CN114126667A

CN114126667A - 使用糖苷水解酶的基因疗法载体向视网膜细胞的改进递送

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Publication number: CN114126667A
Application number: CN202080051735.0A
Authority: CN
Inventors: K·C·迈尔; S·利基特
Original assignee: Nationwide Childrens Hospital Inc
Current assignee: Nationwide Childrens Hospital Inc
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2022-03-01
Also published as: KR20220009427A; WO2020236351A1; US20220233655A1; AU2020278960A1; JP2022533645A; EP3969059A1; WO2020236352A1; JP7707081B2; AR118696A1; CA3141020A1; TW202110486A; EP3969060A1; CA3141017A1; AU2020278499A1; US20220226507A1; JP2022533983A

Abstract

本公开涉及使用优化的基因疗法载体与糖苷水解酶例如神经氨酸酶联合靶向视网膜内特定细胞类型的方法。特别地，本公开提供了与糖苷水解酶一起施用以特异性靶向视网膜细胞的基因疗法载体以及治疗视力损伤、视网膜变性和视力相关疾病的方法。

Description

使用糖苷水解酶的基因疗法载体向视网膜细胞的改进递送

本申请要求2019年5月17日提交的美国临时申请62/849,794的优先权，该临时专利申请通过引用整体并入本文。

通过引用并入电子递交的材料

作为本公开的一部分的序列表与说明书作为文本文件同时提交。含有序列表的文本文件的名称为“55603_Seqlisting.txt”，所述文件于2020年4月13日创建，并且大小为15,459字节。序列表的主题通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开涉及使用优化的基因疗法载体与糖苷水解酶组合靶向视网膜内特定细胞类型的方法。特别地，本公开内容提供了特异性靶向视网膜细胞的基因疗法载体以及治疗视力损伤、视网膜变性和视力相关疾病的方法。

背景技术

由于眼睛的明确解剖结构，基因疗法载体的眼部施用具有许多优点。特别地，眼睛易于接近使得能够进行快速和渐进的检查；相对封闭的结构和小尺寸的眼睛需要较低剂量的载体进行递送；血-视网膜屏障防止载体泄漏到全身循环中，维持相对免疫免除的环境；并且已经鉴定出主要或部分涉及特定眼部疾病的单个或多个基因。

基因疗法载体的眼部施用已显示出一些有希望的结果。目前，已有许多针对视力丧失相关疾病的临床基因疗法试验，这些试验主要针对遗传性视网膜疾病。例如，临床试验研究了莱伯先天性黑蒙(LCA)、莱伯遗传性视神经病变和视网膜色素变性。迄今为止，AAV载体，尤其是AAV2血清型，已成为眼部基因疗法中最常用的载体。参见Lee等人，Progress inretinal and eye research 68:31-53,2019。

神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)是一组严重的神经退行性疾病，其被统称为巴藤病(Batten disease)。这些疾病影响神经系统并且通常导致例如运动、视力和思考能力的恶化问题。不同的NCL以其遗传原因为特征。患有儿童期巴藤病的患者通常会出现部分或完全视力丧失。特别是，在患有巴藤病的人中，脂褐素会积聚在细胞内，包括大脑和视网膜的细胞。脂褐素的积聚会损害视网膜、视神经和处理视力的大脑区域中的光感受器。

目前，需要靶向视网膜中特定细胞类型的改进的基因治疗方法。而且，没有可以逆转巴藤病症状的疗法。因此，本领域仍然有治疗巴藤病的需求。

发明内容

本公开提供了包含优化的基因疗法载体和糖苷水解酶的组合物，该载体靶向特定细胞类型，例如视网膜中的特定细胞。这些优化的基因疗法载体可用于结合糖苷水解酶的施用，使用玻璃体内递送将转基因递送至特定的视网膜细胞。糖苷水解酶的施用增强了基因疗法在视网膜内的渗透。本公开提供治疗视力相关病症的方法，包括结合糖苷水解酶的施用，使用玻璃体内递送施用优化的基因疗法载体。靶向视网膜中特定细胞类型的基因治疗方法在治疗视力丧失相关疾病方面具有优势。

本公开提供包含基因疗法载体和糖苷水解酶的组合物。例如，糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。在一些实施方案中，基因疗法载体是AAV8、AA9或Anc80。

在示例性实施方案中，本公开提供了配制用于局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑室内或鞘内递送的组合物。例如，本公开提供了其中将基因疗法载体和糖苷水解酶混合用于同时施用的组合物。

此外，本公开提供用于将转基因递送至受试者的细胞的试剂盒，其包含基因疗法载体和糖苷水解酶。例如，细胞是视网膜细胞。在示例性实施方案中，糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。此外，基因疗法为AAV8、AA9或Anc80。任选地，该试剂盒包含用于将基因疗法载体和糖苷水解酶递送给受试者的说明书。

本公开提供将转基因递送至受试者中的细胞的方法，包括向受试者施用i)编码转基因的基因疗法载体和ii)糖苷水解酶。例如，细胞是视网膜细胞。在一些实施方案中，糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶，和/或基因疗法载体是AAV8、AAV9或Anc80。本公开提供了方法，其中使用局部静脉内(IV)递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑室内递送、实质内递送或鞘内(脑脊液)递送将基因疗法载体和/或糖苷水解酶施用于受试者。例如，所公开的方法导致将转基因递送至所有视网膜细胞，包括但不限于双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、穆勒神经胶质细胞、小神经胶质细胞、水平细胞和/或无长突细胞。本文举例说明了向视网膜细胞的递送，然而所公开的方法、组合物和用途可以靶向其中糖苷水解酶清除细胞膜上的受体的任何细胞类型。其他细胞类型包括肌肉细胞、神经细胞如星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞和斯旺细胞。

本公开还提供了用于将转基因递送至受试者中的细胞的组合物，其中所述组合物包含i)编码转基因的基因疗法载体和ii)糖苷水解酶。例如，细胞是视网膜细胞。在另外的实施方案中，本公开提供用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的组合物，其中该组合物包含编码该转基因的基因疗法载体，其中该组合物与包含糖苷水解酶的第二组合物一起施用。例如，该组合物被配制用于使用局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑池内注射、脑室内递送、肌肉内递送或鞘内注射来施用基因疗法载体。

本公开还提供了组合物在制备用于将转基因递送至受试者中的细胞的药物中的用途，其中所述组合物包含i)编码转基因的基因疗法载体和ii)糖苷水解酶。例如，细胞是视网膜细胞。在一些实施方案中，本公开提供了编码转基因的基因疗法载体在制备用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的药物中的用途，其中所述药物与包含糖苷水解酶的组合物一起施用。在其他实施方案中，本公开提供糖苷水解酶在制备用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的药物中的用途，其中所述药物与包含编码转基因的基因疗法载体的组合物一起施用。例如，药物被配制用于使用局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送或鞘内递送来施用基因疗法载体。

本公开还提供了治疗受试者的视力损伤、视网膜变性或视力相关病症的方法，包括向受试者施用i)编码转基因的基因疗法载体和ii)糖苷水解酶。在一些实施方案中，糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶，和/或基因疗法载体是AAV8、AAV9或Anc80。本公开提供了其中使用局部静脉内(IV)递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑室内递送、实质内递送、肌肉内递送或鞘内递送来施用基因疗法载体和/或糖苷水解酶的方法。

本公开还提供了用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的组合物，其中所述组合物包含i)编码转基因的基因疗法载体和ii)糖苷水解酶。在一些实施方案中，本公开提供用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的组合物，其中所述组合物包含糖苷水解酶，其中所述组合物与包含转基因的编码基因疗法载体的第二组合物一起施用。例如，组合物被配制用于使用局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑室内递送、肌肉内递送或鞘内递送来施用基因疗法载体。

在另外的实施方案中，本公开提供组合物在制备用于治疗受试者的视觉损伤或视觉相关病症的药物中的用途，其中所述组合物包含编码转基因的基因疗法载体。本公开还提供了编码转基因的基因疗法载体在制备用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的药物中的用途，其中所述药物与包含糖苷水解酶的组合物一起施用。此外，本公开提供了糖苷水解酶在制备用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的药物中的用途，其中所述药物与包含编码转基因的基因疗法载体的组合物一起施用。例如，药物被配制用于使用局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑室内递送、肌肉内递送或鞘内递送来施用基因疗法载体。

例如，视力相关病症是巴藤病、先天性白内障、先天性青光眼、视网膜变性、视神经萎缩、眼部畸形、斜视、眼球错位、青光眼、湿性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、无脉络膜血症、莱伯先天性黑蒙、莱伯遗传性视神经病变、早发性视网膜营养不良、色盲、性连锁视网膜劈裂症、Usher综合征1B、新生血管性年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑变性、糖尿病性黄斑变性或糖尿病性黄斑水肿。在一个具体实施方案中，视力相关病症是CLN巴藤病，例如CLN1病、CLN2病、CLN3病、CLN4病、CLN5病、CLN6病或CLN8病。

在任何公开的方法、用途或组合物中，转基因是编码感兴趣的多肽的多核苷酸序列或者是抑制、干扰或沉默感兴趣的基因例如siRNA或miRNA的表达的核酸。示例性转基因是编码RPE65、RPGR、ORF15、CNGA3、CMH、ND4、PDE6B、ChR2、MERTK、hRS1、hMYOJA、hABCA4、CD59、抗hVEGF抗体、内皮抑素-血管抑制素、sFLT01或sFLT-1的多核苷酸。另外的示例性转基因包括针对RTP801的siRNA、针对VEGFR-1的siRNA、针对VEGF的siRNA或针对ADRB2的siRNA。在一个实施方案中，转基因编码CLN多肽，例如CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6或CLN8。

在本文公开的任何公开方法、组合物或用途中，基因疗法载体和糖苷水解酶同时或依次施用。此外，在任何公开的方法、组合物或用途中，基因疗法载体和糖苷水解酶使用相同的递送模式施用或各自施用，或各自使用不同的递送模式施用。在任何公开的方法、用途或组合物中，基因疗法载体和糖苷水解酶作为单次施用进行施用，例如将基因疗法载体和糖苷水解酶混合。或者，基因疗法载体和糖苷水解酶分开施用。在一些实施方案中，在施用基因疗法载体前至少约30分钟施用糖苷水解酶。

在任何公开的方法、用途或组合物中，基因疗法载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13、AAVTT或Anc80、AAV7m8和它们的衍生物。

在任何公开的方法、用途或组合物中，基因疗法载体包含CMV启动子——p546或CB启动子。

此外，在任何公开的方法、用途或组合物中，使用鞘内递送施用基因疗法载体和/或糖苷水解酶，并且该方法进一步包括在施用基因疗法载体后将受试者置于Trendelenburg卧位。

在所提供的任何方法、用途和组合物中，所述组合物可以包括非离子低渗透造影剂。例如，所述组合物可以包括非离子低渗透造影剂，其中所述非离子低渗透造影剂选自由以下组成的组：碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰和其组合。

附图说明

图1提供了在本公开中测试的载体的示意图。

图2展示了玻璃体内递送后GFP转基因的视网膜递送，并展示了该施用与神经氨酸酶增强的转基因渗透结合。

图3提供了详细说明在8周野生型小鼠中使用和不使用神经氨酸酶的玻璃体内注射时序的示意图。

图4A-4C表明神经氨酸酶的加入显著增加了双极细胞的病毒转导。对组织进行GFP和Otx的染色，Otx是一种双极细胞特异性标记物。

具体实施方式

针对眼睛治疗视力相关疾病的AAV基因疗法的优化需要特异性靶向不同细胞类型。本公开提供了比较不同基因疗法载体、启动子和施用途径的实验数据，以确定用于将转基因靶向递送至小鼠和非人类灵长类动物的视网膜中的特定细胞类型的最佳基因疗法载体。

数据集中于AAV9和Anc80载体的施用，但本公开考虑使用包含特异性靶向视网膜细胞的启动子的任何基因疗法载体，并且这些优化的载体使用局部静脉内(IV)递送、视网膜下递送、玻璃体内递送、脑室内递送、肌肉内递送、实质内递送或鞘内递送进行施用。例如，数据表明，通过脑室内注射直接注射到脑脊液中的AAV9有效靶向视网膜双极细胞中的转基因表达。因此，鞘内注射可用于将基因疗法载体递送至眼睛，并且特别是用于将基因疗法载体递送至双极细胞。

基因疗法载体

腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度约为4.7kb，包含两个145个核苷酸的末端反向重复(ITR)并且可用于指病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式，除非另有说明。存在多种血清型AAV。AAV的血清型各自与特定进化枝相关，其成员具有血清学和功能相似性。因此，进化枝也可以指AAV。例如，AAV9序列称为“进化枝F”序列(Gao等人，《病毒学期刊(J.Virol.)》，78:6381-6388(2004)。本公开考虑在特定进化枝内使用任何序列，例如进化枝F。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人，《病毒学期刊》，45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人，《病毒学期刊》，78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》，13(1):67-76(2006)中提供；AAV-11基因组在《病毒学(Virology)》，330(2):375-383(2004)中提供；AAV-12基因组的部分在Genbank登录号DQ813647中提供；AAV-13基因组的部分在Genbank登录号EU285562中提供。参见美国专利9,434,928中提供了AAVrh.74基因组的序列，其通过引用并入本文。AAV-B1基因组的序列在Choudhury等人，《分子疗法》，24(7):1247-1257(2016)中提供。Anc80是AAV1、AAV2、AAV8和AAV9的AAV载体。Anc80的序列在Zinn等人，Cell Reports 12：1056-1068，2015；Vandenberghe等人，PCT/US2014/060163(两者均通过引用整体并入本文)以及GenBank登录号KT235804–KT235812中提供。

指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)偶联的两个rep启动子(p5和p19)导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶特性，所述酶特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性剪接及非共有转译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka，《当前微生物学和免疫学的话题(Current Topics inMicrobiology and Immunology)》,158:97-129(1992)中评论。

AAV具有独特的特征，这使其作为例如在基因治疗中将外源DNA递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。而且，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。而且，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用如含有启动子、感兴趣的DNA和多腺苷酸化信号的基因盒等外源DNA替代。在一些情况下，rep和cap蛋白以反式提供。AAV的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。

如本文所使用的术语“AAV”是指野生型AAV病毒或病毒颗粒。术语“AAV”、“AAV病毒”和“AAV病毒颗粒”在本文中可互换使用。术语“rAAV”是指重组AAV病毒或重组感染性包封的病毒颗粒。术语“rAAV”、“rAAV病毒”和“rAAV病毒颗粒”在本文中可互换使用。

术语“rAAV基因组”是指衍生自已经修饰的天然AAV基因组的多核苷酸序列。在一些实施方案中，已经修饰rAAV基因组以去除天然cap和rep基因。在一些实施方案中，rAAV基因组包括内源性5’和3’末端反向重复(ITR)。在一些实施方案中，rAAV基因组包括来自AAV血清型的ITR，所述AAV血清型不同于衍生AAV基因组的AAV血清型。在一些实施方案中，rAAV基因组包括感兴趣的转基因，其通过末端反向重复(ITR)侧接在5’和3’末端。在一些实施方案中，所述rAAV基因组包括“基因盒(gene cassette)”。

术语“scAAV”是指包括自身互补型基因组的rAAV病毒或rAAV病毒颗粒。术语“ssAAV”是指包括单链基因组的rAAV病毒或rAAV病毒颗粒。

在一些实施方案中，本文提供的rAAV基因组包括侧接转基因多核苷酸序列的一个或多个AAV ITR。转基因多核苷酸序列与转录控制元件(包含但不限于启动子、增强子和/或多腺苷酸化信号序列)可操作地连接，所述转录控制元件在靶细胞中起作用以形成基因盒。启动子的实例是CMV启动子、鸡β肌动蛋白启动子(CB)和P546启动子。本文考虑了其它启动子，包含但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。

本文另外提供的是CMV启动子序列、CB启动子序列、P546启动子序列，和与CMV、CB或P546序列的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的启动子序列，其具有转录促进活性。

转录控制元件的其它实例是组织特异性控制元件，例如，允许在神经元内特异性表达或在星形胶质细胞内特异性表达的启动子。实例包含神经元特异性烯醇酶和胶质原纤维酸性蛋白启动子。还考虑了诱导型启动子。诱导型启动子的非限制性实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。基因盒还可以包含内含子序列，以便在哺乳动物细胞中表达时促进转基因RNA转录物的加工。这种内含子的一个实例是SV40内含子。

“包装”是指一系列细胞内事件，其导致AAV颗粒的组装和衣壳化。术语“生产”是指通过包装细胞生产rAAV(感染性的、包封的rAAV颗粒)的过程。

AAV“rep”和“cap”基因分别是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。

AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于AAV的各种这样的辅助病毒是本领域已知的，包含腺病毒、疱疹病毒和如牛痘病毒等痘病毒。腺病毒可以涵盖许多不同的亚组，尽管最常用的是亚组C的5型腺病毒。许多人类、非人类哺乳动物和禽类的腺病毒是已知的并且可从如ATCC等存放处获得。疱疹病毒家族的病毒包含例如单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；这些也可以从如ATCC等存放处获得。

“(一种或多种)辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的(一种或多种)功能，其允许AAV复制和包装(结合本文所描述的复制和包装的其它要求)。如本文所描述的，“辅助病毒功能”可以以多种方式提供，包含通过提供辅助病毒或向反式生产细胞提供例如编码一种或多种必需功能的多核苷酸序列。

本文提供的rAAV基因组缺乏AAV rep和cap DNA。本文考虑的rAAV基因组(例如，ITR)中的AAV DNA可以来自适于衍生重组病毒的任何AAV血清型，包含但不限于AAV血清型Anc80、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74和AAV-B1。如上文所述，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。还考虑具有衣壳突变的rAAV。参见例如，Marsic等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》，22(11):1900-1909(2014)。本文还考虑了修饰的衣壳，并且包含具有各种转译后修饰的衣壳，如糖基化和脱酰胺。天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的脱酰胺作用导致天冬酰胺残基转化为天冬氨酸或异天冬氨酸残基，并且本文提供的rAAV衣壳中考虑了谷氨酰胺向谷氨酸或异谷氨酸的转化。参见例如，Giles等人，《分子疗法》，26(12):2848-2862(2018)。本文还考虑了修饰的衣壳包括将rAAV导向受影响的组织和需要治疗的器官的靶向序列。

本文提供的DNA质粒包括本文所描述的rAAV基因组。可以将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如，腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配到具有AAV9衣壳蛋白的感染性病毒颗粒中。产生rAAV的技术是本领域的标准，其中将待包装的rAAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV颗粒的产生需要以下组分存在于单个细胞(在本文中表示为包装细胞)内：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即，不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何可以衍生重组病毒的AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型。假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中公开，其通过引用整体并入本文。在各种实施方案中，可以修饰AAV衣壳蛋白以增强重组rAAV的递送。对衣壳蛋白的修饰通常是本领域已知的。参见例如US 2005/0053922和US 2009/0202490，其公开内容通过引用整体并入本文。

生成包装细胞的方法是创建稳定表达rAAV产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAVrep和cap基因、以及如新霉素抗性基因等可选择的标志物可以整合到细胞的基因组中。可以通过如GC拖尾等程序将rAAV基因组引入细菌质粒中(Samulski等人,1982，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.S6.USA)》,79:2077-2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(Laughlin等人,1983,《基因(Gene)》,23:65-73)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter,1984,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,259:4661-4666)。然后可以用如腺病毒等辅助病毒感染包装细胞系。此方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。合适方法的其它非限制性实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞。

rAAV颗粒产生的一般原理在例如Carter，1992，《生物技术当前述评(CurrentOpinions in Biotechnology)》，1533-539；和Muzyczka，1992，《微生物学和免疫学的当前课题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》，158:97-129)中评论。各种方法描述于Ratschin等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》,81:6466(1984)；Tratschin等人,《分子与细胞生物学》5:3251(1985)；McLaughlin等人,《病毒学期刊(J.Virol.)》,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,1988《分子与细胞生物学》,7:349(1988)。Samulski等人,(1989,《病毒学期刊》,63：3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和对应美国专利第5,658.776号；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)《疫苗(Vaccine)》13：1244-1250；Paul等人(1993)《人类基因疗法(Human GeneTherapy)》4：609-615；Clark等人(1996)《基因疗法(Gene Therapy)》3:1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利6,258,595中。前述文献在此通过引用整体并入本文，特别强调与rAAV颗粒产生有关的文献的那些部分。

本文进一步提供了产生感染性rAAV颗粒的包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施方案中，包装细胞可以是未转化的癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人类胚肾细胞)、MRC-5细胞(人类胚胎成纤维细胞)、WI-38细胞(人类胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。

本文还提供了包括本公开的rAAV基因组的rAAV(例如，感染性衣壳化的rAAV颗粒)。rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA，即在rAAV的基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。rAAV基因组可以是自身互补型(sc)基因组。具有sc基因组的rAAV在本文中称为scAAV。rAAV基因组可以是单链(ss)基因组。具有单链基因组的rAAV在本文中称为ssAAV。

rAAV可以通过本领域标准方法纯化，如通过柱色谱法或氯化铯梯度。从辅助病毒中纯化rAAV的方法是本领域已知的，并且可以包含在例如Clark等人，《人类基因疗法》，10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark，《分子医学方法(Methods Mol.Med.)》，69:427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657。

还提供了包括rAAV的组合物。组合物包括编码CLN6多肽的rAAV。组合物可以包含编码不同感兴趣的多肽的两种或更多种rAAV。在一些实施方案中，rAAV是scAAV或ssAAV。

本文提供的组合物包括rAAV和药学上可接受的一种或多种赋形剂。可接受的赋形剂对受体无毒，并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包含但不限于缓冲液，如磷酸盐[例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)]、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、共聚物如泊洛沙姆188，普郎尼克(如普郎尼克F68)或聚乙二醇(PEG)。本文提供的组合物可以包括药学上可接受的含水赋形剂，其含有非离子低渗透化合物，如碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰，其中含有非离子的低渗透化合物的水性赋形剂可以具有下列特性中的一种或多种：约180mgI/mL，蒸气压渗透法测定的渗透压约为322mOsm/kg水，渗透压约为273mOsm/L，在20℃下绝对粘度为约2.3cp并且在37℃下为约1.5cp，并且在37℃下的比重为约1.164。示例性组合物包括约20％到40％的非离子低渗透化合物或约25％到约35％的非离子低渗透化合物。一种示例性组合物包括配制在20mM的Tris(pH为8.0)、1mM的MgCl₂、200mM的NaCl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scAAV或rAAV病毒颗粒。另一种示例性组合物包括配制在1X PBS和0.001％普郎尼克F68中的scAAV。

在本公开的方法中待施用的rAAV的剂量将根据例如特定rAAV、施用方式、施用时间、治疗目标、个体和靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准的方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg)为单位表示。本文考虑的剂量包括约1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、约1×10¹²、约1×10¹³、约1.1×10¹³、约1.2×10¹³、约1.3×10¹³、约1.5×10¹³、约2×10¹³、约2.5×10¹³、约3×10¹³、约3.5×10¹³、约4×10¹³、约4.5×10¹³、约5×10¹³、约6×

10¹³、约1×10¹⁴、约2×10¹⁴、约3×10¹⁴、约4×10¹⁴、约5×10¹⁴、约1×10¹⁵到约1×10¹⁶或更多的总病毒基因组。约1×10⁹到约1×10¹⁰vg、约5×10⁹到约5×10¹⁰vg、约1×10¹⁰到约1×10¹¹vg、约1×10¹¹到约1×10¹⁵vg、约1×10¹²到约1×10¹⁵vg、约1×10¹²到约1×10¹⁴vg、约1×10¹³到约6×10¹⁴vg和约6×10¹³到约1.0×10¹⁴vg的剂量也是可以考虑的。本文举例说明的一剂量是6×10¹³vg。本文举例说明的另一剂量是1.5×10¹³vg。

提供了用rAAV转导靶标视网膜细胞的方法。视网膜细胞包括双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、穆勒神经胶质细胞、小神经胶质细胞、水平细胞或无长突细胞。

术语“转导”用于指通过本公开的复制缺陷型rAAV在体内或在体外向靶细胞施用/递送CLN6多核苷酸，导致受体细胞表达功能性多肽。用本公开的rAAV转导细胞导致由rAAV编码的多肽或RNA的持续表达。本公开因此提供了通过鞘内、局部IV递送、脑室内、肌内、视网膜下注射、玻璃体内递送或实质内递送或其任何组合向受试者施用/递送编码转基因编码多肽的rAAV的方法。鞘内递送是指递送到脑或脊髓的蛛网膜下的空间。在一些实施方案中，鞘内施用是通过脑池内施用。

转基因

公开了将任何感兴趣的转基因递送至视网膜细胞的方法。转基因是编码感兴趣的多肽的多核苷酸序列或者是抑制、干扰或沉默感兴趣的基因例如siRNA或miRNA的表达的核酸。

示例性转基因是编码RPE65、RPGR、ORF15、CNGA3、CMH、ND4、PDE6B、ChR2、MERTK、hRS1、hMYOJA、hABCA4、CD59、抗hVEGF抗体、内皮抑素-血管抑制素、sFLT01或sFLT-1的多核苷酸。在一个实施方案中，转基因编码CLN多肽，例如CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6或CLN8。另外的示例性转基因包括针对RTP801的siRNA、针对VEGFR-1的siRNA、针对VEGF的siRNA或针对ADRB2的siRNA。

在视网膜中表达的miRNA被考虑作为包括在公开的优化基因疗法载体中的转基因。miRNA的例子在Karali等人，Nucleic Acids Res.2016Feb 29；44(4):1525–1540中提供，在此引入作为参考。

本文提供的rAAV基因组可包含编码转基因的多核苷酸，所述转基因包含编码RPE65、RPGR、ORF15、CNGA3、CMH、ND4、PDE6B、ChR2、MERTK、hRS1、hMYOJA、hABCA4、CD59、PEDF、内皮抑素-血管抑制素基因、sFLT-1、编码抗hVEGF抗体的基因中任一种的多核苷酸序列。例如，由转基因编码的多肽包括包含如下氨基酸序列的多肽：与转基因序列编码的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

本文提供的rAAV基因组包含编码CLN多肽例如CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6和CLN8的多核苷酸。所述多肽包括包含如下氨基酸序列的多肽：与CLN多肽氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，并且其编码具有CLN活性的多肽(例如，与例如治疗前的患者相比，治疗时，溶酶体自发荧光存储材料的清除率增加、ATP合酶亚基C的溶酶体积累减少、以及患者中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少中的至少一种)。

在一些情况下，本文提供的rAAV基因组包括编码CLN多肽的多核苷酸，或与编码具有CLN活性(例如，与例如治疗前的患者相比，治疗时，溶酶体自发荧光存储材料的清除率增加、ATP合酶亚基C的溶酶体积累减少、以及患者中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少中的至少一种)的多肽的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供的rAAV基因组包括包含多核苷酸序列的转基因，该多核苷酸序列编码具有期望活性的多肽并且在严格条件下与已知的感兴趣转基因的任何一个核酸序列或其互补序列杂交。在其他实施方案中，本文提供的rAAV基因组包含编码具有CLN活性的多肽并且在严格条件下与编码CLN多肽的任何一个核酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸序列。

以下概述了每个巴藤病亚型的疾病特征，重点是视觉组成部分。“原代受影响的视网膜细胞”列中包含的数据是根据从小鼠视网膜编译的单细胞RNA数据确定的。对这些数据的调查仍在进行中。

术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交的严格性主要由温度、离子强度、以及如甲酰胺等变性剂的浓度确定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例包含但不限于0.015M氯化钠、65℃到68℃下0.0015M柠檬酸钠，或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和42℃下50％甲酰胺。参见例如，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratory Manual)》，第2版，冷泉港实验室，(纽约冷泉港，1989)。

施用方法

鞘内施用在本文中举例说明。鞘内递送是指递送到脑或脊髓的蛛网膜下的空间。在一些实施方案中，鞘内施用是通过脑池内注射或腰髓内注射。这些方法包含用本文所描述的一种或多种rAAV转导靶细胞。在一些实施方案中，将包括转基因的rAAV病毒颗粒施用或递送到患者的眼睛、脑和/或脊髓。在一些实施方案中，将多核苷酸递送到脑。考虑用于递送的脑区包含但不限于运动皮层、视觉皮层、小脑和脑干。在一些实施方案中，将多核苷酸递送到脊髓。在一些实施方案中，将多核苷酸递送到下运动神经元。多核苷酸可以递送至视网膜细胞，例如双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、穆勒神经胶质细胞、小神经胶质细胞、水平细胞或无长突细胞。

在本文提供的方法的一些实施方案中，在施用rAAV后(例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟或约20分钟)将患者保持在Trendelenburg卧位(头向下位置)。例如，患者可以在头部向下位置倾斜约1度到约30度、约15度到约30度、约30度到约60度、约60度到约90度或约90度到约180度。

对于视网膜下施用，用针，例如30G针，在眼睛赤道处或之后做一个小的巩膜切口。病毒或载体通过该切口在视网膜下递送，例如，通过管子连接到Hamilton注射器或通过30G针头和Hamilton注射器的细玻璃吸管。例如，视网膜下施用由受过临床训练的外科医生使用本领域已知的方法进行。

对于脑室内注射，将针头插入颅骨并将液体注入含有脑脊液的脑室。例如，脑室内注射由受过临床训练的外科医生使用本领域已知的方法进行。

在任何施用方法中，组合物可包含非离子、低渗透造影剂。例如，所述组合物可以包括非离子低渗透造影剂，其中所述非离子低渗透造影剂选自由以下组成的组：碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰和其组合。

本文提供的方法包括将包括本文提供的rAAV的组合物的有效剂量或有效多剂量施用于有需要的受试者(例如，包含但不限于人类患者的动物)的步骤。如果在视力相关病症的症状出现之前施用该剂量，则该施用是预防性的。如果在视力相关病症的症状出现之后施用该剂量，则施用是治疗性的。有效剂量是减轻(消除或减少)与视力相关病症相关的至少一种症状的剂量，其减缓或阻止所述病症的进展、减少所述病症的程度、导致所述病症的缓解(部分或全部)和/或延长生存期和/或视力。与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法导致视力丧失或视网膜变性的稳定、进展减缓，或视力或黄斑变性的改善。

当视力相关病症是CLN巴藤病时，与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法导致用于评估CLN巴藤病的进展和/或改善的一种或多种量表的稳定化、进展减少或改善，例如统一的巴藤病评估系统(UBDRS)或汉堡运动和语言量表。UBDRS评估量表(如Marshall等人，《神经病学(Neurology)》，2005 65(2):275-279中所述)[包括UBDRS物理一个或多个量表，其用于评估CLN巴藤病的进展和/或改善，例如统一的巴藤病评估系统(UBDRS)或汉堡运动和语言量表。UBDRS评估量表(如Marshall等人，《神经病学(Neurology)》，2005 65(2):275-279中所描述)[包含UBDRS物理评估量表、UBDRS癫痫发作评估量表、UBDRS行为评估量表、UBDRS能力评估量表、UBDRS症状发作序列和UBDRS临床总体印象(CGI)]；小儿生活质量量表(PEDSQOL)量表、运动功能、语言功能、认知功能和生存。与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法可以导致以下一种或多种：自发荧光存储材料的溶酶体积累减少或减缓、ATP合成酶亚基C的溶酶体积累减少或减缓、减少或减缓胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化；减少或减缓星形细胞增生，并且示出了通过MRI测量的脑量损失减少或延迟。

糖苷水解酶

本公开提供了在载体中与糖苷水解酶例如神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶组合施用优化的基因疗法。外切葡糖苷酶从聚糖链中去除末端唾液酸。这些唾液酸存在于所有细胞类型和大多数分泌蛋白的聚糖链的最外端。已知糖苷水解酶可以清除细胞膜残留物，据认为这种清除允许更大的病毒受体靶向和细胞进入。例如，神经氨酸酶处理去除N-连接的半乳糖残基，从而增强使用N-连接的半乳糖残基作为进入细胞的受体的AAV的渗透，例如AAV9(参见Shen等人，J.Biol.Chem.286:13532-13540,2011)。本文举例说明了向视网膜细胞的递送，然而所公开的方法、组合物和用途可以靶向其中糖苷水解酶清除细胞膜上的受体的任何细胞类型。

还提供了包含优化的基因疗法载体的联合疗法。术语“联合疗法”和“联合治疗”是指将公开的优化基因疗法载体与提高对视网膜细胞的靶向性的试剂例如酶一起施用。在一些实施方案中，该方法包括将糖苷水解酶与基因疗法载体的施用联合地施用给受试者。例如，糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。可以通过本文所述的任何施用途径将所述试剂与载体同时或依次施用。

如本文所使用的组合包含同时治疗或顺序治疗。例如，基因疗法载体和糖苷水解酶使用相同的施用方式同时施用，或者基因疗法载体和糖苷水解酶分别使用不同的施用方式同时施用。在另外的实例中，基因疗法载体和糖苷水解酶使用相同的施用方式依次施用，或者基因疗法载体和糖苷水解酶分别使用不同的施用方式依次施用。本文所描述的方法与标准医学治疗的组合是特别考虑的。

在一些实施方案中，优化的基因疗法载体与糖苷水解酶例如神经氨酸酶同时施用。在其他实施方案中，优化的基因疗法载体在糖苷水解酶例如神经氨酸酶之前或之后立即施用。在其他实施方案中，优化的基因疗法载体在糖苷水解酶如神经氨酸酶的施用的约15分钟内、约20分钟内、约25分钟内、约30分钟内、约45分钟内、1小时内、2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、12小时内、24小时内、36小时内或48小时内施用。在一些实施方案中，糖苷水解酶在施用优化的基因疗法载体之前或在施用优化的基因疗法载体之后施用。

在一些实施方案中，优化的基因疗法载体和糖苷水解酶例如神经氨酸酶在单次玻璃体内注射中施用。然而，本公开还提供了在单独的玻璃体内注射中施用优化的基因疗法载体和糖苷水解酶例如神经氨酸酶的组合。例如，在施用优化的基因疗法载体前约30分钟施用糖苷水解酶，例如神经氨酸酶。此外，优化的基因疗法载体和糖苷水解酶可以使用不同的施用方式施用。

实施例

虽然以下实施例描述了具体的实施方案，但应理解，本领域技术人员将想到变化和修改。因此，只有权利要求中出现的这些限制才能适用于本发明。

实施例1

scAAV9.GFP和Anc80.GFP的产生

人GFP cDNA克隆获自马里兰州Rockville的Origene。在杂交鸡β-肌动蛋白启动子(CB)、CMV增强子-启动子或P546启动子下，将GFP cDNA进一步亚克隆到自互补AAV9基因组或Anc80基因组中，并进行体外和体内测试。图1中提供了质粒构建体的示意图，其显示插入AAV2 ITR之间的GFP cDNA。质粒构建体还包含CB启动子、内含子例如猿猴病毒40(SV40)嵌合内含子和牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号(BGH PolyA)中的一种或多种。将图1中的构建体封装到AAV9基因组或Anc80基因组(统称为“AAV”)中。

实施例2

联合神经氨酸酶的scAAV9.CB.GFP玻璃体注射

将小鼠麻醉用于如上所述的玻璃体内注射。用30G针在异色边缘(lumbus)和巩膜之间做一个小切口。使用通过管子连接到Hamilton注射器或通过30G针头和Hamilton注射器的细玻璃吸管，将病毒或载体通过该切口递送到玻璃体空间中。在注射之前和之后，局部施加奥复星和vetropolycin，允许小鼠通过标准护理(恢复用加热笼，笼底食物，长吸管)恢复并监测直至稳定。

通过一次玻璃体内注射将scAAV9.CB.GFP施用于小鼠(1-5个月大)，并在两个月的过程中在不同时间点监测表达。AAV和Anc80的施用剂量范围为9x10⁹和3.2x10¹⁰ vg，其用PBS稀释或直接注射rAAV。此外，在单次玻璃体内注射中，rAAV与神经氨酸酶或不与神经氨酸酶同时施用。对于同时施用，在注射前立即将rAAV与神经氨酸酶混合，并作为单一溶液施加。如图2A所示，玻璃体内注射导致GFP在视网膜中的表达。此外，施用scAAV9.CB.GFP联合神经氨酸酶增强了转基因到视网膜外层的渗透。下面列出了视网膜染色标记物的关键词：

视网膜细胞类型	视网膜层	抗体
			双极细胞(全部)	内核层(INL)	Otx2
双极细胞(视杆)	内核层	PKCα
			穆勒神经胶质细胞	全部具有INL中的核	Sox2
光感受器(视杆)	外核层	视紫红质
			无长突细胞	内核层	Pax6
水平细胞	内核层	钙视网膜蛋白
			小胶质细胞	内核层	Iba1

钙视网膜蛋白是水平细胞(红色染色)的标志物，并且染色视网膜的内核层。如图2B所示，玻璃体内注射AAV9.CB.GFP，将转基因递送至水平细胞，以及神经氨酸酶，增强了转基因对视网膜内核层的渗透。

Otx2是所有双极细胞的核标志物(红色染色)并染色视网膜的内核层。如图2C所示，玻璃体内注射AAV9.CB.GFP，将转基因递送至双极细胞，以及神经氨酸酶，增强了转基因对视网膜内核层的渗透。

Pax6是无长突细胞的标志物(红色染色)，并且染色视网膜的内核层。如图2D所示，玻璃体内注射AAV9.CB.GFP，将转基因递送至无长突细胞，以及神经氨酸酶，增强了转基因对视网膜内核层的渗透。

Sox2是穆勒神经胶质细胞的标志物(红色染色)，并且染色视网膜内层的所有核。如图2E所示，玻璃体内注射AAV9.CB.GFP，将转基因递送至穆勒神经胶质细胞，以及神经氨酸酶，增强了转基因对视网膜内核层的渗透。

实施例3

为了进一步研究神经氨酸酶对在有或没有神经氨酸酶的情况下接受玻璃体内注射AAV9.CB.GFP的8周龄野生型小鼠的转导的影响，如图3所示。如实施例2中详细描述的，将～2x10¹⁰ vg的AAV9.CB.GFP注射到小鼠中。图4A和图4B中的视网膜组织针对转基因GFP和双极细胞特异性标记物Otx2进行了染色。在玻璃体内注射AAV载体之前或之后添加神经氨酸酶显著增加了双极细胞的病毒转导(见图4C)。

虽然已经在本文示出并且描述了本发明的优选实施方案，但是对本领域的技术人员而言显而易见的是这种实施方案仅以实例方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应该理解，可以采用本文所描述的实施方案的各种替代方案。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

本申请中提及的所有文献均特此通过引用整体并入。

参考文献

Arsov,T.,Smith,K.R.,Damiano,J.,Franceschetti,S.,Canafoglia,L.,Bromhead,C.J.,…

Berkovic,S.F.(2011).Kufs disease,the major adult form of neuronalceroid lipofuscinosis,caused by mutations in CLN6.American Journal of HumanGenetics,88(5),566–573.

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2011.04.004

Bras,J.,Verloes,A.,Schneider,S.A.,Mole,S.E.,&Guerreiro,R.J.(2012).Mutation of the parkinsonism gene ATP13A2 causes neuronal ceroid-lipofuscinosis.Human Molecular Genetics,21(12),2646–2650.https://doi.org/10.1093/hmg/dds089

Canafoglia,L.,Morbin,M.,Scaioli,V.,Pareyson,D.,D’Incerti,L.,Fugnanesi,V.,…Franceschetti,S.(2014).Recurrent generalized seizures,visualloss,and palinopsia as phenotypic features of neuronal ceroid lipofuscinosisdue to progranulin gene mutation.Epilepsia,55(6),e56–e59.

https://doi.org/10.1111/epi.12632

Cannelli,N.,Cassandrini,D.,Bertini,E.,Striano,P.,Fusco,L.,Gaggero,R.,…Santorelli,F.M.(2006).Novel mutations in CLN8 in Italian variant lateinfantile neuronal ceroid lipofuscinosis:another genetic hit in theMediterranean.Neurogenetics,7(2),111–117.

https://doi.org/10.1007/s10048-005-0024-y

Estrada-Cuzcano,A.,Martin,S.,Chamova,T.,Synofzik,M.,Timmann,D.,Holemans,T.,…Schüle,R.(2017).Loss-of-function mutations in the ATP13A2/PARK9gene cause complicated hereditary spastic paraplegia(SPG78).Brain:A Journalof Neurology,140(2),287–305.

https://doi.org/10.1093/brain/aww307

Kniffin,C.(2016).OMIM Clinical Synopsis-％609055-CEROIDLIPOFUSCINOSIS,NEURONAL,9；CLN9.2019年3月19日获取自http://omim.org/clinicalSynopsis/609055

Moen,M.N.,

R.,Hamdani,E.H.,Laerdahl,J.K.,Menchini,R.J.,Vigeland,M.D.,…Chaudhry,F.A.(2016).Pathogenic variants in KCTD7 perturb neuronal K⁺fluxes and glutamine transport.Brain,139(12),3109–3120.https://doi.org/10.1093/brain/aww244

Mole,S.E.,&Williams,R.E.(1993).Neuronal Ceroid-Lipofuscinoses.

University of Washington,Seattle.获取自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20301601

Nosková,L.,Stránecky,V.,Hartmannová,H.,

A.,

V.,Ivánek,R.,…Kmoch,S.(2011).Mutations in DNAJC5,encoding cysteine-string proteinalpha,cause autosomal-dominant adult-onset neuronal ceroidlipofuscinosis.American Journal of Human Genetics,89(2),241–252.https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2011.07.003

Roosing,S.,van den Born,L.I.,Sangermano,R.,Banfi,S.,Koenekoop,R.K.,Zonneveld-Vrieling,M.N.,…Hoyng,C.B.(2015).Mutations in MFSD8,Encoding aLysosomal Membrane Protein,Are Associated with Nonsyndromic AutosomalRecessive Macular Dystrophy.Ophthalmology,122(1),170–179.https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2014.07.040

Staropoli,J.F.,Karaa,A.,Lim,E.T.,Kirby,A.,Elbalalesy,N.,Romansky,S.G.,…Cotman,S.L.(2012).A homozygous mutation in KCTD7 links neuronal ceroidlipofuscinosis to the ubiquitin-proteasome system.American Journal of HumanGenetics,91(1),202–208.

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2012.05.023

Weizmann Institute of Science.(2019).Ceroid Lipofuscinosis,Neuronal,10disease:Malacards-Research Articles,Drugs,Genes,Clinical Trials.2019年3月19日获取自

https://www.malacards.org/card/ceroid_lipofuscinosis_neuronal_10_2

Xin,W.,Mullen,T.E.,Kiely,R.,Min,J.,Feng,X.,Cao,Y.,…Sims,K.(2010).CLN5 mutations are frequent in juvenile and late-onset non-Finnish patientswith NCL.Neurology,74(7),565–571.https://doi.org/10.1212/WNL.0b013e3181cff70d

CLN3核苷酸序列(SEQ ID NO:1)

CLN3氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

CLN6核苷酸序列(SEQ ID NO：3)

CLN6氨基酸序列:(SEQ ID NO:4)

CLN8核苷酸序列(SEQ ID NO：5)

CLN8氨基酸序列(SEQ ID NO:6)

CB启动子(SEQ ID NO:7)

CMV启动子(SEQ ID NO:8)

P546启动子(SEQ ID NO: 9)

gaacaacgccaggctcctcaacaggcaactttgctacttctacagaaaatgataataaag

aaatgctggtgaagtcaaatgcttatcacaatggtgaactactcagcagggaggctctaa

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Claims

1.一种组合物，其包含基因疗法载体和糖苷水解酶。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述基因疗法载体是AAV8、AA9或Anc80。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送或鞘内递送。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述基因疗法载体和所述糖苷水解酶被混合用于同时施用。

6.一种用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的试剂盒，其包含基因疗法载体和糖苷水解酶。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其中所述基因疗法载体是AAV8、AA9或Anc80。

9.一种将转基因递送至受试者的视网膜细胞的方法，包括向所述受试者施用i)编码所述转基因的基因疗法载体，和ii)糖苷水解酶。

10.一种治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的方法，包括向所述受试者施用i)编码转基因的基因疗法载体，和ii)糖苷水解酶，其中所述转基因的递送有效地治疗所述视力损伤或所述视力相关病症。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述视网膜细胞为双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、穆勒神经胶质细胞、小胶质细胞、水平细胞或无长突细胞。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中使用局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送或鞘内递送将所述基因疗法载体施用于所述受试者。

14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中将所述编码转基因的基因疗法载体和所述糖苷水解酶同时施用于所述受试者。

15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述基因疗法载体和所述糖苷水解酶混合。

16.根据权利要求9-14中任一项所述的方法，其中所述基因疗法载体和所述糖苷水解酶被分开施用。

17.根据权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述视力相关病症是巴藤病、先天性白内障、先天性青光眼、视网膜变性、视神经萎缩、眼部畸形、斜视、眼球错位、青光眼、湿性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、无脉络膜血症、莱伯先天性黑蒙、莱伯遗传性视神经病变、早发性视网膜营养不良、色盲、性连锁视网膜劈裂症、Usher综合征1B、新生血管性年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑变性、糖尿病性黄斑变性或糖尿病性黄斑水肿。

18.一种用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的组合物，其中所述组合物包含i)编码所述转基因的基因疗法载体，和ii)糖苷水解酶。

19.一种用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的组合物，其中所述组合物包含i)编码转基因的基因疗法载体，和ii)糖苷水解酶。

20.一种用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的组合物，其中所述组合物包含编码所述转基因的基因疗法载体，其中所述组合物与包含糖苷水解酶的第二组合物一起施用。

21.一种用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的组合物，其中所述组合物包含编码转基因的基因疗法载体，其中所述组合物与包含糖苷水解酶的第二组合物一起施用。

22.一种用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的组合物，其中所述组合物包含糖苷水解酶，其中所述组合物与包含编码所述转基因的基因疗法载体的第二组合物一起施用。

23.一种用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的组合物，其中所述组合物包含糖苷水解酶，其中所述组合物与包含编码转基因的基因疗法载体的第二组合物一起施用。

24.根据权利要求19-23中任一项所述的组合物，其中所述糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的组合物，其中所述视网膜细胞为双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、穆勒神经胶质细胞、小胶质细胞、水平细胞或无长突细胞。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送或鞘内递送。

27.根据权利要求20-26中任一项所述的组合物，其中所述组合物和所述第二组合物被同时施用于所述受试者。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的组合物，其中所述组合物和所述第二组合物被混合。

29.根据权利要求20-27中任一项所述的组合物，其中所述组合物和所述第二组合物被分开施用。

30.根据权利要求19、21或23-29中任一项所述的组合物，其中所述视力相关病症是巴藤病、先天性白内障、先天性青光眼、视网膜变性、视神经萎缩、眼部畸形、斜视、眼球错位、青光眼、湿性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、无脉络膜血症、莱伯先天性黑蒙、莱伯遗传性视神经病变、早发性视网膜营养不良、色盲、性连锁视网膜劈裂症、Usher综合征1B、新生血管性年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑变性、糖尿病性黄斑变性或糖尿病性黄斑水肿。

31.组合物在制备用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的药物中的用途，其中所述组合物包含i)编码所述转基因的基因疗法载体，和ii)糖苷水解酶。

32.组合物在制备用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的药物中的用途，其中所述组合物包含i)编码转基因的基因疗法载体，和ii)糖苷水解酶。

33.编码转基因的基因疗法载体在制备用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的药物中的用途，其中所述药物与包含糖苷水解酶的组合物一起施用。

34.编码转基因的基因疗法载体在制备用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的药物中的用途，其中所述药物与包含糖苷水解酶的组合物一起施用。

35.糖苷水解酶在制备用于将转基因递送至受试者的视网膜细胞的药物中的用途，其中所述药物与包含编码所述转基因的基因疗法载体的组合物一起施用。

36.糖苷水解酶在制备用于治疗受试者的视力损伤或视力相关病症的药物中的用途，其中所述药物与包含编码转基因的基因疗法载体的组合物一起施用。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的用途，其中所述糖苷水解酶是神经氨酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、转化酶或溶菌酶。

38.根据权利要求32-37中任一项所述的用途，其中所述视网膜细胞为双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、穆勒神经胶质细胞、小胶质细胞、水平细胞或无长突细胞。

39.根据权利要求32-38中任一项所述的用途，其中所述药物被配制用于局部静脉内递送、视网膜下递送、玻璃体内递送或鞘内递送。

40.根据权利要求33-39中任一项所述的用途，其中将所述药物和所述组合物同时施用于所述受试者。

41.根据权利要求33-39中任一项所述的用途，其中将所述组合物和所述组合物混合。

42.根据权利要求33-39中任一项所述的用途，其中所述药物和所述组合物被分开施用。

43.根据权利要求32、34或36-42中任一项所述的用途，其中所述视力相关病症是巴藤病、先天性白内障、先天性青光眼、视网膜变性、视神经萎缩、眼部畸形、斜视、眼球错位、青光眼、湿性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、无脉络膜血症、莱伯先天性黑蒙、莱伯遗传性视神经病变、早发性视网膜营养不良、色盲、性连锁视网膜劈裂症、Usher综合征1B、新生血管性年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑变性、糖尿病性黄斑变性或糖尿病性黄斑水肿。