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CN114409711A - 一种适配体-环金属铱偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种适配体-环金属铱偶联物及其制备方法与应用 Download PDF

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CN114409711A
CN114409711A CN202210099640.7A CN202210099640A CN114409711A CN 114409711 A CN114409711 A CN 114409711A CN 202210099640 A CN202210099640 A CN 202210099640A CN 114409711 A CN114409711 A CN 114409711A
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Abstract

本发明公开了一种适配体‑环金属铱偶联物及其制备方法与应用。一种适配体‑环金属铱偶联物，包括以下结构式中的至少一种：ApIrC1、ApIrC2、ApIrC3、和ApIrC4；其中，结构式中的核酸适配体为AS1411适配体。所述适配体‑环金属铱偶联物，对肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MCF‑7等肿瘤细胞株具有优良的抑制效果，且对正常细胞的毒性较小，同时，能与癌细胞特异性结合，可运用于荧光成像和抗肿瘤药物中。

Description

一种适配体-环金属铱偶联物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于金属铱偶联物技术领域，具体涉及一种适配体-环金属铱偶联物及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是全球第二大死亡原因，在世界范围内产生了沉重的疾病负担。目前针对恶性肿瘤的治疗策略主要为化疗、放疗、手术等，但是这些治疗手段都缺乏对肿瘤细胞的选择性，从而导致不良反应的产生，显著降低患者的治疗效果。使用高细胞毒性的化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时，也会不可避免地会对患者的正常组织造成严重的非特异性损伤并诱导癌细胞产生耐药性。
因此，有必要构建靶向给药系统，提高非靶向药物的疗效和生物利用度并降低对正常细胞的毒副作用。其中，单克隆抗体(mAbs)作为靶向治疗领域增长最快的药物类别之一，已经有9种抗体药物偶联物(ADC)获得美国食品药品监督管理局(FDA)的监管批准。然而，大多数单克隆抗体由于体积太大而无法有效地穿透肿瘤细胞，且生产价格昂贵，与药物结合的过程耗时且繁琐。即使部分单克隆抗体已经在临床上获得了应用，但抗体自身的内在交叉反应性和免疫原性可能会导致脱靶效应和副作用，从而影响疗效。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：
提供一种适配体-环金属铱偶联物。所述适配体-环金属铱偶联物对肿瘤细胞具有靶向作用。
本发明所要解决的第二个技术问题是：
提供一种所述适配体-环金属铱偶联物的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是：
所述适配体-环金属铱偶联物的应用。
为了解决所述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种适配体-环金属铱偶联物，包括以下结构式中的至少一种：
Figure BDA0003491966010000021
其中，
Figure BDA0003491966010000022
为AS1411适配体。
其中，核酸适配体是指通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)在体外筛选获得的单链DNA或RNA序列，可以选择性地结合特定靶点，并具有高度特异性和亲和力。AS1411是一种富含鸟嘌呤的核酸适配体，可形成G-四链体结构并特异性识别癌细胞表面的核仁素蛋白。核仁素是核仁中一种高度保守的非核糖体磷酸化蛋白，参与细胞粘附、迁移、rRNA转录调控等多种重要的细胞过程。相比于人体正常细胞，核仁素在多种癌细胞膜表面高度表达，与恶性肿瘤的快速增殖密切相关。因此，开发有效的核仁素靶向药物和荧光探针对癌症的治疗和诊断具有重要意义。将适配体与药物结合形成适配体-药物偶联物(ApDC)时，作为低分子量分子，ApDC几乎不能诱导抗体产生，因此可以在临床上应用更长的时间。此外，适配体还具有无毒性、靶标范围广、热力学稳定性好、易于合成和修饰等优点。
环金属化铱配合物具有优良的光物理和光化学性质、强大的抗癌活性和有限的副作用。与临床上广泛使用的化疗药物顺铂(cisplatin)及其类似物相比，铱配合物具有较好的配体取代动力学，外周配体易于修饰，具有比典型的铂配合物方形结构更丰富的分子结构，显示出多功能的抗肿瘤活性，其独特的光谱特性，显示出比钌类配合物更长的发光寿命和更高的量子产率，并拥有可调节的发射波长和激发波长。铱配合物与天然活性物质、多肽和药物等的结合已成为增强溶解度、提高选择性和降低毒性的有效策略。
为了解决所述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种制备所述适配体-环金属铱偶联物的方法，包括以下步骤：
S1混合4-甲酰苯甲酸、1，10-菲咯啉-5，6-二酮和铵盐，经反应，得到配体L1；
S2混合配体L1、N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂和部分催化剂，经反应，得到配体L2；
S3混合配体L2、6-氨基己酸和余量催化剂，经反应，得到配体L3；
S4混合含铱化合物、含氟化合物和配体L3，经反应，得到配体lr1；
S5混合配体lr1和含氯化合物，经反应，得到配体lr2；
S6混合配体lr2和适配体，经反应，得到所述适配体-环金属铱偶联物。
根据本发明的一种实施方式，步骤S6中，混合配体lr2、碳酸氢钠和适配体于溶剂中，经室温涡旋反应，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到适配体-环金属铱偶联物。优选地，溶剂选自水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，其中，水和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比为2-3：1-2。
根据本发明的一种实施方式，所述4-甲酰苯甲酸与所述1，10-菲咯啉-5，6-二酮的摩尔比为2-3：2-3，优选为2-3：2。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2反应之后，还包括减压浓缩得到粘稠固体的步骤。
根据本发明的一种实施方式，所述缩合剂包括碳二亚胺类缩合剂、有机磷类缩合剂和鎓盐类缩合剂中的至少一种。
根据本发明的一种实施方式，所述含铱化合物化学式为Ir2(R)4Cl2，其中，R包括7，8-苯并喹啉、2-苯基吡啶、2-(2，4-二氟苯基)吡啶和2-(2-噻吩)吡啶中的至少一种，R优选为2-(2-噻吩)吡啶。
根据本发明的一种实施方式，在冰浴条件下混合配体lr1和含氯化合物，再加热回流。
根据本发明的一种实施方式，所述配体lr2和适配体的摩尔比为100-200：4-6。
根据本发明的一种实施方式，还包括固液分离、干燥和纯化的步骤。
本发明的再一个方面，还提供一种适配体-环金属铱偶联物在制备荧光成像剂或抗肿瘤药物中的应用。
所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
所述适配体-环金属铱偶联物，对肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MCF-7等肿瘤细胞株具有优良的抑制效果，且对正常细胞的毒性较小，可运用于制备荧光成像剂和抗肿瘤药物中。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中L1的核磁共振氢谱图。
图2为实施例1中L2的核磁共振氢谱图。
图3为实施例1中L3的核磁共振氢谱图。
图4为实施例1中Ir1的核磁共振氢谱图。
图5为实施例1中AS1411、ApIrC1和Ir1的光谱测试图。
图6为实施例1中ApIrC1的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度分析图。
图7为实施例1中ApIrC1的聚丙烯酰胺凝胶电泳稳定性分析图。
图8为实施例1中ApIrC1的色谱测试图。
图9为实施例1中ApIrC1的色谱面积百分比报告。
图10为实施例1中ApIrC1和Ir1与不同细胞孵育后的共聚焦显微镜图像。
图11为流式细胞术测定实施例1中ApIrC1和Ir1与不同细胞孵育后的细胞摄取水平。
图12为流式细胞术分析实施例1中ApIrC1和Ir1与不同细胞孵育后的平均荧光强度。
图13为实施例1中ApIrC1和Ir1与不同细胞系孵育6h后的电感耦合等离子体质谱仪检测Ir(III)的含量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
实施例1
一种制备所述适配体-环金属铱偶联物的方法，包括以下步骤：
S1将4-甲酰苯甲酸(0.3g，2mmol)、1，10-菲咯啉-5，6-二酮(0.42g，2mmol)和醋酸铵(0.77g，10mmol)添加到10mL冰醋酸中。在氩气下加热至130℃回流搅拌4h，反应结束后将反应混合物冷却至室温后，用100mL纯水稀释，析出沉淀后在4℃冷却过夜，抽滤收集所得沉淀物并用纯水洗涤。真空干燥粗产物并通过硅胶柱层析纯化，得到配体L1。L1的核磁共振氢谱图如图1所示。
S2将配体L1(0.17g，0.5mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.1438g，1.25mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(400μL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌2h后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.24g，1.25mmol)，继续室温搅拌反应18h，反应完毕后减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L2。L2的核磁共振氢谱图如图2所示。
S3将配体L2(0.1748g，0.4mmol)、6-氨基己酸(0.131g，1mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.9mL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18h后，停止反应并减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L3，L3的核磁共振氢谱图如图3所示，配体L3化学式为:
6-(4-(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzamido)hexanoicacid(PICONH(CH2)5COOH)。
S4在三口烧瓶中将三氯化铱水合物IrCl3·xH2O(0.298g，1mmol)溶解在80mL的2-甲氧基乙醇/水(3:1，v/v)的混合溶液中，并加入过量2-(2-噻吩)吡啶(thpy)(0.483g，3mmol)，混合物在氩气保护下120℃避光回流搅拌24h后，将溶液冷却至室温，抽滤收集所产生的沉淀即得Ir2(thpy)4Cl2；
将Ir2(thpy)4Cl2(0.1096g，0.1mmol)和配体L3(0.0906g，0.2mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2:1，v/v)的混合溶液(30mL)中，在氩气保护下避光回流5h，反应结束后冷却至室温，抽滤，滤液减压浓缩后转移至烧杯，加入六氟磷酸钾(KPF6)饱和水溶液。静置后抽滤收集沉淀，真空干燥后使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，硅胶柱层析纯化得配体lr1，lr1的核磁共振氢谱图如图4所示，配体lr1化学式为：
[Ir(thpy)2(PICONH(CH2)5COOH)]PF6。
S5在冰浴条件下向30mg配体lr1中缓慢滴加5mL SOCl2，滴加完毕后搅拌30min，然后转移至室温下搅拌30min后70℃加热回流反应3h，反应完毕后冷却至室温，减压旋蒸后得到配体lr2，配体lr2的化学式为：
[Ir(thpy)2(PICONH(CH2)5COCl)]PF6。
S6在适配体AS1411(5nmol，125μL)中加入NaHCO3溶液(0.1M，10μL)，60μL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和30μL的配体lr2的DMF母液(200nmol，10mM)，置于涡旋器上室温反应36h，反应完毕后使用透析袋(MW＝3000)透析除去过量配合物，透析液为DMF/水＝2/3(v/v)的混合溶液，总共透析3次，每次15h，直到透析液中检测不到荧光为止。然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC1。
ApIrC1的结构式为：
Figure BDA0003491966010000071
其中，适配体AS1411为：
5’-NH2(CH2)6-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.1)。
实施例1中，配体L3的合成路线为：
Figure BDA0003491966010000072
实施例1中，ApIrC1的合成路线为：
Figure BDA0003491966010000073
实施例2
一种制备所述适配体-环金属铱偶联物的方法，包括以下步骤：
S1将4-甲酰苯甲酸(0.3g，2mmol)、1，10-菲咯啉-5，6-二酮(0.42g，2mmol)和醋酸铵(0.77g，10mmol)添加到10mL冰醋酸中。在氩气下加热至130℃回流搅拌4h，反应结束后将反应混合物冷却至室温后，用100mL纯水稀释，析出沉淀后在4℃冷却过夜，抽滤收集所得沉淀物并用纯水洗涤。真空干燥粗产物并通过硅胶柱层析纯化，得到配体L1。
S2将配体L1(0.17g，0.5mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.1438g，1.25mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(400μL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌2h后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.24g，1.25mmol)，继续室温搅拌反应18h，反应完毕后减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L2。
S3将配体L2(0.1748g，0.4mmol)、6-氨基己酸(0.131g，1mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.9mL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18h后，停止反应并减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L3，配体L3化学式为:
PICONH(CH2)5COOH。
S4在三口烧瓶中将三氯化铱水合物IrCl3·xH2O(0.298g，1mmol)溶解在80mL2-甲氧基乙醇/水(3:1，v/v)的混合溶液中，并加入过量7,8-苯并喹啉(bzq)(0.537g，3mmol)，混合物在氩气保护下120℃避光回流搅拌24h后，将溶液冷却至室温，抽滤收集所产生的沉淀即得Ir2(bzq)4Cl2；
将Ir2(bzq)4Cl2(0.1mmol)和配体L3(0.2mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2:1，v/v)的混合溶液(30mL)中，在氩气保护下避光回流5h，反应结束后冷却至室温，抽滤，滤液减压浓缩后转移至烧杯，加入六氟磷酸钾(KPF6)饱和水溶液。静置后抽滤收集沉淀，真空干燥后使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，硅胶柱层析纯化得配体lr3，配体lr3化学式为：
[Ir(bzq)2(PICONH(CH2)5COOH)]PF6。
S5在冰浴条件下向30mg配体lr3中缓慢滴加5mL SOCl2，滴加完毕后搅拌30min，然后转移至室温下搅拌30min后70℃加热回流反应3h，反应完毕后冷却至室温，减压旋蒸后得到配体lr4，配体lr4的化学式为：
[Ir(bzq)2(PICONH(CH2)5COCl)]PF6。
S6在适配体AS1411(5nmol，125μL)中加入NaHCO3溶液(0.1M，10μL)，60μLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)和30μL的配体lr4的DMF母液(200nmol，10mM)，置于涡旋器上室温反应36h，反应完毕后使用透析袋(MW＝3000)透析除去过量配合物，透析液为DMF/水＝2/3(v/v)的混合溶液，总共透析3次，每次15h，直到透析液中检测不到荧光为止。然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC2。
ApIrC2的结构式为：
Figure BDA0003491966010000091
其中，适配体AS1411为：
5’-NH2(CH2)6-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.1)。
实施例2中，ApIrC2的合成路线为：
Figure BDA0003491966010000092
实施例3
一种制备所述适配体-环金属铱偶联物的方法，包括以下步骤：
S1将4-甲酰苯甲酸(0.3g，2mmol)、1，10-菲咯啉-5，6-二酮(0.42g，2mmol)和醋酸铵(0.77g，10mmol)添加到10mL冰醋酸中。在氩气下加热至130℃回流搅拌4h，反应结束后将反应混合物冷却至室温后，用100mL纯水稀释，析出沉淀后在4℃冷却过夜，抽滤收集所得沉淀物并用纯水洗涤。真空干燥粗产物并通过硅胶柱层析纯化，得到配体L1。
S2将配体L1(0.17g，0.5mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.1438g，1.25mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(400μL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌2h后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.24g，1.25mmol)，继续室温搅拌反应18h，反应完毕后减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L2。
S3将配体L2(0.1748g，0.4mmol)、6-氨基己酸(0.131g，1mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.9mL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18h后，停止反应并减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L3，配体L3化学式为:
PICONH(CH2)5COOH。
S4在三口烧瓶中将三氯化铱水合物IrCl3·xH2O(0.298g，1mmol)溶解在80mL2-甲氧基乙醇/水(3:1，v/v)的混合溶液中，并加入过量2-苯基吡啶(ppy)(0.465g，3mmol)，混合物在氩气保护下120℃避光回流搅拌24h后，将溶液冷却至室温，抽滤收集所产生的沉淀即得Ir2(ppy)4Cl2；
将Ir2(ppy)4Cl2(0.1mmol)和配体L3(0.2mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2:1，v/v)的混合溶液(30mL)中，在氩气保护下避光回流5h，反应结束后冷却至室温，抽滤，滤液减压浓缩后转移至烧杯，加入六氟磷酸钾(KPF6)饱和水溶液。静置后抽滤收集沉淀，真空干燥后使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，硅胶柱层析纯化得配体lr5，配体lr5化学式为：
[Ir(ppy)2(PICONH(CH2)5COOH)]PF6。
S5在冰浴条件下向30mg配体lr5中缓慢滴加5mL SOCl2，滴加完毕后搅拌30min，然后转移至室温下搅拌30min后70℃加热回流反应3h，反应完毕后冷却至室温，减压旋蒸后得到配体lr6，配体lr6的化学式为：
[Ir(ppy)2(PICONH(CH2)5COCl)]PF6。
S6在适配体AS1411(5nmol，125μL)中加入NaHCO3溶液(0.1M，10μL)，60μLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)和30μL的配体lr6的DMF母液(200nmol，10mM)，置于涡旋器上室温反应36h，反应完毕后使用透析袋(MW＝3000)透析除去过量配合物，透析液为DMF/水＝2/3(v/v)的混合溶液，总共透析3次，每次15h，直到透析液中检测不到荧光为止。然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC3。
其中，ApIrC3的结构式为：
Figure BDA0003491966010000111
实施例3中，ApIrC3的合成路线为：
Figure BDA0003491966010000112
实施例4
一种制备所述适配体-环金属铱偶联物的方法，包括以下步骤：
S1将4-甲酰苯甲酸(0.3g，2mmol)、1，10-菲咯啉-5，6-二酮(0.42g，2mmol)和醋酸铵(0.77g，10mmol)添加到10mL冰醋酸中。在氩气下加热至130℃回流搅拌4h，反应结束后将反应混合物冷却至室温后，用100mL纯水稀释，析出沉淀后在4℃冷却过夜，抽滤收集所得沉淀物并用纯水洗涤。真空干燥粗产物并通过硅胶柱层析纯化，得到配体L1。
S2将配体L1(0.17g，0.5mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.1438g，1.25mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(400μL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌2h后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.24g，1.25mmol)，继续室温搅拌反应18h，反应完毕后减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L2。
S3将配体L2(0.1748g，0.4mmol)、6-氨基己酸(0.131g，1mmol)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.9mL)溶解在10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18h后，停止反应并减压浓缩得到粘稠固体。加入纯水并超声，抽滤得到固体产物并真空干燥，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到配体L3，配体L3化学式为:
PICONH(CH2)5COOH。
S4在三口烧瓶中将三氯化铱水合物IrCl3·xH2O(0.298g，1mmol)溶解在80mL2-甲氧基乙醇/水(3:1，v/v)的混合溶液中，并加入过量2-(2,4-二氟苯基)吡啶(dfppy)(0.573g，3mmol)，混合物在氩气保护下120℃避光回流搅拌24h后，将溶液冷却至室温，抽滤收集所产生的沉淀即得Ir2(dfppy)4Cl2。
将Ir2(dfppy)4Cl2(0.1096g，0.1mmol)和配体L3(0.0906g，0.2mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(2:1，v/v)的混合溶液(30mL)中，在氩气保护下避光回流5h，反应结束后冷却至室温，抽滤，滤液减压浓缩后转移至烧杯，加入六氟磷酸钾(KPF6)饱和水溶液。静置后抽滤收集沉淀，真空干燥后使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，硅胶柱层析纯化得配体lr7，配体lr7化学式为：
[Ir(dfppy)2(PICONH(CH2)5COOH)]PF6。
S5在冰浴条件下向30mg配体lr7中缓慢滴加5mL SOCl2，滴加完毕后搅拌30min，然后转移至室温下搅拌30min后70℃加热回流反应3h，反应完毕后冷却至室温，减压旋蒸后得到配体lr8，配体lr8的化学式为：
[Ir(dfppy)2(PICONH(CH2)5COCl)]PF6。
S6在适配体AS1411(5nmol，125μL)中加入NaHCO3溶液(0.1M，10μL)，60μLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)和30μL的配体lr8的DMF母液(200nmol，10mM)，置于涡旋器上室温反应36h，反应完毕后使用透析袋(MW＝3000)透析除去过量配合物，透析液为DMF/水＝2/3(v/v)的混合溶液，总共透析3次，每次15h，直到透析液中检测不到荧光为止。然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC4。
其中，ApIrC4的结构式为：
Figure BDA0003491966010000131
实施例4中，ApIrC4的合成路线为：
Figure BDA0003491966010000132
性能测试：
对实施例1的适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC1，进行光谱表征，在298K下将AS1411、ApIrC1和Ir1溶于乙腈和H2O的混合液(1/1，v/v)中，测得紫外吸收光谱图(图5A)和荧光发射光谱图(图5B)，由图5(A)可以看出，ApIrC1同时拥有配合物和适配体的紫外吸收峰，由图5(B)可以看出，相比于未结合配合物的适配体，ApIrC1表现出与Ir1相当的强荧光。
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对实施例1的适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC1进行纯度分析，结果如图6所示。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，ApIrC1对应的第一泳道中，没有出现杂质条带。此外，还可以看出，合成的ApIrC1比单纯适配体速度慢，这可能归因于分子量的增加。
通过PAGE分析ApIrC1在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中不同时间的稳定性，图像结果(图7)表明孵育36h后仍可观察到ApIrC1的条带，证明偶联物具有良好的血清稳定性。
对实施例1的适配体-环金属铱偶联物，即ApIrC1，进行色谱分析，结果如图8-9所示。其中，图8为色谱测试图，图9为色谱面积百分比报告。ApIrC1通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)纯化后，根据色谱峰面积比，计算出所合成的ApIrC纯度高于97％。
通过噻唑蓝(MTT)比色法分别检测配体实施例1中lr1、适配体和ApIrC1对正常人肝细胞L-02和人胚肾细胞HEK-293T的毒性及其对肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MCF-7等肿瘤细胞株的抑制效果。
分别取对数生长期的细胞(L-02、HEK293T、A549、HeLa、HepG2和MCF-7，市购所得)，用0.25％胰蛋白酶消化，DMEM培养基稀释为4.0×104/mL细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h后，
吸出培养液，加入配方相同的新培养液90μL及不同浓度的Ir1、AS1411和ApIrC1药液。同时设对照组和调零孔，加入相同体积的培养液，每一浓度设3个平行孔。培养48h后，分别每孔加入5％MTT(5mg/mL)20μL，继续孵育4h，然后每孔加入DMSO(二甲基亚砜)150μL。在微型振荡器上避光振荡20min，结晶溶解后，立即比色，用酶标仪测量OD值，比色以空白孔调零。实验重复3次。
根据公式计算细胞增殖率：细胞增殖抑制率(％)＝(1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100％，并计算其半数抑制浓度(IC50)，结果如表1。
表1 ApIrC1对不同肿瘤细胞和正常细胞的IC50值
Figure BDA0003491966010000141
Figure BDA0003491966010000151
由表1的结果可以看出，相比于单独的铱配合物和适配体，配合物与适配体结合后的ApIrC1对4种肿瘤细胞都的抑制活性都明显得到提升，IC50值都达到了纳摩尔级别，其中ApIrC1对HeLa和MCF-7细胞的IC50值分别为0.47±0.3μM和0.49±0.2μM。
此外，ApIrC1对正常细胞L-02和HEK293T的IC50值都远高于肿瘤细胞的IC50值，表明铱配合物与适配体结合后获得了对肿瘤细胞的选择性靶向作用。
进一步研究ApIrC1对肿瘤细胞的选择性靶向作用及成像能力。分别使用共聚焦显微镜、流式细胞分析仪和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析配体lr1和ApIrC1在L-02、HEK-293T、A549、HeLa、HepG2和MCF-7细胞中的总吸收，具体如下：
流式细胞术和共聚焦显微镜分析：
将1mL细胞(1×105/mL)接种于24孔板中，并在实验前孵育24h。移除培养基后，用PBS清洗细胞两次。然后，将细胞与300nM Ir1、AS1411和ApIrC1在37℃下孵育3h，用PBS清洗一次，用200μL胰蛋白酶消化细胞。以1000rpm离心3min收集细胞，并重悬于PBS中，用于流式细胞术分析。对数生长期的细胞与和ApIrC1(300nM，3h)进行共染，移除细胞培养基，用PBS冲洗细胞3次。最后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像，观察细胞对样品的摄取(激发通道：405nm；发射通道：595±20nm)，结果如图10所示，其中图10中(a)为ApIrC1与不同细胞孵育后的共聚焦显微镜图像，图10中(b)为Ir1与不同细胞孵育后的共聚焦显微镜图像。
图10结果表明，与ApIrC1共孵育3h后，核仁素过表达细胞(HeLa、MCF-7、A549和HepG2)表现出对ApIrC1显著的细胞摄取能力，而正常细胞(L-02、HEK293T)中ApIrC的荧光强度可忽略不计。在相同孵育条件下，Ir1处理后的所有细胞都观察到明显的荧光，且荧光强度相差不大。
图11为实施例1中ApIrC1和Ir1在各种细胞中的摄取研究的流式细胞术分析图。图12为实施例1中ApIrC1和Ir1与不同细胞的平均荧光强度测试图。
由图11和图12可以知道，经ApIrC1处理后，4种癌细胞中的荧光强度显著增加，而脱靶细胞(L-02和HEK293T)只检测到微弱的荧光偏移。而不含AS1411的Ir1配合物在正常细胞和癌细胞系中的吸收几乎没有表现出差异性。
这些结果均表明ApIrC1能与癌细胞特异性结合，可用于肿瘤诊断的荧光分子探针。
ApIrC1的细胞总吸收测试：
取对数生长期的L-02、HEK293T、A549、HeLa、HepG2和MCF-7细胞悬液以1×105/孔接种于6孔板中，37℃、5％CO2培养箱中孵育24h后，加入Ir1、AS1411和ApIrC1作用不同时间。
孵育完成后，将细胞收集并裂解，以配好的标准品为对照。
图13结果表明，ApIrC1在肿瘤细胞中的含量明显高于正常细胞中的含量，体现出很好的癌细胞靶向能力。
实施例2-4制备的适配体-环金属铱偶联物与实施例1制备的适配体-环金属铱偶联物有相似的技术效果。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江）
广东医科大学
<120> 一种适配体-环金属铱偶联物及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26

Claims (10)

1.一种适配体-环金属铱偶联物，其特征在于：
包括以下结构式中的至少一种：
Figure FDA0003491966000000011
其中，
Figure FDA0003491966000000012
为AS1411适配体。
2.一种制备如权利要求1所述的一种适配体-环金属铱偶联物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1混合4-甲酰苯甲酸、1，10-菲咯啉-5，6-二酮和铵盐，经反应，得到配体L1；
S2混合配体L1、N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂和部分催化剂，经反应，得到配体L2；
S3混合配体L2、6-氨基己酸和余量催化剂，经反应，得到配体L3；
S4混合含铱化合物、含氟化合物和配体L3，经反应，得到配体lr1；
S5混合配体lr1和含氯化合物，经反应，得到配体lr2；
S6混合配体lr2和适配体，经反应，得到所述适配体-环金属铱偶联物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述4-甲酰苯甲酸与所述1，10-菲咯啉-5，6-二酮的摩尔比为2-3：2-3，优选为2-3：2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S2反应之后，还包括减压浓缩得到粘稠固体的步骤。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述缩合剂包括碳二亚胺类缩合剂、有机磷类缩合剂和鎓盐类缩合剂中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含铱化合物化学式为Ir2(R)4Cl2，其中，R包括7，8-苯并喹啉、2-苯基吡啶、2-(2，4-二氟苯基)吡啶和2-(2-噻吩)吡啶中的至少一种，R优选为2-(2-噻吩)吡啶。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在冰浴条件下混合配体lr1和含氯化合物，再加热回流。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述配体lr2和适配体的摩尔比为100-200：4-6。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：还包括固液分离、干燥和纯化的步骤。
10.如权利要求1所述的一种适配体-环金属铱偶联物在制备荧光成像剂或抗肿瘤药物中的应用。
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