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CN103945868B - 骨生成促进剂 - Google Patents

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CN103945868B CN201280034387.1A CN201280034387A CN103945868B CN 103945868 B CN103945868 B CN 103945868B CN 201280034387 A CN201280034387 A CN 201280034387A CN 103945868 B CN103945868 B CN 103945868B
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Abstract

本发明的目的在于提供直接促进基于成骨细胞的骨生成的骨生成促进剂和骨疾病的预防剂及治疗剂。本发明的特征在于，使用信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质。作为所述结合抑制物质，可优选示例抗信号素4D抗体、抗神经丛素B1抗体、包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质等。

Description

骨生成促进剂
技术领域
本发明涉及骨生成促进剂和骨疾病的预防剂及治疗剂。更具体涉及以信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质为有效成分的骨生成促进剂和骨疾病的预防剂及治疗剂。
背景技术
随着社会高龄化，骨折、骨质疏松症、风湿性关节炎、腰背痛等骨科疾病的患者增加。骨组织中，负责骨生成的成骨细胞与负责骨吸收的破骨细胞协调作用，以良好的平衡进行骨生成和骨吸收，从而维持骨组织的功能。该骨代谢的平衡由于老化和卵巢功能的下降等因素而失衡，如果骨生成低下或骨吸收异常亢进，则骨量(骨密度)降低，产生各种各样的骨疾病。作为所述骨疾病，已知骨折、骨缺损、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少症、腰背痛、变形性骨炎、强直性脊柱炎、风湿性关节炎、变形性关节炎等。特别是如果高龄者患上骨疾病，则连日常生活所需水平的运动也变得困难，根据情况很有可能就此卧床不起。因此，在不断高龄化的现代社会，预防和治疗骨疾病具有重要意义。
目前，作为骨疾病的治疗剂，一般采用活化维生素D3剂、双磷酸盐剂、降钙素制剂、含雌二醇的激素制剂、维生素K2剂等。此外，作为副作用更少且效果更好的治疗剂，进行了雌二醇衍生物、活化维生素D3衍生物、双磷酸盐衍生物等的开发(参照专利文献1)。但是，虽然维生素D3具有提高血中钙浓度的作用，而雌二醇和双磷酸盐具有骨吸收的抑制作用，但是均没有直接促进基于成骨细胞的骨生成的作用。骨疾病、特别是骨代谢疾病的治疗中，多剂并用疗法逐渐成为主流，所以期待开发出具有与以往的预防剂及治疗剂不同的作用机理的新的预防剂及治疗剂。
骨通过骨的吸收阶段和接着该阶段的重复骨的形成阶段的被称为骨重建（remodeling）的步骤连续地再生。各阶段和阶段的过渡必须通过从参与破骨细胞-成骨细胞间的通信的骨细胞分泌或者从骨基质释放的骨重建因子精细地控制。已知骨吸收之间所释放的TGF-β和IGF-1刺激骨形成，因此被称为偶联因子。虽然对于骨重建重要的候选分子的体外数据丰富，未充分提供体内的证据。
轴突导向分子在神经系统的外侧被广泛发现，在那里控制细胞迁移、免疫应答、组织演化和血管生成等(参照非专利文献1和2)。近年来的研究提示，信号素和蝶素（Ephrin）等轴突导向分子参与破骨细胞-成骨细胞间的细胞间通信(参照非专利文献3～5)。
已知信号素4D(Semaphorin4D)从少突胶质细胞被分泌，在中枢神经系统中诱导生长锥的崩解。此外，发现信号素4D对于免疫应答和免疫系统的动态平衡的维持很重要。作为信号素4D的受体之一，已知神经丛素(Plexin-B1)(参照非专利文献6)。另外，非专利文献7中提示，来源于破骨细胞的信号素4D可能具有成骨细胞分化抑制作用，并且促进介以成骨细胞的破坏细胞形成。此外，非专利文献8中揭示，信号素4D未在成骨细胞中被检出，而是存在于破骨细胞的表面，确认使信号素4D(Sema4D)纯合缺失的雌性sema4D-/-小鼠中，骨量与野生型小鼠相比增加。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特表2005-509629号公报
非专利文献
非专利文献1:B.J.Dickson,Science298,1959(2002年12月6日)
非专利文献2:A.B.Huber,A.L.Kolodkin,D.D.Ginty,J.F.Cloutier,Annu Rev Neurosci26,509(2003)
非专利文献3:N.Takegahara等,Nat Cell Biol8,615(2006年6月)
非专利文献4::N.Irie等,J Biol Chem284,14637(2009年5月22日)
非专利文献5:C.Zhao等,Cell Metab4,111(2006年8月)
非专利文献6:I.Oinuma等,Science,305卷,5685号,862-865页（2004年8月6日）
非专利文献7:石田真哉、金田利夫、武藤章弘、吉田正，日本骨代谢学会学术会议日程抄录集，25卷、266页，2007年6月发行，《来源于破骨细胞的信号素4D在骨代谢中的生理作用的分析》
非专利文献8:Romain DACQUIN,Chantal Domenget,Pierre Jurdic,Irma Machuca-Gayet,《2010年ASBMR年会摘要(ASBMR2010Annual MeetingAbstracts)》,发表编号MO0152,《基于信号素4D的骨吸收的生理控制取决于卵巢功能(Physiological Control of Bone Resorption bySemaphorin4D is Dependent on Ovarian Function)》
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的课题在于提供直接促进基于成骨细胞的骨生成的骨生成促进剂和骨疾病的预防剂及治疗剂。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人在如上述背景技术中记载的状况下进行了认真研究后发现，(a)来源于破骨细胞的信号素4D如果与成骨细胞上的神经丛素B1受体结合，则使抑制成骨细胞分化的小G蛋白RhoA活化，使IRS信号(促进成骨细胞的分化的信号)减少，抑制成骨细胞的分化，从而抑制骨生成，(b)抗信号素4D抗体或抗神经丛素B1抗体等直接促进基于成骨细胞的骨生成，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：
(1)以信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质为有效成分的骨生成促进剂；
(2)如上述(1)所述的骨生成促进剂，其特征在于，结合抑制物质为抗信号素4D抗体；
(3)如上述(1)所述的骨生成促进剂，其特征在于，结合抑制物质为抗神经丛素B1抗体或者包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质。
此外，本发明还涉及：
(4)以信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质为有效成分的骨疾病的预防剂及治疗剂；
(5)如上述(4)所述的骨疾病的预防剂及治疗剂，其特征在于，结合抑制物质为抗信号素4D抗体；
(6)如上述(4)所述的骨疾病的预防剂及治疗剂，其特征在于，结合抑制物质为抗神经丛素B1抗体或者包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质；
(7)如上述(4)～(6)中的任一项所述的骨疾病的预防剂及治疗剂，其特征在于，骨疾病选自骨折、骨缺损、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少症、腰背痛、变形性骨炎、强直性脊柱炎、风湿性关节炎和变形性关节炎。
另外，本发明还涉及
(8)骨生成促进剂的有效成分的候选物质的判定方法，其特征在于，确定被检物质是不是信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质，所述被检物质是所述结合抑制物质的情况下，将所述被检物质判定为骨生成促进剂的有效成分的候选物质；
(9)如上述(8)所述的判定方法，其特征在于，确定被检物质是不是信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质的方法包括以下的工序(A)～(D):(A)在被检物质的存在下使信号素4D与神经丛素B1接触的工序、(B)测定信号素4D与神经丛素B1的结合程度的工序、(C)将通过上述工序(B)测定的程度与不存在被检物质的条件下的结合程度比较的工序、(D)通过上述工序(B)测定的程度比不存在被检物质的条件下的结合程度低的情况下将该被检物质确定为信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质的工序；
(10)骨生成促进剂的有效成分的候选物质的筛选方法，其特征在于，使用上述(8)或上述(9)所述的判定方法，从被检物质中搜寻骨生成促进剂的有效成分的候选物质。
发明的效果
如果采用本发明，则可直接促进基于成骨细胞的骨生成，或者预防并/或治疗骨疾病。
附图说明
图1是表示通过显微CT(微计算机断层扫描技术，microcomputedtomography)(μCT)分析测定的野生型(WT)小鼠和信号素4D敲除(Sema4d-/-)小鼠中的骨量的图。
图2是表示通过μCT分析测定的WT小鼠和Sema4d-/-小鼠中的骨小梁宽度的图。
图3是表示每4天的进行了钙黄绿素双重标记的WT小鼠和Sema4d-/-小鼠的通过骨形态形成分析测定的骨生成[成骨细胞表面积(左)、钙化了的骨表面积(中央)和骨形成率(右)]的图。
图4是表示WT小鼠和Sema4d-/-小鼠的通过骨形态形成分析测定的破骨细胞表面积及细胞数(左和中央)和骨吸收的参数(右)的图。
图5是表示将WT小鼠或Sema4d-/-小鼠的骨髓细胞进行了过继免疫细胞移植的小鼠的骨量的图。左起的2个图表示移植于WT小鼠时的该小鼠的骨量，右起的2个图表示移植于Sema4d-/-小鼠时的该小鼠的骨量。
图6是表示向在骨生成条件下进行了培养的颅盖骨细胞添加Fc-sema4D(与IgG1的Fc区域融合的重组信号素4D)时的骨结节数的图。
图7是成骨细胞分化中的神经丛素B型和分化群72(CD72，cluster ofdifferentiation72)的mRNA的表达的图。
图8是表示使用Fc-sema4D的钓饵(pull-down)分析的结果的图。右板表示钓饵放下前的样品的分析结果，左板表示钓饵放下后的样品的分析结果。
图9是表示通过μCT分析测定的WT小鼠和神经丛素B1敲除(Plxnb1-/-)小鼠中的骨量的图。
图10是表示通过μCT分析测定的WT小鼠和Plxnb1-/-小鼠中的骨小梁宽度的图。
图11是表示通过骨形态形成分析测定的WT小鼠和Plxnb1-/-小鼠中的成骨细胞表面积的图。
图12是表示通过骨形态形成分析测定的WT小鼠和Plxnb1-/-小鼠中的钙化了的骨表面积的图。
图13是表示通过骨形态形成分析测定的WT小鼠和Plxnb1-/-小鼠中的骨形成率的图。
图14是神经丛素B1、GAP结构域中具有变异的神经丛素B1的RA突变体(R1661/1662/1968A)和PDZ结合结构域缺失的(ΔPDZ)神经丛素B1被剪切的突变体的概要的图。
图15是表示通过μCT分析测定的WT小鼠(对照小鼠)和显性失活突变RhoA(RhoA DNOB)小鼠中的骨量的图。
图16是表示通过μCT分析测定的WT小鼠和RhoA DNOB小鼠中的骨小梁宽度的图。
图17是表示通过骨形态形成分析测定的WT小鼠和RhoA DNOB小鼠中的骨生成[成骨细胞表面积]的图。
图18是表示通过骨形态形成分析测定的WT小鼠和RhoA DNOB小鼠中的骨生成[钙化了的骨表面积]的图。
图19是表示通过骨形态形成分析测定的WT小鼠和RhoA DNOB小鼠中的骨生成[骨形成率]的图。
图20是表示通过骨形态形成分析测定的卵巢摘除(OVX)小鼠和用抗Sema4D抗体进行了处理的OVX小鼠中的成骨细胞表面积的图。
图21是表示通过μCT分析测定的OVX小鼠和用抗信号素4D抗体(抗Sema4D抗体)进行了处理的OVX小鼠中的骨量的图。
图22是表示通过骨形态形成分析测定的OVX小鼠和用抗Sema4D抗体进行了处理的OVX小鼠中的骨生成[骨形成率]的图。
图23是表示通过μCT分析测定的OVX小鼠和用抗Sema4D抗体进行了处理的OVX小鼠中的骨小梁间隔的图。
图24的上板是表示对将小鼠成骨细胞在WT小鼠或Sema4d-/-小鼠的破骨细胞和抗Sema4D抗体的存在下培养的情况下的钙化形成的考察结果的图。图24的下板是表示对将小鼠成骨细胞在Fc-sema4d和/或抗神经丛素B1抗体的存在下培养的情况下的钙化形成的考察结果的图。
图25是表示对将人成骨细胞(HOS)在破骨细胞或者其上清和/或抗Sema4D抗体等的存在下培养的情况下的钙化形成的考察结果的图。
图26是表示通过骨形态形成分析测定的卵巢摘除(OVX)小鼠和自OVX处理后6周起用抗信号素4D抗体(抗Sema4D抗体)进行了处理的OVX小鼠中的成骨细胞表面积的图。
图27是表示通过μCT分析测定的OVX小鼠和自OVX处理后6周起用抗Sema4D抗体进行了处理的OVX小鼠中的骨量的图。
图28是表示通过骨形态形成分析测定的OVX小鼠和自OVX处理后6周起用抗Sema4D抗体进行了处理的OVX小鼠中的骨生成[骨形成率]的图。
图29是表示通过μCT分析测定的OVX小鼠和自OVX处理后6周起用抗Sema4D抗体进行了处理的OVX小鼠中的骨小梁间隔的图。
具体实施方式
作为本发明的“骨生成促进剂”和本发明的“骨疾病的预防剂及治疗剂”(以下也统一表示为“本发明的制剂”)，只要是以信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质(以下也简单表示为“本发明中的结合抑制物质”)为有效成分即可，无特别限定，且作为所述的本发明中的结合抑制物质，只要是抑制某种脊椎动物的信号素4D与神经丛素B1的结合的物质即可，无特别限定，但可优选示例抗信号素4D抗体、抗神经丛素B1抗体、包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质。本发明中的结合抑制物质被认为抑制来源于破骨细胞的信号素4D与成骨细胞上的神经丛素B1受体的结合，经过RhoA的活化抑制和IRS信号的减少抑制，阻碍成骨细胞的分化抑制，从而促进基于成骨细胞的骨生成。本说明书中，“阻碍”一词与“抑制”一词无特别区分地使用。
上述的抗信号素4D抗体和抗神经丛素B1抗体(以下称为“本发明的抗体”)可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体及其功能性片段中的任一种，从特异性高等角度来看，较好是单克隆抗体。上述的抗信号素4D抗体和抗神经丛素B1抗体可使用信号素4D和神经丛素B1通过目前公知的方法制成。作为本发明的抗体的功能性片段是指对于作为本发明的抗体特异性结合的抗原的信号素4D和神经丛素B1特异性结合的抗体的片段，更具体可例举Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、二硫键连接的ＦＶ、单链ＦＶ（ｓｃＦＶ）及它们的聚合物等(D.J.King,《单克隆抗体的应用及工程(Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies)》,1998，T.J.国际公司(T.J.International Ltd))。这样的抗体片段可通过例如基于木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶的抗体分子的消化或公知的基因工程学方法获得。本发明的抗体中，只要不妨碍抗体或其功能性片段的抗体结合能力，为了便于操作也可在抗体或其功能性片段上附加肽或蛋白质。
此外，本发明的抗体包含人抗体。在此，本发明中的“人抗体”是指作为来源于人的抗体基因的表达产物的抗体。人抗体可通过向引入人抗体基因座而具有产生来源于人的抗体的能力的转基因动物给予信号素4D和神经丛素B1来获得。作为该转基因动物的例子，可例举例如小鼠。作为可产生人抗体的小鼠，可例举例如缺少内源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重链和小鼠κ轻链且同时具有包含人Ig重链基因的14号染色体片段(SC20)和人Igκ链转基因(KCo5)的小鼠。该小鼠通过具有人Ig重链基因座的系统A的小鼠与具有人Igκ链转基因的系统B的小鼠的交配制成。系统A对于内源性Ig重链和κ轻链破坏这两者是同源接合体，是保持可传给后代的14号染色体片段(SC20)的小鼠系统(Tomizuka.等,Proc Natl Acad Sci USA.,2000，97卷:722)。此外，系统B对于内源性小鼠Ig重链和κ轻链缺失这两者是同源接合体，是保持人Igκ链转基因(KCo5)的小鼠系统(Nat Biotechnol.,1996，14卷:845)。
本发明的多克隆抗体可通过例如以下所述的方法制造。可通过将信号素4D和神经丛素B1根据需要与免疫活化剂(弗氏佐剂(Freund's Adjuvant)等)一起对小鼠、兔、山羊、马等非人哺乳动物进行免疫而获得。本发明的单克隆抗体可通过由从免疫致敏动物获得的抗体产生细胞和不具有自我抗体产生能力的骨髓瘤系细胞(骨髓瘤细胞)制成杂交瘤，将杂交瘤克隆化，筛选产生对用于免疫的抗原显示特异的亲和性的单克隆抗体的克隆来获得。该杂交瘤的制备按照克勒()和米尔斯坦(Milstein)等的方法(Nature,1975，256卷:495-497)进行。产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可如下进行：将杂交瘤在例如微孔板中进行培养，使用例如ELISA等酶免疫测定法、放射免疫分析、荧光抗体法等免疫学方法测定对于可见增殖的孔中的培养上清的免疫抗原的反应性。
自杂交瘤的单克隆抗体的制造可通过将杂交瘤在体外进行培养而从培养上清分离。此外，也可在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等的腹水中于体内进行培养，从腹水分离。此外，可从杂交瘤等抗体产生细胞克隆编码单克隆抗体的基因，整合至合适的载体，将其导入宿主(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)中，使用基因重组技术制备重组型抗体(P.J.Delves,《抗体制备的主要技术(ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES)》,1997，约翰威立国际出版公司(WILEY)、P.Shepherd和C.Dean,《单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)》,2000，牛津大学出版社(OXFORD UNIVERSITY PRESS)、J.W.Goding,《单克隆抗体:原理及实践(MonoclonalAntibodies:principles and practice)》,1993，学术出版社(ACADEMICPRESS))。
另外，也可使用转基因动物制备技术制备目标抗体的基因整合至内源性基因中的转基因的牛、山羊、绵羊或猪，从该转基因动物的乳汁中获取大量来源于该抗体基因的抗体。
所产生的抗体可通过适当组合例如采用蛋白质A柱的色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、硫铵盐析法、凝胶过滤、亲和色谱法等本领域中公知的方法来进行纯化。
所述的包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质可通过捕获信号素4D来抑制信号素4D与神经丛素B1的结合。作为所述蛋白质，只要是包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质即可，无特别限定，还可优选例示与抗体的恒定区(较好是任意的免疫球蛋白的Fc片段)融合的蛋白质。
上述的抗信号素4D、抗神经丛素B1、包含神经丛素B1的细胞外区域的蛋白质可通过例如下述方法等目前公知的方法获得：基于这些蛋白质的序列信息，制成包含该序列的表达载体，将该表达载体转化至适当的宿主细胞中而在细胞内生成目标蛋白质，分离该目标蛋白质。例如人的信号素4D的DNA序列(序列编号1)和氨基酸序列(序列编号2)揭示于例如GenBank的登录号NM_001142287，而人的神经丛素B1的DNA序列(序列编号3)和氨基酸序列(序列编号4)揭示于例如GenBank的登录号NM_001130082。此外，人的神经丛素B1的细胞外区域与上述的登录号NM_001130082的氨基酸序列的氨基酸编号1～1490对应。
某物质是不是信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质例如可通过下述方法容易地确认：在存在该物质的条件下和不存在该物质的条件下，通过免疫印迹分析等测定信号素4D与神经丛素B1的结合，考察在存在该物质的条件下该结合是否下降。
本发明中的骨生成促进效果是指促进骨生成的效果，更好是包括通过阻碍成骨细胞的分化抑制而促进基于成骨细胞的骨生成的效果。某物质是不是具有骨生成促进效果可通过下述方法确认：向骨量比通常低的脊椎动物(较好是骨质疏松症患者、骨质疏松症模型脊椎动物)给予该物质，考察骨量是否增加。
本发明中的骨疾病的预防及治疗效果是指预防及/或治疗本发明中的某种骨疾病的效果，或者改善其症状的效果。某物质是不是具有骨疾病的治疗效果可通过下述方法确认：向罹患骨疾病的患者或脊椎动物(较好是骨质疏松症患者、骨质疏松症模型脊椎动物)给予该物质，考察该骨疾病是否治愈或改善。
本发明的制剂可仅包含本发明中的结合抑制物质，但也可添加药学上允许的通常的载体、抗氧化剂、粘合剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、pH缓冲剂、崩解剂、增溶剂、助溶剂、等渗剂等各种制剂用配合成分。作为本发明的降低剂的剂型，可以是粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等固体制剂，也可以是溶液剂、乳剂、混悬剂等液体制剂。这些制剂可通过对本发明中的结合抑制物质进行基于常规方法的处理来适当制备。
作为本发明的制剂的给药方法，只要是可获得所需的骨生成促进效果或所需的骨疾病的预防及治疗效果即可，无特别限定，可以非口服给药或口服给药。作为非口服给药的方法，可例示血管内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、经鼻给药、经肺给药等，其中可优选例示血管内给药，其中更优选例示静脉内给药。此外，本发明的制剂的给药量、给药次数和给药浓度可根据给药对象的体重和骨疾病的种类、骨疾病的症状的程度等适当调节。
作为本发明的制剂的给药对象，可例示脊椎动物，其中可优选例示属于哺乳类的动物和属于鸟类的动物，其中可更优选例示人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、马、兔、绵羊、山羊、猫、狗、鸡、鹌鹑等，其中可进一步优选例示人、家畜及家禽类。此外，从获得更稳定、良好的骨生成促进效果和骨疾病的预防及治疗效果的观点来看，作为本发明的制剂所含的本发明中的结合抑制物质发挥结合抑制作用的信号素4D和神经丛素B1的来源的脊椎动物的种类，较好是与作为本发明的制剂的给药对象的脊椎动物的种类一致。作为信号素4D的来源的脊椎动物与作为神经丛素B1的来源的脊椎动物的种类可以相同或不同。
作为本发明中的骨疾病的种类，只要是与由骨生成的降低导致的骨疾病或骨生成的降低相关的骨疾病即可，无特别限定，可优选例示骨折、骨缺损、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少症、腰背痛、变形性骨炎、强直性脊柱炎、风湿性关节炎、变形性关节炎、成骨不全症、骨多孔症，其中可更优选例示骨质疏松症、骨软化症、骨质减少症、成骨不全症。
本发明的判定方法是骨生成促进剂的有效成分的候选物质的判定方法，其特征在于，确定被检物质是不是信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质，所述被检物质是所述结合抑制物质的情况下，将所述被检物质判定为骨生成促进剂的有效成分的候选物质。作为上述的判定方法中确定被检物质是不是信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质的方法，可优选例示包括以下的工序(A)～(D)的方法：
(A)在被检物质的存在下，使信号素4D与神经丛素B1接触的工序；
(B)测定信号素4D与神经丛素B1的结合程度的工序；
(C)将通过上述工序(B)测定的程度与不存在被检物质的条件下的结合程度比较的工序；
(D)通过上述工序(B)测定的程度比不存在被检物质的条件下的结合程度低的情况下，将该被检物质确定为信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质的工序。
上述判定方法中，可作为信号素4D采用标记了的信号素4D细胞外区域或信号素4D细胞外区域与免疫球蛋白Fc区域等的融合蛋白质，作为神经丛素B1采用其表达于细胞表面的蛋白质，分别测定结合的程度。或者，可作为神经丛素B1采用标记了的神经丛素B1细胞外区域或神经丛素B1细胞外区域与免疫球蛋白Fc区域等的融合蛋白质，作为信号素4D采用其表达于细胞表面的蛋白质，分别测定结合的程度。
本发明的判定方法中的被检物质无特别限定，可以是预先已知具有抑制信号素4D与神经丛素B1结合的活性的物质，也可以是不清楚是否具有所述活性的物质。此外，作为被检物质，可同时使用多种被检物质。同时使用多种被检物质时，可分别在不同的样品内同时使用单独的被检物质，也可在单一样品内同时使用多种被检物质，还可准备多种使用多种被检物质的单一样品并同时使用。在单一样品内同时使用多种被检物质时，有时通过一次试验无法确认这些被检物质中的哪一个是信号素4D与神经丛素B1的结合抑制物质，但如果分阶段缩小被检物质的范围而进行多次试验，则可确认哪一种被检物质是该结合抑制物质。本发明的判定方法也可用作以从被检物质中搜寻骨生成促进剂的有效成分的候选物质为特征的骨生成促进剂的有效成分的候选物质的筛选方法。
作为本发明的其它形式，可例举(a)上述的骨生成促进剂或骨疾病的预防剂及治疗剂的制备中的本发明的结合抑制物质的用途、(b)用于骨生成促进和骨疾病的预防及治疗的本发明的结合抑制物质、(c)将本发明的结合抑制物质用于骨生成的促进或骨疾病的预防及治疗的方法、(d)通过向对象脊椎动物给予本发明的结合抑制物质来促进骨生成的方法、(e)通过向对象脊椎动物给予本发明的结合抑制物质来预防及治疗骨疾病的方法。
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
[小鼠和骨表型的分析]
Sema4d-/-、Plxnb1-/-、神经丛素B2敲除(Plxnb2-/-)、CAT-RhoA DN和α1(I)-Cre小鼠的制备按照文献中所记载的方法进行(W.Shi等,Immunity13,633(2000年11月)、R.H.Friedel等,J Neurosci27,3921(2007年4月4日)、R.H.Friedel等,Proc Natl Acad Sci U S A102,13188(2005年9月13日)、K.Kobayashi等,J Neurosci24,3480(2004年4月7日)、R.Dacquin,M.Starbuck,T.Schinke,G.Karsenty,Dev Dyn224,245(2002年6月))。所有的小鼠与C57BL/6小鼠回交8次以上。所有小鼠维持无特异性病原菌的状态。全部的动物实验得到东京医科齿科大学的动物实验委员会的认可，符合相关指导方针和法律。对于骨表型，采用各种基因改变小鼠并将其同腹小鼠作为对照，分别对雌雄各8只进行分析。三维显微CT(μCT)分析和组织形态测量的分析按照文献中所记载的方法进行(K.Nishikawa等,J Clin Invest120,3455(Oct1，2010年10月1日)、T.Koga等,Nature428,758(2004年4月15日))。
[骨髓嵌合体小鼠]
骨髓嵌合体小鼠的制备通过将文献(B.Zhao等,Nat Med15,1066(2009年9月))中所记载的方法部分改变后进行。即，采集野生型Sema4d-/-同腹小鼠的供体骨髓细胞(C57BL6-Ly5.2背景)，将从各供体得到的2×106细胞向经照射致死放射线的野生型受体小鼠(3周龄，C57BL/6-Ly5.1背景)或Sema4d-/-小鼠的尾静脉进行静脉内给药。骨髓移植8周后，实现了高水平的供体型嵌合状态(＞95％)。
[GeneChip分析]
GeneChip分析按照文献(K.Nishikawa等,J Clin Invest120,3455(2010年10月1日))中所记载的方法进行。即，进行基于使用总RNA的逆转录的cDNA合成后，通过在体外转录，从而合成进行了生物素标记的cRNA。将cRNA片段化后，按照文献(T.Koga等,Nat Med11,880(2005年8月)、H.Takayanagi等,Dev Cell3,889(2002年12月))的记载进行使用小鼠A430GeneChip(昂飞公司(Affymetrix社)制)的杂交。
[体外的向成骨细胞的分化诱导]
体外的向成骨细胞和破骨细胞的分化诱导按照文献(T.Koga等,NatMed11,880(2005年8月)、H.Takayanagi等,Dev Cell3,889(2002年12月))中所记载的方法进行。即，通过将来源于头盖骨的细胞在骨生成培养基(50μM的抗坏血酸、10nM的地塞米松和10mM的β-甘油磷酸盐)中进行培养来进行分化诱导，分化诱导的确认通过碱性磷酸酶(ALP)试验(7天后)和骨结节形成分析(21天后，茜素红染色)进行。每3天添加Fc-sema4D、抗Sema4d抗体和抗神经丛素B1抗体(抗Plexin-B1抗体)。破骨细胞上清在核因子κB活化受体配体(RANKL，派普泰克公司(Peprotech社)制)刺激后从野生型和Sema4d-/-细胞的各培养液回收。将培养破骨细胞用胶原被覆培养皿(岩城硝子株式会社(ＩＷＡＫＩ社)制)培养，RANKL刺激2天后通过胰蛋白酶处理进行回收。破骨细胞上清作为含上述试剂的骨生成培养基使用，每3天添加到培养破骨细胞(1×105细胞/孔，24孔板)中。
[定量实时RT-PCR分析]
定量实时RT-PCR使用Light Cycler(罗氏公司(Roche社)制)装置和SYBRGreen(东洋纺株式会社(TOYOBO社)制)按照制品实验方法进行。使用以下的引物。
Plxnb1正义引物:5’-tgggtcatgtgcagtacgat-3’(序列编号5)、
Plxnb1反义引物:5’-cactgctctccaggttctcc-3’(序列编号6)、
Plxnb2正义引物:5’-aggggagcctctctacaagc-3’(序列编号7)、
Plxnb2反义引物:5’-tcgatcccttcatcctgaac-3’(序列编号8)、
Plxnb3正义引物:5’-atatgctgagcgtgccttct-3’(序列编号9)、
Plxnb3反义引物:5’-tgctgttgagcaaattggag-3’(序列编号10)、
CD72正义引物:5’-gccttctcctgtcctgtctg-3’(序列编号11)、
CD72反义引物:5’-cctcctggaactgctgagac-3’(序列编号12)、
Alpl正义引物:5’-aacccagacacaagcattcc-3’(序列编号13)、
Alpl反义引物:5’-gcctttgaggtttttggtca-3’(序列编号14)、
Bglap正义引物:5’-gcgctctgtctctctgacct-3’(序列编号15)、
Bglap反义引物:5’-accttattgccctcctgctt-3’(序列编号16)、
Col1a1正义引物:5’-gagcggagagtactggatcg-3’(序列编号17)、
Col1a1反义引物:5’-gttcgggctgatgtaccagt-3’(序列编号18)、
Gapdh正义引物:5’-acccagaagactgtggatgg-3’(序列编号19)、
Gapdh反义引物:5’-cacattgggggtaggaacac-3’(序列编号20)。
mRNA表达的水平通过Gapdh表达的水平标准化。
[腺病毒和逆转录病毒基因导入]
承载RhoA(Myc-V14Rho)及Rac(hRac1V12)的构成的活化型(CA)和RhoA(Myc-N19Rho)及Rac1(hRac1V12)的显性失活型(DN)的腺病毒载体的制备方法及它们的导入方法按照文献(Bito,H.等，《在哺乳动物CNS神经元中决定轴突生长中的Rho相关激酶p160ROCK的关键性作用(A critical rolefor a Rho-associated kinase,p160ROCK,in determining axonoutgrowthin mammalian CNS neurons.)》,Neuron26,431-441(2000))中所记载的方法进行。同时表达绿色荧光蛋白质(EGFP)和3种神经丛素B1(野生型[Plexin-B1]、不会引发R-Ras的GTP酶活化的突变型[Plexin-B1RA]和无法活化RhoA的突变型[Plexin-B1DPDZ-EGFP])的逆转录病毒载体(pMXs-Plexin-B1-EGFP、pMXs-Plexin-B1RA-EGFP和pMXs-Plexin-B1DPDZ-EGFP)的制备通过向pMXs-IRES-EGFP分别插入Plexin-B1、Plexin-B1RA(I.Oinuma,Y.Ishikawa,H.Katoh,M.Negishi,Science305,862(2004年8月6日))和Plexin-B1DPDZ(V.Perrot,J.Vazquez-Prado,J.S.Gutkind,J Biol Chem277,43115(2002年11月8日))的cDNA片段来进行。重组逆转录病毒的制备按照文献(S.Morita,T.Kojima,T.Kitamura,Gene Ther7,1063(2000年6月))中所记载的方法进行。即，通过将制成的逆转录病毒载体导入Plat-E细胞来进行逆转录病毒的包装。
[对于OVX诱导骨量减少的抗Sema4D抗体处理]
通过OVX(卵巢摘除)诱导的骨质疏松症模型小鼠的制备按照文献(M.Shinohara等,J Biol Chem282,17640(2007年6月15日))中所记载的方法进行。即，对7周龄的雌性小鼠进行卵巢摘除或假手术。这些模型小鼠中，各组检查超过6只小鼠。为了考察对于骨量减少是否有预防效果，按照以下所示的方法进行验证。即，对于OVX小鼠，自术后3天至8周，每周1次从尾静脉将20μg的抗Sema4D抗体(MBL公司制)或生理食盐水进行静脉注入。术后8周后将所有的小鼠处死，进行μCT分析和骨形态形成分析。此外，为了考察对于减少的骨量是否有促进效果，按照以下所示的方法进行验证。即，OVX的6周后，3周内每3天向OVX小鼠从尾静脉将20μg的抗Sema4D抗体(MBL公司制)或生理食盐水进行静脉注入。术后9周后将所有的小鼠处死，供于μCT分析。
[免疫印迹分析、钓饵分析和免疫荧光染色]
将头盖骨细胞用骨生成培养基(50μM的抗坏血酸、10nM的地塞米松和10mM的β-甘油磷酸盐)培养2天，然后用Fc-Sema4D进行刺激。将经纯化的人IgG(Fc部分)(贝克曼库尔特公司(BECKMAN COULTER社)制)用于钓饵分析的阴性对照(时间0)。在所示的时间点采集细胞，进行使用抗Plexin-B1抗体(克隆A-8，圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz社)制)、抗PDZ-RhoGEF抗体(多克隆，蛋白质表达公司(ProteinExpress社)制)、抗LARG抗体(多克隆，莱夫斯班生物科技公司(LIFESPAN CIOSCIENCES社)制)、抗phospho-Akt抗体(Thr308)(多克隆，赛信通公司(Cell Signaling社)制)、抗Akt抗体(多克隆，赛信通公司制)、抗phosphor-ERK抗体(Thr202/Tyr204)(多克隆，赛信通公司制)、抗ERK抗体(多克隆，赛信通公司制)、抗Met抗体(克隆25H2，赛信通公司制)、抗ErbB2抗体(克隆29D8，赛信通公司制)、抗Rac1抗体(克隆102/Rac1，BD公司(BD Transduction laboratories社)制)、抗RhoA抗体(克隆55/Rho，BD公司制)、抗cadherin-11抗体(多克隆，英杰公司(Invitrogen社)制)、抗IRS1抗体(克隆58-10C-31，默克密理博公司(MILLIPORE社)制)和抗b-肌动蛋白抗体(克隆AC40，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich社)制)的免疫印迹分析或钓饵分析。神经丛素B1、Met、ErbB2和IRS1的磷酸化在使用与它们分别对应的特异性抗体的免疫沉淀后通过抗磷酸化酪氨酸抗体(4G10，阿普斯泰特生物公司(Upstate社)制)检测。为了检测与信号素4D结合的神经丛素B1，细胞溶解产物与同蛋白质A-琼脂糖珠结合的Fc-sema4D(500ng)孵育，使用抗Plexin-B1抗体进行免疫印迹分析。GTP酶的活化的检测按照文献(M.Shinohara等,J Biol Chem282,17640(2007年6月15日))的记载进行。即，将头盖骨细胞用Fc-sema4D进行处理，在所示的时间点进行采集。将细胞溶解产物与同谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(glutathione sepharose)结合的GST-RBD(RhoA用)或GST-PAK1(Rac1用)(2μg)孵育，进行分别使用抗RhoA抗体或抗Rac1抗体的免疫印迹分析。作为免疫荧光染色用，将细胞用4％多聚甲醛固定后，进行渗透处理，然后用Alexa Fluor488标记二次抗体和罗丹明共轭鬼笔环肽(分子探针公司(Molecular Probes社)制)染色。
[流式细胞术]
为了分析来源于骨髓的细胞和头盖骨细胞，将从骨髓和头盖骨制备的单个细胞浮游液用8种共轭有荧光染料的单克隆抗体[共轭有PerCP.Cy5.5的抗CD45.2抗体、共轭有FITC的抗CD45.2抗体(克隆104)、共轭有eFluor450的抗CD11b抗体(克隆M1/70)、共轭有PE的抗CD105抗体(克隆MJ7/18)、共轭有Alexa Fluor647的抗CD106抗体(克隆4.29E+02)、共轭有APC-Alexa Fluor750的抗CD44抗体、共轭有AC-Cy7的抗CD44抗体(克隆IM7)和共轭有APC的抗Sca-1抗体(克隆D7)(电子生物科技公司(eBioscience社)制)]染色。然后，通过Diva软件(BD生物科技公司(BD Biosciences社)制)用FACSCantⅡ进行流式细胞术分析。
[细胞增殖分析]
将来源于骨髓的基质细胞用骨生成条件培养基进行培养，使用细胞增殖ELISA试剂盒(罗氏公司制)在人IgG的Fc部分或Fc-Sema4D的存在下分析成骨细胞分化前(第0天)或基于信号素4D刺激的成骨细胞分化过程(第14天)中的细胞增殖率，检测5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的导入。
[集落形成单位(CFU)分析]
将骨髓细胞以每孔3×106细胞点样至24孔板后，用含10％胎牛血清的α-MEM培养3天，然后改成骨生成条件培养基。集落形成单位-碱性磷酸酶(CFU-ALP)在第7天作为ALP阳性集落检出，CFU-成骨细胞(CFU-Ob)在第21天作为茜素红阳性集落检出。在第7天和第21天通过甲苯胺蓝染色检出集落的总数(CFU-成纤维细胞(CFU-F))。
[统计学分析]
所有的数据以平均值±SEM(n=5)表示。统计学分析使用学生氏T检验(Student’s t test)ANOVA，可能的话用邦弗朗尼检验(Bonferroni test)进行(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005，n.s.不显著)。结果为4次以上的另外的实验的代表例。
[结果]
为了考察作为轴突导向分子的信号素、蝶素、裂隙蛋白（Slit）和导向素（Netrin）是否参与骨重建，通过GeneChip分析进行破骨细胞和成骨细胞的mRNA的全基因组的筛选。即，对20种信号素、16种蝶素、6种裂隙蛋白（Slit）和6种导向素（Netrin）进行了分析，结果在破骨细胞中确认非常高的信号素4D的表达。另一方面，成骨细胞中，未确认到所述表达。这些结果表示破骨细胞形成过程中信号素4D被选择性表达诱导。
为了考察破骨细胞形成过程中被选择性表达诱导的信号素4D的功能，进行使用Sema4d-/-小鼠的骨骼系统的功能分析。通过μCT和骨形态形成分析，显示Sema4d-/-小鼠的骨量(图1)和骨小梁宽度(图2)与野生型小鼠(WT小鼠)相比显著增加。此外，Sema4d-/-小鼠的成骨细胞表面积(图3，左)、钙化的骨表面积(图3，中央)和骨形成率(图3，右)与野生型小鼠相比分别显著上升，但表示破骨细胞的骨吸收的参数(破骨细胞表面积(图4，左)、破骨细胞数(图4，中央)和被侵蚀的骨表面积(图4，右))没有变化。另外，观察到Sema4d-/-细胞中的体外的破骨细胞形成也正常。该结果提示信号素4D尽管特异性表达破骨细胞，但Sema4d-/-小鼠的高骨量的表型是由于成骨细胞导致的骨生成的增加。
为了考察Sema4d-/-小鼠的骨表型是否基于骨髓细胞系列的异常，使用包含破骨前体细胞的骨髓细胞进行过继免疫细胞移植。其结果是，与向野生型小鼠移植野生型骨髓细胞相比，向野生型小鼠移植Sema4d缺失骨髓细胞的情况下骨量增加(图5的左侧2个图)。另一方面，与向Sema4d-/-小鼠移植Sema4d缺失骨髓细胞相比，向Sema4d-/-小鼠移植野生型骨髓细胞的情况下骨量减少而恢复正常(图5的右侧2个图)。该结果显示，Sema4d-/-小鼠的骨表型是由于包含破骨细胞的造血类细胞的异常。此外，Sema4d-/-头盖骨细胞的骨结节形成中，未发现Sema4d-/-头盖骨细胞的骨结节的明显增加。这些结果提示，破骨细胞中表达的信号素4D起到抑制基于成骨细胞的骨生成的骨重建因子的作用。
为了具体考察对于成骨细胞的信号素4D的抑制效果，制成Fc-sema4D(I.Ishida等,Int Immunol15,1027(2003年8月))后，将所述Fc-sema4D添加至在骨生成条件下培养的头盖骨细胞。Fc-sema4D的添加与浓度成比例地抑制骨结节形成(图6)和成骨细胞标记物基因(ALP的活化，骨钙素[Bglap]和Ⅰ型胶原蛋白[Col1a1])的表达。这些结果表示Sema4D抑制成骨细胞的分化诱导，从而骨结节形成受到阻碍。另外，为了考察来源于破骨细胞的信号素4D是否参与骨生成的调节，在破骨细胞的培养上清或破骨细胞的存在下培养头盖骨细胞。野生型的破骨细胞的培养上清或与破骨细胞的共同培养中，对骨结节形成没有产生影响，而Sema4d-/-破骨细胞的培养上清或与Sema4d-/-破骨细胞的共同培养中，骨结节形成被显著促进。这些结果显示，破骨细胞介以至少部分可溶地生成的信号素4D抑制骨生成。此外，还应注意破骨细胞的上清还包含促进骨生成的1种或多种因子这一点。所述因子产生的骨生成促进效果被认为在不存在信号素4D的情况下发挥。
为了特定成骨细胞表达的信号素4D受体，通过定量实时RT-PCR对作为非淋巴细胞和淋巴细胞中的信号素4D受体已知的(K.Suzuki,A.Kumanogoh,H.Kikutani,Nat Immunol9,17(2008年1月))神经丛素B型和CD72的mRNA的表达进行分析。其结果是，神经丛素B1表达量在成骨细胞分化中显著增加(图7)。另一方面，神经丛素B2的表达量相当低，且神经丛素B3和CD72的表达几乎未检出(图7)。此外，进行了使用Fc-sema4D的钓饵分析，结果显示信号素4D与神经丛素B1相互作用(图8)。另外，还显示Fc-sema4D诱导神经丛素B1的磷酸化。已知信号素4D在与神经丛素B1结合时与酪氨酸激酶ErbB2形成复合物，ErbB2依存于信号素4D将自身和神经丛素B1磷酸化。成骨细胞中，抑制了ErbB2的激酶活性，因而神经丛素B1的依赖于信号素4D刺激的磷酸化减少。这些结果提示，神经丛素B1在成骨细胞起到信号素4D的主要受体的作用。此时，对Plxnb1-/-小鼠的骨表型进行了分析。与Sema4d-/-小鼠同样，Plxnb1-/-小鼠的骨量(图9)和骨小梁宽度(图10)与野生型小鼠相比，因成骨细胞骨生成的上升而显著增加。此外，Plxnb1-/-小鼠的成骨细胞表面积(图11)、钙化的骨表面积(图12)和骨形成率(图13)与野生型小鼠相比也分别显著上升，但表示破骨细胞的骨吸收的参数(破骨细胞表面积、破骨细胞数和被侵蚀的骨表面积)没有变化。这些结果提示，Plxnb1-/-小鼠的高骨量的表型与Sema4d-/-小鼠的高骨量的表型同样，是由于成骨细胞导致的骨生成的增加。Sema4d-/-破骨细胞中所确认的野生型成骨细胞产生的对骨结节形成的刺激效果未在Plxnb1-/-细胞中得到确认。该结果提示，神经丛素B1主要介以信号素4D识别成骨细胞。
信号素4D-神经丛素B1是怎样在成骨细胞中转换成抑制信号呢。抑制信号素-神经丛素系统主要通过介以Rho家族低分子GTP酶调节肌动蛋白细胞骨架的再构成，调节细胞形态形成和细胞迁移。此外，已知如果信号素4D与神经丛素B2结合，则在酪氨酸激酶ErbB2的存在下，RhoA活性被刺激，而信号素4D在其它酪氨酸激酶Met的存在下起到相反的作用(J.M.Swiercz,T.Worzfeld,S.Offermanns,J Biol Chem283,1893(2008年1月25日))。在此，对信号素4D活化RhoA的可能性进行了考察。对成骨细胞中的ErbB2和Met的表达量进行了分析，结果显示ErbB2的表达量比Met多得多。此外，信号素4D刺激诱导了ErbB2的磷酸化，但Met的磷酸化未诱导。另外，免疫印迹分析和钓饵分析显示，信号素4D使RhoA的GTP结合活化型增加，该活性特别是被Plxnb1-/-细胞抑制。另一方面，作为另一Rho家族的Rac1的活性未被信号素4D刺激影响。与该结果一致，使用腺病毒导入结构性活化型RhoA的情况下，头盖骨细胞中的骨结节形成被抑制，而导入显性失活RhoA的情况下，骨结节形成得到促进。另一方面，结构性活化型Rac1和显性失活RhoA没有对骨生成产生影响。这些结果提示，RhoA选择性介导对信号素4D-神经丛素B1的骨生成的抑制效果。神经丛素B1具有2个RhoGTP酶调节结构域，即GTP酶活化蛋白质(GAP)结构域和与Rho-GEF结合的PDZ-结合结构域(I.Oinuma,Y.Ishikawa,H.Katoh,M.Negishi,Science305,862(2004年8月6日)、J.M.Swiercz,R.Kuner,J.Behrens,S.Offermanns,Neuron35,51(2002年7月3日)、V.Perrot,J.Vazquez-Prado,J.S.Gutkind,J Biol Chem277,43115(2002年11月8日)、M.H.Driessens,C.Olivo,K.Nagata,M.Inagaki,J.G.Collard,FEBS Lett529,168(2002年10月9日))。实际上，钓饵分析和免疫印迹分析显示，作为Rho-GEF已知的PDZ-RhoGEF和LARG(白血病相关RhoGEF，leukemia associated RhoGEF)在成骨细胞中也与神经丛素B1结合。在此，为了判断上述GAP结构域和PDZ-结合结构域对于骨生成的抑制是否重要，制成2种神经丛素B1的突变体(PlexinB1-ΔPDZ和PlexinB1-RA)(I.Oinuma,Y.Ishikawa,H.Katoh,M.Negishi,Science305,862(2004年8月6日))(图14)。制成分别过度表达所述2种神经丛素B1的突变体与作为对照的野生型神经丛素B1(WT-Plexin-B1)的Plxnb1-/-头盖骨细胞后，通过Fc-sema4D进行刺激，对成骨细胞分化的抑制效果进行了评价。Plxnb1-/-细胞中，成骨细胞标记物(Alpl、Bglap和Col1a1)的mRNA表达所示的Fc-Sema4d的抑制效果通过WT-PlexinB1和PlexinB1-RA的过度表达恢复，但PlexinB1-ΔPDZ的过度表达未恢复。这些结果提示，RhoA特异性介导基于信号素4D的骨生成的抑制。
为了考察成骨细胞中的RhoA在体内的作用，使CAT-RhoA DN转基因小鼠(K.Kobayashi等,J Neurosci24,3480(2004年4月7日))与胶原蛋白α1(Ⅰ)-Cre转基因小鼠(R.Dacquin,M.Starbuck,T.Schinke,G.Karsenty,Dev Dyn224,245(2002年6月))交配，制成在成骨细胞中特异性表达显性失活RhoA(RhoA DNOB)小鼠。由于基于成骨细胞的骨生成被促进，RhoA DNOB小鼠的骨量(图15)和骨小梁宽度(图16)与野生型小鼠相比增加。此外，RhoADNOB小鼠的成骨细胞表面积(图17)、钙化的骨表面积(图18)和骨形成率(图19)与野生型小鼠相比显著上升，但表示破骨细胞的骨吸收的参数(破骨细胞表面积、破骨细胞数和被侵蚀的骨表面积)没有变化。所述骨表型与Sema4d-/-和Plxnb1-/-小鼠的骨表型同样。随着RhoA DNOB的表达在成骨细胞分化中增加，骨结节形成和成骨细胞标记物基因(Alpl、Bglap和Col1a1)的表达在来源于RhoA DNOB小鼠的头盖骨细胞中显著上升。此外，提示RhoADNOB细胞中增加的骨结节形成未被Fc-sema4d抑制，所以RhoA在信号素4D-神经丛素B1的下游介导抑制信号。
为了考察Sema4d的功能抑制对骨质疏松症是否有效，使用经过OVX(卵巢摘除)的闭经后骨质疏松症的模型小鼠进行了验证。即，将抗Sema4d抗体每周对OVX处理后的小鼠进行静脉内给药，考察对于骨量减少是否有预防效果。对骨组织进行了分析，结果在未给予抗Sema4d抗体的情况下，骨量减少，而通过给予抗Sema4d抗体，确认到骨生成的促进(成骨细胞表面积(图20)、骨量的增加(图21)和骨形成率(图22)的增加以及骨小梁间隔的减少(图23))。另一方面，表示破骨细胞的骨吸收的参数(破骨细胞数和被侵蚀的骨表面积)没有变化。这些结果显示，如果通过抗Sema4d抗体处理抑制信号素4D的功能，则具有预防骨质疏松症中的骨量下降的效果。另外，考察了信号素4D的功能抑制是否也对已经减少的骨量的治疗有效。即，OVX处理后，骨量减少6周后，在3周内每周3天通过尾静脉给予抗Sema4d抗体。对表示骨生成的参数(成骨细胞表面积、骨量的增加和骨形成率的增加以及骨小梁间隔的减少)进行了分析，结果确认到骨生成的促进(成骨细胞表面积(图26)、骨量的增加(图27)和骨形成率(图28)的增加以及骨小梁间隔的减少(图29))。因此，可知一度减少了的骨在上述OVX处理后恢复至每周给予抗Sema4d抗体的情况同等水平。即，确认到与预防骨量下降的情况同等程度的恢复。另一方面，表示破骨细胞的骨吸收的参数(被侵蚀的骨表面积)没有变化。此外，考察了信号素4D和神经丛素B1的功能抑制对骨结节形成的影响。使用小鼠成骨细胞和WT小鼠的破骨细胞的情况下，骨结节形成与抗Sema4D抗体的浓度成比例地得到促进(图24的上板左起第1个至第3个板)。另一方面，被Fc-sema4d抑制的骨结节形成与抗神经丛素B1抗体的浓度成比例地得到促进(图24的下板)。这些结果表示，如果通过抗Sema4d抗体处理或抗神经丛素B1抗体处理抑制信号素4D-神经丛素B1相互作用，则不仅抑制骨质疏松症中的骨量下降，而且具有促进骨量增加的效果。另外，考察了人成骨细胞中的信号素4D的功能抑制对骨结节形成产生的影响。即，使用从来源于人外周血单核细胞的CD14阳性细胞分化的破骨细胞(图25，下段)及其培养上清(图25，上段)进行了验证，如果除了所述破骨细胞及其培养上清之外向抗Sema4d抗体添加成骨细胞，则骨结节形成与抗Sema4d抗体的浓度成比例地得到促进(图25)。该结果表示，在人细胞中也支持上述闭经后骨质疏松症的模型小鼠中的结果，同时抑制信号素4D-神经丛素B1相互作用，这成为用于增加骨生成的新战略。
对于信号素4D的成骨细胞分化抑制的作用点进行了详细分析。即，通过流式细胞术分析，将Sema4d-/-小鼠中的骨髓造血干细胞(Sca-1+CD105+CD106+CD44+CD45.2-CD11b)数与野生型小鼠进行了比较，结果没有差异。此外，进行了细胞增殖分析，结果骨髓中的成骨前体细胞数在成骨细胞分化前因Sema4d而稍有增加(第0天)，成骨细胞分化过程中未因信号素4D刺激而产生变化(第14天)。根据CFU分析，通过信号素4D刺激，ALP表达和茜素所示的骨生成得到抑制。这些结果提示，信号素4D作用于成骨细胞分化阶段。
已知基于胰岛素样生长因子(IGF，Insulin-like growth factors)-1的胰岛素受体底物(IRS，Insulin receptor substrate)信号促进成骨细胞分化。在此，通过信号素4D刺激考察了涉及IRS信号Akt和ERK的磷酸化，结果所述磷酸化水平低。此外，作为IRS的活化指标的Tyr磷酸化也下降，这些结果提示信号素4D刺激使IRS信号下降。此外，可知活化型RhoA使Akt和ERK的磷酸化下降，反而作为RhoA抑制剂的Y-27632和RKI使这些磷酸化亢进。另外，还可知所述RhoA抑制剂诱导IRS信号中的活化型磷酸化的亢进。这些结果提示，信号素4D通过活化RhoA而诱导IRS信号的下降，抑制成骨细胞分化。
[总结]
通过以上的实验，将来源于破骨细胞的信号素4D鉴定为对于骨重建中的破骨细胞-成骨细胞间的传递重要的媒介物。骨重建通过由3个阶段(基于破骨细胞的骨吸收的开始、基于成骨细胞的向新的骨生成的过渡和新骨合成的结束(K.Matsuo,N.Irie,Arch Biochem Biophys473,201(2008年5月15日))形成的循环进行。破骨细胞中表达的Sema4d到破骨细胞吸收结束为止抗起到成骨细胞的分化被抑制的初期阶段的骨生成的抑制因子的作用。另外，还显示RhoA的活化在体内抑制成骨细胞骨生成。显示与过渡阶段相关的蝶素B2/EphB4也利用RhoA来调节骨生成(C.Zhao等,Cell Metab4,111(2006年8月))，Rho家族低分子GTP酶起到骨重建信号传递的协调者的作用。通过GeneChip分析，还显示含PDZ的RhoA特异性GEFArfgef12(LARG)(J.M.Swiercz,R.Kuner,J.Behrens,S.Offermanns,Neuron35,51(2002年7月3日)、V.Perrot,J.Vazquez-Prado,J.S.Gutkind,J Biol Chem277,43115(2002年11月8日))在成骨细胞中高表达。该结果证明了信号素4D-神经丛素B1-RhoA通路的重要性。此外，根据采用免疫荧光染色的分析，Fc-sema4D刺激后观察到钙粘蛋白11的下调，提示被调节的间隙连接能力的参与。间歇的甲状旁腺激素(PTH)处理是目前证明骨生成增加的唯一有效方法。开发中的抗Sost抗体作为新的骨生成剂受到瞩目，而以信号素4D-神经丛素B1-RhoA通路相关的因子为靶的抗体、抑制剂等可期待作为对于骨减少性疾病的新治疗剂。
工业上的可利用性
本发明可良好地用于骨生成的促进和骨疾病的预防及/或治疗的领域。

Claims (9)

1.抗信号素4D抗体或其功能性片段、或者抗神经丛素B1抗体或其功能性片段在对象的骨疾病的预防剂及治疗剂的制备中作为有效成分的应用，其特征在于，所述抗体或其功能性片段能抑制信号素4D与神经丛素B1的结合。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨疾病是骨折、骨缺损、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少症、腰背痛、变形性骨炎、强直性脊柱炎、风湿性关节炎、变形性关节炎或它们的组合。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述对象是人。
5.抗信号素4D抗体或其功能性片段、或者抗神经丛素B1抗体或其功能性片段在骨生成促进剂的制备中作为有效成分的应用，其特征在于，所述抗体或其功能性片段能抑制信号素4D与神经丛素B1的结合，且所述抗体或其功能性片段能促进成骨细胞的分化。
6.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗体或其功能性片段是单克隆抗体。
7.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗体的功能性片段是F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段、二硫键连接的FV片段、单链FV(scFV)片段或它们的聚合物。
8.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗体或其功能性片段是人抗体。
9.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述预防剂、治疗剂、骨生成促进剂的给药方法为口服给药、血管内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、经鼻给药、经肺给药或它们的组合。
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