CN1140998A

CN1140998A - 抑制编程性细胞死亡的组合物、其纯化方法及其用途

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Publication number: CN1140998A
Application number: CN94194745A
Authority: CN
Inventors: I·C·巴萨尔斯特; J·D·布拉德雷; L·D·托梅; P·J·巴尔
Original assignee: LXR Biotechnology Inc
Current assignee: LXR Biotechnology Inc
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 1997-01-22
Also published as: AU1261295A; KR960706350A; US5620885A; FI962246A7; US5635187A; US5759548A; JPH11501284A; NO962187D0; JP2007084573A; EP0732930A1; US5567425A; US5635186A; FI962246A0; DE69434459T2; US20020110608A1; CA2177825A1; ATE302015T1; US5624672A; US6656729B2; US6306398B1

Abstract

本发明直接涉及抑制编程性细胞死亡的植物来源的脱脂提取物的制备方法、所制备的提取物、含有所述提取物的组合物以及使用所述组合物的方法。附图是一个方框图，它表明与对照组相比用氨甲喋呤处理并用含本发明组合物的饲料喂养，小鼠的腹泻发病率降低。

Description

抑制编程性细胞死亡的组合物、其纯化方法及其用途

本申请是美国专利申请系列号No.08/320155的部分继续申请，后者是美国专利申请系列号No.08/158980的部分继续申请(1993年11月30日申请)并在此引为参考。

本发明的领域

本发明涉及具有抑制编程性细胞死亡作用的物质的组合物。

本发明的背景技术

编程性细胞死亡是导致个体细胞死亡的正常生理过程。此编程性细胞死亡过程参与了多种正常的及病理的生物过程并可由多种不相关的刺激物引起。在老龄化过程中，编程性细胞死亡的生物调节也发生变化，这种变化引起很多与老龄化相关的症状和疾病。最近对编程性细胞死亡的研究表明导致细胞死亡的普通代谢途径可由多种信号引起，包括激素、血清生长因子缺乏、化疗试剂、离子辐射及人免疫缺陷病毒(HIV)的感染。Wyllie(1980)Nature 284：555-556；Kanter等人(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.118：392-399；Duke and Cohen(1986)Lymphokine Res.5：289-299；Tomei等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commum.155：324-331；及Kruman等人(1991)J.Cell.Physiol.148：267-273；Ameisen and Capron(1991)Immunol.Today 12：102-105；及Sheppard and Ascher(1992)J.AIDS 5：143-147。能作用于编程性细胞死亡的生物控制试剂便应用于多种临床症状的治疗中。

编程性细胞死亡的特征是细胞收缩、染色体凝聚、细胞浆产生气泡、膜的渗透性增加及核小体间DNA裂解。Gerschenson等人(1992)FSDEB J.6：2450-2455；及Cohen and Duke(1992)Ann.Rev.Immunol.10：267-293。

本申请上下文中引用的所有文献在此引为参考。

部分含有经部分加工的植物提取物的多种补充食物已被用于改善化疗、辐射及AIDS经常伴发的胃肠道功能紊乱。这种补充食物通常含有碳水化合物、脂肪及植物蛋白水解产物。例如，见Tomei and Cops等人的in Apoptosis The Moleclar Basis of CellDeath(1991)Cold Spring Harbor Laboratory Press。

几种来自植物提取物的蛋白酶抑制剂具有抗致癌物活性。Troll等人(1987)Adv.Cancer Res.49：265-283。在这些抑制剂中，Bowman-birk抑制剂被描述得最充分。Birk(1985)Int.J.Pep.Pro.Res.25：113-131。Bowman-birk抑制剂被描述为一族二硫键蛋白，分子量约为8kD，它可抑制细胞变形。Chou等人(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71：1748-1752；Yavelow等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5395-5399；及Yavelow等人(1983)Cancer Res.(Suppl.)43：2454s-2459s。已知大豆的粗提取物含有Bowman-Birk抑制剂。Knnedy等人美国专利4793996；PCT专利WO94/20121；及Kennedy，A.R.(1994)Cancer Res.(suppl.)54：1999s-2005s。Bowman-Birk抑制剂的免疫学性质也有描述。WO90/03574及美国专利4959310及5053327。还发现Bowman-Birk抑制剂在巨噬细胞的失粒作用中有活性。日本专利63051335。

溶血磷脂酸(LPA)以多种磷脂的形式发现于多种植物产品中。已发现LPA具有多种生理活性，包括促有丝分裂作用、生长因子及作为抗皱试剂。美国专利4263286、4746652、5326690及5340568。Moolenaar(1994)TICB 4：213-219及Eichholtz等人(1990)Biochem.J.291：677-680对LPA进行了详细的综述。

本发明概述

本发明包括制备抑制编程性细胞死亡组合物的方法及由此制备的组合物。此组合物命名为植物源编程性细胞死亡抑制剂(PAIs)。本发明包括以足以调节编程性细胞死亡的量适于使用PAIs的生理上可接受的组合物。本发明还包括PAIs的使用方法。

附图的简要描述

图1表示对于融合的C3H 10T_1/2细胞PAIs的抗编程性细胞死亡作用。

图2表示对在指数生长期的C3H 10T_1/2细胞PAIs的抗编程性细胞死亡作用与浓度的关系。

图3表示由乙醇萃取纯化的PAIs与由筛析凝胶过滤色谱进一步纯化的PAIs对C3H 10T_1/2细胞抗编程性细胞死亡活性的比较。此数据以对胰蛋白酶抑制活性作用表示。

图4表示不同浓度的大豆PAIs对以放线菌酮处理的非活动性的C3H 10T_1/2的抗编程性细胞死亡活性。

图5表示PAI中单糖的色谱图。

图6描述了在鼠心肌细胞获得的结果。

图7是描述豆粉提取物对氨甲喋呤处理的小鼠的作用图示。

图8是描述豆粉提取物对氨甲喋呤处理的小鼠的作用图示。

图9是描述豆AcE对氨甲喋呤处理的小鼠的作用图示。

图10是描述豆粉提取物对氯甲喋呤处理的小鼠的作用图示。

图11是描述用氨甲喋呤和不同食物处理后小鼠腹泻发病率的方框图。

图12是总结用氨甲喋呤和不同食物处理后小鼠腹泻发病率及体重增加情况的方框图。

图13是DNA序列梯的照片，用以测量由感染HIV个体获得的淋巴细胞中的编程性细胞死亡。

图14是描述在用BSA或提取段B预处理提高溶血磷脂酸的情况下，抗编程性细胞死亡活性的方框图。所用缩略语为：LPA，L-α-溶血磷脂酸、油酰基(C18：1，〔顺〕-9)；BSA，牛血清白蛋白；提取段V，乙醇提取物；及“B，”由豆粉所得的提取段B，主要是磷脂酰肌醇。

图15是描述对体外血清缺乏C3H 10T_1/2细胞，溶血磷脂酸、油酰基(C18：1，〔顺〕-9)的抗编程性细胞死亡作用图示。

实施本发明的方式

现已发现，多种植物成分含有一些组份，当将其至少作部分纯化和纯化时，它表现有抑制编程性细胞死亡的能力。很容易将这些组合物与Bowman-Birk抑制剂分离并明显不同于其它已知的治疗有效的植物产品。此组合物因来源和原来植物的生长条件会在化学组成上有细微的变化。因为本发明包括通过本文描述的方法制备的相关组合物，但这些组合物来自不同的植物，故这些组合物在本文指“PAIs”。此组份也可通过类脂合成领域中已知的方法合成制得。有几种相对纯化的组合物，将它们指定为L/G、AcE、MAcE及FAcE以表示下述不同的纯化程度。相对纯化提取段在下面的讨论中也被称为“D”及“L”，每个都是磷脂的混合物。相对纯化的两个组合物还都含有溶血磷脂酸(LPA)、LPA及蛋白载体和LPA及其它无活性提取段“B”。

PAIs可由多种不同的植物及植物器官分离。优选的植物属豆科(蚕豆及豌豆等)，但PAIs也可由其它植物分离，如茄属(如马铃薯)及葱属(如大蒜)。PAIs也可由部分纯化的植物提取物中分离，包括但不限于糖蜜、植物凝集素、部分纯化的蛋白浓缩物及部分纯化的蛋白水解物。使用本文描述的方法确定是否可由一种特定的植物、植物提取物或植物器官中分离出PAIs是本领域技术人员的一般知识。

能得到此组合物的任何植物提取物或其一部分都适用于本发明。所用植物器官包括但不限于茎、叶、根、花、根茎并优选的是储存器官和球茎，优选所用植物部分是储存器官包括但不限于马铃薯及大蒜。最优选豆的干种子包括但不限于黄豆及豌豆用于简化制备过程。虽然本文中使用了术语“种子”及“多种种子”，但应理解，这些术语包括能得到至少一种有治疗活性的PAI或在细胞培养中有活性的PAI的任何植物部分。

本发明包括初步纯化PAIs的方法。可达到不同程度的纯化。将多种种子研碎或粉碎，优选制成粉或面。在本文中，术语“粉”指研碎的干燥植物部分。粉的粒度应足够小以便使物质表面接触不同的提取液。任何研碎或粉碎方法均适用于本发明，一般地讲，通过商用磨完成多种种子的粉碎。PAIs对热异常稳定，此研碎过程可在使很多蛋白变性的温度下进行。也可使用购买的种子面。例如，已发现黄豆面及多种黄或绿豌豆面含有活性PAIs。

然后将种子粉用本领域已知方法脱脂。脱脂需要在惰性环境(例如无氧的氮气氛或氩气氛)中进行，或在此过程中加入抗氧剂如BHT或BHA，以改善活性或降低氧化。脱脂作用一般通过用含有机溶剂的溶液提取粉末来完成。适宜的有机溶剂包括但不限于丙酮、四氯化碳、乙醚、己烷及氯仿。溶液中有机溶剂的浓度一般为50-100％。优选有机溶剂是丙酮。所用有机溶剂的浓度可随特定的溶剂及种子类型变化。确定有效的浓度是本领域技术人员的一般知识。优选丙酮的浓度约为70％。也可进行多相有机提取。粉末与有机溶液的比率(重量/体积)也可变化。虽然不限于下列范围，但一般比率为约2∶1至约1∶20(粉末重量/有机溶剂体积)。对于丙酮，优选比率为1∶5。

由于PAIs的稳定性，进行脱脂作用的温度和气压至多只受到所用有机溶剂的冰点或沸点的限制。一般为了方便，在室温和常压下进行脱脂。而提取的时间并不严格，主要取决于粉末与有机溶剂的比率。对于用70％的丙酮以1∶5的比率提取时，脱脂一般进行30分钟，并不断搅拌。

然后以任何本领域已知的方法将有机溶剂从粉末中分离。优选通过离心将粉末从有机相中沉降并除去有机相。也可采用任何适宜的分离形式包括但不限于过滤或通过重力分离。PAIs留在提取后的粉末中。

然后用水溶液提取脱脂粉末得到含有PAIs的水保留液。该水溶液可以是缓冲液如磷酸盐水缓冲液(PBS)并也可含有高达约80％的与水混溶的有机溶剂。适宜的与水混溶的有机溶剂包括但不限于乙腈、低级链烷醇，特别是C₁-C₄链烷醇如乙醇、甲醇及丙醇，低级链烷二醇，特别是C₂-C₄的链烷二醇如乙二醇，及低级链烷二醇的聚合物，特别是聚乙二醇。优选使用乙醇，最优选以50％的浓度。

粉末与水溶液的比率也可变化。提取比率可以是约1∶1至至少约1∶20(粉末重量/水溶液体积)。一般使用1∶10的50％乙醇。提取时间也随水溶液的体积及所用与水混溶的有机溶剂的百分率而变化。对于1∶10(体积比)的50％乙醇，提取过程为1小时，并不断混合或搅拌(搅动)。

已发现水溶液的pH范围关系不大，已试验了2.5至11的范围；而似乎甚至更大的范围也可以是有效的。一般为了方便，pH范围为7-8。

水溶液提取的温度和气压可在大范围内变化，在主要决定于水溶液的冰点和沸点。一般，提取在室温和常压下进行。一旦用水溶液提取，水保留液就被除去以进一步加工。本领域已知的任何除去水溶液的方法都是适宜的，包括但不限于离心及过滤。

水保留液再进一步纯化得到PAI。通过任何本领域已知的方法均可将任何与水混溶的有机溶剂除去，包括但不限于超滤、干燥及透析。使用10kD分子量的界限值进行超滤可除去低分子量蛋白质如Bowman-Birk抑制剂单体及有机溶剂。透析管的分子量界限值同样可以是10kD。

超滤后通过渗滤或通过多次改变透析液(如纯水)可除去残留的有机溶剂。水保留液可以以溶液的形式保存最多几天而以冻干固体的形式可无限期保存。优选将水保留液冻干。如果起始物质是豆粉，则冻干固体是ACE。水保留液及冻干保留物都可进行进一步加工；冻干保留物在进一步加工前再悬于适当的水溶液中。得到的物质可通过任意分子量筛析色谱法进一步分离，包括但不限于用水缓冲液的Sepharose S100HR(PharmaciaBiotechnology Piscataway NJ.USA)或BioGel P-100(BioRadLaboratories Inc，Hercules CA，USA)。适当的缓冲液包括但不限于10至50mM磷酸盐(中性pH)的0.1至0.3M碳酸氢铵或0.1至0.3M氯化钠。

由筛析色谱得到的PAIs发现于空体积中并具有大于80kD的外观分子量。发现于此提取段的物质可通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在减压条件下分离出，其中含有几种蛋白质。用考马司蓝染色表明存在有分子量在18至68kD的6-8种蛋白质。通过薄层色谱分析显示存在几种类脂型化合物。

由色谱洗脱在280nm具有最大吸收的提取段与含有最大生物活性的提取段相符合。由低分子量物质中及空体积中某一位置的洗脱物中分离的生物活性与分子量大于80kD的或凝集物的相一致。此物质可以浓缩、透析、冻干并以冻干形式无限期保存。如果起始物质是豆粉，则冻干的固体是FAcE。

可溶性PAIs可用浓度为70％或更大的丙酮沉淀。但是，用不同试剂处理，包括强酸，可破坏其活性。例如，三氟乙酸、盐酸、三氯乙酸及苯酚破坏其活性。而pH若低到2.5则不破坏活性，因为1％乙酸不影响PAIs的活性。

通过将脱脂及乙醇提取的种子粉末中得到的冻干的高分子量提取段用氯仿∶甲醇∶水(4∶8∶3)单相混合物提取，可进一步分离PAIs。通过将干燥物质溶于水，然后加入甲醇、氯仿，混合并除去沉淀，可最方便地作到这一点。此提取过程得到保留PAI活性的糖脂/磷脂提取段。

例如，将0.1gEQ(得自0.1g起始物质的量)高分子量提取段(FAcE)溶于7.5ml水并不断搅拌，加入20ml甲醇后，加入10ml氯仿。通过离心(8,000×g×10分钟)除去不溶物质，通过旋转蒸发除去有机溶剂并冻干除去水再从溶液中得到PAI。得到的提取段被命名为L/G提取段。L/G提取段的碳水化合物组合物由比率为3∶2的阿拉伯糖及半乳糖以及微量的岩藻糖、鼠李糖、葡糖胺、葡糖及甘露糖组成。

基于在氯仿∶甲醇混合物中的溶解性通过在硅胶色谱柱中或薄层色谱(TLC)板上进行拆分，可将L/G提取段做进一步分离。

然后，将此物质在硅酸(即Mallinckrodt SiO₂·xH₂O100目粉末)上进行预色谱步骤。将活性物质装载于氯仿中并用氯仿或氯仿∶甲醇(90∶10)的混合物洗涤，并用甲醇或氯仿∶甲醇(10∶90或20∶80)洗脱。

活性物质可在二醇柱如Diol SepPak柱(Waters，Millipore)上经色谱法进一步纯化。例如，硅胶纯化的L/G、粗商用植物凝集素或其它溶于氯仿中的豆磷脂制剂可作为起始物质。例如，将约100-1000mg的样品以约为100mg/ml的浓度溶于氯仿中并将其装载于已平衡的10g二醇柱上。用2-5体积的氯仿洗涤，用2-5体积的异丙醇，2-5体积的乙醇洗脱，最后用2-5体积的甲醇洗脱。虽然在乙醇洗脱液中也发现了一些活性，但大部分活性存在于甲醇洗脱液中。通过干燥将活性物质由甲醇中分离出。适当的干燥方法包括但不限于旋转蒸发或减压蒸馏。一些样品在-20℃储存过夜后产生沉淀，但此沉淀可通过离心除去而不损失活性。

活性物质可通过HPLC色谱在硅胶柱如Rainin InstrumentCo.，Inc.的Dynamax 60A Si柱上进一步分离。所用洗脱活性物质的洗脱液的梯度为乙腈∶甲醇∶水∶氢氧化铵95∶3∶2∶0.05至65∶21∶14∶0.35。在205nm下检测洗脱液的情况。如下面给出的实施例中描述的，此纯化阶段产生5个分离的产品，指定为提取段1-5。这些产品被分离并对其组份及抗编程性细胞死亡活性分别进行分析。将几个提取段合并并检测它们的抗编程性细胞死亡活性。发现主要含有溶血磷脂酸(LPA)的流出液(如下所述)是一类化合物。当测其活性时，发现市售LPA，L-α-溶血磷脂酸、油酰基(C18：1，〔顺〕-9)没有抗编程性细胞死亡活性。在此提取段中发现的LPA及市售LPA在与其特定结合的一种蛋白质或多种蛋白质的存在下，确实具有抗编程性细胞死亡活性。因此，本发明的一个实施方案是含有LPA及有效量的特定结合蛋白的组合物。优选此结合蛋白是血清白蛋白。注意Bowman-Birk抑制剂的存在不影响LPA的抗编程性细胞死亡活性。还发现在提取段“B”的存在下，LPA也具有抗编程性细胞死亡的活性。提取段“B”主要是磷脂酰肌醇，并不具有抗编程性细胞死亡活性。因此本发明的另一实施方案是含有LPA及有效量的提取段B或其某种活性成分的组合物。注意提取段B不含蛋白质，因此不仅仅由于磷脂的存在才诱发LPA具有抗编程性细胞死亡活性。虽然没有任何理论阐述，但提取段B的作用可能是由于形成胶粒或脂质体，它能保护LPA和/或能让LPA正确地引进细胞中。

提取段“D”也可制得并具有抗编程性细胞死亡活性。此提取段对应于实施例8中的峰3。因此本发明的另一实施方案是含有提取段D的组合物。

提取段“L”也可制得并发现其具有抗编程性细胞死亡活性。此提取段对应于实施例8中的峰5。因此本发明的另一实施方案是含有提取段L的组合物。提取段D及提取段L在其抗编程性细胞死亡活性上可以加和。因此本发明的另一实施方案是含有提取段D和提取段L的组合物。

因此，上述实施方案也包括在术语PAI中并适用于本文描述的症状和组合物。LPA具有下列结构：其中R是未取代或取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的具有11至约23个碳原子的烷基。

另外，本文中使用的LPA包含多种分子，包括但不限于结构式如下的2-脱氧或2-脱氧-2-卤代-溶血磷脂酸化合物或其药用盐：其中-R是未取代或取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的具有11至约23个碳原子的烷基；每个X独立地为O或S；Y是O或CH₂；Z是H、卤素、NH₂、SH、OH或OPO₃H₂。

另外还包括RC(O)O-是月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、棕榈油酰基、油酰基或亚麻酰基；特别是油酰基、棕榈油酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基或月桂酰基；特别是肉豆蔻酰基或月桂酰基。

LPAs的药用盐包括但不限于碱金属盐如钠及钾盐；碱土金属盐如钙和镁盐；无毒重金属盐；铵盐；三烷基铵盐如三甲基铵盐和三乙基铵盐和烷氧基铵盐如三乙醇铵盐、三(2-羟乙基)铵盐及三甲胺(三(羟甲基)氨基甲烷)。特别优选钙盐。与特定结合蛋白或提取段B联合使用的优选的LPA化合物包括但不限于L和D1-肉豆蔻酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-月桂酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-油酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-棕榈油酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D肉豆蔻酰基-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-月桂酰基-2-氯-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-肉豆蔻酰基-2-氯-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯及其钙盐。

可能影响这些组合物活性的其它因素是LPA的链长，胆固醇的存在，胶粒、脂质体、洗涤剂及乳化剂的存在及在LPA中链的位置，即是在甘油的第一还是第二个碳上。对于胶粒、脂质体及洗涤剂，胶粒和脂质体将提高活性而洗涤剂及类洗涤剂分子将引起活性的降低。

由HPLC硅胶色谱获得的活性提取段可根据它们的疏水性进一步分离，例如在C18柱(Dynamax 60A，Rainin Instrument Co.Inc.)上用含有缓冲液的多种甲醇进行HPLC，所述甲醇液包括但不限于含800mg/l乙酸铵的100％甲醇；含有1mM磷酸钠(pH7.4)的99％甲醇及含有10％磷酸钠(pH7.4)的90％甲醇。以90∶10甲醇：5mM磷酸钠(pH7.4)洗脱此物质。

本领域已知多种纯化及分析类脂的方法。任何本领域已知的方法都可用于本发明，只要它能纯化活性提取段。有关综述见Blighand Dyer(1959)Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917；Patton等人(1982)J.Lipid Res.23：190-196；Jungalwala(1985)RecentDevelopments in Techniques for Phospholipid Analysis，inPhospholipids in Nervous Tissues(Eichberg编辑)John Wileyand Sons，pp.1-44；Mamilton等人(1992)，A Practical Approach(Richwood等人编辑)IRL Press at Oxford University Press；及Kates(1986)Techniques of Lipidology：Isolation，Analysis andIdentification in Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(Burdon等人编辑)Elsevier。

一般地讲，豆粉面或其某些提取段是通过悬浮于水(对于粉面20％重量/体积)并加入两体积的甲醇及一体积的氯仿提取的。这是个单相并于室温下搅拌/混合30分钟至1小时。向此混合物中加入一体积的氯仿，混合后加入一体积的水。形成两相，在首先除去任何固体后(如果是用粉面做原料)，通过离心或分液漏斗进行分相。活性物质在有机相(底部)中。

PAIs在体外对编程性细胞死亡的抑制活性似乎主要限于活性增殖细胞；相对而言，对非活动的细胞似乎无作用。

PAIs的活性组份在蛋白酶的存在下非常稳定。例如，用胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草蛋白酶及蛋白酶K在适于蛋白水解的条件下处理PAIs，但此蛋白酶对它们的活性无影响。

本发明还包括含有基本纯化的PAIs的治疗组合物。组合物所需纯化水平可按照经验确定，这是本领域技术人员已知的。所述组合物适用于如下描述的多种功能紊乱中，并可用于人和兽。

用纯化方法得到的PAIs及其活性提取段的活性可用任何本领域已知的抗编程性细胞死亡试验检测。这些包括但不限于C3H10T_1/2细胞的血清缺乏试验，它详细描述于公众可得到的PCT公开号WO9425621，它是优选的试验方法；也是实施例3及4描述的方法。此外，体内编程性细胞死亡抑制作用也可通过任何本领域已知的方法检测。

总之，因在治疗剂量范围内低毒，稳定并可掺入种类极多的载体以多种途径给药，PAIs是可以药用的。此PAIs可单独给药或与其它有疗效的试剂联合给药，包括但不限于抗生素、创伤愈合试剂、抗氧化剂及其它治疗剂。适宜的抗生素包括但不限于氨苄青霉素、四环素、氯霉素及青霉素。适宜的创伤愈合试剂包括但不限于转化生长因子(TGF-βs)、表皮生长因子(EGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)及血小板生长因子(PDGFs)。适宜的抗氧化剂包括但不限于维生素C及E。

所述组合物至少含有治疗有效量的至少一种PAI并可含有至少一种生理可接受的载体。生理可接受的载体是给药后不引起副反应的物质以及PAIs在其中充分溶解以便提供治疗有效量的化合物的物质。PAIs的治疗有效量部分取决于给药的方式及所治疗的症状及其它对本领域技术人员显而易见的因素。一般地讲，以症状得以改善为迹象的足以调节被治疗对象的编程性细胞死亡的量是治疗有效量。治疗有效量一般为含有约为0.5-100％重量比的至少一种PAI。用于特定症状的给药途径(一种或多种)讨论如下，这对本领域技术人员是已知的。

给药途径包括但不限于局部、透皮、非肠道、胃肠道、经支气管及经肺泡给药。局部给药通过局部使用含有治疗有效量的PAIs的霜剂、凝胶剂、洗剂等完成。透皮给药是通过涂敷能使PAIs穿过皮肤并进入血流的霜剂、洗剂、凝胶剂等完成。非肠道途径给药包括但不限于直接注射如静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射。胃肠道途径给药包括但不限于食物摄入及直肠给药。经支气管及经肺泡途径给药包括但不限于通过口腔或鼻腔吸入及直接进行呼吸道注射如通过气管切开术。

虽然PAIs可单独局部给药，但较理想的是需要与局部药用或化妆品用载体混合使用。

本文所用“局部药用载体”是指任何常规用于药物的局部给药的基本无毒的载体，当直接用于皮肤或粘膜表面时PAIs在其中稳定并可被生物利用。例如，PAIs可以常规方式溶解于某种液体，分散或乳化于某种介质中形成液体制剂，或者与半固体(凝胶)或固体载体混合形成糊剂、霜剂、软膏剂、散剂、洗剂等。

适宜的局部药用载体包括水、矿脂(凡士林)、矿脂、矿物油、植物油、动物油、有机或无机蜡(如微晶纤维素、石蜡及地蜡)、天然聚合物(如黄原胶、明胶、纤维素、胶原、淀粉或阿拉伯树胶)、合成聚合物(如下所述)、醇、多元醇等。所述载体可以是某种与水混溶的载体组合物，它基本混溶于水。此类与水混溶的局部药用载体组合物可以包括上述一个或多个适宜成分制成的组合物，也可包括缓释或控释载体，它包括含水、水分散性或水溶性组合物例如脂质体、微海绵、微球体或微胶囊、水基软膏、油包水或水包油乳剂、凝胶等。

在本发明的一个实施方案中，局部药用载体包括缓释或控释载体。此载体是能使PAIs缓释或控释的任意载体，它可提供更有效的给药方式，使PAIs以一或多次较低的频率给药和/或降低给药剂量、易于操作并扩大或延长对皮肤病的作用。当在治疗部位与任何油状物、脂肪、蜡或潮湿环境相接触时载体能释放PAIs，或者根据PAIs在载体中的载药量通过扩散或者释放来达到释放PAIs的目的。此类非限定性载体的实例包括天然和合成聚合物等的脂质体、微海绵、微球体或微胶囊。在潮湿环境中缓释或延长释放的适当载体的例子包括明胶、阿拉伯胶、黄原胶聚合物；通过载药量释放的实例包括木素聚合物等；通过油状物、脂肪或蜡环境释放的实例包括热塑性或柔性热固性树脂或弹性体包括热塑性树脂如聚卤乙烯、聚乙烯酯、聚偏卤乙烯及卤代的聚烯烃，弹性体如巴西红木精、聚二烯及卤代的天然和合成橡胶，以及柔性热固性树脂如聚脲烷、环氧树脂等。优选缓释或延长释放的载体为脂质体、微海绵、微球体或凝胶。

本发明治疗皮肤病的方法中使用的组合物可直接用于被治疗的区域。虽然不是必需，但局部用组合物最好能在需要的部位维持PAIs约24至48小时。

如果需要，所述载体中还可包括常规用于局部用药物或化妆品组合物的一个或多个添加组份：如保温剂、增湿剂、调味剂、缓冲剂、色素、防腐剂、维生素如A、C及E、乳化剂、分散剂、湿润剂、味道修饰剂、凝胶剂、稳定剂、推进剂、抗微生物剂、防晒剂、酶等。局部用药物制剂领域的技术人员可容易地选择适当的特定添加成分及其用量。适宜的添加成分的非限制性实例包括超氧化物歧化酶、硬脂醇、肉豆蔻酸异丙醇酯、脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、丙二醇、水、月桂酰基碱金属或碱土金属硫酸盐、对羟基苯甲酸甲酯、二甲基-对氨基-苯甲酸辛基酯(Padimate O)、尿酸、网硬蛋白、聚粘多糖、透明质酸、芦荟、植物凝集素、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、维生素A或C、生育酚(维生素E)、α-羟基或α-酮酸如丙酮酸、乳酸或乙醇酸，或者美国专利4340586、4695590、4959353或5130298及5140043公开的任何局部用药用成分。

因为治疗的皮肤病是可见的，局部用载体也可是局部化妆品用载体。本文所用“局部化妆品用载体”是指任何常规用于化妆品的局部使用的基本无毒的载体，当直接用于皮肤表面时PAIs在其中稳定并可被生物利用。适当的化妆品用载体对本领域技术人员是已知的并包括但不限于化妆品用液体、乳油、油剂、洗剂、软膏、凝胶或固体，如常规化妆品晚霜、粉底霜、增黑洗剂、防晒霜、护手霜、化妆或化妆粉底、面膜等。这样，对于局部用化妆品载体及药用载体如果不常是等同的则应基本上是相似的，故前面讨论的多数药用载体也可用作化妆品用载体。这些组合物可含有化妆品中常用的其它组份，包括香料，雌激素，维生素A、C或E，α-羟基或α-酮酸如丙酮酸、乳酸或乙醇酸，羊毛脂，凡士林，芦荟，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，色素等。

用于治疗皮肤疾病或症状的组合物中PAIs的有效量随如皮肤条件、皮肤年龄、特定的PAI及所用PAIs的纯度、制剂的形式及所用载体组份、使用频率、被治疗个体的整体健康状况等因素而变化。任意特定病人使用的精确剂量由药学领域的技术人员综合考虑这些因素及本发明公开内容来决定。优选该组合物每天以至少两个剂量并不多于六个剂量使用，或者当使用缓释或延长释放剂型时使用较小的药量。

局部给药组合物通常含有占组合物总重量约0.0001％至约90％(重量比)的PAIs，PAIs占组合物总重量的比例优选约0.5％至约20％，并特别优选约2％至约5％。

局部用组合物通过向需要治疗的皮肤或粘膜区施用药膜或药帖给药。为了方便使用，将施用的物质涂在该区域上。涂敷用品不需要涂进皮肤，而药帖或药膜可在皮肤上放置过夜。

本发明提供了适于透皮给药的组合物，包括但不限于药用洗液、混悬液、油剂、霜剂、软膏剂、清洗液、凝胶及脂质体载体，它们悬浮于适当的载体中，其中混合有治疗有效量的PAIs。这样的组合物直接用于皮肤或掺混入保护载体如透皮用具(所谓的“膏药”)中。常见的适当的实例有霜剂、软膏剂等，例如，在Physician′s Desk Reference中的实例。适于经透皮吸收的用具例如在美国专利4818540(Chien等人)中所述。

本发明包括适于非肠道给药的PAIs组合物，包括但不限于药用无菌等渗溶液。这样的溶液包括但不限于适于PAIs静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射的生理盐水及磷酸生理盐水缓冲液。

本发明包括适于胃肠道给药的PAIs组合物，包括但不限于药用散剂、丸剂或可吸收的液体及适于直肠给药的栓剂。

本发明包括适于经支气管及经肺泡给药的PAIs组合物，包括但不限于多种类型的用于吸入的药用气雾剂。以气雾剂形式给药的药物的实例为戊双咪，它通过吸入给AIDS病人用药以防止卡氏肺囊虫引起的肺炎。

本发明进一步包括适于PAIs经支气管及经肺泡给药的装置。这样的装置包括但不限于喷雾器及汽化器。本发明也包括电或直接注射装置。电注射或离子电渗疗法，是使用小电流驱动带电元素、化合物及药物通过皮肤以达到将治疗化合物转运至局部组织或全身的目的而不损伤皮肤的方法。

本发明进一步包括适于储存移植前器官的溶液。适当的溶液描述于Chien等人的(1993)＂Hibernation Induction Trigger forOrgan Preservation＂in Medical Intelligence Uint，R.G.Landes Co.Austin，TX。例如，PAIs可用来替换通常使用的多种不纯的豆制剂(如Soycal)。

上述组合物旨在描述但不是限制本发明适于PAIs给药的组合物。制备这些多种组合物的方法是本领域技术人员的一般技能，将不在此赘述。

制备注射或局部涂敷的装置、喷雾器及汽化器的方法是本领域已知的，将不在此详细描述。

本发明进一步提供了治疗编程性细胞死亡的方法，它包括使用一定量的PAIs有效抑制编程性细胞死亡。可通过此方法治疗的各种与编程性细胞死亡有关的症状包括但不限于皮肤的老化作用、功能紊乱及疾病，免疫抑制，胃肠道功能紊乱，心肌功能紊乱，组织移植的排异反应及阿尔茨海默病。

现已发现，PAIs可局部用于皮肤来治疗多种皮肤病。这些疾病包括但不限于因年龄和/或光损伤、牛皮癣产生的皱纹或皮肤下垂。因而本发明包括了治疗皮肤病的方法。此外，头发毛囊的细胞发生编程性细胞死亡可引起秃顶。因此，PAIs可在皮肤病治疗中用于防止持续性脱发。

如上所述，这些疾病优选通过含有有效量的PAIs的组合物的局部应用加以治疗。PAI的有效量是能改善或消除皮肤病症状的量。优选的是，所述治疗能导致皮肤病的治愈或正常皮肤功能的恢复；但症状的任何改善或降低也包括于本发明中。

与免疫抑制有关的紊乱是由多种刺激物引起的，它们包括但不限于病毒包括但不仅限于HIV、化疗试剂及辐射。这些刺激物在多种紊乱中引起编程性细胞死亡，包括但不限于消化道组织及有关的胃肠道功能紊乱。

胃肠道功能紊乱包括但不限于肠壁损伤、严重的慢性溃疡、结肠炎、辐射引起的损伤、化疗引起的损伤及寄生虫引起的胃肠道功能紊乱以及由任何其它原因引起的腹泻。已知多种病毒及细菌感染导致胃肠道功能紊乱；PAIs也适于用来治疗与这些感染有关的副作用。PAIs特别适于用来改善与化疗有关的胃肠道功能紊乱。正如下面的实施例所示，用氨甲喋呤及多种PAIs处理的小鼠进食问题较少并未发现任何一个患有发现于对照组动物身上的腹泻。因此，PAIs不仅适用于防止与化疗有关的腹泻也可用于防止恶心。

PAIs特别适于治疗动物特别是牲口的多种胃肠道疾病。这样的疾病，特别是腹泻，是由流产引起的。胃肠道疾病的治疗优选通过胃肠道给药。对于牲口，有效量的PAIs可方便地与饲料混合。对于人，可通过胃肠道给药领域任何已知的方法给药。

此外，PAIs可给免疫缺陷的病人特别是HIV阳性病人使用，用来防止或至少减轻与疾病有关的T细胞编程性死亡，该编程性细胞死亡会导致如在全面发作的AIDS病人身上见到的免疫缺陷的恶化。对这种病人的PAIs给药优选方式是非肠道给药，但也可通过透皮或胃肠道给药。

PAIs也可用于治疗发生在多种疾病中的与再灌注损伤有关的编程性细胞死亡，这些疾病包括但不限于冠状动脉阻塞；大脑栓塞；脊柱/脑外伤及伴发的严重麻痹；由其它损害如冻伤造成的再灌注损伤；以及以前认为可通过超氧化物歧化酶(SOD)治疗的任何疾病。为了回顾氧自由基在心脏病中的作用，可参见Signal(1988)＂Oxygen Radicals in the Pathophysiology of Heart Disease＂Kluwer Academic Publishers，MA，USA.

心肌及脑栓塞一般是由栓、血栓或大面积坏死所产生的压力引起动脉或静脉供血的突然不足而引发；心脏、脑、脾、肾、肠、肺及睾丸容易被感染。组织周围发生编程性细胞死亡阻止血液对此区域的再灌注；因此如果在栓塞的起始阶段，在再灌注期间或刚刚结束时，使用PAIs是有效的。

因此，本发明包括治疗与再灌注有关的编程性细胞死亡的方法，包括给需此治疗的病人使用治疗有效量的至少一种PAI。

本发明进一步包括对高危性心脏病及梗塞病人通过给需此治疗的病人使用治疗有效量的至少一种PAI以降低与心肌及脑栓塞有关的编程性细胞死亡及再灌注损伤的方法。

优选通过本发明的组合物非肠道给药治疗再灌注损伤。但可使用任何其它适当的方法，例如，在心肌梗塞发生时直接进行心脏注射。这种注射的装置是本领域已知的，例如，Aboject心脏注射器。

本发明进一步提供了通过向培养或保存哺乳动物器官、组织及细胞领域的任何介质或溶液中加入有效量的PAIs来限制并防止培养或保存哺乳动物器官、组织及细胞期间细胞中编程性细胞死亡的方法。

本发明进一步包括培养或保存哺乳动物器官、组织及细胞领域中已知的介质及溶液，其中含有至少一种PAI，其治疗有效量足以有效地限制或防止培养物中细胞的编程性细胞死亡。

本发明的这些方面包括了含有至少一种治疗有效量的PAI的哺乳动物细胞培养基及此类培养基在限制或防止哺乳动物细胞培养时细胞编程性死亡方面的用途。现已发现，PAIs在细胞被温和地损伤(通常引起编程性细胞死亡)的环境下可限制或防止编程性细胞死亡。这样的外伤包括但不限于低水平的辐射，细胞存贮液冻融，温度、pH及渗透压或培养基中离子浓度快速改变，长时间与不适宜的温度、pH、渗透压或所述培养基的离子浓度相接触，接触细胞毒素，在制备原始细胞培养基过程中由完整的组织中分离细胞，缺乏血清(或在无血清培养基中生长)。

因而本发明包括含有组织培养介质及至少一种有效量的PAI的组合物。PAIs作为抗编程性细胞死亡培养基的补充物加入的无血清培养基，包括但不限于AIM V^培养基、Neuman and Tytell无血清培养基、Trowell T8培养基、Waymouth MB 752/1及705/1培养基以及williams培养基E。除无血清培养基外，PAIs可作为抗编程性细胞死亡培养基的补充物加入的适当的哺乳动物细胞培养基，包括但不限于Basal Eagle培养基、Fisher培养基、McCoy培养基、培养基199、RPMI培养基1630及1640、以F-10及F-12营养混合物为基础的培养基、Leibovitz L-15培养基、Glasgow极限必需培养基及Dulbecco改进的Eagle培养基。可进一步加入PAIs的哺乳动物细胞培养基进一步含有任何本领域已知的培养基补充物，包括但不限于糖、维生素、激素、金属蛋白、抗生素、抗真菌剂、生长因子、脂蛋白及血清。

本发明进一步包括在器官移植前保存哺乳动物器官的溶液，其中含有至少一种有效量的PAI；以及此溶液在限制或防止在移植前手术切除及处理过程中发生于此哺乳动物器官中编程性细胞死亡方面的应用。在所有的情况下，用于限制或防止编程性细胞死亡的PAIs的浓度可由本领域技术人员通过与实施例2、3及4相同的方法以及本领域已知的其它方法凭经验确定。

现在还发现，PAI提取段在高于某一浓度时可在溶液中形成胶粒。因而本发明包括含有胶粒的组合物。

下列实施例用来说明但不限制本发明。

实施例1

PAI的分离及纯化

将约100g市售大豆粉(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO.USA and Central Soya，Archer Daniel Midlands)悬浮于500ml70％丙酮中并在室温下搅拌30分钟。通过离心(1500g)10分钟回收脱脂大豆粉。将此物质悬浮于1l的50％乙醇中并于室温下搅拌30分钟。上清液，水保留液，通过离心(1500g)10分钟回收。

水保留液通过超滤浓缩并用10kD膜(Amicon Beverly MA.USA)渗滤除去乙醇。然后将此物质直接装载在10mM碳酸氢铵平衡的Sepharose S100HR(Pharmacia Biotechnology，Inc.Piscataway，NJ.，USA)上。A₂₈₀吸收峰的物质在空体积中洗脱、储存并冻干。将此冻干的高分子量物质在氯仿∶甲醇∶水(3∶8∶4)的单一相混合物中提取，方法是将单一相混合物加入到干燥的物质中，在室温下混合30分钟。然后将混合物离心除去不溶物。所述不溶物是保留有PAI活性的类脂/糖脂提取段。此提取段被称为L/G提取段。L/G提取段中的碳水化合物组合物由阿拉伯糖及半乳糖(3∶2)及少量的岩藻糖、鼠李糖、葡糖胺、葡糖及甘露糖组成。所述碳水化合物组合物如实施例5所述测定。

根据其在氯仿∶甲醇(80∶20)中的溶解度并在硅胶(SilicicAcid100目，Mallinckrodt Chemical，Inc.KY)柱上进行色谱，L/G提取段可被进一步分离。硅胶色谱溶于甲醇中得到活性提取段(SiMe)。

表1对不同纯化阶段大豆粉提取物的理化性质进行了详细的总结，其中ND表示“未检测”。

在表1中，测定了纯化四个阶段产品的活性及物理性质。这四个阶段是：水保留液；70％丙酮提取物；70％丙酮中颗粒沉淀的50％乙醇提取物；及由50％乙醇提取段通过筛析过滤色谱纯化的高分子量提取段。蛋白的产率表示为由每克起始物质(干重)中回收的蛋白量，由Bradford试验方法(BioRad Laboratories)测量。如实施例2所述抗编程性细胞死亡活性表示为的保留释放剂无血清培养基中50％细胞所需物质的累积浓度(μg/ml培养基)。胰蛋白酶抑制作用表示为样品中每μg蛋白中的相对单位。相对单位(U)定义为抑制活性的量，即在总体积1ml中2μg胰蛋白酶降低100μM底物水解的起始速率的50％。在260及280nm的吸收值表示在1ml细胞中每克起始物质。这表明存在的蛋白及核酸的相对浓度。260/280的比率用来计算存在核酸的量，如Dawson等人的Data for Biochemical Research，第3版(Oxford SciencePublications 1990出版)中所述。

表1

不同纯化阶段豆PAI提取物的物理性质

蛋白质浓度抗编程性胰蛋白酶抑 A280 A260 核酸

细胞死亡制作用

活性豆粉水提196mg/gm 抑制 0.561μ/μg 116/gm 134/gm 2.4％取物豆粉70％140μg/gm 抑制 ND 4.5/gm 7.2/gm 11％丙酮提取物豆粉70％310μg/gm 11μg/ml 117μ/μg 32/gm 36/μ ND丙酮中颗 gm粒沉淀的50％乙醇提取物(AcE)豆粉丙酮62μg/gm 0.14μg/ml 3.5μ/μg 10/gm 12/gm ND中颗粒沉淀的50％乙醇凝胶过滤沉淀池(FAcE)豆粉丙酮20μg/gm 45ng/ml ND 8.4/gm 9.1/gm ND颗粒沉淀50％乙醇凝胶过滤沉淀池中有机提取物(L/G)豆粉丙酮0.9μg/gm 12ng/ml ND 6.55/gm 7.7/gm ND颗粒沉淀50％乙醇凝胶过滤沉淀池中有机提取物的硅酸甲醇洗脱液(SiMe)

实施例2

C3H 10T_1/2细胞的编程性细胞死亡试验

为了测定PAIs的编程性细胞死亡活性，进行如下试验。所述细胞试验公开于PCTWO9425621中。简言之，将细胞系C3H 10T_1/2克隆8在融合时进行试验(图1)，在指数生长期当细胞周期位置随机分布时，在G₀期(图2及3)、非活动期(图4)无细胞抑制。在开始试验5天前植入每毫升2000个细胞(60毫米培养皿加5毫升)以保证指数生长期。在T＝0时，培养基转移至无血清培养基，这作为一种编程性细胞死亡的刺激物，并加入接种物提取物。对照组包括10^-7M12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)以保证细胞培养的反应。将通过乙醇提取和凝胶过滤制备的PAI样品以0.1g(干重)等份加入到无血清培养基中并在加入培养基前过滤除菌。试验一式三份或一式四份。血清缺乏和/或用豆粉来源的PAIs处理后22至28小时期间分析细胞的反应。在每个含有不同细胞计数的培养皿上分别进行两次试验。

1.将所有非粘着或粘着松散的细胞由培养皿中除去并用适当的方法计数，一般用电子颗粒计数仪。这些是编程性死亡的细胞，血清缺乏的释放细胞(SDR)，通过在无血清培养基中培养释放。约95％的这些释放细胞编程性死亡，如超结构分析及DNA裂解分析所示。

2.留下的粘着细胞(ADH)接触缓冲液(一般pH7.3)、平衡盐溶液如Hanks平衡盐溶液(其中不含钙和镁盐而含有0.05％胰蛋白酶及0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA))。每个培养基在室温及37℃在摇动平台上培养以保证胰蛋白酶均匀分布在培养基表面。标准时间(一般10分钟)过后，由每个培养皿中将释放细胞除去并通过上述相同的方法检测，一般用电子颗粒计数仪。此ADH细胞计数中含有耐胰蛋白酶及胰蛋白酶敏感细胞，如PCT WO9425621所述。

编程性细胞死亡细胞试验得到的结果列于图1、2、3及4，图1中分别显示了编程性死亡的细胞(SDR)及粘着细胞(ADH)的百分数。图1数据表明与血清缺乏的Basal培养基Eagle(BME)对照组相比，PAIs能有效降低融合细胞的编程性细胞死亡。

图2中，结果表示为用PAIs处理的样品中的粘着细胞的百分数，将其用无PAIs无血清对照样品中粘着细胞数量校准。换言之，用PAIs处理后从编程性细胞死亡中挽救的细胞的百分数。图2数据表明豆PAIs对指数生长期的C3H 10T_1/2细胞具有依赖于浓度的抗编程性细胞死亡的作用。

图3中，表示了用50％乙醇提取后PAIs(右侧)及用筛析凝胶过滤色谱进一步纯化的PAIs(左侧)的抗编程性细胞死亡活性。图3结果以与无PAIs无血清样品比较用PAIs处理从编程性细胞死亡中挽救的细胞(SDR细胞转化为ADH细胞)的百分率表示，其中均以胰蛋白酶抑制单位表示。图3数据表明当Bowman-Birk抑制剂的浓度(通过胰蛋白酶抑制作用检测)经筛析凝胶过滤色谱降低时，PAI的抗编程性细胞死亡活性保持不变。因此，PAI制剂的抗编程性细胞死亡活性与Bowman-Birk抑制因子无关。

图4中，表示了对用放线菌酮处理的静止期C3H 10T_1/2细胞不同豆PAIs浓度的抗编程性细胞死亡活性。静止期细胞不再对血清缺乏起反应。为激活编程性细胞死亡，通过向C3H 10T_1/2细胞中加入10μg/ml放线菌酮刺激这些细胞产生编程性细胞死亡。一般地讲，这些细胞在培养约1星期后融合，在约2星期后进入静止期。图4结果以处理后留下的生存细胞(ADH)表示。图4数据表明豆PAIs对静止期C3H 10T_1/2细胞具有较小但是显著的抗编程性细胞死亡作用。

实施例3

新生小鼠心肌细胞的编程性细胞死亡试验

按照Circulation Research 56：884-894，1985的描述由出生一天的小鼠的心脏制备心肌细胞。简言之，主要通过交替进行室温胰蛋白酶水解及机械解聚作用获得个体细胞。将细胞收集、洗涤并悬浮于MEM(5％小牛血清及50U/ml青霉素G)中。为降低非心肌细胞污染，将细胞预培养30分钟。将非粘着心肌细胞由培养皿中除去，用血细胞计数器计数并再悬浮于培养基中，使浓度达600000生存细胞/ml。将细胞悬液分布于不同的培养皿中并在37℃5％二氧化碳孵育箱中孵育16-24小时。产率为3-5×10⁶细胞/心脏，通过台盼蓝染色证明生存细胞＞90％。

培养的第一天，用极限Eagle培养基(MEM)将细胞清洗几次以除去碎屑及非粘着细胞。与前面相同，用血清补充培养基将其再充满。第二天用不同条件的RPMI1640培养基刺激心肌细胞。结果列于表2，其中PAI1×表示由0.1g豆粉起始物获得的物质。

表2

新生心肌细胞

心跳频率细胞数无血清 + 11606条件培养基 +++++ 5128PAI1× +++ 15062

所得结果表明PAI提取段在可引起编程性细胞死亡的损伤出现时有能力使细胞保存完好。

实施例4

PAI组合物中碳水化合物的测定

为了测定PAIs中是否含有碳水化合物，将PAIs的L/G提取段接触不同的条件并检测所得的碳水化合物残基。PAIs得自Simga豆粉(批号103H0820)，如实施例1所述处理得到PAIs。按照Dionex Document No.034441中描述的方法在未处理的PAIs中三种游离的单糖通过HPLC在Dionex Carbopac^TM PA1上用16mM氢氧化钠测得。所得结果列于表3。然后将样品用2N TFA(三氟乙酸)在100℃水解4小时，如Hardy and Towmsend(1994)Meth.Enzymol.230：208-225所述。所得结果列于表4。将样品用6N盐酸在100℃进一步水解6小时，通过如Hardy and Towmsend(1994)描述的方法检测。所得结果描述于图5。

表3

PAI中检测到的单糖单糖 ng/25μg PAI ng/mg PAI阿拉伯糖 1.098 45-9葡糖 0.058 2-36总计 1.157 48.26

表4

水解释放的单糖单糖 ng/50μg PAI μg/mg PAI岩藻糖 1625 32.50阿拉伯糖 4605 92.10半乳糖胺 86 1.71葡糖胺 478 9.56半乳糖 5280 105.60葡萄糖 352 7.04木糖 520 10.40总计 12946 258.91

实施例5

用PAIs防止化疗引起的胃肠功能紊乱

为了检测PAIs的体内活性，进行如下动物试验。在实施例6及7中动物试验基本按照Funk and Baker(1991)J.Nutr.121：1684-1692；及Funk and Baker(1991)J.Nutr.121：1673-1683进行。简言之，雄性Sprague-Dawley小鼠用来确定由豆粉中按照实施例1描述获得的分离的AcE及L/G是否能减轻氨甲喋呤(MTX)的毒性。将小鼠分别装于金属丝底的不锈钢笼中，在注射MTX前7天，让它们分别适应食物，在注射后7天内保持同样的食物。饲料为半纯化的小鼠饲料，并添加如下成分：1.酪蛋白2.酪蛋白及豆浓缩物(10g及10)3.酪蛋白及豆粉(10g及10g)4.酪蛋白及AcE5.酪蛋白及L/G

使用由原料豆中提取的相同浓度的AcE及L/G。

在注射前期记录小鼠体重及进食情况。给小鼠腹膜内注射20mg/kg MTX。在注射后7天内，记录小鼠体重、进食及腹泻发病率。用非参数Kruskal-Wallis检验及post-hoc比较分析小鼠的体重及进食数据。通过用比较的数量(10)除以0.05调整P值来进行多重比较。因为在各组间的变量不均一并因而假定变量分析不一致，故使用非参数检验。MTX注射后的进食情况以占每只动物注射前3天的平均进食的百分率表示。因此，每只动物都作为自身对照。只对MTX注射后第3、4、5及6天进行统计学分析。其原因是第3及4天是毒性最严重的时候，而第5及6天开始恢复。腹泻数据用Fisher标准检验及对数分析进行分析。

结果表明豆浓缩物及豆粉起始物以及AcE和L/G能够改善MTX注射后的进食状况(表5及图7)。在统计学方面讲，在第3天小鼠食入豆粉及豆浓缩物比单独食入酪蛋白或含有L/G的酪蛋白更多。第3天进食含AcE酪蛋白的小鼠占一半，除进食豆粉的以外，从统计学上讲，所有各组均相近似。第4天显示的情况相同，只是小鼠对L/G的进食比第3天稍有增加，虽然进食量仍很低，但这些小鼠与食用豆浓缩物的小鼠不再有统计学上的差异。第5及6天明显恢复，所有组中的进食量在统计学上相似。体重变化(表6)反映了所观察到的进食情况，这与预期的相同。食用豆浓缩物及豆粉的小鼠在MTX注射后的头4天内体重有所增加。单独食用AcE、L/G或酪蛋白的小鼠体重增加很少，统计学上讲，食用酪蛋白的小鼠比食用豆浓缩物或豆粉的体重增加较少。腹泻发病率的差异不具统计学意义，但腹泻的情况与进食及体重变化相一致(表6)。食用豆浓缩物或豆粉的小鼠无腹泻而食用AcE(10％)的小鼠中只出现少量的腹泻，食用L/G或单独食用酪蛋白(30-40％)的小鼠出现中量的腹泻。

总之，此试验表明在被试成分中豆浓缩物及豆粉能提供最好保护。含AcE的酪蛋白为中等并在维持进食及体重以及降低腹泻发病率方面明显地优于单独食用酪蛋白或L/G。此结果表明由豆中分离的化合物可对TMX毒性提供保护。在此试验中，L/G提取段在此浓度似乎无保护作用。但实施例7表明增高L/G浓度则是有效的。

表5

食物及氨甲喋呤对进食的影响¹

处理后进食(％)³食物处理前进食²第3天第4天第5天第6天

(g/天)酪蛋白 18.4±0.6 34.1±11.0^a 39.6±13.0^a 83.0±12.5 108.9±2.7豆浓缩物 18.4±0.5 94.3±6.5^bc 94.8±5.1^bc 98.9±2.5 101.8±3.3-酪蛋白(50/50)豆粉-酪 17.8±0.4 99.0±4.6^c 99.1±2.0^c 98.2±2.3 102.1±3.5蛋白(50/50)酪蛋白- 18.5±0.4 63.6±9.3^ab 68.3±10.3^ab 88.6±6.9 99.5±4.0AcE酪蛋白- 19.0±0.8 46.3±11.7^a 53.9±14.2^ab 75.3±13.1 96.4±11.0L/G1.数值为平均值±10只雄性小鼠的平均值的标准误。在适应7天后腹膜内注射氨甲喋呤。各列中带不同上标的数值间有差异(P≤0.05，Kruskal-Wallis检验及post hoc比较)。2.处理前进食表示MTX给药前3天的时间内的平均值。3.处理后进食表示占处理前进食的％。

表6

食物及氨甲喋呤对小鼠重量的影响¹

体重变化食物处理前平均体重² 第0-4天第4-6天腹泻发病

(g) (g) (g) 率

(％)酪蛋白 230.0±4.7 1.2±5.3^a 16.3±1.5 30豆浓缩物 227.2±4.7 22.1±1.5^b 9.7±1.6 0-酪蛋白(50/50)豆粉-酪 227.2±4.4 22.7±1.6^b 10.1±1.0 0蛋白(50/50)酪蛋白- 230.3±3.2 11.7±4.1^ab 13.5±2.1 10AcE酪蛋白- 232.9±5.1 6.9±5.6^ab 9.8±4.5 40L/G1.数值为平均值±10只雄性小鼠的平均值的标准误。在适应7天后腹膜内注射氨甲喋呤。各列中带不同上标的数值间有差异(P≤0.05，Kruskal-Wallis检验及post hoc比较)。2.处理前体重表示注射当天的平均体重。

实施例6

使用PAIs防止化疗引起的胃肠道紊乱

雄性Sprague-Dawley小鼠用来测定各浓度梯度的分离的豆提取段(AcE、L/G及MAcE)是否能减轻氨甲喋呤(MTX)的毒性。动物分别装在金属丝底的不锈钢笼中。在MTX注射前让小鼠在7天内各自适应食物，在注射后7天内保持同样的饮食。饲料为半纯化的及加入如下成分的酪蛋白：1.无添加物2.AcE(100mg/20g酪蛋白；1×)3.AcE(300mg/20g酪蛋白；3×)4.AcE(1000mg/20g酪蛋白；10×)5.L/G(10mg/20g酪蛋白；1×)6.L/G(30mg/20g酪蛋白；3×)7.L/G(100mg/20g酪蛋白；10×)8.MAcE(100mg/20g酪蛋白；1×)9.MAcE(300mg/20g酪蛋白；3×)10.MAcE(1000mg/20g酪蛋白；10×)11.MAcE(3000mg/20g酪蛋白；30×)

注意MAcE是豆糖蜜的提取物如同豆粉提取的AcE。除了食用无添加化合物的酪蛋白组有10只小鼠外，每个饮食组由8只小鼠组成。在注射前期记录小鼠体重及进食情况。给小鼠腹膜内注射20mg/kg MTX。在注射后7天内，记录小鼠体重、进食及腹泻发病率。不同组的进食情况如图8-10所示。腹泻的发病率描述于图11。整个组的小鼠进食情况描述于图12。由ANOVA用治疗析因设计对化合物及剂量的主要作用以及化合物及剂量间的可能的关系进行试验，分析小鼠的体重及进食数据。只对使用每个化合物的1×、3×及10×剂量的治疗组进行析因分析。此外，用t试验检测每个化合物的10×浓度之间以及只含有酪蛋白的饲料之间的差异。MTX注射后的进食情况以占每只动物注射前3天的平均进食的百分率表示。因此，每只动物都作为自身对照。只对MTX注射后第3、4、5及6天进行统计学分析。其原因是第3及4天是毒性最严重的时候，而第5及6天开始恢复。腹泻数据用Fisher标准检验及对数分析进行分析。只对每个化合物的10×浓度与酪蛋白比较进行腹泻发病率差异的统计学分析。图12。此原因是Fisher检验是一种保守的检验方法。当进行多重比较时，误差的频率必需调整。为了增加统计学显著性的机率，只对每个化合物最好的反应(可由进食及体重变化数据得出)进行这些比较。

进食及体重变化的析因分析结果见表7及8。结果表明AcE化合物能最有效地减轻MTX毒性。合并的所有AcE组比两个其它组在MTX给药第3天进食量大并且在第4天比食用MAcE的还大(P＜0.05)。食用AcE的小鼠与食用MAcE的小鼠相比，低毒性也反映在体重上，因为在给药后头4天内食用AcE的比食用MAcE的增加更多的体重(P＜0.05)。虽然这并不具有统计学上的显著性，但进食的改善及体重的保持在每个化合物的浓度增加时可以见到，而30X浓度的MAcE是个例外。每个化合物最好的反应浓度是10×。将每个化合物的10×浓度与单独使用的酪蛋白比较，在统计学方面讲，AcE的作用在给药后第3、4及5天更大(P＜0.05)。腹泻的情况与进食的结果一致。50％食用酪蛋白的小鼠发生腹泻。食用10×浓度所述化合物的动物不发生腹泻，在统计学方面讲，这比只食用酪蛋白的少(P＝0.088)。所有其它组表现出有某种程度的腹泻，而食用3×浓度的AcE是个例外。

总之，对于试验化合物，AcE在减轻MTX毒性方面最好。L/G及MAcE对MTX毒性也有正面的影响，与只食用酪蛋白相比在降低腹泻发病率方面是显而易见的，而在进食量及维持体重方面没有统计学意义上的显著性的改善。更高浓度的AcE及L/G可能提供更多的保护。MAcE的30×浓度无作用并与单一酪蛋白非常相近。因此，显然阈值一旦达到较高的浓度是不利的。在本试验中，剂量在10×至30×浓度之间的被试验MAcE可能更有效。

表7

食物及氨甲喋呤对进食的影响¹

处理后进食(％)食物 n 处理前进食第3天^2、3 第4天^3、4 第5天³ 第6天

(g/天)1 10 18.5±0.5 39.5±11.5 33.5±11.7 58.9±12.4 96.3±5.92 8 19.7±0.6 57.6±12.8 52.7±16.6 71.5±11.2 93.0±4.83 8 16.2±0.4 61.4±7.0 71.3±11.3 92.6±6.0 105.6±4.74 8 16.7±0.4 78.2±9.2 76.7±11.0 90.3±6.7 97.8±4.35 8 17.9±0.4 40.0±8.4 45.9±11.4 80.3±11.4 105.7±3.66 8 18.3±0.7 46.0±9.8 50.7±12.8 79.6±12.0 105.2±5.37 8 17.3±0.6 60.8±9.9 61.9±12.8 79.2±11.8 103.3±3.98 8 18.5±0.7 40.8±10.2 34.5±9.4 59.1±9.8 100.2±4.89 8 17.2±0.5 38.0±8.4 45.4±10.6 82.2±11.7 100.4±6.410 8 16.9±0.4 50.4±5.8 52.2±9.4 70.4±13.9 89.3±12.011 8 16.4±0.4 30.0±6.0 33.9±9.8 58.1±9.1 110.4±4.0注：1.数值为平均值±雄性小鼠平均值的标准误差。在适应7天后腹膜内注射氨甲喋呤。处理前进食表示MTX给药前3天的时间内的平均值。处理后进食表示占处理前进食的％。2.酪蛋白-AcE组(2-4)比酪蛋白-L/G组(5-6)及酪蛋白-MAcE组(8/11)维持更好的处理后进食(P＜0.05，ANOVA及Student Newmans-Keuls检验之后进行析因分析)。3.酪蛋白-AcE(10×)组(3)的动物比酪蛋白组处理后的进食更好(P＜0.05，t一试验)。4.酪蛋白-AcE组比酪蛋白-MAcE组维持更好的处理后进食(P＜0.05，ANOVA及student Newmans-Keuls检验之后进行析因分析)。

表8

食物及氨甲喋呤对小鼠重量及腹泻的影响1

体重变化食物 n 处理前平均体重第0-4天² 第4-6天腹泻的发病率

(g) (g) (g) (％)1 10 220.2±5.5 -2.1±1.8 13.2±1.8 502 8 233.5±4.2 8.3±5.6 11.1±0.7 253 8 224.7±3.6 9.0±3.0 10.8±2.0 04 8 227.3±3.8 12.4±5.4 10.6±1.5 05 8 232.6±2.7 2.5±3.6 14.3±1.9 12.56 8 225.5±3.3 3.8±3.9 12.2±1.8 12.57 8 232.6±4.5 6.3±5.0 11.3±1.2 08 8 234.1±6.3 0.0±2.3 13.5±2.4 12.59 8 226.1±3.2 1.5±4.9 11.6±1.7 2510 8 235.2±2.3 3.1±3.2 7.9±3.8 011 8 220.6±2.8 -2.3±3.4 140.0±1.2 25注：1.数值为平均值±雄性小鼠平均值的标准误差。在适应7天后腹膜内注射氨甲喋呤。处理前体重表示注射当天的平均体重。2.酪蛋白-AcE组(2-4)比酪蛋白-MAcE组(8/11)在急性毒性期维持整体体重更好(P＜0.05，ANOVA及Student Newmans-Keuls检验之后进行析因分析)。酪蛋白-AcE(10×)组(4)的动物比酪蛋白组的体重减轻显著地少(P＜0.05，t一试验)。3.食用10×浓度化合物的动物组(4、7、10)比酪蛋白动物组的腹泻发生率显著低(P＜0.088，腹泻的Fisher标准检验)。

实施例7使用PAIs抑制从HIV感染病人获得的淋巴细胞的编程性细胞死亡

试验从豆粉中分离的PAIs的L/G提取段抑制从HIV感染病人获得的淋巴细胞编程性细胞死亡的能力。

从病人那里获得外周血单核细胞(PBMCs)并按照标准方法进行分离。在37℃5％二氧化碳中，PBMCs于2×10⁶/孔的24孔板中(Costar-Cambridge，MA)培养72小时，板中含有含抗生素和10％对羟基偶氮苯的RPMI 16402ml/孔。某些培养基含有10μg/mlPokeweed Mitogen(PWM)(Sigma，St.Louis，MO)。将胸腺细胞悬液吸出或在含5μM地塞米松(DEX)(Sigma-St.Louis，MO)的RPMI+10％小牛血清中培养18小时后立即使用。细胞接触如下浓度的L/G提取段3天，其中0.5gEQ来自重0.5g的起始粉末。电泳带# PWM L/G1 - 无2 - 纯化L/G-0.5gEQ/ml3 - 纯化L/G-0.05gEQ/ml4 - 纯化L/G-0.005gEQ/ml5 + 无6 + 纯化L/G-0.5gEQ/ml7 + 纯化L/G-0.05gEQ/ml8 + 纯化L/G-0.005gEQ/ml9 - 未处理小鼠胸腺细胞(阴性

对照)10 - 地塞米松处理的小鼠胸腺细

胞(阳性对照)11 - 123bpDNA标准

提取DNA并进行凝胶电泳(如Sambrook等人MolecularCloning-Laboratory Manuals，2nd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，NY pp.134-135，E3-E4及E10-11所述)。简言之，通过离心将获得的细胞沉淀并在60℃用400μl的50mM氯化钾、10mM Tris-HCl(pH8)、1％NP-40、1％土温-20及0.5mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)中裂解1小时。用苯酚-氯仿提取后，用乙醇回收，将DNA在1.5％琼脂糖凝胶(SeaKem，Rockland，ME)上在90mM Tris-硼酸盐、2.5mM EDTA(pH8.3)中在30至50V电泳约4小时。123碱基对序列梯(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)用作DNA标准(DS)标记物。凝胶用1μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(Molecular Probes，Eugene，OR)染色并在蒸馏水中脱色。

图13结果表明其电泳带如上所述。

所得结果表明在无PWM刺激时(电泳带1)观察到显著的DNA裂解，在含有0.5gEQ的L/G(电泳带2)培养基中此裂解几乎完全被抑制。低浓度L/G(0.05gEQ及0.005gEQ)在不存在PWM(电泳带3及4)或存在PWM(电泳带7及8)时并不抑制DNA裂解。在存在PWM时(电泳带5)与无PWM(电泳带1)相比DNA裂解增加。在PWM存在时观察到0.5gEQ L/G的存在(电泳带6)与电泳带5相比对DNA裂解有轻度抑制。阴性对照及阳性对照(电泳带10及11)结果正常。

实施例8

PAIs的进一步纯化及定性

样品先通过提取纯化(如实施例1所述)，然后进行硅胶、二醇及HPLC硅胶色谱并分析产品的化学组成、分子量及结构。由硅胶HPLC观察到流出液及五个主要的峰。

通过NMR质谱及碳13核磁分析确定流出液含有溶血磷脂酸。脂肪酸分析表明C16：0和C18：2(十六烷酸和9，12-十八碳二烯酸)混合物的比率为60∶40至50∶50，这取决于豆起始物。

通过质谱NMR及在TLC分析中具有可信标准的共迁移，将峰2确定为磷脂酰肌醇。此外，脂肪酸分析表明在两个可能的位置上的C16：0及C18：2(十六烷酸和9，12-十八碳二烯酸)有相似的比率60∶40(这是主要的并是典型的豆磷脂酰肌醇)至50∶50，这取决于样品峰的位置，即前沿或拖尾。

峰3含有四个可确定的脂肪酸C16：0、C18：0、C18：1及C18：2的多种变体，即十六烷酸、十八烷酸、顺-9-十八烯酸及9，12-十八碳二烯酸，比率为40∶5∶10∶45，最活动峰含有的比率为45∶5∶5∶45。此外，此峰含有一种未知的脂肪酸成分，在洗脱时间为16.2至16.3分钟流出，比16：0(在10.8分钟)及18：0、18：1和18：2(在13.2至14.1分钟间)晚。此未知的组份占存在的脂肪酸总量的50％至68％。用质谱分析，确定了溶血磷脂酰肌醇，其中含有16：0及18：2脂肪酸变体。此峰还含有在R1及R2位置上有16：0及18：2脂肪酸的磷脂酰肌醇。还发现了分子量为861、864及939-940的三个未知物。

峰3被定为“D”，早在豆粉提取物中就已发现。峰4定为“B”，无抗编程性细胞死亡活性。

峰5定为“L”，最早发现于植物凝集素中得到的物质。峰5含有两个可鉴定的脂肪酸C16：0、C18：0变体，即十六烷酸及十八烷酸，比率为75∶25。此外，此峰含有一个未知的脂肪酸组份，在洗脱时间19至22分钟流出。未知组份占存在的脂肪酸总量的66％。用质谱确定在16：0及18：0脂肪酸变体中磷脂酰肌醇。还观察到分子量为113及191的两个未知物。

以脂肪酸甲酯的形式对脂肪酸进行分析。酯基转移作用试剂是无水HCl/MeOH，如Christie＂HPLC and Lipids＂(1987)所述制备，并按照Christie＂Gas Chromatograph and Lipids：a practicalguide＂(1989)所述进行分析，这两本书由OilyPress Ltd.Dundee Scotland出版。向每个样品中加入300μl二氯甲烷及700μl HCl/MeOH。在氮气氛中室温下进行18小时的衍生作用。此后，加入1ml水并用3×2ml己烷提取样品。合并的提取液在氮气气流下干燥，再溶解于100μl己烷中并转移至GC-MS装样小瓶中。如van den Berg等人(1993)J.Lipid Res.34：2005-2012所述，用装有Hewlett-Packard 5971系列质量选择检测器的Hewlett-Packard5890气相色谱分析样品。

在VG BloQ三重四极质谱仪上以负态电子喷射离子化方法进行电喷射质谱法(MS)。起源温度为80℃，溶剂是甲醇或含0.05％乙酸铵的甲醇，速度为5μl/分钟，毛细管电压为4.7kV。质谱方法一般描述于“Christie′s Gas Chromatography and Lipids”(1989)。

实施例9

已知磷脂的抗编程性细胞死亡活性

按照实施例2所述方法，对血清缺乏的10T_1/2细胞进行已知磷脂化合物的抗编程性细胞死亡活性试验。室温下将所有购买的样品以10mM浓度(100×试验浓度)溶于1％小牛血清白蛋白(BSA)、0.5mM氯化钙、0.5mM氯化镁中。在1％BSA中预孵育后对所有化合物进行试验。在编程性细胞死亡试验中BSA的最终浓度≤0.01％。用BSA或提取段“B”(主要是PI)预孵育，提高了LPA的抗编程性细胞死亡活性(图14)。所有被试验化合物得自Sigma。BSA得自Boehringer Mannheim。所得结果列于表9和图15中。

表9化合物活性L-α-溶血磷脂酸，油^** ++酰基(C18：1，〔顺〕-9)L-α-溶血磷脂酰基- ++L-丝氨酸L-α-溶血磷脂酰基胆 --碱，VI型L-α-溶血磷脂酰肌醇^** --L-α-溶血磷脂酰基乙 0醇胺，IV型L-α-磷脂酸，二油酰 0基(C18：1，〔顺〕-9)L-α-磷脂酰基-L- 0丝氨酸，得自小牛脑L-α-磷脂酰胆碱V- 0EA型L-α-磷脂酰肌醇^** 0L-α-磷脂酰基乙醇 0胺，IV型注：++抗编程性细胞死亡活性0无活性--编程性细胞死亡或坏死作用^**存在于活性提取段中通过质谱鉴定的化合物

尽管为了便于清楚理解的目的以图示及实施例的形式在某种程度上详尽描述了上述发明，但本领域技术人员显而易见的是进行某种改变或修饰是可行的。因此，说明书及实施例不能解释为对本发明范围的限制，而本发明范围如后面的权利要求书所述。

Claims

1.制备含有抗编程性细胞死亡活性因子的组合物的方法，其中所述方法包括步骤：

a)用脱脂试剂将植物粉末脱脂；

b)将粉末与脱脂试剂分离；

c)用水溶液提取所述脱脂的粉末；

d)将水溶液与脱脂粉末分离以得到水保留液。

2.权利要求1的方法，其中植物粉末是通过用选自由丙酮、四氯化碳、乙醚、己烷及氯仿组成的有机溶剂提取进行脱脂。

3.权利要求1的方法，其中植物粉末得自植物的任意部分。

4.权利要求3的方法，其中植物部分是储存器官。

5.权利要求4的方法，其中储存器官选自块茎、种子及球茎。

6.权利要求1的方法，其中植物粉末得自豆科、茄科及葱科的植物。

7.权利要求6的方法，其中植物粉末得自豌豆或黄豆种子。

8.权利要求6的方法，其中植物粉末得自马铃薯块茎。

9.权利要求1的方法，其中所述水溶液含有一种或多种与水混溶的有机溶剂，其浓度最高达溶液的80％。

10.权利要求1的方法，其中所述水溶液是缓冲盐水溶液。

11.权利要求10的方法，其中所述水溶液是磷酸盐水缓冲液。

12.权利要求9的方法，其中所述与水混溶的有机溶剂选自乙腈、低级链烷醇(特别是C₁-C₄链烷醇)、低级链烷二醇、C₂-C₄链烷二醇及低级二醇的聚合物。

13.权利要求12的方法，其中所述与水混溶的有机溶剂是乙醇。

14.权利要求13的方法，其中乙醇的浓度是50％。

15.权利要求9的方法，其中进一步包括除去残留的与水混溶的有机溶剂的步骤。

16.权利要求15的方法，其中除去残留的与水混溶的有机溶剂步骤是通过透析、超滤或冻干的方法。

17.权利要求1的方法，其中进一步包括沉淀除去水保留液中杂质的步骤。

18.权利要求1的方法，其中进一步包括通过对水溶液进行筛析凝胶过滤色谱将水溶液中的组合物与其它组份分离的步骤。

19.权利要求18的方法，其中所用色谱试剂选自Sepharose及BioGel。

20.权利要求19的方法，其中所用色谱试剂是SepharoseS100HR。

21.权利要求18的方法，其中使用色谱缓冲液并且它选自含有0.1至0.3M碳酸氢铵或0.1至0.3M氯化钠及10至50mM pH中性磷酸盐的一组缓冲液。

22.权利要求21的方法，其中色谱缓冲液含有0.1M碳酸氢铵。

23.权利要求18的方法，其中提取段得自凝胶过滤色谱且收集并储存在280nm有最强吸收的部分。

24.权利要求18的方法，其中提取段得自凝胶过滤色谱且收集并储存分子量大于80kD的部分。

25.权利要求24的方法，其中提取段得自凝胶过滤色谱且将含有所述组合物的部分通过透析及冻干纯化并浓缩。

26.权利要求25的方法，其中进一步包括用有机溶剂和水的单相混合物提取水保留液的步骤，以得到含有所述组合物的水相及有机相。

27.权利要求26的方法，其中进一步包括将水保留液冻干的步骤。

28.权利要求27的方法，其中进一步包括步骤：

a)用有机溶剂和水的单相混合物提取冻干的物质；及

b)通过分离提取混合物中的不溶物质将含糖脂及磷脂的部分分离。

29.权利要求28的方法，其中有机溶剂和水的单相混合物含有氯仿、甲醇和水。

30.权利要求29的方法，其中氯仿、甲醇及水的比率是4∶8∶3。

31.权利要求28的方法，其中分离步骤b)通过过滤或离心的方法完成。

32.权利要求30的方法，其中进一步包括通过用氯仿∶甲醇混合物进行硅胶色谱分离的步骤。

33.权利要求32的方法，其中进一步包括在二醇柱上进行分离的步骤。

34.权利要求33的方法，其中进一步包括在硅胶柱上进行HPLC分离得到流出液及五个提取段的步骤。

35.一种组合物，其中含有按照权利要求34方法得到的流出液。

36.一种组合物，其中含有按照权利要求34方法得到的流出液及提取段2。

37.一种组合物，其中含有通过权利要求34的方法得到的提取段3。

38.一种组合物，其中含有通过权利要求34的方法得到的流出液和提取段4。

39.一种组合物，其中含有通过权利要求34方法得到的提取段5。

40.制备具有抗编程性细胞死亡活性的组合物的方法，其中包括步骤：

a)制备干燥豌豆的粉末；

b)用含有70％丙酮的有机相将粉末脱脂，其中有机相的体积与粉末的重量约相等。

c)将丙酮从脱脂粉末中分离；

d)用含乙醇及水的水相提取脱脂粉末，其中水相的体积与脱脂粉末的重量约相等；

e)将水相从提取的植物粉末中分离出，得到水保留液；

f)通过过滤由水保留液中除去乙醇；及

g)冻干步骤f)的产品。

41.权利要求40的方法，其中进一步包括下列步骤，即用比率为4∶8∶3的氯仿、甲醇及水的单相混合物提取步骤g)的冻干产品；并分离含类脂/糖脂/磷脂的提取段，通过离心分离由提取混合物中分离出不溶的物质。

42.一种按照权利要求1的方法制备的组合物。

43.一种按照权利要求15的方法制备的组合物。

44.一种按照权利要求17的方法制备的组合物。

45.一种按照权利要求18的方法制备的组合物。

46.一种按照权利要求32的方法制备的组合物。

47.一种按照权利要求33的方法制备的组合物。

48.一种含有编程性细胞死亡抑制剂的组合物，该抑制剂得自植物或植物产品，它在室温溶于50％乙醇/50％水溶液并基本不溶于70％丙酮/30％水溶液。

49.一种含有编程性细胞死亡抑制剂的组合物，该抑制剂得自植物或植物产品，它在室温溶于60％硫酸铵水溶液，并溶于50mM氯化镁水溶液。

50.权利要求49的组合物，它在2.5至11的pH范围内是稳定的。

51.一种治疗编程性细胞死亡的方法，其中包括给需要这种治疗的患者使用含有权利要求1的组合物的治疗有效量的药用组合物。

52.权利要求51的方法，其中所述患者患有胃肠道功能紊乱。

53.权利要求52的方法，其中引起所述胃肠道功能紊乱的刺激物包括人免疫缺陷病毒、化疗试剂及辐射。

54.权利要求52的方法，其中治疗降低了与免疫缺陷病毒、化疗试剂或辐射有关的免疫缺陷。

55.权利要求54的方法，其中所述的病毒是人免疫缺陷病毒。

56.权利要求55的方法，其中所述的治疗消除了与人免疫缺陷病毒有关的T细胞编程性细胞死亡。

57.权利要求51的方法，其中所述患者患有与再灌注有关的编程性细胞死亡。

58.权利要求57的方法，其中再灌注与冠状动脉阻塞；大脑栓塞；脊柱/脑损伤及伴发的严重瘫痪；冻伤及以前认为可用超氧化物歧化酶治疗的任何疾病有关。

59.权利要求58的方法，其中治疗是针对以前认为可用超氧化物歧化酶治疗的任何疾病。

60.一种含有组织培养基及有效量的至少一种PAI的组合物。

61.权利要求60的组合物，其中组织培养基选自Basal Eagle培养基、Fisher培养基、McCoy培养基、培养基199、RPMI培养基1630及1640、以F-10及F-12营养混合物为基础的培养基、LeibovitzL-15培养基、Glasgow极限必需培养基及Dulbecco改进的Eagle培养基。

62.权利要求60的组合物，其中组织培养基不含血清。

63.权利要求62的组合物，其中无血清组织培养基选自AIMV^培养基、Neuman and Tytell无血清培养基、Trowell T8培养基、Waymouth MB 752/1及705/1培养基以及williams培养基E。

64.在培养细胞中防止编程性细胞死亡的方法，其中包括用权利要求60的组合物处理细胞。

65.权利要求64的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

66.权利要求65的方法，其中所述细胞是人细胞。

67.权利要求64的方法，其中所述细胞是组织的一部分。

68.权利要求64的方法，其中细胞是器官的一部分。

69.一种为随后的移植提高器官保存期的方法，其中包括向保存器官的溶液中加入有效量的至少一种PAI。