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CN114026235B - 用于选择性富集人免疫球蛋白Fc结构域的基于适体的亲和捕获方法 - Google Patents

用于选择性富集人免疫球蛋白Fc结构域的基于适体的亲和捕获方法 Download PDF

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CN114026235B CN202080046686.1A CN202080046686A CN114026235B CN 114026235 B CN114026235 B CN 114026235B CN 202080046686 A CN202080046686 A CN 202080046686A CN 114026235 B CN114026235 B CN 114026235B
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Abstract

本发明提供了一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置。该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到该亲和捕获装置的该表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。用结合缓冲液稀释该生物流体样本。该结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2‑乙磺酸(MES)或4‑(2‑羟基乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用该结合缓冲液将该生物流体样本中的该人免疫球蛋白Fc结构域吸附到该适体。

Description

用于选择性富集人免疫球蛋白Fc结构域的基于适体的亲和捕 获方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2019年6月26日提交的名称为“Aptamer BasedAffinityCaptureMethods forthe SelectiveEnrichmentofHumanImmunoglobulin FcDomains,”的美国临时专利申请号62/866,830的优先权和权益，该专利申请的全部内容据此以引用方式并入。
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式以电子方式提交，并且据此以引用的方式全文并入本文。在2020年6月24日创建的所述ASCII副本命名为W-4126-US02_(102994_1005_3)_SL.txt并且大小为5千字节。
技术领域
本公开涉及用于使用适体来选择性捕获在免疫球蛋白中发现的或包含在人源化单克隆抗体内的人Fc结构域的方法和试剂盒。更具体地，本技术涉及适体配体的经改善的选择性和结合，以更有效地捕获在免疫球蛋白中发现的人Fc结构域。
背景技术
在过去的几十年内，免疫疗法的市场已指数性生长。直至2018年，超过80种抗体治疗剂已经被FDA批准，并且数百个候选者经历临床试验。人单克隆抗体(mAb)表示最常用的抗体治疗方式中的一者，并且提供显著减小的免疫原性风险。约80％的FDA批准的抗体药物是具有超过90％人序列起源的完全人或人源化抗体。为了跟上对人抗体治疗剂需求的这种快速增长，需要高通量、选择性纯化来自细胞培养和生物流体样本的靶蛋白。
发明内容
需要方法和试剂盒，其使用适体来选择性捕获在免疫球蛋白中发现的或包含在人源化单克隆抗体内的人Fc结构域的方法和试剂盒。由于对人抗体治疗剂需求的快速增长，因此本技术的方法高通量和选择性纯化来自细胞培养和生物流体样本的靶蛋白。本技术是稳健的并且有利于人Fc捕获，能够在药代动力学、药效动力学和生物转化研究期间执行详细且准确的分析。
令人惊讶地发现，在用于将适体结合到基底的结合缓冲液中的一价与二价阳离子之间存在竞争作用，以及令人惊讶的发现，即结合缓冲液易受不同阳离子的影响。这些令人惊讶的发现导致常见的缓冲液被从本方法中排除，如下文所详述。本技术的一个益处是，复合基质(例如，生物流体)可以在其一价阳离子浓度下被还原，并且内源性一价离子的负面影响被最小化，这提供了经改善的适体的结合能力而不损失选择性。
在一个方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 1如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 1：
5'末端-G GrArGrG[i2FU]rG C[i2FU]C C GAAArGrGAA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 2至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 2如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 2：
5'末端–G GrArGrG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC][i2FC]GAAArGrG rA rA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 3至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 3如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 3：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC]C G A A A rG rG rA rA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 4至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 4如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 4：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC][i2FC]G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。C(OMe)、G(OMe)和A(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 5至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 5如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 5：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU]rG C U(OMe)C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。U(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 6至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 6如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 6：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC]U(OMe)[i2FC][i2FC]G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。U(OMe)、C(OMe)、G(OMe)和A(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 7至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 7如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 7：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU]C(OMe)[i2FC]G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。C(OMe)、G(OMe)和A(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 8至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 8如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 8：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC]C(OMe)G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。C(OMe)、G(OMe)和A(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 9至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 9如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 9：
5'末端–G G rA rG[i2FG][i2FU]rG C[i2FU]C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 10至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 10如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 10：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU][i2FG]C[i2FU]C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 11至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 11如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 11：
5'末端–GGrArGrG[i2FU]rGrC[i2FU]C C GAAArGrGAA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 12至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 12如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 12：
5'末端–G GrA rG rG[i2FU]rG C rU C C GAAArG rGA A[i2FC][i2FU]CC–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
在另一方面，本技术涉及一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 13至少80％相同。该方法还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体。SEQ ID NO 13如下所示。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
SEQ ID NO 13：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU]rG C U(OMe)C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。U(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在一些实施方案中，适体与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)至少85％、90％、95％、98％或99％相同。适体可以例如与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO13)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些百分比可以用于形成一个范围，例如，适体可以与SEQ ID NO 1(或SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)85％到99％相同或90％到95％相同。在一些实施方案中，适体是23-核苷酸适体。适体可以是具有约3个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以是具有约5个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以共价地固定或非共价地固定到亲和捕获装置的表面上。
在一些实施方案中，结合缓冲液具有小于约50mM的一价阳离子浓度。结合缓冲液可具有小于约30mM的一价阳离子浓度。在一些实施方案中，结合缓冲液的pH介于约5与约9之间。结合缓冲液的pH可介于约6至约8之间。结合缓冲液的pH可为约7.2。例如，结合缓冲液的pH可为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。这些pH值可以用于形成一个范围，例如约7.0至约7.4，或约7.1至约7.3。
可以稀释生物流体样本。例如，生物流体样本能够以系数2、10或20被稀释。在一些实施方案中，生物流体样本以系数1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20被稀释。这些稀释系数可以用于形成一个范围，例如约2至约20、或约2至约10，或约10至约20。在一些实施方案中，生物流体样本被稀释以获得不大于100mM、不大于50mM或不大于30mM的生物流体样本的总一价阳离子浓度。经稀释的生物流体样本的总一价阳离子浓度可以不大于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或10mM。
在一些实施方案中，该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液，从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。在一些实施方案中，铵浓度介于约50mM至约500mM之间。洗脱液的pH可介于约6.5至约8.0之间。洗脱液的pH可为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。这些pH值可以用于形成一个范围，例如介于约7.0至约8.0，或约6.5至约7.5之间。
在一些实施方案中，该方法还包括用结合缓冲液来洗涤吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还可以包括用包含Ca+的缓冲液来洗涤吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。
在一些实施方案中，镁阳离子的浓度介于约50μM至约1mM之间。镁阳离子的浓度可以是例如50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、550μM、600μM、650μM、700μM、750μM、800μM、850μM、900μM、950μM或1000μM。这些浓度可以用于形成一个范围，例如介于约50μM至约500μM，或约50μM至约200μM之间。
在一些实施方案中，该方法还包括用检测器来分析洗脱的人免疫球蛋白Fc结构域。检测器可以是夹心酶联免疫吸附测定或质谱仪。
在一些实施方案中，人免疫球蛋白Fc结构域包含在人源化单克隆抗体内。该方法还可以包括纯化人源化单克隆抗体。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO2至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 3至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO4至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 5至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 6至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 7至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 8至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 9至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 10至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 11至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 12至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 13至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。该方法还包括使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，适体与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)至少85％、90％、95％、98％或99％相同。适体可以例如与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO13)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些百分比可以用于形成一个范围，例如，适体可以与SEQ ID NO 1(或SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)85％到99％相同或90％到95％相同。在一些实施方案中，适体是23-核苷酸适体。适体可以是具有约3个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以是具有约5个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以共价地固定或非共价地固定到亲和捕获装置的表面上。
在一些实施方案中，铵浓度介于约50mM至约500mM之间。例如，铵浓度可以是约50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM。这些值可以用于形成一个范围，例如介于约200mM至约400mM之间。
在一些实施方案中，洗脱液具有介于约6.5至约8.0之间的pH。例如，洗脱液的pH可为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。这些pH值可以用于形成一个范围，例如介于约7.0至8.0之间，或介于约6.5至约7.0之间。
该方法还可以包括用检测器来分析洗脱的人免疫球蛋白Fc结构域。检测器可以是夹心酶联免疫吸附测定或质谱仪。
在一些实施方案中，人免疫球蛋白Fc结构域包含在人源化单克隆抗体内。该方法还可以包括纯化人源化单克隆抗体。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 2至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 3至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO4至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 5至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 6至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 7至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 8至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 9至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 10至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 11至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 12至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 13至少80％相同。试剂盒还包括瓶装结合缓冲液。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，适体与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)至少85％、90％、95％、98％或99％相同。适体可以例如与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO13)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些百分比可以用于形成一个范围，例如，适体可以与SEQ ID NO 1(或SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)85％到99％相同或90％到95％相同。在一些实施方案中，适体是23-核苷酸适体。适体可以是具有约3个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以是具有约5个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以共价地固定或非共价地固定到亲和捕获装置的表面上。
在一些实施方案中，结合缓冲液具有小于约50mM的一价阳离子浓度。结合缓冲液可具有小于约30mM的一价阳离子浓度。在一些实施方案中，结合缓冲液的pH介于约5与约9之间。结合缓冲液的pH可介于约6至约8之间。结合缓冲液的pH可为约7.2。例如，结合缓冲液的pH可为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。这些pH值可以用于形成一个范围，例如约7.0至约7.4，或约7.1至约7.3。
在一些实施方案中，镁阳离子的浓度介于约50μM至约1mM之间。镁阳离子的浓度可以是例如50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、550μM、600μM、650μM、700μM、750μM、800μM、850μM、900μM、950μM或1000μM。这些浓度可以用于形成一个范围，例如介于约50μM至约500μM，或约50μM至约200μM之间。
在一些实施方案中，试剂盒还包括铵瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度。铵能够以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。
在一些实施方案中，试剂盒还包括包含Ca+的瓶装缓冲液。可以浓缩缓冲液，并且试剂盒还可以包括用于使用水将浓缩缓冲液稀释至工作浓度的说明书。例如，缓冲液的工作浓度可以介于约0.5mM与20mM之间，并且浓缩浓度可以介于约20mM至500mM之间。
在一些实施方案中，瓶装缓冲液包含10mM Tris、5mM CaCl2，pH为7.2。
在一些实施方案中，试剂盒还包括用于执行本文所述的方法中的任一种方法的说明书。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 2至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 3至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 4至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 5至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 6至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 7至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 8至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 9至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 10至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 11至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 12至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在另一方面，本技术涉及试剂盒。试剂盒包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 13至少80％相同。试剂盒还包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度，其中铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
在一些实施方案中，适体与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)至少85％、90％、95％、98％或99％相同。适体可以例如与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO13)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些百分比可以用于形成一个范围，例如，适体可以与SEQ ID NO 1(或SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)85％到99％相同或90％到95％相同。在一些实施方案中，适体是23-核苷酸适体。适体可以是具有约3个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以是具有约5个残基的延长序列或截短序列的23-核苷酸适体。适体可以共价地固定或非共价地固定到亲和捕获装置的表面上。
在一些实施方案中，铵浓度介于约50mM至约500mM之间。例如，铵浓度可以是约50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM。这些值可以用于形成一个范围，例如介于约200mM至约400mM之间。
在一些实施方案中，洗脱液具有介于约6.5至约8.0之间的pH。例如，洗脱液的pH可为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。这些pH值可以用于形成一个范围，例如介于约7.0至8.0之间，或介于约6.5至约7.0之间。
试剂盒还可以包括用于执行本文所述的方法中的任一种方法的说明书。
附图说明
图1是根据本技术的例示性实施方案的捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法的流程图。
图2A是示出根据本技术的例示性实施方案的对于各种结合缓冲液，二价阳离子对在洗脱物中回收的hIgG的影响的图表。图2A显示结合缓冲液中的二价阳离子的影响，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的回收情况。缓冲液A包含:10mMTrisHCl，pH 7.2；缓冲液B包含:10mM Tris HCl、5mM MgCl2，pH 7.2；缓冲液C包含:10mM Tris HCl，5mM CaCl2；缓冲液D包含:10mM Tris HCl，5mM MnCl2；缓冲液E包含:10mMTris HCl，5mM乙酸锌。Nakamura等人提出的缓冲液包含:145mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2、20mM Tris HC1，pH 7.6。实验细节可在实施例1中找到。
图2B是示出根据本技术的例示性实施方案的对于各种结合缓冲液，二价阳离子对穿透的hIgG的影响的图表。图2B显示结合缓冲液中的二价阳离子的影响，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的穿透情况。缓冲液A包含:10mMTris HCl，pH 7.2；缓冲液B包含:10mMTrisHCl、5mMMgCl2，pH7.2；缓冲液C包含:10mM TrisHCl，5mM CaCl2；缓冲液D包含:10mMTrisHCl，5mMMnCl2；缓冲液E包含:10mM Tris HCl，5mM乙酸锌。Nakamura等人提出的缓冲液包含:145mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mMMgCl2、20mM Tris HC1，pH 7.6。实验细节可在实施例1中找到。
图3A是示出根据本技术的例示性实施方案的对于各种结合缓冲液，一价阳离子对在洗脱物中回收的hIgG的影响的图表。图3A显示结合缓冲液中的一价阳离子的影响，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的回收情况。缓冲液A包含:10mMTrisHCl、150mMNaCl，pH 7.2；缓冲液B包含:10mMTrisHCl、150mMNaCl、5mM KCl，pH 7.2；缓冲液C包含:10mM TrisHCl、150mM NaCl、5mM MnCl2，pH7.2；缓冲液D包含:10mMTrisHCl、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH7.2；缓冲液E包含:10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mMMnCl2，pH 7.2；缓冲液F包含:10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mM乙酸锌，pH 7.2。缓冲液G包含:10mM Tris HCl、5mMMgCl2，pH 7.2；缓冲液H包含:10mM Tris HCl、5mM CaCl2，pH 7.2；缓冲液I包含:10mM Tris HCl、5mM MnCl2，pH 7.2:缓冲液J包含:10mMTris HCl、5mM乙酸锌，pH 7.2。实验细节可在实施例1中找到。
图3B是示出根据本技术的例示性实施方案的对于各种结合缓冲液，一价阳离子对穿透的hIgG的影响的图表。图3B显示结合缓冲液中的一价阳离子的影响，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的穿透情况。缓冲液A包含:10mMTris HCl、150mM NaCl，pH 7.2；缓冲液B包含:10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mM KCl，pH7.2；缓冲液C包含:10mM TrisHCl、150mM NaCl、5mM MnCl2，pH 7.2；缓冲液D包含:10mMTrisHCl、150mM NaCl、5mM CaCl2，pH7.2；缓冲液E包含:10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mMMnCl2，pH 7.2；缓冲液F包含:10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mM乙酸锌，pH 7.2。缓冲液G包含:10mM Tris HCl、5mM MgCl2，pH 7.2；缓冲液H包含:10mM Tris HCl、5mM CaCl2，pH 7.2；缓冲液I包含:10mM Tris HCl、5mM MnCl2，pH 7.2:缓冲液J包含:10mMTris HCl、5mM乙酸锌，pH 7.2。实验细节可在实施例1中找到。
图4A是示出根据本技术的例示性实施方案的pH缓冲液组分(tris对比磷酸盐)对在洗脱物中回收的hIgG的影响的图表。图4A显示pH缓冲液组分的影响(Tris对比磷酸盐)，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的回收情况。缓冲液A包含:20mM磷酸钠，pH7.0；缓冲液B包含:20mM磷酸钠、150mM NaCl，pH 7.0；缓冲液C包含:20mM磷酸钠、5mM MgCl2，pH7.0；缓冲液D含:10mM Tris HCl，pH7.2；缓冲液E包含:10mMTris HCl、150mMNaCl，pH 7.2；缓冲液F包含:10mM Tris HCl、5mM MgCl2，pH 7.2。实验细节可在实施例1中找到。
图4B是示出根据本技术的例示性实施方案的pH缓冲液组分(tris对比磷酸盐)对穿透的hIgG的影响的图表。图4B显示pH缓冲液组分的影响(Tris对比磷酸盐)，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的穿透情况。缓冲液A包含:20mM磷酸钠，pH7.0；缓冲液B包含:20mM磷酸钠、150mM NaCl，pH 7.0；缓冲液C包含:20mM磷酸钠、5mM MgCl2，pH7.0；缓冲液D含:10mM Tris HCl，pH7.2；缓冲液E包含:10mMTrisHCl、150mMNaCl，pH7.2；缓冲液F包含:10mM Tris HCl、5mM MgCl2，pH 7.2。实验细节可在实施例1中找到。
图5是示出根据本技术的例示性实施方案的使用不同结合缓冲液的非特异性结合研究的图表。图5显示使用不同结合缓冲液的非特异性结合研究，即当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40L链霉亲和素树脂上的5μg适体的回收和穿透情况。缓冲液A包含:10mMTris HCl、150mM NaCl、5mM MeCl2，pH 7.2；缓冲液B包含:10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mMCaCl2，pH 7.2；缓冲液C包含:10mM TrisHCl、150mM NaCl、5mM MnCl2，pH 7.2；缓冲液D包含:10mM Tis HCl、150mM NaCl、5mM乙酸锌，pH7.2，缓冲液E包含:10mM Tris HCl、5mM MgCl2，pH 7.2；缓冲液F包含:10mM Tris HCl，5mM CaCl2，pH 7.2；缓冲液G包含:10mM Tris HCl，5mM MnCl2，pH 7.2:缓冲液H包含:10mM Tris HCI、5mM乙酸锌，pH 7.2。实验细节可在实施例2中找到。
图6是示出根据本技术的例示性实施方案的结合缓冲液中的镁浓度的影响和洗脱缓冲液的选择的图表。图6显示结合缓冲液中的Mg浓度的影响和洗脱缓冲液的选择，当加载有100μg的人IgG时，对于固定到40μL链霉亲和素树脂上的5μg适体的回收和穿透情况。结合缓冲液包含10mM Tris HCl，pH 7.2，其中MgCl2浓度范围为1μM至200mM。所捕获的hIgG用200mM醋酸铵或200mM EDTA来进行洗脱。实验细节可在实施例2中找到。
图7是示出根据本技术的例示性实施方案的适体对比单结构域抗体VHH的结合能力的图。图7显示适体对比单结构域抗体VHH的结合能力。当加载有500μg的人IgG时，对于具有不同量的经固定的抗人Fc配体(适体或VHH)的40μL链霉亲和素树脂的回收和穿透情况。实验细节可在实施例3中找到。
图8A是根据本技术的例示性实施方案的血浆样本的LC-UV曲线。
图8B是根据本技术的例示性实施方案的适体流通的LC-UV曲线。
图8C是根据本技术的例示性实施方案的洗脱物级分的LC-UV曲线。
图8D是根据本技术的例示性实施方案的从具有5μg、12.5μg和25μg经固定的适体的40μg链霉亲和素树脂回收的洗脱物级分的LCUV覆盖。
图8E是示出根据本技术的例示性实施方案的所计算的NIST mAb和血浆蛋白的加载和回收的表。
图9A是根据本技术的例示性实施方案的使用洗涤缓冲液A至F的适体2nd洗涤级分的LC-UV曲线的覆盖。缓冲液A包含:10mM Tris HCl、0.5mM MgCl2，pH 7.2(结合缓冲液)；缓冲液B包含:10mM Tris HCl、5mM CaCl2，pH 7.2；缓冲液C包含:145mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2、20mM Tris HCl，pH 7.6(Nakamura等人)；缓冲液D包含:20mM磷酸盐，pH 7.0；缓冲液E包含:0.1M甘氨酸HCl，pH 2.7；缓冲液F包含:150mM NaCl。实验细节可在实施例4中找到。
图9B是根据本技术的例示性实施方案的在使用洗涤缓冲液A至F的2nd洗涤步骤之后，适体洗脱物级分的LC-UV曲线的覆盖。缓冲液A包含:10mM Tris HCl、0.5mM MgCl2，pH7.2(结合缓冲液)；缓冲液B包含:10mM Tris HCl、5mM CaCl2，pH 7.2；缓冲液C包含:145mMNaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2、20mM Tris HCl，pH 7.6(Nakamura等人)；缓冲液D包含:20mM磷酸盐，pH7.0；缓冲液E包含:0.1M甘氨酸HCl，pH2.7；缓冲液F包含:150mMNaCl。实验细节可在实施例4中找到。
图9C是根据本技术的例示性实施方案的使用2nd洗涤缓冲液A至F，在2nd洗涤和洗脱物级分中的NIST mAb和血浆蛋白的所计算的回收。缓冲液A包含:10mMTris HCl、0.5mMMgCl2，pH7.2(结合缓冲液)；缓冲液B包含:10mM Tris HCl、5mM CaCl2，pH 7.2；缓冲液C包含:145mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2，0.8mM MgCl2、20mM Tris HCl，pH7.6(Nakamura等人)；缓冲液D包含:20mM磷酸盐，pH7.0；缓冲液E包含:0.1M甘氨酸HCl，pH2.7；缓冲液F包含:150mM NaCl。实验细节可在实施例4中找到。
具体实施方式
本技术包括用于使用适体来选择性捕获在免疫球蛋白中发现的人Fc结构域的方法和试剂盒。使用本技术，已经显著改善了某些适体配体的选择性和结合能力，使其对人IgG(hIgG)的捕获适用性更有效。与适体经固定的树脂的具体实施方案和亲和捕获装置的形状因数一起，已经设计了用于抗人Fc捕获的强大且稳健的技术。在一个示例性实施方案中和优化的工作流程中，经固定的适体树脂包含在移液管尖端内，并且用于从在临床前啮齿动物或猴试验期间获得的生物流体样本中快速和选择性地捕获包含在单克隆抗体(mAb)治疗剂内的人源化Fc结构域。
亲和捕获方法是用于促进抗体纯化、抗体表征和临床诊断发展的最强大技术中的一些技术。如果适当设计的亲和消耗品可用，则可以将靶抗体的富集简化为一步过程。已经提出了将适体(即具有独特3D构象的一组短的单链寡核苷酸)作为高容量和高选择性富集的新型亲和配体。这些化学合成的分子的大小通常小于10kDa，并且其高亲和能力可以通过经由SELEX(指数富集的配体系统进化)扩增的靶向筛选来加以实现。由于其相对较小的尺寸，适体可以通过可控固定在固体载体上实现高表面覆盖率，最小化任何可能的空间位阻，并确保样本制备时间显著降低的靶蛋白的高产率。此外，由于它们是体外合成的寡核苷酸，因此适体通常高度稳定，并且它们可以高效且经济地加以制造，具有可能更好的批次间可重现性与基于蛋白质的配体。
由40个或更少核苷酸组成的抗人Fc适体配体在Nakamura等人的美国专利号8,637,656(其全文以引用方式并入本文)中示出，作为用于纯化抗体和生物治疗剂的蛋白A替代物。先前涉及这些适体的研究已经示出，GGUGCU凸起基序对于与人IgG Fc结构域的选择性相互作用是必不可少的。凸起基序两端的两个茎结构与3个或4个核苷酸环一起形成分子的临界亲和基序。还应用了在选择嘧啶核苷酸残基内掺入2'-氟基团，以改善适体的稳定性和选择性。在人IgG适体复合物的晶体学研究中，发现该优化的适体与人IgG Fc结构域的若干保守残基主要经由范德瓦尔斯接触和氢键来进行相互作用，而不是静电力。此外，建议适体的结合结构可以由钙离子来加以稳定，并且结合可以通过钙螯合来进行逆转。然而，尽管存在抗人Fc适体的这些有价值的基本研究，但仍然需要有利于人Fc捕获的稳健方法，使得可以在药代动力学、药效动力学和生物转化研究期间执行更详细且更准确的分析。
使用本技术，提供了一种新型的、基于适体的样本制备方法，以用于选择性捕获人免疫球蛋白Fc结构域。可以采用具有SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 13中的任一者的23-核苷酸适体。此外，可以使用美国专利号8,637,656中描述的其他序列，并且其全文以引用方式并入本文。即，SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 13已经示出具有对人免疫球蛋白进行选择性捕获的能力，并且相对于本技术在其对SEQ ID NO 1的适用性中是等效的。美国专利号8,637,656中描述的一些序列可能缺乏实现来自动物、临床前生物流体的人Fc结构域的选择性捕获所需的物种选择性。这些适体序列可能模拟蛋白A的相对较宽的特异性。然而，据信它们也将适合于本发明的方法，可能是针对用于纯化来自细胞培养基的单克隆抗体的替代方法。以下示出了SEQ ID No 1至SEQ ID No 13中的每一者。
SEQ ID NO 1：
5'末端-G GrArGrG[i2FU]rG C[i2FU]C C GAAArGrGAA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 2：
5'末端–G GrArGrG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC][i2FC]GAAArGrG rA rA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 3：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC]C G A A A rG rG rA rA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 4：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC][i2FC]G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
SEQ ID NO 5：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU]rG C U(OMe)C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 6：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC]U(OMe)[i2FC][i2FC]G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
SEQ ID NO 7：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU]C(OMe)[i2FC]G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
SEQ ID NO 8：
5'末端–G(OMe)G(OMe)rA rG rG[i2FU]rG[i2FC][i2FU][i2FC]C(OMe)G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)rGrGrArA[i2FC][i2FU]C(OMe)C(OMe)–3'末端
SEQ ID NO 9：
5'末端–G G rA rG[i2FG][i2FU]rG C[i2FU]C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 10：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU][i2FG]C[i2FU]C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 11：
5'末端–GGrArGrG[i2FU]rGrC[i2FU]C C GAAArGrGAA[i2FC][i2FU]C C–3'末端
SEQ ID NO 12：
5'末端–G GrA rG rG[i2FU]rG C rU C C GAAArG rGA A[i2FC][i2FU]CC–3'末端
SEQ ID NO 13：
5'末端–G G rA rG rG[i2FU]rG C U(OMe)C C G A A A rG rG A A[i2FC][i2FU]C C–3'末端其中A、C、G、U表示四个核碱基。大写字母对应于脱氧核糖核苷酸，并且rX指示核糖核苷酸。[i2FC]和[i2FU]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。U(OMe)、C(OMe)、G(OMe)和A(OMe)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
在本技术的所有实施方案中，将适体配体固定到适用于执行亲和捕获和样本富集的基底。基底包括但不限于微量板、移液管尖端和实验室器具的表面，以及由聚合物、二氧化硅和有机二氧化硅组成的多孔和无孔树脂。
当适体固定到树脂上时，可以将树脂固定到消耗品上(例如微量板、移液管尖端和/或其他实验室器具)。以此方式，树脂可用于增加与表面结合的适体的表面积和/或量。在其他实施方案中，具有经固定的适体的树脂可以用作色谱柱中的固定相。
适体的序列可以从其5'-或3'-末端或其内部残基中的一个内部残基进行修饰。该序列修饰可以赋予化学柄和任选的间隔臂部分，包括但不限于亲水性分子组合物，诸如聚乙二醇或聚环氧乙烷的2个至50个重复单元。此外，该序列修饰可以用于实现定向固定。例如，在向5'或3'末端添加伯氨基团的情况下，适体可以经由亲核/亲电反应方案来进行修饰，以产生与也赋予限定方向性的另一分子、表面或树脂的单点连接。在一些实施方案中，上述化学柄可包括生物素、胺、羧基或硫醇基团。在固定和储存时，经固定的适体可用一种或多种核酸酶抑制剂来加以增强，以改善其保存期。还可以在储存溶液和工作缓冲液中添加核酸酶以延长经固定的适体的稳定性。
图1示出了捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法100。该方法包括提供亲和捕获装置105。该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)至少80％相同。适体可以与SEQ IDNO 1(或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13)85％、90％、95％、98％或99％相同。适体可以是23核苷酸适体。适体可以是具有约3个残基或约5个残基的延长序列或截短序列的23核苷酸适体。适体可以非共价地或共价地固定到亲和捕获装置的表面上。
方法100还包括用结合缓冲液来稀释生物流体样本110。结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。方法100还包括用结合缓冲液将生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域吸附到适体115。
适体的结合特性高度依赖于其所采用的缓冲液系统的组成(参见图2至图5)。基于研究工作，已经发现适体以金属依赖性机制进行运转。在使用适体时，已经观察到适当选择的二价离子的存在对于维持高亲和力和选择性是必不可少的(图2、图5)。Nakamura和同事提出了钙离子是形成该适体的亲和力能力基序的最关键组分的提议。在本文中，示出了镁离子在增加适体的结合能力而不引入与其他非靶向蛋白的任何显著量的非特异性结合方面更有效。镁阳离子的浓度可以介于50μM至约1mM之间。
如本文所用，术语“约”意指该数值是近似的，并且较小的变化不会显著影响所公开的实施方案的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另外指明，否则“约”意指该数值可改变±10％并且仍然在所公开的实施方案的范围内
同时，已经发现一价离子用作亲和结合基序的干扰物，从而用作由Nakamura和同事提出的对螯合剂的潜在替代性洗脱液。因此，在本技术的一些实施方案中，可以以洗脱缓冲液的形式来使用一价阳离子溶液，包括但不限于铵、钠和钾的溶液，以有助于在中性pH下回收靶蛋白/分析物(图3、图4和图6)。此外，与由Nakamura和同事提出的磷酸盐缓冲液相比，已经发现本发明的适体在Tris缓冲液中工作更有利。事实上，当与相同的离子添加剂一起使用时，发现Tris缓冲液比磷酸盐缓冲液产生更好的结合能力。三乙胺(TEA)、MES(2-乙磺酸)和HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)可以赋予优于磷酸盐缓冲液的优点。
在一些实施方案中，结合缓冲液具有小于约50mM的一价阳离子浓度。结合缓冲液可具有小于约30mM的一价阳离子浓度。在一些实施方案中，结合缓冲液的pH介于约5与约9之间。结合缓冲液的pH可介于约6至约8之间。结合缓冲液的pH可为约7.2。例如，结合缓冲液的pH可为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。这些pH值可以用于形成一个范围，例如约7.0至约7.4，或约7.1至约7.3。
可以稀释生物流体样本。例如，生物流体样本能够以系数2、10或20被稀释。在一些实施方案中，生物流体样本以系数1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20被稀释。这些稀释系数可以用于形成一个范围，例如约2至约20、或约2至约10，或约10至约20。在一些实施方案中，生物流体样本被稀释以获得不大于100mM、不大于50mM或不大于30mM的生物流体样本的总一价阳离子浓度。经稀释的生物流体样本的总一价阳离子浓度可以不大于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM或10mM。
参考图1，方法100还可以包括使用洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域120。洗脱液的铵浓度介于约10mM至约1000mM之间。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。铵浓度可以例如介于约50mM至约500mM之间。洗脱液的pH可以介于约6.5至约8.0之间。
方法100还可以包括用结合缓冲液来洗涤吸附的人免疫球蛋白Fc结构域125。在一些实施方案中，用包含Ca+的缓冲液来完成洗涤。
方法100还可以包括用检测器来分析洗脱的人免疫球蛋白Fc结构域130。检测器可以是夹心酶联免疫吸附测定或质谱仪。
在一些实施方案中，人免疫球蛋白Fc结构域包含在人源化单克隆抗体内，并且该方法还包括纯化人源化单克隆抗体(未示出)。
本技术还涉及一种从经固定的适体洗脱人免疫球蛋白Fc结构域的方法。该方法包括提供亲和捕获装置，该亲和捕获装置具有含有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。经固定的适体具有吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。使用具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度的洗脱液来从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。该方法可包括本文所述的实施方案中的任一个实施方案。
本技术还涉及试剂盒。试剂盒可包括亲和捕获装置，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。试剂盒还可以包括瓶装结合缓冲液，该结合缓冲液包括(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺(TES)、2-乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；(B)浓度介于约10μM至约20mM之间的镁阳离子；和(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的任一个实施方案。试剂盒还可以包括瓶装洗脱液，该洗脱液具有介于约10mM至约1000mM之间的铵浓度。铵能够以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒还可以包括包含Ca+的瓶装缓冲液。可以浓缩试剂盒中提供的缓冲液，并且试剂盒可以包括用于将浓缩缓冲液稀释至工作浓度的说明书。可以使用水来稀释缓冲液。试剂盒还可以包含用于执行本文所述的方法中的任一种方法的说明书。
本技术涉及一种试剂盒，该试剂盒包括亲和捕获装置和瓶装洗脱液，该亲和捕获装置包括具有适体的表面，该适体固定到亲和捕获装置的表面上并与SEQ ID NO 1至少80％相同。洗脱液的铵浓度介于约10mM至约1000mM之间。铵能够以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。试剂盒可包括本文所述的实施方案中的任一个实施方案。试剂盒可以包括用于执行本文所述的方法中的任何方法的说明书。
在实践中，抗人Fc适体可与小心限定的方案步骤(即结合、洗涤和洗脱步骤)一起使用。具体地，对于结合步骤，适体可以与Tris、TEA、MES或HEPES结合缓冲液(由浓度范围为10μM至20mM或更理想地50μM至1mM的Mg组成)一起使用。一价阳离子浓度在该结合缓冲液中有意地保持最小，该浓度小于50mM，更理想地小于30mM。此外，溶液的pH被设计为介于5与9之间，更理想地为6至8。使用该配方和方法来改善适体的结合能力，而不损失选择性(参见图5和图6)。这与由Nakamura和同事呈现的实例相反，其中描述了145mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2、20mM Tris，pH 7.6的缓冲液。因为在适体捕获方案的结合步骤期间最小化任何一价离子的存在是至关重要的，所以本发明的某些实施方案需要2倍至20倍的样本稀释。以此方式，复合基质(例如生物流体)在其一价阳离子浓度下被还原，并且内源性一价离子的负面影响被最小化。
(图8和图9)。
在示例性实施方案中，该方法包括由两个程序组成的洗涤步骤。第一洗涤程序专门用结合缓冲液来洗涤吸附的分析物和树脂来进行。第二洗涤程序优先用包含Ca2+的缓冲液来进行，因为已经观察到，在复合样本基质中显著降低适体配体的非特异性结合并且改善捕获/富集的hIgG的纯度(图9)。
在该方法的最终步骤中，所捕获的Fc结构域可以任选地通过使用中性pH缓冲液(pH介于6.5至8.0之间)来进行洗脱，该缓冲液具有螯合剂，包括由Nakamura和同事描述的那些(如10mM至200mM EDTA、苹果酸盐、柠檬酸盐和卟吩)，或具有浓缩一价阳离子(如K+、Na+、Ag+和Cs+)。另选地，包含分析物的Fc结构域可用如本文所公开的新型缓冲液系统(该新型缓冲液系统基于双膦酸盐，包括但不限于亚甲膦酸盐和依替膦酸盐)或用MS兼容的挥发性一价阳离子(诸如铵、四甲基铵或三乙基铵)来进行洗脱。在一个实施方案中，采用由10mM至1000mM或更理想地50mM至500mM的甲酸铵或醋酸铵构成的洗脱缓冲液。使用该类型的洗脱液，可以执行在线免疫亲和MS测定。同样，具有酸性pH(pH≤4.0)的常见的蛋白A洗脱缓冲液，如0.1M甘氨酸HCl、0.1M柠檬酸、5％乙酸或甲酸，是用于洗脱捕获Fc结构域分析物的另一个选项。这些洗脱条件的选择延长了适体亲和捕获与许多下游过程的兼容性。在一些实施方案中，采用抗人Fc适体和对应的装置以对后续的基于LC或LCMS的测定(如反相色谱法、离子交换、亲水相互作用液相色谱法、疏水相互作用色谱、蛋白A亲和色谱法、亚基分析、肽谱、聚糖表达谱和完整质量分析)执行样本制备。通过本技术促进的分析还可以包括在线免疫亲和捕获、毛细管电泳和质谱。另外，本文所述的方法可以应用于酶联免疫吸附测定(实施例7)。在另一个实施方案中，适体的热诱导变性可以应用于洗脱所捕获的人Fc分析物而不引入任何洗脱缓冲液。
概括地说，本技术规定了用于选择性捕获人Fc结构域的新型样本制备方法。由于其基于较小亲和配体的使用，因此它示出了相比于依赖于全尺寸IgG抗体配体的方法的有利结合能力，以及对由Nakamura和同事建立的现有技术的明显改善。(图7)。
实施例1：使用不同的结合缓冲液来捕获hIgG
具有SEQ ID NO 1的适体改编自US 8,637,656 B2，并且在其5'-末端处包含生物素标签。由IntegratedDNATechnologies(Coralville,IA)执行适体的合成。经由在室温下孵育30分钟，将每份5μg的生物素酰化适体固定到96孔滤板(可从MilliporeSigma,Burlington,MA商购获得)中的40μL高容量链霉亲和素树脂(可从ThermoFisherScientific,SanJose,CA商购获得)。利用正压歧管(可从WatersTechnologies Corporation,Milford,MA商购获得)以驱动流动穿过滤板。使用DS-11分光光度计(可从DeNovix Inc.,Wilmington,DE商购获得)，通过以260nm的吸光度来确定经固定的适体的量。该非共价地固定的适体亲和树脂用于执行包含在200μL的若干不同结合缓冲液(在下文中指定)内的100μg人IgG(来自人血清的IgG，可从Sigma-Aldrich(现在为MilliporeSigma)，St.Louis,MO商购获得)的亲和捕获。混合1小时后，用两份重复的200μL体积洗涤树脂，以移除任何未结合的蛋白质。保存合并的hIgG流通和洗涤级分以确定hIgG穿透的量。用两份重复的200μL体积的洗脱缓冲液(200mMEDTA，10mMtris，pH7.2)来洗脱所捕获的人IgG。保存洗脱物，以用于使用荧光读板机(Ex.280nm，Em.370nm；GeminiTMXPS读板机，可从Molecular Devices,San Jose,CA商购获得)的hIgG回收测量。
以引用方式并入本文的适体的结合能力高度依赖于结合缓冲液的组成。为了研究二价离子对适体结合特性的影响，筛选了一系列包含不同二价阳离子的Tris缓冲液。所测试的结合缓冲液为：具有5mMMgCl2的10mMTris缓冲液，pH7.2；具有5mMCaCl2的10mMTris缓冲液，pH 7.2；具有5mM MnCl2的10mMTris缓冲液，pH7.2，和具有5mM乙酸锌的10mMTris缓冲液，pH 7.2。没有所添加的阳离子的Tris缓冲液(10mM Tris/Tris HCl，pH7.2)用作对照，并与由Nakamura和同事提出的缓冲液系统(145mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mMMgCl2、20mM Tris，pH 7.6)进行比较。如图2所见，二价阳离子(特别是Zn2+和Mg2+)的存在导致hIgG的捕获和回收显著改善。这两种缓冲液作为其回收和选择性的示例性实施方案。另一方面，令人惊讶的是，当采用由Nakamura和同事提出的缓冲液时，仅捕获20％的加载hIgG(比较实施例)，这意味着缓冲液中的浓缩的氯化钠(NaCl)的存在以及多种二价/一价阳离子的组合抑制了适体的结合能力。
这样，通过使用包含和不包含Na+或K+阳离子的结合缓冲液来比较结合能力和蛋白质回收，再次证明了对从一价阳离子的存在捕获hIgG的负面影响。在该特定研究中探究的结合缓冲液包括a)不具有150mMNaCl的缓冲液；具有5mM MgCl2的10mM Tris缓冲液，pH7.2；具有5mM CaCl2的10mMTris缓冲液，pH7.2；具有5mMMnCl2的10mMTris缓冲液，pH7.2，和具有5mM乙酸锌的10mM Tris缓冲液，pH 7.2对比b)被制成也包含150mM NaCl的匹配缓冲液以及具有5mM KCl、150mM NaCl的10mM Tris缓冲液，pH 7.2。包含150mM NaCl的Tris缓冲液也用作对照。本研究的结果汇总在图3中。根据这些数据，看起来在包含二价阳离子的结合缓冲液中存在150mM NaCl对将hIgG吸附到经固定的适体上是破坏性的，如体现在适体结合能力和hIgG回收的显著降低。将钾阳离子(K)添加到包含氯化钠(NaCl)的结合缓冲液中对改善回收没有影响。当使用由Nakamura和同事提出的结合缓冲液时，该结果与所观察到的适体的结合特性一致，因为其含有相对较高浓度的一价阳离子，即浓度大于10mM的一价阳离子。
适体结合缓冲液的类型是影响捕获效率的另一因素。这里使用基于磷酸盐的缓冲液作为结合步骤的替代方案。在本研究中应用三种磷酸盐缓冲液，包括：没有添加NaCl的20mM Na2HPO3，pH 7.0；具有150mM NaCl的20mMNa2HPO3，pH 7.0；和具有5mM MgCl2的20mMNa2HPO3，pH 7.0。采用具有相同离子组分的10mMTris缓冲液作为对照。如图4所示，当与相同的离子添加剂一起使用时，Tris缓冲液提供比磷酸盐缓冲液更好的结合能力。当适体与仅含磷酸盐的缓冲液一起使用时，其示出对IgG几乎没有亲和力，而其亲和力可以经由添加5mM Mg2+来部分回收。根据与本技术有关的hIgG适体复合物的所报告的晶体结构，提出磷酸盐可能中断适体进入其活性亲和基序的折叠是合理的。
概括地说，包含二价阳离子(如Zn2+或Mg2+)的10mM Tris缓冲液作为本技术的示例性实施方案。已经执行了附加实验以证明这些缓冲液的可用性，并且在下文详述其结果。
实施例2：结合和洗脱缓冲液对适体选择性捕获的影响
在结合缓冲液中存在二价阳离子有潜力促进适体亲和基序的激活，但也可以促进非特异性结合。因此，我们还旨在解决适体的非特异性结合。如实施例1中所述来固定生物素酰化适体，并且随后用于hIgG捕获。在具有和不具有150mM NaCl的情况下，制备包含不同二价阳离子(Mg、Ca、Mn、Zn)的Tris结合缓冲液，并且然后用于本研究。这些结合和洗脱缓冲液的组成早期在实施例1中列出。使用兔IgG(rIgG)(可从Sigma-Aldrich(现在为MilliporeSigma)，St.Louis,MO商购获得)和牛血清白蛋白(BSA)(可从Sigma-Aldrich(现在为MilliporeSigma)，St.Louis,MO商购获得)作为两个阴性对照，以研究适体的非特异性结合。使用200μL体积的各种结合缓冲液将100μg的hIgG、rIgG和BSA加载到非共价地固定的适体树脂。在结合和洗涤步骤之后，用洗脱缓冲液来洗脱所捕获的蛋白质，并且使用荧光读板机来测量每份洗脱物中的蛋白质回收。
蛋白质回收的结果汇总在图5中。有趣的是，包含Zn2+的缓冲液导致了与所测试的所有蛋白质的高水平非特异性结合，特别是当不存在NaCl时。因此，包含Zn的结合缓冲液被视为不适用于该方法。在使用包含Mn2+的缓冲液的情况下观察到相同的问题，这还产生与rIgG的高水平非特异性结合。按照这些结果，应当指出的是，一些NaCl可以包括在洗涤缓冲液中以便衰减一些类型的非特异性结合。
对结果的进一步分析示出，由Mg2+组成的缓冲液在结合方面最有前景，因为其提供了具有可忽略不计的非特异性结合的有效捕获。然而，可以示出在结合缓冲液中具有不同浓度的Mg2+可能对结合能力具有影响。如图6所汇总的，Mg2+浓度介于50μM至1mM之间的结合缓冲液导致在所有所测试的条件下的最高hIgG捕获和回收。因此，似乎使用具有超过20mM或小于10μM Mg2+的结合缓冲液可能导致亚最佳hIgG结合。
在另一个研究中，我们选择研究用于hIgG洗脱的浓缩醋酸铵缓冲液的用途(图6)。由于我们的初步结果指示结合高度依赖于某些二价阳离子的存在，因此我们旨在了解竞争性阳离子是否可用于从hIgG适体复合物中置换二价阳离子，从而洗脱所捕获的hIgG。如Nakamura所提出，EDTA缓冲液可以用作洗脱缓冲液。然而，这种非挥发性螯合剂可能导致下游质谱(MS)分析的问题。相反，具有竞争性挥发性一价阳离子(如醋酸铵(NH4OAc)、甲酸铵或碳酸氢铵)的缓冲液可以是更加MS友好的洗脱缓冲液。在这一点上，200mM醋酸铵，pH 7.2用于从适体洗脱所捕获的hIgG，并将该洗脱物的质量与用200mM EDTA洗脱缓冲液获得的洗脱物的质量进行比较。如图6所示，浓缩NH4OAc的洗脱效率高度依赖于在结合缓冲液中的Mg2 +浓度。对于由50μM至10mM Mg2+组成的结合缓冲液，用NH4OAc来进行的hIgG回收可以是使用EDTA洗脱缓冲液获得的hIgG回收的80％至90％。
概括地说，具有Mg2+的10mM Tris结合缓冲液可以最小化不期望的非特异性结合并且提供示例性结合能力。理想的结合缓冲液中的Mg2+浓度介于10μM与10mM之间，更理想地为50μM至1mM。重要的是，使用该所选的结合缓冲液，浓缩铵缓冲液(例如，200mM醋酸铵)可用于实现与MS友好的洗脱缓冲液相比较高的回收。
实施例3：适体结合能力的评估
为了确定适体的结合能力，采用由本技术建立的方案以进行涉及超过500μg的hIgG的量的样本制备。将5μg、12.5μg、25μg、37.5μg、50μg和100μg的生物素酰化适体固定到40μL的链霉亲和素树脂上。用于适体固定和hIgG捕获的程序与先前实施例中所述的那些相同。对经固定的适体的量绘制hIgG的回收，以估计适体的最大结合能力(图7)。分别采用10mM Tris、0.5mMMg、pH 7.2和200mM EDTA、10mM Tris、pH 7.2以用于结合和洗脱。根据hIgG回收曲线，可以看出，通过使用本技术的优化的缓冲液和方案，适体的最大结合能力接近6.5μg hIgG/μg经固定的适体，其比使用基于全长IgG的抗人Fc抗体所估计可能的最大结合能力高约20倍。还值得注意的是，通过非共价固定到链霉亲和素树脂的限制，适体的表面覆盖率在该测试中受到约束。可以预测通过直接固定而制备的适体的较高结合能力。经固定的适体的覆盖率可以为约1nmol/m2至约1000nmol/m2。为了最小化成本，可以优选较低覆盖率固定。然而，为了实现高结合能力表面，期望较高的覆盖率。
在又一实例中，该基于适体的亲和捕获的能力已经与用于人Fc捕获的商业化纳米抗体配体进行比较。衍生自羊驼VHH结构域的纳米抗体先前已开发，并且现在以Thermo-Fisher Scientific 品牌技术的形式商购获得。在本研究中，抗人Fc VHH配体从改编自US 9,040,666 B2的序列(其全文以引用方式并入本文)进行重组表达(GenScript,Piscataway,NJ)并且被设计成具有由额外的半胱氨酸残基、TEV蛋白酶裂解位点和His标签组成的C-末端延伸部分。所获得的纳米抗体用ProTEV(可从Promega,Madison,WI商购获得)来进行处理以移除其His标签，然后用EZ-LinkTM、碘乙酰基-PEG2生物素(可从Thermo-Fisher Scientific,San Jose,CA商购获得)进行衍生。所得生物素酰化VHH的纯度通过LCMS来进行评估，并且确定大于80％生物素酰化。生物素酰化VHH被非共价地固定到40μL的链霉亲和素树脂浆液，并且被用于使用与适体相同的程序来捕获hIgG。使用DS-11分光光度计(可从DeNovixInc.,Wilmington,DE商购获得)，通过以280nm的吸光度来测量经固定的VHH的量。20mM磷酸盐，pH 7.0和0.1M甘氨酸HCl，pH 2.7由来自Thermo FisherScientific的CaptureSelect文献推荐为适当的结合和洗脱缓冲液。如图7所示，基于该VHH的配体的最大结合能力(5μg hIgG/μg经固定的VHH)低于适体的最大结合能力。
实施例4：从生物流体捕获hIgG
为了研究纯化来自生物流体基质的人Fc结构域的选择性，将不同量的NIST mAb(NIST参考材料8671)掺入大鼠血浆中，然后使用本发明所述的方案，用非共价地固定的适体来进行亲和捕获。用BEH300C4柱(1.7μm，2.1x100nm)(可从WatersTechnologiesCorporation,Milford,MA商购获得)使用H-Class Bio(可从WatersTechnologies Corporation,Milford,MA商购获得)来分析流通、洗涤和洗脱物级分的纯度。使用荧光读板机(Gemini XPS(可从Molecular Devices,LLC,SanJose,CA商购获得)；Ex.280nm，Em.370nm)来确定每个级分的蛋白质浓度；并且根据色谱纯度评估来重新计算。图8A-图8C示出了来自以下情况的示例性数据：使用12.5μg经固定的适体来纯化来自20μL大鼠血浆基质的100μg的NIST mAb。纯化后，回收约85％的掺入的NIST mAb，其中纯度从10.6％增加至72.4％。
确定经纯化的NIST mAb洗脱物中的较小部分杂质是大鼠血浆内源性蛋白与适体的非特异性结合。通过将包含50μg的NISTmAb的20μL大鼠血浆加载到增加量的经固定的适体(5μg、12.5μg、25μg)上来研究NIST mAb与血浆蛋白之间的结合竞争。该实验的结果汇总在图8D-图8E中。由此，可以观察到当前实验方法的NIST mAb与血浆蛋白的结合比率接近7:3(来自UV测量)。这些数据表明可以进一步减小非特异性结合。
从而在洗脱步骤之前施加额外的洗涤步骤(第二洗涤)。为了测试该任选的方案步骤，用结合缓冲液将20μL血浆和25μg的NIST mAb稀释至200μL，然后加载到40μL链霉亲和素树脂上，其中5μg适体为非共价地固定的。在用结合缓冲液进行第一洗涤之后，施加两份200μL体积的每种潜在第二洗涤缓冲液，包括由Nakamura和同事提出的结合结合缓冲液(10mMTris、5mM CaCl2，pH 7.2)；20mM磷酸盐，pH 7.0；0.1M甘氨酸HCl，pH 2.7；150mM NaCl和结合缓冲液(对照)。然后用EDTA缓冲液执行洗脱。在本文中，收集第二洗涤和洗脱级分并通过LC-UV分析来进行分析。如图9A所示，发现由Nakamura等人提出的结合缓冲液以及20mM磷酸盐、0.1M甘氨酸和150mM NaCl均不是合适的次级洗涤缓冲液。在两种情况下，所捕获的NISTmAb与血浆杂质一起进行洗脱。另一方面，包含5mM CaCl2的Tris缓冲液能够选择性地从适体中洗掉杂质。根据图9B和图9C，经固定的适体示出了最佳NIST mAb回收，连同在施加次级洗涤步骤之后的最高纯度，该次级洗涤步骤基于包含5mM CaCl2的tris缓冲液。因此，该包含Ca2+的缓冲液是推荐的，然而任选的，次级洗涤缓冲液在用于从生物流体样本捕获人Fc结构域的优化方案中加以使用。在以下方案中概述本发明的示例性实施方案。
实施例5：用于从临床前类型生物流体样本捕获基于人源化mAb的治疗性蛋白质的 示例性方案
该示例性方案旨在与经固定的适体材料或装置一起使用。
·所使用的缓冲液：
○结合/1st洗涤缓冲液：10mM Tris、0.5mM MgCl2，pH 7.2
○2nd(次级)洗涤缓冲液：10mM Tris、5mM CaCl2，pH 7.2
○洗脱缓冲液：10mMTris、200mMEDTA，pH 7.2或200mM醋酸铵，pH 7.2(用于MS分析)
·生物流体样本制备：
○推荐将生物流体样本用结合缓冲液稀释至少十倍，然后将样本加载到经固定的适体上。例如，用90μL结合缓冲液来稀释10μL生物流体样本，以制成100μL最终体积。
·结合步骤：
○用结合缓冲液(对比亲和树脂/床的体积，约10柱体积(CV))
来平衡经固定的适体树脂/装置
○将经稀释的生物流体样本加载到经固定的适体上
○在室温下孵育装置1小时，混合。(例如，在5-600rpm下的板振荡器)
○从树脂/装置中移除流通溶液
·洗涤步骤：
○使用结合缓冲液(约10CV所使用的树脂)来执行1st洗涤步骤
○从树脂/装置移除1st洗涤溶液
○使用次级洗涤缓冲液(约10CV所使用的树脂)来执行2nd洗涤步骤。
○从树脂/装置移除次级洗涤溶液
·洗脱步骤：
○用期望的洗脱缓冲液(可以使用约10CV树脂，尽管洗脱缓冲液的体积可以按需变化)来洗脱所捕获的人Fc分析物
○将级分保存为洗脱物，以用于下游分析
实施例6：在线免疫亲和捕获MS分析实施例
可以采用经固定的抗人Fc适体以用于在线免疫亲和捕获MS，以有利于人源化生物治疗剂的识别和定量。在一些实施方案中，免疫亲和柱填充有经固定的适体树脂并且与LCMS直接耦接以用于分析。在本申请中可以使用溶剂管理系统以递送结合缓冲液、次级洗涤缓冲液和MS兼容的洗脱缓冲液。此处描述的洗脱缓冲液包括但不限于挥发性一价盐，如甲酸铵、醋酸铵、碳酸氢铵、四甲基铵或三乙基铵；挥发性酸，如甲酸、乙酸、TFA或DFA；挥发性溶剂，如乙腈和甲醇。为了避免MS污染，可以将LC流通转向到废液以用于结合和洗涤步骤，然后切换回MS以用于洗脱步骤。根据LC设定，来自免疫亲和柱的流出物的前30秒至2分钟也可以导向废液。另选地，可以采用MS兼容的洗涤缓冲液。在通过MS进行洗脱和检测时，保留时间、峰面积和m/z值被一起使用以表征样本的组分。在另一个实施方案中，可以将经填充的适体免疫亲和柱应用于二维(2D)LCMS系统，以用于更全面的分析。涉及此类2D-LCMS系统的次级分析柱可以配备有多种技术，包括但不限于正常相分离、反向相分离、尺寸排阻分离、离子交换分离、HILIC分离、HIC分离、亲和捕获或酶消化。
实施例7：抗人Fc ELISA实施例
作为抗人Fc亲和配体，以引用方式并入本文的适体序列可与本发明的各方面一起使用，以建立敏感的酶联免疫吸附测定(ELISA)，以用于准确量化具有Fc结构域的人IgG或人源化治疗剂。在一些实施方案中，将抗人Fc适体涂覆到ELISA板的表面上并且用于从生物流体捕获靶IgG。应用上述所选的结合缓冲液，以确保实现期望的结合能力和特异性。然后使用所述洗涤缓冲液中的一种或多种洗涤缓冲液，从板中洗涤未结合的杂质。在典型的实施方案中，利用具有酶标签(诸如辣根过氧化物酶)的次级检测配体以形成夹心免疫测定。该检测配体在一个或多个结构域处(包括但不限于CH1、轻链κ、轻链λ、VH或VL)与人IgG结合。在检测配体的结合之后，将基底(通常是TMB)添加到ELISA板中并由酶标签催化，以产生浓度可以使用UV读板机来进行测量的有色产物。在另选的实施方案中，适体配体在溶液中游离，但经修饰以包含酶标签。然后可以用本技术描述的结合方案来执行直接ELISA测量。在另一个实施方案中，适体配体被修饰为包含酶标签本身，以便促进间接ELISA测量。
本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验便能确定本文所述具体程序的许多等同形式。此类等同形式被认为是在本技术的范围内并由以下权利要求书所涵盖。本申请通篇引用的所有参考文献、发布专利和公布的专利申请的内容据此以引用方式并入。

Claims (36)

1.一种捕获生物流体样本中的人免疫球蛋白Fc结构域的方法，所述方法包括：
提供亲和捕获装置，所述亲和捕获装置包括具有适体的表面，所述适体固定到所述亲和捕获装置的所述表面上并如SEQ ID NO.1所示；
用结合缓冲液稀释所述生物流体样本，所述结合缓冲液包括：
(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺、2-乙磺酸或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；
(B)浓度介于10μM至20mM之间的镁阳离子；和
(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度，其中所述结合缓冲液不包含NaCl；以及
用所述结合缓冲液将所述生物流体样本中的所述人免疫球蛋白Fc结构域吸附到所述适体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述适体非共价地固定到所述亲和捕获装置的所述表面上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述适体共价地固定到所述亲和捕获装置的所述表面上。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合缓冲液具有小于50mM的一价阳离子浓度。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合缓冲液具有小于30mM的一价阳离子浓度。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合缓冲液的pH介于5与9之间。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合缓冲液的pH介于6至8之间。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合缓冲液的pH为7.2。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物流体样本以系数2被稀释。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物流体样本以系数10被稀释。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物流体样本以系数20被稀释。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物流体样本被稀释以获得不大于100mM的所述生物流体样本的总一价阳离子浓度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物流体样本被稀释以获得不大于50mM的所述生物流体样本的总一价阳离子浓度。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物流体样本被稀释以获得不大于30mM的所述生物流体样本的总一价阳离子浓度。
15.根据权利要求1或2所述的方法，还包括使用洗脱液从经固定的适体洗脱吸附的人免疫球蛋白Fc结构域，所述洗脱液具有介于10mM至1000mM之间的铵浓度，其中所述铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述铵浓度介于50mM至500mM之间。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述洗脱液具有介于6.5至8.0之间的pH。
18.根据权利要求1或2所述的方法，还包括用所述结合缓冲液来洗涤所述吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。
19.根据权利要求1或2所述的方法，还包括用包含钙阳离子的缓冲液来洗涤所述吸附的人免疫球蛋白Fc结构域。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述镁阳离子的浓度介于50μM至1mM之间。
21.根据权利要求15所述的方法，还包括用检测器来分析洗脱的人免疫球蛋白Fc结构域。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测器为夹心酶联免疫吸附测定。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测器为质谱仪。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述人免疫球蛋白Fc结构域包含在人源化单克隆抗体内。
25.根据权利要求24所述的方法，还包括纯化所述人源化单克隆抗体。
26.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
亲和捕获装置，所述亲和捕获装置包括具有适体的表面，所述适体固定到所述亲和捕获装置的所述表面上并如SEQ ID NO.1所示；
和瓶装结合缓冲液，所述结合缓冲液包括：
(A)三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、三甲胺、2-乙磺酸或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；
(B)浓度介于10μM至20mM之间的镁阳离子；和
(C)0至不大于100mM的总一价阳离子浓度，
其中所述结合缓冲液不包含NaCl。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述结合缓冲液具有小于50mM的一价阳离子浓度。
28.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述结合缓冲液具有小于30mM的一价阳离子浓度。
29.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述结合缓冲液的pH介于5与9之间。
30.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述结合缓冲液的pH介于6至8之间。
31.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述结合缓冲液的pH为7.2。
32.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述镁阳离子的浓度介于50μM至1mM之间。
33.根据权利要求26或27所述的试剂盒，还包括瓶装洗脱液，所述洗脱液具有介于10mM至1000mM之间的铵浓度，其中所述铵以四甲基铵、三乙基铵、甲酸铵或醋酸铵的形式呈现。
34.根据权利要求26或27所述的试剂盒，还包括包含钙阳离子的瓶装缓冲液。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述缓冲液被浓缩，并且所述试剂盒还包括用于使用水将所述浓缩缓冲液稀释至工作浓度的说明书。
36.根据权利要求26或27所述的试剂盒，还包括用于执行根据权利要求1至17中任一项所述的方法的说明书。
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