CN114166972A - 一种氟苯尼考的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氟苯尼考的高效液相色谱检测方法。本发明的氟苯尼考的液相色谱检测方法包括以下步骤：精密称取氟苯尼考标准品，加入稀释剂溶解稀释，制备多个不同浓度的标准品溶液，建立所述标准品的浓度与所述标准品的特征吸收峰面积的关系函数；精密称取含有氟苯尼考的待测样品进行高效液相色谱测定，获得特征吸收峰面积，带入所述关系函数中获得待测样品中氟苯尼考的含量；其中，所述高效液相色谱检测采用的流动相为至少含有高氯酸的水溶液与甲醇的混合液。本发明的液相色谱检测方法，经过精密度试验、线性关系以及回收率试验对方法进行了验证，结果表明该方法准确可靠，灵敏度高和准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及氟苯尼考含量检测的技术领域，特别涉及一种氟苯尼考的高效液相色谱检测方法。
背景技术
氟苯尼考(Florfenicol)，又名氟洛芬，是甲砜霉素的单氟衍生物，化学名：[R-(R*,R*)]-二氯-N-[1-(氟甲基)-2-羟基-2-(4-(甲基磺酰基)苯基]乙基乙酰胺。氟苯尼考是氯霉素的第三代产品，属于新型动物专用广谱抗生素。氟苯尼考及制剂于1990年在日本上市，1993年在挪威上市，1995年在法国、英国、奥德利及西班牙等国上市。目前该品种已收载于《中华人民共和国兽药典》2020版，采用反相高效液相色谱法测定氟苯尼考及制剂的含量。其测定方法主要存在以下几个问题：
1、流动相中酸性调节剂为冰醋酸(占比例为1.0％)，含量测定中检测波长为224nm。因为冰醋酸的截止吸收波长210nm，含量测定中所选用的224nm靠近冰醋酸的截止吸收波长210nm，造成基线波动和噪音比较大，方法的灵敏度差。尤其是在制剂稳定性考察过程中，此方法不能有效且灵敏的反映出微量的变化。
2、流动相中酸性调节剂为冰醋酸(占比例为1.0％)，容易挥发。造成流动相在配制和使用过程中使用寿命缩短，给实际检测工作人员重复劳动工作量加大。
因此，急需开发一种简便、高效、精密度和准确度高的氟苯尼考含量检测方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种氟苯尼考的高效液相色谱检测方法。本发明的检测方法，优化流动相的选择以及其他测试条件，有效提高了氟苯尼考含量检测的精密度和准确度，是一种简便、高效、精密度和准确度高的氟苯尼考含量检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明的目的之一是提供一种氟苯尼考的液相色谱检测方法，包括以下步骤：
精密称取氟苯尼考标准品，加入稀释剂溶解稀释，制备多个不同浓度的标准品溶液；
精密吸取所述多个不同浓度的标准品溶液，进行高效液相色谱测定，根据所述多个不同浓度的标准品溶液的浓度和所述多个不同浓度的标准品溶液的特征吸收峰面积，建立所述标准品的浓度与所述标准品的特征吸收峰面积的关系函数；
精密称取含有氟苯尼考的待测样品，加入稀释剂溶解，进行高效液相色谱测定，获得特征吸收峰面积，带入所述关系函数进行计算，获得待测样品中氟苯尼考的含量；
其中，所述高效液相色谱检测采用的流动相为至少含有高氯酸的水溶液与甲醇的混合液；所述稀释剂的组成与所述流动相的组成相同。
优选地，
所述流动相中，甲醇在流动相中的体积百分含量为40％-50％。
优选地，
所述流动相中，高氯酸的水溶液选自高氯酸水溶液、高氯酸-高氯酸钠水溶液、高氯酸-高氯酸钾水溶液。
优选地，
所述高氯酸的水溶液中高氯酸根的浓度为10～50mmol/L；
更优选的，
所述高氯酸-高氯酸钠水溶液中，高氯酸和高氯酸钠的总浓度为10～50mmol/L；所述高氯酸和高氯酸钠的摩尔比为2：3～2：2；
所述高氯酸-高氯酸钾水溶液中，高氯酸和高氯酸钾的总浓度为10～50mmol/L；所述高氯酸和高氯酸钾的摩尔比为2:3～2:2。
优选地，
所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱。
优选地，
所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
优选地，
所述高效液相色谱检测采用的色谱柱的柱温为30℃～40℃。
优选地，
所述高效液相色谱检测的波长选择210nm～240nm。
优选地，
所述关系函数y＝21324x-3925.8，y代表氟苯尼考特征吸收峰面积，x代表氟苯尼考的浓度，单位为mg/ml。
优选地，
所述含有氟苯尼考的待测样品包括氟苯尼考原料或氟苯尼考制剂。
与现有技术相比，本发明主要的优点：
本发明的液相色谱检测方法，采用的流动相为至少含有高氯酸的水溶液与甲醇的混合液，经过精密度试验、线性关系以及回收率试验对方法进行了验证，结果表明该方法准确可靠，灵敏度高和准确性高。
本发明的液相色谱检测方法出峰时间短，节约了流动相和时间，提高了工作效率。
本发明的氟苯尼考的液相色谱检测方法，获得的标准曲线方程y＝f(x)的标准溶液浓度x在25-75μg/ml范围，即本发明能够在较大的检测范围内获得准确可靠的检测结果，检测的浓度范围广，实用价值高。
附图说明
图1为本发明实施例中1氟苯尼考对照品溶液的一个HPLC检测图谱；
图2是氟苯尼考对照品的线性关系图；
其中，图2中横坐标x代表氟苯尼考的浓度(μg/ml)；纵坐标y代表氟苯尼考峰面积(mau*s)；
图3是对比例1测得的氟苯尼考对照品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例与对比例中采用的原料，如果没有特别限定，那么均是现有技术公开的，例如可直接购买获得或者根据现有技术公开的制备方法制得。
实施例1
一种氟苯尼考的液相色谱检测方法
(1)色谱条件
采用沃特世高效液相色谱仪联合紫外检测器，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱，选用岛津Wondasil C18柱(4.6*250mm，5μm)；流动相是10mmol/L高氯酸水溶液-甲醇(高氯酸水溶液和甲醇两者的体积比60:40)；流速1.0ml/min；柱温是35℃，紫外检测器，检测波长：224nm；稀释剂为流动相；进样量20μl。
(2)标准曲线方程的获得
精密称取氟苯尼考标准品25mg，置于50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释定容至刻度做为氟苯尼考标准品溶液，然后将氟苯尼考标准品溶液逐级稀释制成氟苯尼考浓度为0.025、0.04、0.05、0.06、0.075mg/ml的氟苯尼考标准品溶液，将不同浓度的氟苯尼考标准品溶液分别注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱，进样量20μl，分别计算同一保留时间下的峰面积。以标准品溶液浓度x为横坐标，以氟苯尼考峰面积y为纵坐标，做出标准曲线方程(即关系函数)y＝21324x-3925.8，R2＝0.9997，如图2所示，结果表明氟苯尼考在25-75μg/ml范围内，峰面积和浓度成以上线性关系。
(3)待测样品(氟苯尼考注射液)中氟苯尼考的含量：
精密称取氟苯尼考注射液样品作为待测样品，用上述的方法同样稀释，按照适当的稀释比例进行稀释(稀释因子为稀释比例的倒数)，制成0.05mg/ml的氟苯尼考溶液，摇匀后用0.45μm有机滤头过滤。注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱，进样量20μL，计算与步骤(2)同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出待测氟苯尼考注射液样品溶液的浓度，再通过待测样品的取样量和稀释比例计算出氟苯尼考注射液样品中的氟苯尼考含量。氟苯尼考注射液样品中氟苯尼考含量的计算公式如下：
称取本公司(中升挑战生物科技有限公司)生产的氟苯尼考注射液(规格为100ml:10g)0.32514g(商品名:挑战素康；密度为1.2521g/mL)至50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，再精密量取5ml至50ml定容后用0.45μm有机滤头过滤，量取20μL进样，得到氟苯尼考的峰面积为1065595，代入标准曲线方程计算到待测氟苯尼考注射液的浓度为25.2mg/mL，代入氟苯尼考注射液样品中氟苯尼考含量的计算公式得到氟苯尼考注射液的含量为96.61％，具体的检测谱图如图1所示。
(4)精密度考察
对上述步骤(3)中的同一待测样品，连续6次进样，峰面积如表1所示。
表1
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 峰面积 | 1065595 | 1065796 | 1065998 | 1066366 | 1067896 | 1063689 |
6次进样的峰面积相对标准偏差(RSD)为0.13％，结果表明，本发明HPLC法检测氟苯尼考注射液样品含量精密度高，重现性好。
(5)回收率试验
按氟苯尼考制剂处方配制9份不含氟苯尼考的空白制剂，分别向空白制剂中添加处方量80％三份、100％三份、120％三份的氟苯尼考，制成9份回收率样品。精密称取已知含量的氟苯尼考制剂适量，用流动相稀释，制成供试品的浓度分别为上机浓度0.05mg/ml的80％三份、100％三份、120％三份共9份的供试品溶液，摇匀后用0.45μm有机滤头过滤。注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱，进样量20μL，计算与步骤(2)同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出待测氟苯尼考注射液样品溶液的浓度，计算回收率，结果平均回收率为99.84％，RSD为0.08％，表明该方法加样回收率好。
实施例2
(1)色谱条件
采用沃特世1260高效液相色谱仪联合紫外检测器，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱，选用ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)；流动相是A相为10mmol/L高氯酸钠和10mmol/L高氯酸的混合液，B相是甲醇，A：B的体积比＝50：50；流速1.0ml/min；柱温是35℃，紫外检测器，检测波长：224nm，流速为1ml/min，稀释剂为流动相；进样量20μl。
(2)待测样品(氟苯尼考原料)中氟苯尼考的含量：
精密称量待测样品，用本专利中的方法稀释，按照适当的稀释比例进行稀释(稀释因子为稀释比例的倒数)，制成0.05mg/ml的氟苯尼考溶液，摇匀后用0.45μm有机滤头过滤。注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱，进样量20μL，计算与步骤(2)同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出待测氟苯尼考样品溶液的浓度，再通过待测样品的取样量和稀释比例计算出待测样品的氟苯尼考含量。计算方法如下：
称取氟苯尼考0.02542g至50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，再精密量取5ml至50ml定容后用0.45μm有机滤头过滤，量取20μL进样，得到氟苯尼考的峰面积为1125400(mau*s)，代入线性方程计算到待测氟苯尼考注射液的浓度为49.55mg/mL，代入计算公式得到氟苯尼考原料的含量为99.49％。
(4)精密度考察
对上述同一待测样品，连续6次进样，峰面积如表2所示。
表2
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 峰面积 | 1125400 | 1126578 | 1125645 | 1123201 | 1122013 | 1125871 |
6次进样的峰面积相对标准偏差(RSD)为0.16％，结果表明，本发明HPLC法检测氟苯尼考样品含量精密度高，重现性好。
对比例1
与现有授权专利CN109709257A-一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法相比
(1)色谱条件
采用安捷伦1260高效液相色谱仪联合紫外检测器，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱，选用ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)；流动相是A相(为磷酸盐缓冲液中含有质量百分比浓度为5％的十二烷基磺酸钠，12％二水磷酸氢二钠，体积百分比浓度为0.1％的三乙胺和体积百分比浓度为90％磷酸)，B相是乙腈，A：B＝50：50；流速1.0ml/min；柱温是35℃，紫外检测器，检测波长：224nm，流速为1ml/min，稀释剂为流动相；进样量20μl。
称取本公司生产的氟苯尼考注射液(规格为100ml:10g)0.32514g(商品名:挑战素康；密度为1.2521g/mL)至50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，再精密量取5ml至50ml定容后用0.45μm有机滤头过滤，量取20μL进样，连续6次进样，峰面积(mau*s)如表3所示。
表3
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 峰面积 | 1072 | 1065 | 1042 | 1056 | 1050 | 1071 |
6次进样的峰面积相对标准偏差(RSD)为1.10％，本申请专利方法的精密度两次结果均在0.20％以下，结果表明，授权专利中的方法精密度不如本申请专利方法的精密度好。
对比例1中用了离子对试剂十二烷基磺酸钠和本底吸收高的三乙胺等流动相试剂，系统需要长时间平衡且方法的精密度不如本发明的检测方法，本发明节约了流动相和时间，提高了工作效率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
精密称取氟苯尼考标准品，加入稀释剂溶解稀释，制备多个不同浓度的标准品溶液；
精密吸取所述多个不同浓度的标准品溶液，进行高效液相色谱测定，根据所述多个不同浓度的标准品溶液的浓度和所述多个不同浓度的标准品溶液的特征吸收峰面积，建立所述标准品的浓度与所述标准品的特征吸收峰面积的关系函数；
精密称取含有氟苯尼考的待测样品，加入稀释剂溶解，进行高效液相色谱测定，获得特征吸收峰面积，带入所述关系函数进行计算，获得待测样品中氟苯尼考的含量；
其中，所述高效液相色谱检测采用的流动相为至少含有高氯酸的水溶液与甲醇的混合液；所述稀释剂的组成与所述流动相的组成相同。
2.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述流动相中，甲醇在流动相中的体积百分含量为40％-50％。
3.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述流动相中，高氯酸的水溶液选自高氯酸水溶液、高氯酸-高氯酸钠水溶液、高氯酸-高氯酸钾水溶液。
4.根据权利要求3所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述高氯酸的水溶液中高氯酸根的浓度为10～50mmol/L；
优选的，
所述高氯酸-高氯酸钠水溶液中，高氯酸和高氯酸钠的总浓度为10～50mmol/L；所述高氯酸和高氯酸钠的摩尔比为2：3～2：2；
所述高氯酸-高氯酸钾水溶液中，高氯酸和高氯酸钾的总浓度为10～50mmol/L；所述高氯酸和高氯酸钾的摩尔比为2:3～2:2。
5.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱。
6.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
7.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述高效液相色谱检测采用的色谱柱的柱温为30℃～40℃。
8.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述高效液相色谱检测的波长选择210nm～240nm。
9.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述关系函数y＝21324x-3925.8，y代表氟苯尼考特征吸收峰面积，x代表氟苯尼考的浓度，单位为mg/ml。
10.根据权利要求1所述的氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，其特征在于，
所述含有氟苯尼考的待测样品包括氟苯尼考原料或氟苯尼考制剂。
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| CN111220731A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-02 | 吉林大学 | 一种水质中氟苯尼考的检测方法 |
| CN112180015A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-05 | 明一国际营养品集团有限公司 | 一种检测牛奶中抗生素的方法 |
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