CN114306722B

CN114306722B - 一种可注射水凝胶型生物粘合剂及其制备和应用

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Publication number: CN114306722B
Application number: CN202011052782.5A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN114306722A

Abstract

本发明涉及一种可注射水凝胶型生物粘合剂及其制备和应用。具体地，本发明提供了一种水凝胶材料，所述的水凝胶采用带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子溶于含有强碱弱酸盐的生理盐水溶液所形成的成胶前驱液A和末端修饰活性酯的聚乙二醇溶于生理盐水溶液所形成的成胶前驱液B混合从而形成。通过调节前驱液中的pH值，可以使得注射后水凝胶具有不同的凝胶化时间从几秒到几分钟不等，从而用于快速止血、药物缓释、组织粘合，或向体内深部伤口的微创递送治疗等多个临床领域。

Description

一种可注射水凝胶型生物粘合剂及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种针对基于酰胺化反应的凝胶化时间调控方法，及其所制备的不同的可注射水凝胶应用于不同医学临床领域。

背景技术

水凝胶是一种具有亲水性的三维网络结构的聚合物，类似于人体细胞外基质(ECM)；在水中它能够吸收大量的水而发生溶胀并保持其形态而不被溶解，因此该类材料在临床领域具有广泛的应用。近年来，可注射型水凝胶成为水凝胶领域新一轮的研究热点。可注射性水凝胶是指流体形态的水凝胶原料通过注射器同时注入进入体内后，在原位形成凝胶。“液态注射，原位成固”突破了传统水凝胶物态的限制。基于双组分化学交联的可注射水凝胶因其方便的交付方式、交付后高度的伤口形状适应性等优势，在临床领域具有广泛的应用。就组织粘合剂应用而言，基于酰胺化反应(即氨基和活性酯官能团间反应)的可注射水凝胶因其对生物组织界面具有固有的化学键合能力，从而优于其它化学交联的水凝胶。

凝胶化时间即水凝胶从注射后从溶液态到凝胶态的相转变时间，是可注射水凝胶的重要参数，决定了凝胶的适用场景。以止血为应用目的水凝胶，注射后应迅速发生凝胶化转变，从而尽快制止伤口处的出血。此外，对于某些深层组织伤口的密封应用，例如胃穿孔，肺破裂和肝损伤等，缓慢且受控的凝胶化将是合乎临床需要的，以确保在固化之前以最小侵入性的方式递送水凝胶。但是，相对固定的胶凝化速率使其在使用此类水凝胶进行微创交付时，技术上存在挑战性。

因此，在不改变基于酰胺化反应水凝胶的粘附强度，力学性能等性能前提条件下，开发一种对其凝胶化时间进行精确可控的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种水凝胶注射液组合物，所述组合物包括：

(i)注射A液；所述的注射A液包括成胶前驱液A，所述的成胶前驱液A由带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子溶于含有强碱弱酸盐的生理盐水溶液所形成；

(ii)注射B液；所述的注射B液包括成胶前驱液B，所述的成胶前驱液B由末端修饰活性酯的聚乙二醇溶于生理盐水溶液所形成。

在另一优选例中，所述强碱弱酸盐具有以下一个或多个特征：

(a)所述强碱弱酸盐溶于水后，可以进行部分水解，释放氢氧根离子；

(b)所述的强碱弱酸盐可溶于水，且水溶液的pH＝7.0～10.5；

(c)该盐自身不带有氨基；

(d)该盐纯度需大于99％。

在另一优选例中，所述强碱弱酸盐选自下组：硼砂(四硼酸钠)、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢钠、偏铝酸钠、醋酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、偏铝酸钾、碳酸氢钙，或其组合。

在另一优选案例中，所述的强碱弱酸盐为硼砂(Borax)。

在另一优选例中，所述强碱弱酸盐在所述成胶前驱液A中的含量为1 mg/mL～30mg/mL。

在另一优选例中，所述的末端修饰活性酯的聚乙二醇衍生物是被选自下组的活性酯修饰：碳酸酯、乙酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、戊酸酯，或其组合。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇至少具有两个活性酯类官能团修饰。

在另一优选例中，所述的末端修饰活性酯的聚乙二醇衍生物是末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇。

在另一优选例中，所述的琥珀酰亚胺活性酯选自下组：羧酸琥珀酰亚胺基 (-(CH₂)_m-COO琥珀酰亚胺，其中，m为0-10的整数)、二羧酸单琥珀酰亚胺基 (-(C＝O)-(CH₂)_m-COO琥珀酰亚胺)。

在另一优选例中，所述的末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇选自下组：四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥戊二酸酯，或其组合。

在另一优选例中，所述的带有氨基的反应物质选自下组：功能蛋白(指除具有一般蛋白质的营养作用外，还具有某些特殊的生理功能的一类蛋白质)、氨基多糖、或者末端修饰氨基的聚乙二醇。

在另一优选例中，所述的带有氨基的反应物质为功能蛋白溶液，且所述的功能蛋白具有以下一个或多个特征：

(a)每个分子表面暴露的氨基数量≥2；

(b)所述蛋白在37℃水中的溶解度大于50mg/ml；

(c)所述蛋白在碱性条件(pH 7.0～10.5)下不会发生聚集沉淀。

在另一优选例中，所述功能蛋白选自下组：溶菌酶蛋白、血清白蛋白、卵清白蛋白、血红蛋白，或其组合；优选为溶菌酶蛋白。

在另一优选例中，所述的末端修饰氨基的聚乙二醇具有以下一个或多个特征：

(a)重均分子量为5000～100000；

(b)纯度大于99％；

(c)单种聚乙二醇聚合物(PEG)的分散系数(PDI)为1～1.1；

(d)多臂聚(乙二醇)的臂数≥2。

在另一优选例中，所述末端修饰氨基的聚乙二醇的重均分子量为 10000～20000，更佳为10000。

在另一优选例中，所述末端修饰氨基的聚乙二醇具有如下式所示的结构：

其中，n＝2-300的整数。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇为多臂聚乙二醇。

在另一优选例中，所述的成胶前驱液A为功能蛋白和末端修饰氨基的聚乙二醇混合溶液。

在另一优选例中，所述的成胶前驱液A的粘度为0.1-2Pas；

所述的成胶前驱液B的粘度为0.5-1Pas。

在另一优选例中，带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子的浓度为10～200mg/mL；末端修饰活性酯的聚乙二醇的浓度为10～200mg/mL。

本发明的第二方面，提供了一种水凝胶材料，所述的水凝胶材料是通过以下方法制备的：

(1)提供成胶前驱液A，所述的成胶前驱液A为带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子溶于含有强碱弱酸盐的生理盐水溶液所形成的；

(2)提供成胶前驱液B，所述的成胶前驱液B为末端修饰活性酯的聚乙二醇溶于生理盐水溶液所形成的；

(3)用所述的成胶前驱液A和成胶前驱液B混合，形成所述的水凝胶材料。。

本发明的第三方面，提供了一种制备如本发明第二方面所述的水凝胶材料的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供所述的成胶前驱液A和成胶前驱液B；

(b)将所述的成胶前驱液A和成胶前驱液B进行混合，得到所述的水凝胶材料。

在另一优选例中，所述的混合包括：通过双筒注射器将所述的成胶前驱液 A和成胶前驱液B注射至治疗部位，从而进行混合并形成所述的水凝胶材料。

本发明的第四方面，提供了一种医用材料，所述的医用材料包括如本发明第二方面所述的水凝胶材料。

在另一优选例中，所述的医用材料选自下组：可喷涂组织屏蔽/粘合剂、快速止血材料、可微创交付组织封堵剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Borax调控成胶速率机理探究。(a)成胶反应过程；首先进行去质子化作用提高蛋白中氨基(-NH₂)的亲核性，-NH₂进攻4-arm-PEG-SC末端酯键形成PEG-LZM水凝胶，并释放酸性副产物N-羟基琥珀酰亚胺。(b)由于水电解作用，在阴极附近产生氢氧根(OH-)促进成胶反应进行。(c)Borax加入后水解成等量的硼酸(H₃BO₃)和四羟基合硼酸根离子(B(OH)₄ ^-)，并提供缓冲能力消耗质子(H⁺)。 (d)在成胶前驱液A加入硼酸及盐酸后凝胶化时间比较。(e)用NaOH、Borax将成胶前驱液A调至相同的pH后，比较两种体系的凝胶化时间。

图2显示了Borax促进成胶速率的通用性。(a)无Borax添加条件下，不同蛋白和4-arm-PEG-SC在10min内无成胶现象发生。(b)Borax加入后，蛋白和4-arm- PEG-SC成胶速率大幅提升。

图3显示了前驱液A中Borax浓度与前驱液A的pH值与PEG-LZM/Borax水凝胶凝胶化时间的关系。

图4显示了PEG-LZM/Borax水凝胶的交付方式(工具)。

图5显示了将PEG-LZM/Borax成胶液喷涂后发生极速凝胶化将皮肤、心肌缺损伤口进行快速地封闭。

图6显示了体外模拟微创交付PEG-LZM/Borax水凝胶。

图7显示了水凝胶力学性能和组织粘附性能测试。(a)流变测试。(b)水凝胶对猪皮的粘附性能展示及(c)、(d)粘合强度测试。(e)水凝胶抗血管爆破压力测试装置图及(f)结果。

图8显示了PEG-LZM/Borax水凝胶的细胞亲和性和细胞毒性。(a)C2C12细胞和HaCaT细胞在孔板和PEG-LZM/Borax水凝胶表面铺展形态对比(光学显微镜观察和细胞骨架荧光染色)。(b)根据荧光染色结果计算的各组细胞平均铺展面积。接种于不同样品表面的细胞在1、3、5天后的(c)相对细胞活力和(d)活/死细胞荧光染色。

图9显示了PEG-LZM/Borax水凝胶的体内生物相容性。(a)将PEG- LZM/Borax水凝胶植入大鼠背部皮下1w后照片。(b)水凝胶及周围组织H&E染色。

图10显示了PEG-LZM/Borax水凝胶抗菌活性评价。(a)金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa) 与PEG-LZM、PEG-LZM/Borax水凝胶共培养后细菌涂板照片。(b)与不同样品共培养后菌液浊度测量(OD value,600nm)。(c)使用活/死细菌荧光染色和SEM观测不同样品表面生物膜生成情况。

图11显示了PEG-LZM/Borax极速成胶用于左心室贯穿伤封闭评价。(a)手术过程展示:(1)暴露左心室；(2)用1.2mm(内径)针建立左心室贯穿损伤；(3)喷涂水凝胶；(4)水凝胶将出血口封堵。(b)术前正常心脏和术后2d、3w代表性超声心动图图像。(c)射血分数(EF％)和缩短分数(FS％)的统计值。(d)术后3w伤口处照片。(e)伤口组织学观察(H&E)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次研发出以加入硼砂等强碱弱酸盐可对该基于氨基和琥珀酰亚胺活性酯类官能团之间自发亲核加成反应，即酰胺化反应的凝胶化时间进行有效调控。在反应溶液中加入具有pH调节能力的强碱弱酸盐，对如蛋白等反应物中所带氨基的质子化程度即氨基中N原子亲核性进行调控，从而使得该可注射水凝胶具有不同的凝胶化时间。本发明中对蛋白-聚乙二醇水凝胶的凝胶化时间调节后，拥有快速成胶能力的水凝胶可应用于紧急情况下的快速止血，同时可调的成胶时间可为水凝胶向体内深部伤口的微创递送治疗提供便利。该凝胶化时间调控方法简单，可操作性强，安全高效，适合临床应用。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“强碱弱酸盐”是强碱和弱酸反应生成的盐。因为酸根离子或非金属离子在水解中消耗掉一部分的氢离子，电离出氢氧根离子，绝大部分强碱弱酸盐溶液显碱性。

如本文所用，术语“成胶溶剂”指用于溶解成胶组分(前驱体：PEG衍生物、蛋白等)的溶剂。

如本文所用，术语“成胶前驱液”指将成胶组分(前驱体：PEG衍生物、蛋白等)溶解在特定的溶液后形成均匀的溶液。

如本文所用，术语“成胶液”将两相成胶前驱液A/B均匀混合后形成的可发生成胶化学反应的溶液。

如本文所用，术语“凝胶化时间”是指胶液在规定的温度下由能流动的液态转变成固体凝胶所需的时间。

如本文所用，术语“医用硼砂(Borax)”化学式为Na₂B₄O₇·10H₂O，又名四硼酸钠(十水)，黄月砂，硼砂(药用)，月石砂等，是非常重要的含硼矿物及硼化合物。其作为一味中药成份，具有解毒消炎等活性，同时还具有一定的抗菌活性。

聚乙二醇(PEG)

PEG由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合得到的一类水溶性聚醚,是一种pH呈中性、无毒性的聚合物，呈现线性或者支化的链状结构，其链上的醚键 -O-可与水形成较强的氢键使其具有良好的亲水性，分子链上的乙烯基使其有一定的疏水性，也可溶于多种有机溶剂；PEG具有优异的生物相容性，在体内能溶于组织液之中，不会激发人体免疫系统发生排斥作用且可以被基体迅速排出体外而不产生任何的毒副作用。

多臂化聚乙二醇(n-arm-PEG)

在本文中，“多臂聚乙二醇”和“多臂化聚乙二醇”可以互换使用，均指经过进一步化学改性的PEG，可修饰上各种活性基团以各种交联，组装等性能，从而进行组装水凝胶等多种应用。多臂化聚乙二醇为从一个支化点呈放射形连接出多条等分子量的线型链聚乙二醇链的高分子聚合物。本发明中，优选的一类聚乙二醇是多臂化聚乙二醇，更优选地为四臂化聚乙二醇。

本发明主要涉及的四臂化聚乙二醇可用如下结构表示：

其中，使用的分子量不同，重复单元的值n也不同，例如，当其重均分子量为10000，n约为56。

末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS)

本发明的四臂化聚乙二醇可以在四条链的末端修饰上不同的琥珀酰亚胺活性酯(-NHS)，例如，修饰有羧酸琥珀酰亚胺基(如下所示：-(CH₂)_m-COO 琥珀酰亚胺，其中，m为0-10的整数)、二羧酸单琥珀酰亚胺基(如下所示：(- (C＝O)-(CH₂)_m-COO琥珀酰亚胺，其中，m为0-10的整数)等，形成末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4arm PEG-NHS)，使得其具有与其它带氨基基团物质反应的活性。

所述4-arm-PEG-NHS具有以下一个或多个特征：

(a)重均分子量为5000～40000，较佳地，为10000～20000，更佳为10000；

(b)纯度大于99％；

(c)单种聚乙二醇聚合物(PEG)的分散系数(PDI)为1～1.1；较佳地为1.05。

例如，根据琥珀酰亚胺活性酯的类型不同可分为：

四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(4-arm-PEG-SC)，其化学结构式为:

四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(4-arm-PEG-SCM)，其化学结构式为：

四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(4-arm-PEG-SS)，其化学结构式为:

四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥戊二酸酯(4-arm-PEG-SG)，其化学结构式为:

上述各式中，n为2-300的整数

末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇(4-arm-PEG-NH₂)

本发明的四臂化聚乙二醇还可以在四条链的末端修饰有氨基(例如，- (CH₂)m-NH₂，其中，m为0-10的整数)，形成末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇(4- arm-PEG-NH₂)。

所述4-arm-PEG-NH₂具有以下一个或多个特征：

(b)纯度大于99％；

(c)单种聚乙二醇聚合物(PEG)的分散系数(PDI)为1～1.1；较佳地，为1.05。

例如，其化学结构式具体可以为：

末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇可在制备水凝胶的时候用于代替部分蛋白质，可调节水凝胶的力学性能，如弹性模量；聚合物三维网状结构的孔径大小等。

功能蛋白

功能蛋白是指携带能够完成人体的生理功能的蛋白质，它们主要是完成人体的各种代谢活动。功能蛋白有催化蛋白，运输蛋白，免疫蛋白，调节蛋白等。

本发明的功能蛋白是表面暴露有氨基基团的蛋白质，可选自下组：溶菌酶蛋白(可以是各种来源(例如鸟类、家禽)的溶菌酶蛋白，如鸡溶菌酶蛋白)、血清白蛋白、卵清白蛋白、血红蛋白或其组合。

所述蛋白质中，每个蛋白分子表面暴露的氨基数量≥2。

所述蛋白质在37℃水中的溶解度需大于50mg/ml。

四臂化聚乙二醇1-(C＝O)-N-蛋白质

本发明的“四臂化聚乙二醇1-(C＝O)-N-蛋白质”是由末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS)和表面暴露有氨基基团的蛋白质通过氨酯交换反应得到的产物。

四臂化聚乙二醇1-(C＝O)-N-四臂化聚乙二醇2

本发明的“四臂化聚乙二醇1-(C＝O)-N-四臂化聚乙二醇2”是由末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS)和末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇(4-arm-PEG-NH₂)通过氨酯交换反应得到的产物。

PEG-LZM/Borax水凝胶

水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的具有三维交联网络的聚合物材料。PEG-LZM/Borax水凝胶则是用一定量的硼砂(Borax)溶解到生理盐水中作为成胶溶剂溶解溶菌酶蛋白(LZM)作为成胶前驱液A；生理盐水溶解末端修饰活性酯的四臂聚(乙二醇)衍生物(4arm PEG-NHS)作为成胶前驱液B；将两成胶前驱液混合后制备出的水凝胶记为PEG-LZM/Borax。

原位可注射/可喷涂水凝胶

原位可注射水凝胶是指流体形态的水凝胶原料通过注射器同时注入皮下或肌肉组织之后，在原位形成半固体的凝胶，因此很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位。“液态注射，原位成固”突破了传统水凝胶物态的限制，使其对伤口有更好的适应性和贴合性，同时简便的注射手段大大的减少了外科手术的创伤，加速了伤口的愈合，提高疾病的治愈效率与质量，可用于伤口敷料、组织粘合、药物控释以及组织支架等多个方面。

微创交付

微创，就是在手术治疗过程中只对患者造成微小创伤、术后只留下微小创口的技术，是相对传统手术的科技成果。微创交付则是通过这个微小的创口，插入微创导管，在内窥镜等医用设备的辅助下，并通过微创导管注射成胶液，将水凝胶材料输送病灶部位进行治疗。

组织粘合/组织封闭/物理封堵止血

组织胶(或称为组织粘合剂)具有一定的粘合性能且能与人体组织接触，组织胶在人体组织表面成胶过程中也可能与人体组织反应而增加粘合，由此实现止血、代替缝线粘合伤口、封闭组织、封堵损伤创口、防止术后组织粘连等。

可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶材的凝胶化时间调节方法

本发明提供了一种通过掺入强碱弱酸盐对可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶材的凝胶化时间进行调节的方法，所述方法步骤包括：

(a)首先将定量的强碱弱酸盐溶解到生理盐水中；

(b)将上述强碱弱酸盐溶液溶解功能蛋白或者末端修饰氨基的多臂聚乙二醇(n-arm-PEG-NH₂)作为成胶前驱液A；

(c)将生理盐水溶解末端修饰活性酯的多臂聚(乙二醇)衍生物(n-arm-PEG- NHS)作为成胶前驱液B；

(d)将上述成胶前驱液等量装入双筒注射器中，注射后形成四臂化聚乙二醇1-(C＝O)-N-蛋白质；或四臂化聚乙二醇1-(C＝O)-N-四臂化聚乙二醇2聚合物网络，并形成水凝胶。

所述的强碱弱酸盐可以调节pH值，从而使得所述的水凝胶材料以不同的速率进行固化，在另一优选案例中，成胶前驱液A中掺入的强碱弱酸盐可为硼砂、碳酸钠、磷酸氢钠、偏铝酸钠等，随着掺入量的提升，成胶前驱液A中的pH值能不断上升。

在另一优选案例中，成胶前驱液A中掺入的强碱弱酸盐可为医用硼砂 (Borax)，并根据所需凝胶化时间不同，在成胶前驱液A中的掺入量可为4 mg/mL～23mg/mL。

在另一优选案例中，成胶前驱液B可为末端修饰活性酯基团的多臂聚(乙二醇)溶液，且所含多臂聚(乙二醇)溶液具有以下一个或多个特征：

(a)重均分子量为5000～100000；

(b)纯度大于99％；

(c)单种聚乙二醇聚合物(PEG)的分散系数(PDI)为1～1.1。

(d)多臂聚(乙二醇)的臂数≥2。

在另一优选例中，成胶前驱液B中所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(SCM)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)等；较佳地，为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯。

在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的重均分子量为10000～20000，更佳为10000。

在另一优选例中，成胶准备过程中，成胶前驱液A与B中聚合物溶质浓度可以一样也可不一样，一样更佳。

在另一优选例中，成胶准备过程中，加入成胶前驱液A与B进行混合，两者体积需一致，成胶A液和成胶B液按体积比为1：1分别装填到无菌注射器(单筒) 中，进行注射、成胶，从而形成所述的水凝胶材料。

在另一优选例中，所使用的无菌过滤器的滤网孔径为0.22μm。

在另一优选例中，成胶所需的温度为25℃±15℃；较佳地，为37℃。

在另一优选例中，双筒注射器中所装填的溶液需一次注射完毕，不可反复注射。

在另一优选例中，在使用100mg/mL溶菌酶蛋白溶液及100mg/mL末端修饰碳酸酯四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-SC,Mw:10000)溶液分别作为成胶前驱液A和 B，使用不同含量硼砂调节后，成胶前驱液A中硼砂浓度为4mg/mL～22mg/mL 时，凝胶化时间为3s～600s。

在另一优选例中，通过双筒注射器出口处的雾化喷头或者混合针头可使两相成胶前驱液在双筒注射器出口处汇合并瞬间混合均匀。

在另一优选例中，凝胶化时间为3s以内的水凝胶，可注射后瞬间固化将组织缺漏封堵住。

在另一优选例中，凝胶化时间可调节为和成胶液在微创导管中流动时间相一致，从而注射后成胶液既可以在微创导管中顺利流动，又可以在出口处迅速发生凝胶化进行固化(＜10s)。

在另一优选例中，经过对凝胶化时间调节后，水凝胶的力学等各项物理性能等保持相对稳定。

在另一优选例中，当水凝胶前驱体固含量为150mg/mL时，其对猪皮的粘合力为20kPa，抗血管爆破压力为180mmHg。

在另一优选例中，Borax的引入使得水凝胶的抗菌性能明显增强。

在另一优选例中，使用溶菌酶作为成胶组分，所述水凝胶具有良好的细胞黏附能力，以及优异的生物相容性。

不同凝胶化时间的蛋白/聚乙二醇基水凝胶材料的引用

本发明针对不同的临床应用需要，应用本发明第一方面所述方法，对蛋白 /聚乙二醇基水凝胶材料的凝胶化时间进行调节以适用不同的临床应用。经过特殊凝胶化时间调节后的材料可用于组织屏蔽、止血、组织封堵、组织粘合等。

在另一优选例中，所述凝胶化时间按需可调的医用材料为如下的一个或多个：

(1)作为可喷涂组织屏蔽/粘合剂(凝胶化时间调节后，可通过喷涂后原位快速固化的方式对分离组织进行接合)；

(2)作为快速止血材料(凝胶化时间调节后，可在紧急情况下作为快速物理封堵止血材料及促进组织的局部修复)；

(3)作为可微创交付组织封堵剂(凝胶化时间调节后，可通过微创交付的方式应用于人体内脏器官(肠/胃/心脏/肺等)的局部开放性创伤，用于开放性伤口的封堵及促进局部组合的修复)；

本发明的主要优点在于：

(1)通过简单的调控强碱弱酸盐在成胶前驱液中的加入量，可对基于酰胺化反应水凝胶的凝胶化时间进行精确调控。

(2)通过合理的混合交付设计，Borax的加入不会对水凝胶的力学性能、组织黏附性能、抗爆破压力等产生显著影响。

(3)经过调节后，PEG-LZM/Borax最快可在3s内成胶，可用于紧急情况下的快速止血。

(4)精确调控的凝胶化时间可为体内深部伤口微创交付水凝胶提供便利。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：凝胶化时间机理探究

1.水凝胶制备

在制备水凝胶前，首先通过透析-冻干的方法对LZM进行纯化(3d)，以去除蛋白中的酸性物质。使用生理盐水(0.9％，w/v)溶解Borax配制不同Borax含量生理盐水溶液，用其溶解LZM或其它蛋白(15％，w/v)作为成胶前驱液A，用生理盐水溶解4arm PEG-SC(15％，w/v)作为成胶前驱液B。将成胶前驱液A和B等体积装入双筒混料器注射器)中，在双筒注射器喷嘴处装上注射针或喷雾器后快速注射到不同的模具中，形成PEG-LZM/Borax或者其它PEG-Protein/Borax水凝胶。

2.凝胶化时间测定

本实验使用小瓶倾斜法测定凝胶化时间。在室温条件下(25℃)，根据上所述方法准备成胶前驱液A和成胶前驱液B并装入双筒注射器中，开始计时后立刻将注射器中的液体注入小瓶中并不断摇晃，当观察到瓶内液体无法流动时停止计时，所记时间视为该组的凝胶化时间。

3.pH值测定

本实验使用配有pH电极(尖端直径：100μm)的微电极研究系统监测所有溶液及水凝胶中的pH值。测定前，首先将洗净的pH工作电极及参比电极插入pH 为4.0、7.0、9.2校准液中进行校准，以确定不同pH所对应的电压。校准完成后电脑自动生成标准曲线，再将pH工作电极及参比电极仔细清洗后，同时插入溶液或凝胶中，等电压稳定后对应的pH即为所测pH值。

4.电化学沉积实验

为探究成胶液中的OH-离子对成胶反应所起的作用，首先将添加了适量pH 指示剂的生理盐水(0.9％,w/v)溶解的LZM和4arm PEG-SC(15％，w/v)作为成胶前驱液A和B，将两相溶液均匀混合后作为电解液，并将钛片作为工作电极(阴极)，铂丝作为对电极(阳极)，通过电化学工作站施加恒电流(电流密度16A/m2)，进行电沉积实验。使用相机记录电解液中pH指示剂颜色变化，通电20min后取出工作电极，观察电极表面的成胶情况。

5.硼元素对凝胶化时间影响

在含20mg/mL Borax的生理盐水溶液中加入不同量硼酸(H₃BO₃)或盐酸 (HCl)，将溶液的pH值从初始9.1调至8.8、8.6后溶解LZM作为成胶前驱液A，生理盐水溶解4-arm-PEG-NHS(15％，w/v)作为成胶前驱液B。并根据上述方法测定不同溶剂条件下的凝胶化时间。

6.强碱(NaOH)对凝胶化时间影响

使用含20mg/mL Borax生理盐水溶液溶解LZM(150mg/mL),并测定该溶液的pH值。同时，加入适量NaOH至150mg/mL LZM的水溶液中调至相同的pH 值。用上述两种溶液分别作为成胶前驱液A，与相同成胶前驱液B(150mg/mL 4 arm PEG-NHS生理盐水溶液)进行成胶实验。并根据上述方法测定不同条件下的凝胶化时间。

如图1(a)显示了蛋白质与PEG之间发生酰胺化反应的机理，其中蛋白质(例如LZM)中的-NH₂首先进行去质子化，然后对4-arm-PEG-SC末端基团进行亲核取代，形成稳定的酰胺键为交联点的聚合物网络。由于-NH₂的质子化受到初始缓冲液pH值以及反应过程中产生的酸性副产物(N-羟基琥珀酰亚胺)影响，因此，我们期望碱性成胶环境可以促进-NH₂中N原子的去质子化过程，从而催化酰胺化反应。如图1(b)所示，采用电化学测试来验证这一推测。在施加电势之前，电解质溶液显示黄色(酸性)，未观察到凝胶化，表明酸性环境不利于凝胶化反应。然而，施加电压后，阴极钛板上迅速形成水凝胶。同时，阴极附近的溶液由黄色变为蓝色(碱性)，这证明水电解生成的大量OH^-有助于这种成胶液的快速凝胶化。基于此，可以得出结论，碱性环境可以催化酰胺化凝胶反应。

如图1(c)所示，Borax作为一种典型的强碱弱酸盐，在水溶液中电离成Na⁺和B₄O₇ ^2-，而B₄O₇ ^2-可以进一步水解成等量的硼酸(H₃BO₃)和四羟基合硼酸根离子 (B(OH)₄ ^-)，它们之间建立的弱碱性缓冲环境可消耗成胶液中存在的质子(H⁺)。

为了测量Borax存在的情况下PEG-LZM的凝胶化时间，将Borax添加到LZM 溶液中，最终浓度为20mg/mL的情况下，凝胶化时间仅为3s左右，而不添加 Borax则没有任何固体凝胶产生。为了进一步了解Borax的驱动机理，使用硼酸 (H₃BO₃)或盐酸(HCl)两种酸来降低Borax的缓冲能力，将含Borax的LZM溶液的 pH值从8.9降低至在相同的pH 8.6时。无论加入何种酸性物质(H₃BO₃或HCl)， PEG-LZM水凝胶的凝胶化时间均显著增加，并且在相同pH环境下未观察到明显的凝胶化时间差异。因此证明Borax促进的凝胶化过程可以归因于其对成胶环境的pH调节能力。

接下来，为了进一步验证Borax溶液可以在凝胶化过程中具有一定的缓冲能力可以连续消耗H⁺从而加速成胶反应过程，使用非缓冲性NaOH调节LZM溶液 pH值至8.9，进行相同的凝胶化反应。如图1(e)所示，尽管LZM/Borax和 LZM/NaOH两种成胶前驱液A的pH相同，但LZM/Borax成胶前驱液在暴露于4- arm-PEG-NHS时表现出更快的凝胶化速率。这是因为在反应过程中，Borax具有缓冲能力可以阻止酸性物质所带来的pH值过快的下降从而在凝胶化过程前期维持-NH₂的高亲核性。

实施例2：机理通用性评价

使用生理盐水或含20mg/mL Borax的生理盐水溶解LZM，BSA，OVA等一系列蛋白作为成胶前驱液A(15％，w/v)，并以生理盐水溶解4-arm-PEG-NHS作为成胶前驱液B(15％，w/v)；将成胶前驱液相互混合注射后，观察成胶情况。

如图2所示，将PEG-LZM水凝胶中的LZM替换成牛血清白蛋白(BSA)、人血红蛋白(HGB)、鸡卵清白蛋白(OVA)等，并测定它们与4-arm-PEG-NHS的反应速度。发现在未加入Borax时，所有蛋白和4-arm-PEG-NHS反应活性均较差，在10 min内都未有成胶现象发生。但加入Borax后，所有体系的凝胶化速度明显加快，各种水凝胶可在注射后30s内迅速形成水凝胶。因此，通过加入Borax的方式提供了一种简单的调节基于酰胺化反应速率的通用策略。

实施例3：成胶前驱液A中pH及凝胶化时间测定

参照实施案例1中方法对成胶前驱液A中pH及凝胶化时间测定。

首先固定LZM含量，对不同含量Borax的成胶前驱液A的pH值进行测量，结果如图3(a)所示，Borax浓度为8mg/mL以上时，溶液中pH值随Borax浓度的降低而缓慢下降，说明此时Borax可以提供足够的缓冲容量将成胶前驱液A的pH值维持在较高的碱性水平，从而使得溶液中LZM的亲核性大大增强。而当Borax浓度减少到8mg/mL以下时，溶液中pH值随着Borax浓度的减少而迅速下降。这说明此时成胶前驱液A中产生的H⁺可能已超过该浓度下Borax所能提供的缓冲容量。

接下来，对不同Borax含量水凝胶的凝胶化时间进行测定，如图3(b)所示，改变成胶液A中Borax含量可对水凝胶的成胶速率进行控制，其凝胶化时间从几秒到数分钟不等。且凝胶化时间与之前测量的成胶前驱液A中pH值具有明显的对应关系，该凝胶最快可以在注射后3s成胶。因此，我们猜测成胶前驱液A中 pH值即LZM的初始亲核性对PEG-LZM凝胶化时间起到重要作用。同时，对凝胶化时间与Borax浓度之间的对应关系进行拟合得到公式：

Gelation Time(s)＝3.117+4890.865×0.553^C_borax(mg/mL)

可以发现在Borax浓度在1～20mg/mL范围内时，凝胶化时间的实际测量值与拟合值基本一致。因此凭借该公式，可以对PEG-LZM的凝胶化时间进行精确的控制。

实施例4：PEG-LZM/Borax水凝胶应用性能体外验证

1.喷涂水凝胶快速封堵测试

将新鲜猪皮和猪心洗净后，建立直径为2mm的圆形缺损。使用含20mg/mL Borax的生理盐水溶解LZM作为成胶前驱液A(15％,w/v)，4-arm-PEG-NHS的生理盐水溶液作为成胶前驱液B(15％,w/v)。将成胶前驱液装入双筒混料器中(如图4所示)，在缺口处喷涂水凝胶后立刻检查PEG-LZM/Borax水凝胶成胶情况及对缺损的封堵情况(4mL)。

2.体外模拟水凝胶微创交付测试

为验证可调的凝胶化时间为该水凝胶的微创交付创造可能，将长30cm、内径27G的Myostar微创导管一端接上2mL混料器(双筒注射器)，另外一端置于2mL离心管上端，使用注射泵以2mL/min流速注射生理盐水并开始计时，直到导管另外一端出现液滴计时结束。调节Borax含量使得PEG-LZM凝胶化时间和所计时间相同。最后将调配好的成胶液装入混料器并开动注射泵，观察导管出口处成胶情况及对离心管口的封堵情况。

如图5所示，在成胶前驱液A中含有20mg/mL Borax的条件下，对有缺损的猪皮表面喷涂该成胶液，该成胶液可均匀地喷涂并黏附在猪皮表面，同时快速固化将缺损伤口进行密封。接下来，如图5所示，在心脏内部放置一根导管，并将一端放置在心肌缺损处内部，通过另一端的注射泵，不断向心肌伤口的外表面注水，模拟伤口处血液流动。可以发现由于Borax调节后的水凝胶拥有较快的成胶速率，喷涂后的水凝胶可以即时地将伤口完全封闭。

如图6所示，将医用微创导管一端接入双筒注射器并装于注射泵上，一端置于离心管上方。通过对成胶液在导管中需要的流动时间进行计算后，根据上诉公式添加适量的Borax对凝胶化时间进行调控，使之与成胶液在导管中流动时间相匹配。实验结果表明，经过调控后，注射后成胶液可在微创导管中顺利流动，同时在出口处快速发生原位凝胶化，将离心管口进行封堵而不流淌至离心管底部。因此，我们相信这种水凝胶只需调整Borax的含量即可满足微创治疗对凝胶化时间的定制化要求。

实施例5：Borax添加量对水凝胶的物理性能影响

1.水凝胶流变性能测定

在本实验及接下来的水凝胶黏附强度测定实验中，使用含4、8、12、20 mg/mLBorax的生理盐水溶解LZM作为成胶前驱液A(15％,w/v)，生理盐水溶解 4-arm-PEG-NHS作为成胶前驱液B(15％,w/v)制备具有不同凝胶化时间的PEG- LZM/Borax水凝胶。

将制备的PEG-LZM/Borax水凝胶裁剪成直径为20mm的圆片状样品。在37 ℃条件下，使用旋转流变仪测定水凝胶的粘弹性行为。在测试前，为防止测试过程中水凝胶中水分的挥发，使用二甲基硅油对凝胶样品进行封边处理。测试过程中首先对水凝胶进行振幅扫描以确定其线性粘弹区(LVR)，并认为在LVR 内凝胶的模量与应变振幅无关。设定LVR中间振幅值作为条件参数，在0.1～10 Hz范围内对水凝胶进行频率扫描。所测得储能模量G'代表在该剪切频率下PEG- LZM水凝胶的弹性，损耗模量G”代表其粘性。

2.粘合强度测定

将成胶液混合喷射于两块猪皮(1cm×2.5cm)之间(200μL)。反应完全后(30 min)，通过氰基丙烯酸酯胶金象508将粘合在一起的猪皮分别固定到表面经过粗糙化处理过的玻璃片的一端(5cm×2.5cm)。并使用万能力学拉伸机夹住玻璃片对粘合在一起的猪皮进行拉伸，拉伸速率为5mm/min。拉伸过程中所测得的最大值即对应水凝胶的粘合强度。

3.爆破压力测定

选取新鲜的猪动脉血管，洗净后建立直径为2mm的圆形缺口。使用双筒混料器将成胶液前驱液混合喷射在血管缺口处。待凝胶完全固化后，将血管的一端进行封堵，另外一端接上压力表和注射泵。使用注射泵缓慢注入PBS，直至缺口处水凝胶破裂为止，并记录破裂时内部液体压力。

如图7(a)所示，通过流变分析可知，不同Borax含量的PEG-LZM/Borax水凝胶表现出大致相同的储能模量G'和损耗模量G”。

同时，因在成胶过程中，4-arm-PEG-SC上剩余的活性基团还可以与组织表面-NH₂形成酰胺键，从而使得水凝胶具有良好的组织粘附性。如图7(b)所示，使用具有不同含量Borax的成胶液将两块猪皮粘合在一起，并对粘合在一起的猪皮进行拉伸，以测定水凝胶对皮肤组织的粘合强度。可以看出，具有不同Borax 含量的水凝胶的粘合强度大致相同，约为20～21KPa。

同时，如图7(c)所示，使用猪肺主动脉血管缺损模型对PEG-LZM/Borax水凝胶抗爆破强度进行测试。结果表明，水凝胶中Borax含量的改变不会明显影响水凝胶的抗爆破压力。

上述结果均表明，通过加入不同含量Borax对水凝胶的凝胶化时间进行调节的策略，可以将水凝胶的力学、粘合强度等物理性能保持在一个稳定的范围，从而为该材料后续实际应用提供了保证。

实施例6：PEG-LZM/Borax生物相容性评价

在接下来的生物学性能探究实验中，除非另有说明，否则使用20mg/mL Borax生理盐水溶液溶解LZM作为成胶液A。

1.细胞培养与接种

本实验采用小鼠成肌细胞(C2C12)和人角质细胞(HaCaT)作为细胞模型，评价Borax的加入对水凝胶细胞毒性及细胞亲和性的影响。首先将C2C12细胞和 HaCaT细胞在DMEM细胞培养基溶液中(其中含有10％胎牛血清、100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素)均匀分散。取5mL细胞悬浮液于75cm²细胞培养瓶中，将其置于37℃细胞培养箱(5％CO₂)中进行培育。

2.凝胶表面细胞黏附性研究

根据上述方法，在48孔板的每个孔中制备500μL水凝胶。按照每孔3×10⁴密度将C2C12细胞和HaCaT细胞接种于孔板或PEG-LZM/Borax水凝胶表面。培养 12h后，用倒置显微镜观察细胞形态。

接下来对细胞进行免疫荧光染色观察。首先用2.5％戊二醛溶液固定细胞15 min，接着使用Triton X-100(0.1％，v/v)溶液处理样品10min以增加细胞的通透性。使用PBS冲洗5次后，用5μg/mL的FITC-pHalloidin和5μg/mL的DAPI分别孵育样本20min进行细胞骨架、细胞核染色，并采用CLSM观察细胞黏附状态。对不同样本的10个位置随机拍摄，并使用Image J软件计算各组细胞平均铺展面积。

3.细胞增殖速率研究

本实验使用CCK-8试剂盒测定细胞的增殖情况。首先将C2C12细胞和 HaCaT细胞以每孔3×10⁴密度接种于水凝胶表面。在培养第1、3、5d后去除原有培养基并加入含有10％CCK-8的新鲜培养基孵育2h后，每孔吸取100μL孵育液转移至96孔板中，用酶标仪在450nm处测量吸光度，并计算各时间点细胞增殖速率。

4.细胞活/死荧光染色

种植细胞后，将上述水凝胶样品在培养第1、3、5d取出，用PBS对其表面洗涤3次，按照试剂盒说明书(Thermo Fisher,L3224)用钙调素(Calmodulin，CaM) 和碘化丙啶(propidium iodide，PI)进行活/死细胞荧光染色，并用倒置荧光显微镜进行观察。

5.水凝胶体内相容性评价

将200μL PEG-LZM/Borax成胶液(15％,w/v)注入SD大鼠(200～300g)背部皮下评估水凝胶在体内的纤维化和炎症反应。1w后对所有实验老鼠进行安乐死处理，将样品及周围组织取下，用多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、梯度脱水处理后，进行H&E染色观察。(n＝3)

我们评价了较高含量Borax存在时，即能快速成胶时，对水凝胶生物相容性的影响。如先前介绍，独特的LZM成分可赋予水凝胶优异的细胞亲和力。从图8(a)可知，添加Borax后，凝胶依然具有良好细胞亲和性。同时使用MTT试剂盒和活/死细胞荧光染色对水凝胶表面细胞增殖情况进行评价，可以发现细胞可以正常增殖且几乎无细胞死亡情况发生。同时植入体内2w后，炎症细胞依然较少。因此上诉结果表明硼砂加入后，PEG-LZM具有良好的细胞亲和性及组织相容性。

从观察图8(a)可知，细胞可在该水凝胶表面进行正常铺展，且与培养于正常孔板表面的细胞对比，并未观察到明显形态差异。随后将细胞进行免疫荧光染色，可在黏附于水凝胶表面的细胞中观察到明显的肌动蛋白骨架，以及延伸的丝状伪足和板突(绿色)。使用image J软件对于不同基质表面细胞的铺展面积进行统计。如图8(b)所示，不同组之间细胞铺展面积并无明显差异。上述结果均表明含有Borax的PEG-LZM水凝胶仍具有较高的细胞亲和性。同时使用CCK-8 试剂盒(图8(c))和活/死细胞荧光染色(图8(d))对水凝胶表面细胞增殖情况进行评价，从增殖统计结果可以发现，种植于凝胶表面的细胞虽然在第一天表现出一定的相对毒性,但是，在接下来的3天和5天中仍观察到稳健的细胞增殖。此外，活/死荧光染色中，几乎没有观察到细胞死亡。

并如图9所示，在植入1w后PEG-LZM/Borax水凝胶表面没有发现明显的纤维包裹或完整的胶原蛋白沉积。同时对水凝胶周围组织进行切片、H&E染色观察后可以发现，注入的水凝胶周围未出现大量炎性细胞(多核细胞、巨噬细胞等)，只有少量炎性细胞沿着材料和组织的边界聚集，这可能是由于正常组织对异物的短期敏感反应所致。同时无组织坏死情况。在整个实验观察过程中，水凝胶植入的周围组织未显示明显的发红、溃疡或其它炎症反应。上述结果证明PEG-LZM/Borax水凝胶具有良好的组织相容性。

实施例7：PEG-LZM/Borax体外抗菌性能评价

首先根据上述方法在24孔板中制备2mL含/不含Borax的PEG-LZM水凝胶，再分别在各孔中加入1mL菌液(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)，1×10⁷CFU/mL，100％培养基),将正常培养的细菌作为阴性对照，在37℃细菌培养箱中培养12h后，在OD 600nm处的浊度。使用生理盐水对各组菌液梯度稀释10³倍后涂板。在37 ℃细菌培养箱中培养18h后对各琼脂板中的菌落进行计数。

在高葡萄糖含量培养基(1％)培养条件下，将2mL含1×10⁷CFU/mL MRSA 菌液与2mL含/不含Borax的PEG-LZM水凝胶在37℃条件下共孵育48h。培养结束后，用PBS对水凝胶表面轻柔地冲洗3次。在各水凝胶表面加入800μL活/死细菌荧光染色液(1.67mM SYTO 9和20mM propidium iodide)共孵育20min，用CLSM观察水凝胶表面的荧光表达。同时将水凝胶用2.5％戊二醛溶液固定2h 后，酒精梯度脱水后冻干，用SEM观察不同水凝胶表面生物膜生成情况。

如图10所示，与PEG-LZM水凝胶相比，PEG-LZM/Borax组中菌落数明显减少。同时与PEG-LZM/Borax水凝胶共培养后，各菌液浊度也明显降低(图7(b))。上述结果均证明Borax加入可显著提升水凝胶的抗菌活性。

为了进一步检验Borax加入可以提升水凝胶抗菌能力，进行抗生物膜生成实验。通过对不同水凝胶表面活/死细菌荧光染色和SEM微观形貌观察，如图7(c) 所示，空白PEG-LZM水凝胶由于较弱的抑菌能力，水凝胶表面发出明显的一层绿色荧光，及观察到大量细菌聚集在水凝胶表面，因此表面水凝胶表面已经生成一层生物膜。而Borax加入后水凝胶表面并未观察到生物膜结构，同时并未发现水凝胶表面细菌的黏附。因此当加入适当含量Borax后，除了提升水凝胶的成胶速率，还可极大地提高该水凝胶的抗菌活性，抑制伤口处生物膜形成。

实施例8：PEG-LZM/Borax应用于心室损伤治疗

按照40～50mg/kg剂量，耳缘静脉注射戊巴比妥溶液将实验兔麻醉，并对实验兔进行术前超声心动图测量(ECHOs)，记录每只实验兔的左心功能。接着在完成气管插管、呼吸机辅助呼吸、呼吸麻醉、营养液静脉补给等准备工作后，打开胸腔暴露左心室，使用1.2×38mm医用针在左心室建立跨壁穿刺伤，观察并记录左心室出血情况后，直接喷涂200μLPEG-LZM/Borax成胶液对伤口进行快速封闭处理，随后立刻检查心脏跳动和伤口封闭情况。确保正常后，按照临床常规手术操作关闭兔胸腔。注射1mL抗生素防止术后全身性细菌感染。术后2d、3w用ECHOs监测左心室功能恢复情况。3w后对兔子进行安乐死处理，使用多聚甲醛溶液对伤口处组织固定后进行切片、染色(Masson三色)、组织学观察。

图11(a)展示了实验过程。在伤口处注射PEG-LZM/Borax成胶液后，数秒内即可将出血止住。在随后观察中，该水凝胶紧密粘附于跳动心脏表面，不会出现掉落或破裂现象。值得一提的是，本实验中不需任何辅助手段，直接通过注射凝胶即可将封堵伤口，止住出血。因此在紧急情况下该水凝胶显得更具优势。

通过超声心动图(ECHOs)监测术后心功能恢复情况。如图11(b)所示，术后 2d由于手术创伤影响，代表左心室功能的射血分数(EF％)和缩短分数(FS％)相对于术前有小幅度下降，但是3w后可恢复到术前正常水平。

同时3w后对心脏伤口进行观察，水凝胶仍牢固黏附在心肌伤口表面(图 11(d))。通过对伤口组织切片染色可知(图11(e))，在原来伤口位置生成了新的结缔组织，在水凝胶周围未见明显的炎症反应和创面坏死，证明该水凝胶具有良好的生物相容性，并一定程度上促进伤口愈合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种水凝胶注射液组合物，其特征在于，包括：

(i) 注射A液；所述的注射A液包括成胶前驱液A，所述的成胶前驱液A由带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子溶于含有强碱弱酸盐的生理盐水溶液所形成；且所述的强碱弱酸盐为硼砂；

(ii) 注射B液；所述的注射B液包括成胶前驱液B，所述的成胶前驱液B由末端修饰活性酯的聚乙二醇溶于生理盐水溶液所形成。

2.如权利要求1所述的注射液组合物，其特征在于，所述强碱弱酸盐纯度大于99%。

3.如权利要求1所述的注射液组合物，其特征在于，所述的末端修饰活性酯的聚乙二醇衍生物是被选自下组的活性酯修饰：碳酸酯、乙酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、戊酸酯，或其组合。

4.如权利要求1所述的注射液组合物，其特征在于，所述的带有胺基的反应物质选自下组：功能蛋白、氨基多糖、或者末端修饰氨基的聚乙二醇。

5.如权利要求1所述的注射液组合物，其特征在于，所述的成胶前驱液A的粘度为0.1-2Pa· s。

6.如权利要求1所述的注射液组合物，其特征在于，所述的成胶前驱液B的粘度为0.5-1Pa ·s。

7.如权利要求1所述的注射液组合物，其特征在于，带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子的浓度为10~200mg/mL；末端修饰活性酯的聚乙二醇的浓度为10~200mg/mL。

8.一种水凝胶材料，其特征在于，所述的水凝胶材料是通过以下方法制备的：

(1) 提供成胶前驱液A，所述的成胶前驱液A为带有两个以上胺基官能度的水溶性高分子或大分子溶于含有强碱弱酸盐的生理盐水溶液所形成的；且所述的强碱弱酸盐为硼砂；

(2) 提供成胶前驱液B，所述的成胶前驱液B为末端修饰活性酯的聚乙二醇溶于生理盐水溶液所形成的；

(3)用所述的成胶前驱液A和成胶前驱液B混合，形成所述的水凝胶材料。

9.一种制备如权利要求8所述的水凝胶材料的方法，其特征在于，包括步骤：

（a）提供所述的成胶前驱液A和成胶前驱液B；

（b）将所述的成胶前驱液A和成胶前驱液B进行混合，得到所述的水凝胶材料。

10.一种医用材料，其特征在于，所述的医用材料包括如权利要求8所述的水凝胶材料。