CN114081899A - 一种富白细胞富血小板血浆的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血液制品技术领域，公开了一种富白细胞富血小板血浆(L‑PRP)的制备方法，包括采血和制备L‑PRP；还公开了L‑PRP在创面治疗的应用。本发明制备的L‑PRP的血小板含量约为全血的4倍，且富含白细胞及白介素6(IL‑6)，并发现L‑PRP能通过上调IL‑6转录水平并激活信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)促进角质形成细胞迁移加速创面再上皮化；本发明制备的L‑PRP及对其的研究细化了富血小板血浆(PRP)的分类和应用场景，并发现了L‑PRP促创面愈合的新机制，为临床解决难愈创面提供了新的解决方案，具有重要的临床实践意义。

Description

一种富白细胞富血小板血浆的制备方法

技术领域

本发明涉及血液制品技术领域，具体涉及一种富白细胞富血小板血浆的制备方法。

背景技术

难愈创面是指由于血管新生不足、失神经支配、细胞迁移障碍等致生理性愈合延迟或中断的现象，一般定义为愈合时间超过3个月的创面。许多疾病会影响创面愈合，随着全世界老年化、吸烟、肥胖、糖尿病等问题越发严峻，难愈创面的发病率逐渐升高。这不仅会造成患者疼痛、感染，甚至是失能、截肢，以及心理问题，还会给社会带来巨大的经济负担。因此目前如何促进创面愈合，成为临床医生亟待解决的重要命题。

伤口上皮化恢复完整的皮肤屏障是伤口愈合完成的基本特征，也称为再上皮化。角质形成细胞的定向迁移对于伤口上皮形成非常关键，并且该功能的缺陷与慢性难愈创面息息相关。伤口的再上皮化的完成，是角质形成细胞迁移、增殖和分化的结果，这一过程起始于细胞-细胞和细胞-基质之间接触解除；接下来，基底层角质形成细胞开始极化，并且在伤口基质上起始迁移，而紧邻创缘角质形成细胞开始分裂增殖；最后，新形成的表皮分化成多层结构以恢复表皮的功能。在再上皮化过程中，最大的限制步骤是角质形成细胞的迁移。角化不全和角化过度是慢性创面角质形成细胞的特征，而角质形成细胞迁移功能缺陷与慢性难愈伤口相关性最大，因此调控伤口愈合再上皮化过程中的角质形成细胞迁移是促进慢性创面愈合的关键因素。

研究显示IL-6/STAT3通路在促进创面再上皮化和皮肤屏障的恢复中是非常关键的，IL-6缺陷的小鼠伤口再上皮化显著延迟，向角质形成细胞中导入IL-6基因，可促进角质形成细胞增殖。IL-6是STAT3信号转导通路典型的上游配体，在体外用重组IL-6处理角质形成细胞后，STAT3磷酸化及核转位在刺激后30分钟内即发生，细胞核内磷酸化信号传导与转录激活因子3(pSTAT3)含量随时间延长而增加(30min至6h)。IL-6可激活皮肤成纤维细胞中STAT3，促使其分泌可溶性因子，进而介导角质形成细胞迁移。IL-6介导pSTAT3信号传导驱动年轻小鼠急性创面的角质上皮Skint(selection and upkeep of intraepithelial T-cells)基因转录，激活树突状表皮T细胞(dendritic epidermal T cells,DETCs)促进创面愈合，而在年老小鼠延迟愈合的创面发现该信号通路的减弱。Skint表达直接受STAT3信号传导的影响，敲除表皮Stat3基因对创周DETCs的数量和激活，进而影响创面延迟愈合，Stat3是角质形成细胞迁移信号转导中其关键作用，而非其增殖，并且Stat3对于皮肤重塑是必需的，包括毛发周期和伤口愈合。此外，IL-6在体外可明显促进角膜上皮细胞迁移，在处理6h后，即可检测到pSTAT3含量显著增加。因此，IL-6/STAT3通路对于角质形成细胞迁移非常重要，激活该通路可有效促进再上皮化，加速创面愈合。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种富白细胞富血小板血浆(leukocyte-platelet-rich plasma，L-PRP)的制备方法，本发明的L-PRP的血小板含量约为全血的4倍，且富含白细胞及IL-6。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种L-PRP的制备方法，具体步骤如下：用10mL EDTA真空采血紫头管采集全血10mL，然后将装有全血的紫头管置于4℃条件下200g离心10min，全血离心后被清晰地分成三个部分，从上至下依次为澄清淡黄色的血浆层、白色絮状的白膜层和密度最大的红细胞层，然后用1mL无菌吸管吸取至白膜层下2mm处，移于15mL洁净离心管中，弃余下组分，离心管中的部分需包含全部上层血浆层和全部白膜层，之后进行第二次离心，第二次离心条件为4℃条件下200g离心10min，弃上层，留1ml血浆，用无菌吸管小心混悬离心管底的细胞团块，轻柔吹打均匀，混悬后即得1ml淡血色L-PRP。

为解决以上技术问题，本发明还提供了L-PRP。

为解决以上技术问题，本发明还提供了L-PRP在治疗难愈创面的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制备的L-PRP的血小板含量约为全血的4倍，且富含白细胞及IL-6，并发现L-PRP能通过上调IL-6转录水平并激活STAT3促进角质形成细胞迁移加速创面再上皮化；本发明制备的L-PRP及对其的研究细化了PRP的分类和应用场景，并发现了L-PRP促创面愈合的新机制，为临床解决难愈创面提供了新的解决方案，具有重要的临床实践意义。

附图说明

图1为本发明的实施例的PRP的制备流程及含量测定结果示意图；

图2为本发明的实施例的L-PRP促进大鼠创面再上皮化的实验结果图；

图3为本发明的实施例的创周组织促炎因子转录水平结果图；

图4为本发明的实施例的L-PRP对HaCaT细胞IL-6转录水平的影响结果图；

图5为本发明的实施例的细胞划痕实验结果图；

图6为本发明的实施例的细胞迁移实验结果图；

图7为本发明的实施例的L-PRP对HaCaT细胞STAT3激活水平的影响结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例为解决临床创面愈合难的问题，潜心探索了一种富白细胞富血小板血浆(leukocyte-platelet-rich plasma，L-PRP)的制备方法，本实施例所制备的L-PRP中的血小板含量约为全血的4倍，且富含白细胞及IL-6，并经过实验发现L-PRP能通过上调IL-6的转录水平激活STAT3促进角质形成细胞迁移加速创面再上皮化，具体方法见下文。

见附图1，其中图1A和图1B为本实施例的PRP的制备流程示意图，具体制备过程如下：

1.1.采血：①SD大鼠取血：动物禁食，术区剃毛，观察术区无红肿出血可行手术；麻醉：水合氯醛10％0.3mL/100g腹腔注射麻醉；消毒：麻醉起效后，大鼠仰卧固定，酒精消毒腹部备皮部分，开腹探查，找到下腔静脉，头皮针刺入下腔静脉，有回血后，头皮针尾端插入10mL EDTA真空采血紫头管，可采血约10mL；②用10mL EDTA真空采血紫头管采集人静脉血；

1.2.制备L-PRP：对所采集的全血进行第一次离心，离心条件为4℃条件下200g离心10min，全血离心后被清晰地分成三个部分，从上至下依次为澄清淡黄色的血浆层、白色絮状的白膜层和密度最大的红细胞层，然后用1mL无菌吸管吸取至白膜层下2mm处，移于15mL洁净离心管中，弃余下组分，离心管中的部分需包含全部上层血浆层和全部白膜层，之后进行第二次离心，第二次离心条件为4℃条件下200g离心10min，弃上层，留1ml血浆，用无菌吸管小心混悬离心管底的细胞团块，轻柔吹打均匀，混悬后即得1ml淡血色L-PRP。

1.3.制备P-PRP(乏白细胞富血小板血浆)：对所采集的全血进行第一次离心，第一次离心参数按照200g 4℃离心10min，用1mL吸管小心吸取至白膜层表面，至15mL洁净离心管中，弃余下组分，此部分应包含全部上层血浆；第二次离心参数按照200g 4℃离心10min，弃上层，留1ml血浆，用吸管小心混悬离心管底的细胞团块，轻柔吹打均匀，混悬后可得淡黄色P-PRP约1mL。

见附图1，本实施例对L-PRP及P-PRP中的血小板、白细胞和IL-6的含量进行了测定，见附图1C，大鼠全血中血小板含量为629±170×10³/μl，P-PRP中血小板含量为2381±141×10³/μl，L-PRP中血小板含量为2367±918×10³/μl。L-PRP及P-PRP之间血小板含量无明显差异，但是其血小板含量均显著多于全血中血小板水平(约4倍)，符合富血小板血浆的条件。见附图1D，大鼠全血中白细胞含量为5.3±2.2×10³/μl，P-PRP中白细胞含量均低于全血细胞计数仪检测阈值，L-PRP中白细胞含量为10.6±2.3×10³/μl；L-PRP中白细胞含量显著多于全血及P-PRP中白细胞含量，全血中白细胞含量显著多于P-PRP中白细胞含量。将附图1E，ELISA检测大鼠L-PRP及P-PRP中IL-6含量，L-PRP中IL-6含量为53.95±16.65pg/ml，P-PRP中IL-6含量为21.34±11.69pg/ml；L-PRP中IL-6含量显著高于P-PRP中IL-6含量。

本实施例研究了本实施例制备的L-PRP对创面愈合治愈的情况，本实施例在大鼠造背部创面模型后，术后0-7d每日均在同一比例尺下拍照，图片导入ImageJ中以肉眼可见的创面边缘测量创面面积测量3次，取平均值行统计比较，计算累积愈合率：第X天创面累积愈合率＝(Day0创面面积-DayX创面面积)/Day0创面面积×100％；计算每日愈合率：第X天创面每日愈合率＝(Day(X-1)创面面积-DayX创面面积)/Day(X-1)创面面积×100％。

见附图2A-B，记录创面面积变化，可见各组创面面积均随时间减小，创痂脱落一般在术后5-6d，其中，L-PRP组创面愈合最为迅速(图2A)。比较各组累积愈合率，术后1-7d，L-PRP组累积愈合率均显著高于P-PRP组及NS组；P-PRP组和NS组累积愈合率无显著差异。比较各组每日愈合率，术后1d，L-PRP组每日愈合率显著高于P-PRP组及NS组(p＜0.001)，术后3d及5d，L-PRP组日愈合率显著高于P-PRP组(p＜0.05)，但是与NS组日愈合率无明显差异(图2B)。

本实施例在造模后3d及7d取材创面组织，行H.E.染色观察并测量创周上皮舌状突长度。以创周为边界，以上皮舌状突距边界最远垂直距离为上皮舌状突迁移长度，测量3次，取均值做统计比较。

见附图2C-D，术后3d即可观察到各组创周明显的上皮舌状突，其中L-PRP组上皮舌状突已经迁移至新生肉芽组织表面，而P-PRP组及NS组上皮舌状突仅覆盖在收缩的创周组织表面；术后7d，各组上皮舌状突相较于术后3d时均明显延长增厚，其中L-PRP组上皮舌状突延伸最为明显，而P-PRP组及NS组上皮舌状突仅覆盖少量新生肉芽组织(图2C)。术后3d，L-PRP组上皮舌状突长度显著长于P-PRP组(p＜0.001)及NS组(p＜0.001)，P-PRP组上皮舌状突长度显著长于NS组(p＜0.01)；术后7d，L-PRP组上皮舌状突长度显著长于P-PRP组(p＜0.05)及NS组(p＜0.01)，P-PRP组上皮舌状突长度和NS组无明显差异(图2D)。

本实施例还测定了创周组织促炎因子转录水平，结果见附图3，其中IL-6：8h，L-PRP组明显多于P-PRP组(p<0.01)及NS组(p<0.05)；24h，L-PRP明显多于其余两组(p<0.05)；余均无明显差异。

本实施例接下来研究了L-PRP促创面愈合的新机制，细胞实验分组：采用Iguratimod(艾得辛/艾拉莫德)作为IL-6抑制剂，进行如下分组：

见附图4，予不同培养基孵育HaCaT细胞8h后，行IL-6RT-PCR检测IL-6转录水平。L组表达水平明显高于Li组(p＜0.05)、P组(p＜0.001)、C组(p＜0.001)；而P组与C组并无明显差异；Li组虽然表达水平明显低于L组，但是也明显高于C组(p＜0.001)。

本实施例通过细胞划痕实验和细胞迁移实验(Transwell实验)研究了L-PRP对HaCaT细胞迁移能力的影响，细胞划痕实验见附图5，HaCaT细胞铺24孔板，24h后在孔板正中作一垂直划痕，更换不同培养基，在不同时间点观察不同PRP作用下HaCaT迁移距离，可见L组在各时间点，相较于P组及C组，均可明显促进HaCaT细胞迁移；在加入终浓度30μg/mL IL-6抑制剂Iguratimod后，L-PRP促进HaCaT细胞迁移的作用明显减弱。计算相对迁移距离＝(0h初始距离-24h距离)/0h初始距离×100％。在各时间点，L组相对迁移距离均显著大于P组；自24h开始，L组相对迁移距离均显著大于C组；P组仅在72h表现优于C组；而加入了Iguratimod的抑制剂组在各个时间点均与C组没有差异，自24h开始，和L组相比，表现了显著的对HaCaT细胞迁移能力的抑制作用。

细胞迁移实验见附图6，将等量不同培养基置于Transwell下室，在Transwell小室中接种等量单细胞悬液，常规条件下孵育24h后，取出小室，甲醛固定，结晶紫染色可显示不同PRP作用下迁移的HaCaT细胞，可明显发现L组、Li组、P组、C组的HaCaT细胞迁移数量依次减少。在高倍镜视野(400×)下观察，迁移率＝迁移细胞所占面积/总面积×100％，L组迁移率明显高于Li组(p＜0.05)、P组(p＜0.001)、C组(p＜0.001)；P组迁移率明显高于C组(p＜0.01)；Li组虽然迁移率不及L组，但是依旧优于C组(p＜0.01)。

本实施例还研究了L-PRP对HaCaT细胞STAT3激活水平的影响，本实施例予不同培养基孵育HaCaT细胞8h后，行Western-blot检测STAT3激活水平，其中蛋白含量以蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示，其中STAT3激活比例以pSTAT3/STAT3表示。见附图7，L组、P组、C组之间STAT3含量无明显差异，但是Li组STAT3含量和L组(p＜0.05)、C组(p＜0.001)相比显著降低。C组、P组、Li组、L组pSTAT3含量依次升高，差异显著：L组(p＜0.01)、Li组(p＜0.001)、P组(p＜0.01)均显著高于C组，P组(p＜0.001)、Li组(p＜0.05)均显著低于L组。Li组STAT3激活比例最高，L组(p＜0.001)、Li组(p＜0.001)、P组(p＜0.001)均显著高于C组，L组低于Li组(p＜0.001)，但显著高于P组(p＜0.001)。

综上所述，本实施例制备的L-PRP的血小板含量约为全血的4倍，且富含白细胞及IL-6，并发现L-PRP能通过上调IL-6转录水平并激活STAT3促进角质形成细胞迁移加速创面再上皮化。本实施例制备的L-PRP及对其的研究细化了PRP的分类和应用场景，并发现了L-PRP促创面愈合的新机制，为临床解决难愈创面提供了新的解决方案，有望将L-PRP应用于治疗难愈创面的药物中，具有重要的临床实践意义。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种富白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：用10mL EDTA真空采血紫头管采集全血10mL，然后将装有全血的紫头管置于4℃条件下200g离心10min，全血离心后被清晰地分成三个部分，从上至下依次为澄清淡黄色的血浆层、白色絮状的白膜层和密度最大的红细胞层，然后用1mL无菌吸管吸取至白膜层下2mm处，移于15mL洁净离心管中，弃余下组分，离心管中的部分需包含全部上层血浆层和全部白膜层，之后进行第二次离心，第二次离心条件为4℃条件下200g离心10min，弃上层，留1ml血浆，用无菌吸管小心混悬离心管底的细胞团块，轻柔吹打均匀，混悬后即得1ml淡血色L-PRP。

2.权利要求1所述的制备方法制备的L-PRP。

3.权利要求2所述的L-PRP在治疗难愈创面的药物中的应用。

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