CN103937692B - 一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法 - Google Patents

Abstract

一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法，属于食品生物技术领域。本发明提供一株新的可产β-葡萄糖苷酶的丝枝霉菌株，该丝枝霉菌株命名为丝枝霉（<i>Aphanocladium</i><i></i>sp<i>.</i>）SK34.001，保藏号为CCTCC？NO：M？2014090。本发明对β-葡萄糖苷酶产生菌丝枝霉进行斜面、种子、发酵三级培养；从发酵液中分离纯化得到β-葡萄糖苷酶酶粉。本发明提供的利用丝枝霉（<i>Aphanocladium</i><i></i>sp<i>.</i>）SK34.001生产β-葡萄糖苷酶的方法，其发酵工艺简单；酶易于提取；酶活高，酶性质稳定；可直接利用麸皮等废弃资源作为该菌株的培养基碳源，节省能源消耗，降低生产成本，具有广阔的市场应用前景。

Description

一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法

技术领域

本发明涉及一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，也称β-D-葡萄糖苷酶，它能够水解结合于底物末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内，它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。

β-葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，几乎在所有的生物体中都有存在，但来源不同，其性质各异。该酶对糖苷非糖部分的专一性不强，能水解许多β型的糖苷键。

β-葡萄糖苷酶除主要用于降解纤维素以外，还可应用于乳品工业来分解乳糖；催化葡萄糖发生转移反应和缩合反应合成功能性低聚糖，如低聚龙胆糖；作为风味酶应用于(果)酒、茶叶、果汁中起到增香或脱苦作用；另外，β-葡萄糖苷酶还可用来水解大豆异黄酮，制备高活性的大豆异黄酮苷元产品。

目前，国内外用于研究和制备β-葡萄糖苷酶的微生物主要有木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)。研究表明，许多曲霉属是生产高活力β-葡萄糖苷酶的优良菌株，且被认为是不会产生毒素的纤维素酶产生菌，因而研究比较深入。迄今为止，还没有丝枝霉(Aphanocladium)作为β-葡萄糖苷酶产生菌的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法。

本发明的技术方案，一株丝枝霉菌株，是本发明人等先前从腐殖土壤样品中分离筛选得到的一株可以高产β-葡萄糖苷酶的丝枝霉菌株，分类命名为丝枝霉（Aphanocladiumsp.）SK34.001，其保藏号为CCTCCNO：M2014090，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

所述菌株的核糖体DNAITS序列如SEQIDNO：1所示。

所述丝枝霉菌株CCTCCNO：M2014090生产β-葡萄糖苷酶的方法，步骤如下：

（1）斜面培养：取丝枝霉菌株CCTCCNO：M2014090进行斜面培养，采用PDA培养基，各组分以g/L计：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20；自然pH，115℃下灭菌30min；培养温度为25~35℃，培养时间3~8天；

（2）种子培养：采用牛肉膏蛋白胨培养基，各组分以g/L计：牛肉膏2~5，胰蛋白胨5~8，氯化钠2~5，自然pH，121℃灭菌20min；在250mL三角瓶装液30~50mL，将步骤（1）所得的斜面培养液进行种子培养，摇瓶转速150~200rpm，培养温度25~35℃，培养时间18~24h；

（3）发酵培养：发酵培养基组分以g/L计：麸皮20~40，硫酸铵4~6，磷酸二氢钾2~3，硫酸镁0.3~0.5，氯化钙0.3~0.5，自然pH，121℃灭菌20min；步骤（2）所得的种子培养液按体积百分数2%~5%接种量接种于发酵培养基中，摇瓶转速150~200rpm，培养温度25~35℃，培养时间3~8天；

（4）β-葡萄糖苷酶酶粉制备：将步骤（3）制得的发酵液在5000~10000rpm离心10~30min或过滤去除菌体即得发酵上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经硫酸铵沉淀、透析，最后将透析液进行冷冻干燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。

本发明中的β-葡萄糖苷酶活性，是通过使酶作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)，分解所生成的对硝基苯酚的量而测定。该酶的单位定义为每分钟生成1μmol对硝基苯酚的酶量。

本发明的有益效果：本发明为首次采用丝枝霉(Aphanocladium)作为β-葡萄糖苷酶的产生菌，该菌株培养方便，发酵工艺简单。其所产酶为胞外酶，易于提取，酶活高，酶性质稳定，可直接利用麸皮等废弃资源作为丝枝霉(Aphanocladium)的培养基碳源，节省能源消耗，降低生产成本，具有广阔的市场应用前景。

生物材料样品保藏：一株丝枝霉菌株，分类命名为丝枝霉(Aphanocladiumsp.)SK34.001，该菌株已于2014年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014090。

具体实施方式

实施例1

将丝枝霉菌株(Aphanocladiumsp.)SK34.001在下述条件下进行发酵：

斜面培养：采用PDA培养基，各组分以g/L计：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，自然pH，115℃灭菌30min。培养条件为：培养温度30℃，培养时间5天；

种子培养：采用牛肉膏蛋白胨培养基，各组分以g/L计：牛肉膏2.5，胰蛋白胨5.0，氯化钠2.5，自然pH，121℃灭菌20min。培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200rpm，培养温度30℃，培养时间24h；

发酵培养：发酵培养基组分以g/L计：麸皮35，硫酸铵4.0，磷酸二氢钾2.0，硫酸镁0.3，氯化钙0.3，自然pH，121℃灭菌20min。培养条件为：种子培养液按体积百分数2%接种量接种于发酵培养基中，摇瓶转速150rpm，培养温度30℃，培养时间7天，得到发酵液的酶活为5U/mL。

实施例2

β-葡萄糖苷酶酶粉制备：

将实施例1制得的发酵液在8000rpm的转速下离心30min去除菌体即得发酵上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经硫酸铵沉淀、透析，最后将透析液进行冷冻干燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。

<210>SEQIDNO：1

<211>596

<212>DNA

<213>丝枝霉（Aphanocladiumsp.）SK34.001

<400>1

tccgtaggtgaacctgcggagggatcattacagagtttacaactcccaaaccctcatgtg60

aacataccacgatgttgcttcggcggactcgccccggcgtccggacggcctagcgccgcc120

cgcggcccggatccaggcggccgccggagaccaccaaaactattttgtatcagcagtttt180

ttctgaatccgccgcaaggcaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttgg240

ttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcag300

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ataccgccggccccgaaatggagtggcggcccgtccgcggcgacctctgcgtagtaatcc480

aacctcgcaccggaaccccgacgtggccacgccgtaaaacaccccactttctgaacgttg540

acctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa596

Claims (2)

1.一株丝枝霉菌株，其分类命名为丝枝霉（Aphanocladiumsp.）SK34.001，其保藏号为CCTCCNO：M2014090，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述丝枝霉菌株CCTCCNO：M2014090生产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤如下：

（1）斜面培养：取丝枝霉菌株CCTCCNO：M2014090进行斜面培养，采用PDA培养基，各组分以g/L计：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20；自然pH，115℃下灭菌30min；培养温度为25~35℃，培养时间3~8天；

（2）种子培养：采用牛肉膏蛋白胨培养基，各组分以g/L计：牛肉膏2~5，胰蛋白胨5~8，氯化钠2~5，自然pH，121℃灭菌20min；250mL三角瓶装液30~50mL，将步骤（1）所得的斜面种子接种于种子培养基进行种子培养，摇瓶转速150~200rpm，培养温度25~35℃，培养时间18~24h；

（3）发酵培养：发酵培养基组分以g/L计：麸皮20~40，硫酸铵4~6，磷酸二氢钾2~3，硫酸镁0.3~0.5，氯化钙0.3~0.5，自然pH，121℃灭菌20min；步骤（2）所得的种子培养液按体积百分数2%~5%接种量接种于发酵培养基中，摇瓶转速150~200rpm，培养温度25~35℃，培养时间3~8天；

（4）β-葡萄糖苷酶酶粉制备：将步骤（3）制得的发酵液在5000~10000rpm离心10~30min或过滤去除菌体即得发酵上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经硫酸铵沉淀、透析，最后将透析液进行冷冻干燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。