了由该细菌所诱导的在根的构造方面的可能改变。在经历用细菌进行的处理的植物中主根的长度比在对照处理中的主根的长度更长(具有统计学显著性，p<0.05)(图4)。

侧根的数目和根毛的数目也比对照处理显著地更多(p<0.05)，如在图5和图6中所看见的。因此，印度假黄单胞菌的施加增加了根的表面积，并因此增加了营养物吸收的可能性。

实施例10.印度假黄单胞菌在拟南芥和番茄中诱导免疫应答标志物表达的能力的评估

在拟南芥中的测定法

将拟南芥的种子在4℃下在水中温育四天，接着播种在由沙:泥炭(1:1)组成的基质中。在发芽六周时，将它们移植至包含相同基质组成的小花盆。一周后，将花盆随机分为两组。第一组用菌株H32的细菌进行处理，按照1mL/植株，用在盐水溶液中的包含10⁹cfu/mL的悬浮液。第二组(对照)仅用1mL的盐水溶液进行处理。以七天的间隔进行四次施加。在最后一次施加后两小时，采集每个处理的植物的叶和根的样品，并且立即在液氮中进行冷冻。

通过实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)来测定基因PR1(由水杨酸介导的免疫应答的标志物)和PDF1.2(由茉莉酮酸介导的免疫应答的标志物)的表达。作为内部对照，使用泛素的基因。如在图7中所显示的，相对于实验对照而言，观察到在用菌株H32的细菌进行处理的植物的叶中PDF1.2基因的增加的表达。PR1基因的表达水平与在对照组中所观察到的没有不同。因此，印度假黄单胞菌这一物种的细菌以全株方式诱导PDF1.2的表达，这被报道为与针对线虫侵染的抗性相关的防御机制。

在番茄中的测定法

该研究的目标是在全株水平上评价印度假黄单胞菌在番茄(西红柿)中调节免疫应答的能力。在植物的根际中以10⁹cfu/mL的细胞悬浮液施加菌株H32的细菌。在施加细菌后12小时、3天和7天时进行取样。在每个采集时间，随机取每个处理的六个植株的样品，这些植株以两次重复进行分布，以使变化均匀化。一旦采集了样品，就立即保存在液氮中直至以后对其进行处理。通过RT-qPCR方法测定在叶中苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、渗透蛋白、壳多糖酶、氢过氧化物裂合酶(HPL)、环丙烯合酶(AOS)和PR1这些防御基因的相对表达。使用肌动蛋白作为该测定法的内部对照。

图8显示，印度假黄单胞菌可以在与植物相互作用的早期阶段诱导渗透蛋白、HPL、壳多糖酶、GPx和PAL这些基因的表达。另一方面，相对于对照组的植物而言，在向植物施加该细菌后12小时和3天时观察到PR1基因的阻抑，和在七天时观察到相同基因的过表达。在所评价的时间处，AOS基因的表达相对于对照而言未增加。所获得的结果证明，印度假黄单胞菌可以调节植物免疫系统，从而有利于对于病原体攻击的抗性。

实施例11.印度假黄单胞菌制剂的获得和其稳定性的证明

获得由下列组分构成的制剂：印度假黄单胞菌菌株H32的浓缩物(作为活性成分)、酵母提取物(作为富含氨基酸、维生素和生长因子的有机物质的来源)、表面活性物质和水。制剂的最终组成为：70.4％的酵母提取物；1.4％的蔗糖；3.2％的Glanapon DG-158^TM；和20％的微生物印度假黄单胞菌的干生物质。在该组合物中，所述细菌处于10⁹至10¹⁰cfu/mL的浓度。该组合物的残留水分为5.0％。进行3个批次的配制物的实时稳定性研究，对于其测定在储存该制剂的6和12个月时在花盆中的活细胞计数和针对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)这种植物线虫的杀线虫活性。

在表7中显示了对于所示时间的所述制剂的活细胞数目和TE。这反映出，用于植物线虫的生物防治的所述制剂或组合物至少在12个月期间是稳定的。

表7.制剂的稳定性的研究

TE^*：技术效率

实施例12.印度假黄单胞菌对于三种植物线虫物种的杀线虫效应的“体内”评价

在栽培室中进行一个程序以评价在实施例11中所描述的制剂对于南方根结线虫、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和相似穿孔线虫(Radopholus similis)这些物种的“体内”杀线虫效应。用番茄(西红柿)植物来进行用南方根结线虫和花生根结线虫这些物种的测定法，和在香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))植物中进行用相似穿孔线虫的测定法。将番茄和香蕉的小植株移植到具有2kg的由沙:泥炭(1:1)组成的基质的花盆中。在移植前，向所述基质接种3000枚南方根结线虫的卵、3000枚花生根结线虫的卵或500个相似穿孔线虫的样本。在用南方根结线虫和花生根结线虫的测定法中，所使用的计划方案为两次施加：第一次在侵染基质3天时；和第二次施加在移植后14天时进行。在移植35天时，提取植物并且测定侵染程度。对于用相似穿孔线虫侵染的香蕉植物，进行3次施加：在15、49和63天时。在移植80天时，评价线虫数量/100g根。在所述两种作物中，从这些结果开始测定印度假黄单胞菌制剂的TE。如在表8中所显示的，该细菌针对所评价的三个线虫物种是有效的。

表8.印度假黄单胞菌制剂针对几个植物线虫物种的技术效率

植物线虫	TE*(％)
		南方根结线虫	78.45
花生根结线虫	75.89
		相似穿孔线虫	79.65

TE^*：技术效率

Claims

1.生物杀虫剂和生物肥料组合物，其包含印度假黄单胞菌(Pseudoxanthomonasindica)或所述细菌物种的代谢物，以及赋形剂或稀释剂。

2.权利要求1的组合物，其包含活的或灭活的印度假黄单胞菌的悬浮液或浓缩物。

3.权利要求1的组合物，其中所述代谢物通过天然方式、通过重组方式或通过化学合成来获得。

4.权利要求1的组合物，其中所述代谢物为挥发性或可溶性化合物。

5.权利要求1的组合物，其另外还包含稳定化合物、增强剂、杀线虫活性的激发物或种子包衣。

6.权利要求1的组合物，其中印度假黄单胞菌的浓度为1×10⁸至1×10¹⁰cfu/ml。

7.权利要求1的组合物，其中所述生物杀虫剂用于直接地或间接地控制植物病原体和动物线虫。

8.印度假黄单胞菌或所述细菌物种的代谢物用于制备生物杀虫剂或生物肥料组合物的用途。

9.权利要求8的用途，其中印度假黄单胞菌的浓度为1×10⁸至1×10¹⁰cfu/ml。

10.权利要求8的用途，其中所述生物杀虫剂用于直接地或间接地控制植物病原体和动物线虫。

11.权利要求8的用途，其中将所述生物肥料组合物配制为预包装土壤、粉剂、液体、悬浮液、颗粒剂、喷雾剂或包囊产品。

12.用于控制植物病原体和动物线虫的方法，其包括向有此需要的植物或动物施加有效量的印度假黄单胞菌或所述细菌物种的代谢物。

13.权利要求12的方法，其中印度假黄单胞菌作为活的或灭活的所述细菌的悬浮液或浓缩物来进行施加。

14.权利要求12的方法，其中将印度假黄单胞菌配制为预包装土壤、粉剂、液体、悬浮液、颗粒剂、喷雾剂或包囊产品。

15.权利要求12的方法，其中印度假黄单胞菌用于降低在植物中由植物致病性线虫或真菌造成的侵染程度。

16.用于刺激植物生长的方法，其包括向土壤、基质、植物或种子施加有效量的印度假黄单胞菌或所述细菌物种的代谢物。

17.权利要求16的方法，其中将印度假黄单胞菌配制为预包装土壤、粉剂、液体、悬浮液、颗粒剂、喷雾剂或包囊产品。