CN103936598B - 基于新型质量差异标签的生物体系中羧酸类信号分子的相对定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于新型质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法，还提供一种由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对及其合成方法。所述质量差异标签分子对包含轻同位素标签分子和重同位素标签分子，其中两种标签分子为式(I)所示，所述轻/重同位素对存在于所述结构部分A和B中的任一部分或两部分中，其中：结构部分A中的轻/重同位素对选自由H/D，¹²C/¹³C和¹⁴N/¹⁵N组成的组中的一种或多种，或者结构部分B中的轻/重同位素对选自由H/D，¹²C/¹³C和¹⁶O/¹⁸O组成的组中的一种或多种。

Description

基于新型质量差异标签的生物体系中羧酸类信号分子的相对定量方法

技术领域

本发明提供一种基于新型质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法，所述方法是一种高灵敏度、高通量的相对定量方法。本发明还提供一种由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对及其合成方法。

背景技术

羧酸类信号分子是生物内天然存在的某些含羧基的化学分子，其作用是在细胞间和细胞内传递信息，参与调控生物生长发育的很多过程，其研究成果具有重大的应用价值。为了深入研究羧酸类信号分子的作用机理，有必要对它们的含量变化展开研究。但是，羧酸类信号分子的定量分析主要面临以下挑战：含量较低；生物体中存在其它高含量次生代谢产物的干扰；为了研究信号分子的时间-空间分布和/或互作网络，要求对多种信号分子及前体或代谢物同时进行含量分析；一些生物材料，如突变体，非常稀少珍贵；样品通量大，样品处理过程步骤多，耗时长。因此，羧酸类信号分子的检测难度很大，要求十分灵敏的、准确的、多种信号分子同时测定的高通量分析方法。

目前应用较多的定量方法是基于质谱仪的稳定同位素稀释法，在负离子模式下直接对羧酸类信号分子进行绝对定量分析。但该方法主要有以下两个缺陷：对一些信号分子无法检测或灵敏度差；需使用稳定同位素标记的信号分子标准品作为内标，有的难以获得，仅有的标准品种类稀少、价格昂贵。以上缺陷都限制了羧酸类信号分子的定量分析。

很多情况下，生物和植物学家更关注羧酸类信号分子在对比的一组样品中的含量差异，因而可以将蛋白质组学中的相对定量思路应用到此类信号分子的相对定量分析中。目前有报道的唯一相关的技术是利用3-溴-2-氧代丙基吡啶及其氘标试剂为质量差异标签研究了7个茉莉酸类信号分子的相对含量。但该方法的目标仅是一类信号分子，无法满足对多种类信号分子的同时相对定量分析及互作网络研究；此外，该体外标记方式的误差较大，因为对比样品在合并分析之前经过了单独的提取、衍生化标记和固相萃取处理，这些过程的误差无法补偿，且单独过固相萃取柱增加了分析的成本、时间和精力，样品通量较低[HuangYQ，etal.(2011)Useofisotopemassprobesformetabolicanalysisofthejasmonatebiosyntheticpathway.Analyst136：1515-1522]。

为弥补上述方法的不足，我们开发了基于新型质量差异标签的色谱-串联质谱法(LiquidChromatography-tandemMassSpectrometry，LC-MS/MS)对羧酸类信号分子进行相对定量分析。通过化学衍生化方法，使对比的两种样品(如对照组和处理组)在一步溶剂提取之后即分别与一对结构相同、但元素组成不同的质量差异标签，(2-溴乙基)三甲基溴化铵[BromocholineBromide(BETA)，分子式C₅H₁₃NBr₂，轻同位素标签分子]和其9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA[分子式C₅H₄D₉NBr₂，重同位素标签分子]反应，反应后，将对比的两种样品的反应产物合并进行后续的样品预处理及LC-MS/MS分析。得到的峰面积比即该羧酸类信号分子在一组对比样品中的相对含量。本方法首次实现了多种类羧酸类信号分子的同时、高灵敏、高通量、准确的相对定量分析，有助于推动羧酸类信号分子时间-空间分布及互作网络、代谢组学等相关研究的发展。

发明内容

在第一方面中，本发明提供一种由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对，所述质量差异标签分子对包含结构相同、但元素组成不同的两种标签分子，即轻同位素标签分子和重同位素标签分子，这两种标签分子为式(I)所示：

其中：

结构部分A中，R₁是H或者含有1-3个碳原子的低级烷基，

R₂是H或者含有1-3个碳原子的低级烷基，

R₃是H或者含有1-3个碳原子的低级烷基，

其中R₁、R₂和R₃可以是相同的或不同的；

结构部分B中，Y是H或O，

[C]_n是含有1-8个碳原子的直链、支链脂肪烷基，或

是含有5-7个碳原子的环烷基；

结构部分C中，X是I，Br，Cl或F；

所述轻/重同位素对存在于结构部分A和B中的任一部分或两部分中，其中：

结构部分A中的轻/重同位素对选自由H/D，¹²C/¹³C和¹⁴N/¹⁵N组成的组中的一种或多种，或者

结构部分B中的轻/重同位素对选自由H/D，¹²C/¹³C和¹⁶O/¹⁸O组成的组中的一种或多种。

具体地，关于式(I)中各个结构部分的定义参见表1。

表1式(I)中各个结构部分的定义：

在本发明的一个优选实施方案中，提供包含(2-溴乙基)三甲基溴化铵(BETA)和其9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA的质量差异标签分子对，所述标签分子对应于具有下述具体的取代基的式(I)化合物：其中所述结构部分A中，R₁、R₂和R₃是CH₃，所述结构部分B是C₂H₄，所述结构部分C中的X是Br；其中的轻/重同位素对是H/D，存在于结构部分A中，即结构部分A中，与N连接的三个甲基中的9个H均被其同位素D取代。

通常，轻同位素标签分子可以商购，或者按照常规方法合成。重同位素标签分子往往需要设计新的合成路线进行合成。

因此，在第二方面中，本发明提供一种合成(2-溴乙基)三甲基溴化铵(BETA)的9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA的方法，所述方法包括将D₉-三甲基胺在干燥甲醇作用下，于干冰-丙酮浴中与1，2-二溴乙烷反应，待反应混合物恢复至室温后，在室温搅拌2天，形成白色固体，纯化得到(2-溴乙基)三甲基溴化铵BETA的9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA。

在本发明的一个优选实施方案中，(2-溴乙基)三甲基溴化铵(BETA)可商购，例如，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号为B0577，(2-溴乙基)三甲基溴化铵(BETA)的9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA按下述步骤合成：

1.12gD₉-三甲基胺在6mL干燥甲醇作用下，于干冰-丙酮浴中与7.1mL1，2-二溴乙烷反应；

待反应混合物恢复至室温后，在室温搅拌2天；

形成的白色固体经过滤后用冷乙醚洗涤，最终得到2.64g产物D₉-BETA，产率62％。

利用¹H-核磁共振(¹H-NMR)、高分辨质谱(HR-MS)和高分辨串联质谱(HR-MS/MS)分析确证了合成的产物是D₉-BETA。D₉-BETA由本发明人首次合成。

本领域技术人员应该理解，在阅读了本发明关于设计BETA中季铵部分9个H被9个D取代的质量差异同位素标签用于相对定量分析的技术后，可以预测到：通过设计一系列的质量差异标签，方法可扩展应用到多组样品(n＞＝2)的羧酸类信号分子的相对定量分析中。一系列的质量差异标签的设计(见图1)包括但不限于：

a)式(I)中的A部分主要功能是对待测物进行结构修饰，使衍生化产物可以在正离子模式下测定从而增强方法的灵敏度，其结构可以为伯胺，仲胺或叔胺，其中的R₁、R₂和R₃可相同也可以不同，但胺碱性越强，灵敏度越高，此部分的重同位素可以是选自D、¹³C、¹⁵N中的一种或多种同位素，也可以是每种同位素不同数目的各种组合，以D₉-BETA为例，类似的结构也可以是D₈-BETA，D₇-BETA或D₆-BETA等；

b)式(I)中的B部分可以是直链、支链脂肪烷基或环烷基，也可以是Br原子(即，式(I)中的X)附近含羰基(即，式(I)中的Y是O原子)等电正性较强的基团，根据S_N2亲核取代反应机理，该部分电正性越强、α-C或β-C原子上的烃基越少或基团越小时，产生的空间位阻碍越小，反应越易进行，此部分的重同位素可以是选自D、¹³C和¹⁸O中的一种或多种同位素，也可以是每种同位素不同数目的各种组合，如Y是¹⁸O，与其相连的C可以是¹³C，也可以是¹²C；并且，也可以是A部分中重同位素与B部分中重同位素的组合；

c)式(I)中的C部分是离去基团，溴原子可以被I、Cl和F取代，但离去部分碱性越弱，反应越易进行，如I^-＞Br^-＞Cl^-＞F^-。

一旦合成了系列化的质量差异标签，待对比的多组样品分别差异衍生化后合并为一个样品，上样至一支固相萃取柱进行纯化及LC-MS/MS分析，更大程度地提高样品通量，节省样品处理过程中所需的人力、物力、成本和时间。

在第三方面中，本发明提供一种基于由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法，所述方法是一种高灵敏度、高通量的定量方法。

本发明的基于由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法包括下述步骤：

(1)分别称取等质量的待对比其中羧酸类信号分子含量的生物材料，分为对照组样品和处理组样品；

(2)将步骤(1)的对照组样品和处理组样品分别用适当的有机溶剂提取，离心后取上清液，室温下氮气吹干；

(3)将步骤(2)的产物分别复溶于乙腈，依次加入三乙胺作为缚酸剂，对照组样品与本发明第一方面所述的轻同位素标签分子进行衍生化反应，处理组样品与本发明第一方面所述的重同位素标签分子进行衍生化反应，将反应产物分别用氮气吹干；

(4)将步骤(3)的产物分别复溶于水，合并复溶后的溶液，上样至预先活化和平衡好的阳离子交换柱(对阳离子交换柱没有特别限定，只要能够纯化步骤(3)的产物即可，例如，可以是购自美国安捷伦公司的CBA柱)，经淋洗、洗脱，将洗脱液用氮气吹干；

(5)将步骤(4)的洗脱产物用含甲酸的乙腈溶液复溶，过滤，在正离子模式下进行液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析；

(6)按式(II)计算对照组样品和处理组样品中羧酸类信号分子的相对含量：

A1/A2＝C1/C2(II)

其中：

A1表示由轻同位素标签分子标记的对照组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

A2表示由重同位素标签分子标记的处理组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

C1表示对照组样品中羧酸类信号分子的含量；

C2表示处理组样品中羧酸类信号分子的含量。

在本发明的另一个优选实施方案中，提供一种基于包含BETA和其9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA的质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法，所述方法包括下述步骤：分别称取等质量的、要对比的生物材料，分为对照组样品和处理组样品；

将对照组样品和处理组样品分别用有机溶剂，如甲醇，200μL提取，离心后取出上清液，室温下氮气吹干；

将提取产物分别复溶于150μL乙腈，依次加入10μL2％三乙胺(TEA)为缚酸剂，对照组样品的提取产物与20μL200mMBETA进行衍生化反应，处理组样品的提取产物与20μL200mMD₉-BETA进行衍生化反应，涡旋后95℃下反应3.0h；

将衍生化反应的产物分别氮气吹干；

将吹干的衍生化反应的产物复溶于水，合并复溶后的溶液，上样至活化、平衡好的阳离子交换柱，经淋洗、洗脱，将洗脱液用氮气吹干；

将阳离子交换柱的洗脱产物用10％乙腈(含0.1％甲酸)70μL复溶，过滤，在正离子模式下进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，进样量5μL；

按式(II)计算对照组样品和处理组样品中羧酸类信号分子的相对含量。

本发明中尽早合并的策略既提高了方法的准确性，又提高了样品通量，节约了人力、物力、成本和时间。

原理及实施

羧酸类信号分子结构中含有羧基，其LC-MS/MS的常规测定方法是在负离子模式下直接测定。但质谱负离子模式的响应通常比正离子模式低。羧基与卤代烷烃BETA或D₉-BETA在经过一系列优化后选定的条件下发生S_N2亲核取代反应，生成酯类和氢溴酸，见图2。D₉-BETA的合成见图3。

优化的反应条件包括：溶剂种类，缚酸剂种类，BETA或D₉-BETA的用量，反应时间和温度。一种优化后的条件为：使用乙腈为溶剂，三乙胺(TEA)为缚酸剂，与一定量的BETA或D₉-BETA进行衍生化反应，衍生化反应的温度为95℃，反应时间为3.0h。

该化学衍生化反应有两个作用：一方面向对比的一组样品中的羧酸类信号分子分别引入质量差异标签，使产物具有质量差异而在质谱检测时被识别，作为相对定量的基础；另一方面修饰羧酸类信号分子的结构，在产物中引入永久带正电荷的季铵基团，在正离子检测时有很好的质谱响应，从而大幅改善方法的灵敏度，降低测试用生物材料的用量，为生物及植物学家提供便利。通过化学衍生化反应，使对比的一组样品(如对照组和处理组)在一步溶剂提取之后即分别与一对结构相同，但元素组成不同的质量差异标签，(2-溴乙基)三甲基溴化铵[BromocholineBromide(BETA)，分子式C₅H₁₃NBr₂，轻同位素标签]和其9氘代同位素标签D₉-BETA[分子式C₅H₄D₉NBr₂，重同位素标签]反应，对比的两样品合并进行后续的样品预处理及LC-MS/MS分析。由于对比样品中的羧酸类信号分子分别与质量数相差9的质量差异标签发生反应，得到的产物分子量也差9，因而在一级质谱中产物的准分子离子峰相差9而被质谱区分，通过多反应检测(MultipleReactionMonitoring，MRM)进行相对定量分析。得到的峰面积比即该羧酸类信号分子在一组对比样品中的相对含量。

计算公式的解释

对照组样品与处理组样品中羧酸类信号分子的相对含量计算公式：

A1/A2＝C1/C2(II)

其中：

A1表示由轻同位素标签分子标记的对照组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

A2表示由重同位素标签分子标记的处理组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

C1表示对照组样品中羧酸类信号分子的含量；

C2表示处理组样品中羧酸类信号分子的含量。

例如，当使用包含BETA和D₉-BETA的质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量时，式(II)中A1、A2、C1和C2的含义如下：

A1：BETA标记的对照组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

A2：D₉-BETA标记的处理组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

C1：对照组样品中羧酸类信号分子的含量；

C2：处理组样品中羧酸类信号分子的含量。

结果

利用¹H-核磁共振(¹H-NMR)、高分辨质谱(HR-MS)和高分辨串联质谱(HR-MS/MS)分析确证了首次合成的D₉-BETA的结构。以TMS为内标，D₂O为溶剂，¹H-NMR(300Hz，BrukerARX300NMRspectrometer)分析结果如下：3.737(s，4H)，图4。质谱配备电喷雾离子源(ESI)(WatersSynapt^TMG2高分辨质谱)，在正离子模式下监测，分析结果如下：HR-(ESI+)MS(质荷比，m/z)：[M]⁺175.0797，(计算值C₅H₄D₉NBr⁺，175.0796，误差0.6ppm)，见图5；HR-(ESI+)MS/MS(m/z)：[M]⁺106.9492，(计算值C₂H₄Br⁺，106.9491，误差0.9ppm)，见图6。

所考察的5大类、8种羧酸类信号分子包括水杨酸(SA)，生长素(吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚-3-丙酸(IPA)，吲哚-3-丁酸(IBA))，脱落酸(ABA)，茉莉酸类(JA，(+)-7-iso-JA-_L-Ile)和赤霉素(GA₄)。为了考察温度(70-95℃)对衍生化效率的影响，用8种信号分子的混标与BETA分别在70，80和95℃下进行衍生化反应，得到8种衍生化产物的峰面积结果见表2。结果显示，95℃下，所有产物峰的面积均最大，因此选定95℃为较优的反应温度。在最终确定的较优条件下，以上8种信号分子的衍生化效率高达78.9-99.9％，相对误差(SDs)不大于3.4％(n＝3)，反应效率高，重现性好。

由于衍生化反应对结构的修饰，羧酸类信号分子的检测限(LODs)达到埃摩尔水平，相对标准偏差(RSD)不大于9.5％(n＝6)；新方法的检测灵敏度较直接检测原形的方法有1-3个数量级(1.1-278倍)的显著提升，较目前已发表的、测定同样羧酸类信号分子的最灵敏的方法[ChenML，etal.(2012)Highlysensitiveandquantitativeprofilingofacidicphytohormonesusingderivatizationapproachcoupledwithnano-LC-ESI-Q-TOF-MSanalysis.JournalofChromatographyB905：67-74]有1-3个数量级(1.5-136倍)的提升，结果见表3。

通过将氘原子设计在亲水季铵基团附近，使差异标记后的一对产物色谱上共流出，消除了潜在的同位素效应，确保了方法的准确性。

在2-3个数量级的动态范围内(0.1-10及0.003-20)，所有羧酸类信号分子衍生化产物标准曲线的R²均达到0.99，RSD不大于10.1％，结果见表3。

建立了回收率高(68.9-98.7％)、重现性好(SDs不大于6.7％)的固相萃取处理方法，纯化效果好；方法在溶剂提取、衍生化后即合并对比样品，将其用同一根固相萃取柱纯化并进行LC-MS/MS分析，合并后待测的差异标记物互为内标，不仅大大提高了方法准确性，而且提高了样品通量，节约了成本和时间。

表2.不同温度下羧酸类信号分子BETA标记产物的峰面积

表3.本发明方法测定羧酸类信号分子BETA标记产物、常规方法直接测定原形及目前已发表的最灵敏的测定方法的LODs及本发明方法与其他两种方法灵敏度增加倍数比较

注：灵敏度增加倍数^d＝b/a；

灵敏度增加倍数^e＝c/a；

n.a.：无法提供

表4.本发明的基于新型质量差异标签BETA/D₉-BETA的LC-MS/MS法对羧酸类信号分子进行相对定量分析的线性范围及回归方程参数(n＝3).

本发明的有益技术效果：

本发明首次合成了D₉-BETA，并将其与BETA一起用做新颖的质量差异标签，建立的新方法成功实现了多种类羧酸类信号分子的同时相对定量分析，具有以下优势或积极效果：

1)适用于多种类羧酸类信号分子的同时相对定量分析，在信号分子的时间-空间分布及互作网络研究中有重要意义；

2)不必依赖于稳定同位素标记标准品的合成及供给，对很难合成或尚无稳定同位素标记标准品的信号分子可以给出含量差异信息，在信号分子的前体、代谢产物及代谢组学研究中具有广阔的应用前景；

3)灵敏度的大幅提升一方面可以给出离子化效率低、含量较低的羧酸类信号分子在对比样品材料中的相对含量信息，另一方面可降低样品材料用量，从而实现难以获得、来源异常珍贵的材料中的羧酸类信号分子的分析，方便了生物和植物学家的样品准备及取材；

4)对比的样品分别提取、衍生化后，先合并再上样至同一根固相萃取柱进行纯化及LC-MS/MS分析，标记后的一对产物互为内标，补偿了在纯化及LC-MS/MS分析中的误差，与[HuangYQ，etal.(2011)Useofisotopemassprobesformetabolicanalysisofthejasmonatebiosyntheticpathway.Analyst136：1515-1522]文献报道的先分别提取、衍生化、过不同的固相萃取柱纯化，再合并后进行LC-MS/MS分析的方法比，本发明中尽早合并的策略既提高了方法的准确性，又提高了样品通量，节约了人力、物力、成本和时间；

5)本领域技术人员阅读了本发明关于设计BETA中季铵部分9个H被9个D取代的质量差异同位素标签用于相对定量分析的技术后，可以预测到：通过设计一系列的质量差异标签，方法可扩展应用到多组样品(n＞2)的羧酸类信号分子的相对定量分析中。一旦有了系列化的质量差异标签后，对比的多组样品分别差异衍生化后合并为一个样品，上样至一支固相萃取柱进行纯化及LC-MS/MS分析，更大程度地提高样品通量，节省样品处理过程中所需的人力、物力、成本和时间。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.一系列质量差异标签结构及设计。

图2.羧酸类信号分子与新型质量差异标签BETA/D₉-BETA的差异衍生化反应式；

图3.D₉-BETA的合成路线；

图4.D₉-BETA的¹H-NMR谱图(D₂O为溶剂)；

图5.D₉-BETA的HR-(ESI+)MS谱图；

图6.D₉-BETA的HR-(ESI+)MS/MS谱图；

图7.BETA/D₉-BETA质量差异同位素标签用于0.8mgDW12天拟南芥中8种羧酸类信号分子对MeJA处理响应的相对定量分析结果(n＝8)。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

下述实施例中所用的试剂，除非另外指明，均为市售分析纯级别的试剂。

实施例1

合成(2-溴乙基)三甲基溴化铵(BETA)的9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA

1.12gD₉-三甲基胺在6mL干燥甲醇作用下，于干冰-丙酮浴中与7.1mL1，2-二溴乙烷反应；

待反应混合物恢复至室温后，在室温搅拌2天；

形成的白色固体经过滤后用冷乙醚洗涤，最终得到2.64g产物D₉-BETA，产率62％。

利用¹H-核磁共振(¹H-NMR)、高分辨质谱(HR-MS)和高分辨串联质谱(HR-MS/MS)分析确证合成了D₉-BETA。以TMS为内标，D₂O为溶剂，¹H-NMR(300Hz，BrukerARX300NMRspectrometer)分析结果如下：3.737(s，4H)，图4。质谱配备电喷雾离子源(ESI)(WatersSynapt^TMG2高分辨质谱)，在正离子模式下监测，分析结果如下：HR-(ESI+)MS(质荷比，m/z)：[M]⁺175.0797，(计算值C₅H₄D₉NBr⁺，175.0796，误差0.6ppm)，见图5；HR-(ESI+)MS/MS(m/z)：[M]⁺106.9492，(计算值C₂H₄Br⁺，106.9491，误差0.9ppm)，见图6。

实施例2

0.8mg干重(DW)模式植物拟南芥(Col-0)经茉莉酸甲酯(MeJA)处理及未处理12天全苗中以上8种羧酸类信号分子的相对定量分析

处理组样品的处理：向正常条件下生长10天的拟南芥全苗培养皿中加入4mL100mMMeJA(溶剂为0.1％乙醇)，10min后再将放入温室培养2天，取材后之后在液氮下研磨，冻干

对照组样品的处理：正常条件下生长10天的拟南芥全苗培养皿中加入4mL0.1％乙醇(空白溶剂)，10min后再将放入温室培养2天，取材后之后在液氮下研磨，冻干

分别称取0.8mg干重(DW)的对照组样品和处理组样品，分别经甲醇提取后室温下氮气吹干，分别复溶于150μL乙腈，依次加入10μL2％三乙胺(TEA)为缚酸剂，对照组样品与20μL200mMBETA进行衍生化反应，处理组样品与20μL200mMD₉-BETA进行衍生化反应，涡旋混匀后95℃下反应3.0h。将衍生化反应产物氮气吹干，复溶于水，并将对比的一组样品的衍生化反应的产物合并，上样至活化、平衡好的阳离子交换柱(购自美国安捷伦公司的CBA柱)，经洗涤、洗脱后氮气吹干，将洗脱产物用含甲酸的乙腈溶液复溶后过滤，进行LC-MS/MS分析，进样量5μL。

其中A1表示由BETA标记的对照组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；A2表示由D₉-BETA标记的处理组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

按照公式(II)，以测得的A1/A2做为纵坐标，以每个羧酸类信号分子为横坐标做图(见图7)，得到该实施例中8种羧酸类信号分子在对照组样品中的含量与处理组样品中含量的比值，即相对含量结果。以茉莉酸类JA为例，其A1/A2为0.00561±0.00067，可见，处理组样品中JA的含量比对照组中的含量有大幅度提升。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (3)

1.一种由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对，所述质量差异标签分子对包含轻同位素标签分子和重同位素标签分子，其中这两种标签分子为式(I)所示：

其中：

结构部分A中，R₁、R₂和R₃是CH₃；

结构部分B是C₂H₄，

结构部分C中，X是Br；

所述轻/重同位素对是H/D，存在于所述结构部分A中。

2.一种合成(2-溴乙基)三甲基溴化铵的9氘代同位素标记的标签分子D₉-(2-溴乙基)三甲基溴化铵的方法，所述方法包括将D₉-三甲基胺在干燥甲醇作用下，于干冰-丙酮浴中与1，2-二溴乙烷反应，待反应混合物恢复至室温后，在室温搅拌2天，形成白色固体，纯化得到(2-溴乙基)三甲基溴化铵的9氘代同位素标记的标签分子D₉-(2-溴乙基)三甲基溴化铵。

3.一种基于权利要求1的质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)分别称取等质量的待对比其中羧酸类信号分子含量的生物材料，分为对照组样品和处理组样品；

(2)将步骤(1)的对照组样品和处理组样品分别用适当的有机溶剂提取，离心后取上清液，室温下氮气吹干；

(3)将步骤(2)的产物分别复溶于乙腈，依次加入三乙胺作为缚酸剂，对照组样品与权利要求1所述的轻同位素标签分子进行衍生化反应，处理组样品与权利要求1所述的重同位素标签分子进行衍生化反应，将反应产物分别用氮气吹干；

(4)将步骤(3)的产物分别复溶于水，合并复溶后的溶液，上样至预先活化和平衡好的阳离子交换柱，经淋洗、洗脱，将洗脱液用氮气吹干；

(5)将步骤(4)的洗脱产物用含甲酸的乙腈溶液复溶，过滤，在正离子模式下进行液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析；

(6)按式(II)计算对照组样品和处理组样品中羧酸类信号分子的相对含量：

A1/A2＝C1/C2(II)

其中：

A1表示由轻同位素标签分子标记的对照组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

A2表示由重同位素标签分子标记的处理组样品中羧酸类信号分子标记产物的峰面积；

C1表示对照组样品中羧酸类信号分子的含量；

C2表示处理组样品中羧酸类信号分子的含量。