CN103911406A - 酶法还原合成（s）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法所述反应条件为pH6.0-7.5，以在大肠杆菌中高效共表达重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶及辅酶为催化剂，高产率、高纯度地制备还原（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物，其反应时间短，制备成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法，属于医药中间体的合成技术领域。
背景技术
(S)-3-羟基吡咯烷及其衍生物是生产多种医药和农药的关键中间体，如(S)-3-羟基吡咯烷是合成氢溴酸达非那新（Darifenacin hydrobromide）的关键手性原料，这是一种新型的治疗尿失禁药物；(S)-N-苄基-3-羟基吡咯烷可用于合成盐酸巴尼地平（Barnidipine hydrochlorate），一种长效二氢吡啶类钙离子拮抗剂的治疗高血压药物。
通常在使用(S)-3-羟基吡咯烷时，会采用N-保护的形式，如Boc-、Cbz-等N-保护形式。目前所熟知的(S)-3-羟基吡咯烷及其衍生物的合成方式有多种，大致分为以下几个途径：（1）以L-苹果酸、L-Glu或L-Asp等天然手性酸出发，经缩合、还原等进行，往往步骤复杂，均需多步反应，且涉及的手性原料及还原试剂价格昂贵；（2）以手性原料（S）-4-氨基-2-羟基丁酸、（S）-4-氯-3-羟基丁氰和（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯等，经还原或环化等途径进行，这些方式的手性原料成本高，难以获得，且合成步骤往往需要多步，工艺复杂；（3）以脂肪酶进行选择性拆分，(S)-和(R)-型产物均可获得。但脂肪酶拆分获得(S)-3-羟基吡咯烷的理论最高收率仅50%，产物的分离及纯化困难，往往需要硅胶柱层析等，难以工业放大。酶拆分的另一大缺陷是难以消旋化起始原料来获得较高的收率，目前原料消旋化仍没有可行的简便方法，因而脂肪酶的拆分成本居高不下。（4）以微生物或酶促羟基化方式，直接选择性羟基化吡咯烷及其N-保护的衍生物为相应的(S)- 或(R)-3-羟基吡咯烷。目前，该途径仅停留于理论研究和实验室阶段，底物浓度小于5g/L，没有实际生产意义。（5）以酮基还原酶（Ketoreductase）选择性还原3-氧代吡咯烷的衍生类似物，已有专利报道，[JP06/141876(1994);WO98/23768(1998)]，该专利以如下途径进行：
该(R)-还原产物可直接用于合成Panipenan，一种新型碳青霉素烯类强力广谱抗生素。
目前已有多种重要的手性药物中间体可用羰酰还原酶合成，包括纯酶和微生物全细胞或固定化酶/细胞等多种合成方式。通常在合成体系中还需加入辅酶再生酶，如葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase,GDH）和甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase,FDH）等。例如，4-氯-乙酰乙酸乙酯的不对称还原（如：Zhou,J.Am.Chem.Soc.1983105:5925-5926;Santaniello,J.Chem.Res.(S)1982:132-133;U.S.Pat.No.5,891,685等），其还原产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是他汀类药物的关键中间体之一；苯乙酮及其衍生物的不对称还原（如：U.S.Pat.No.6,800,477）；噻吩酮的不对称还原（WO2005/054491）。在医药工业界，仍有多种重要的前手性酮化合物需要开发羰酰还原酶工艺。
发明内容
本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法，所述反应过程如下所示：
P为CO2R、Si(R)3或苄基，其中R为取代的C1-6烷基、苄基或芴基，其取代基任选被Ar、Het或C1-6烷基取代，所述反应条件为PH6.0-7.5，以共表达重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶及辅酶为催化剂，所述重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶催化剂为液体溶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞，所述重组羰酰还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ.ID NO:1所示，所述重组葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如序列表SEQ.ID NO:2所示。
优选地，所述反应条件为pH6.5-7.0，所述重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶在基因工程菌中高效共表达。
优选地，所述基因工程菌为具有重组载体pETDuet-1的大肠杆菌。
一种发酵培养如以上所示的基因工程菌的方法，包括构建基因工程菌及基因工程菌的进一步发酵，所述基因工程菌的构建包括以下步骤：
对全基因合成的重组羰酰还原酶编码基因与葡萄糖脱氢酶编码基因分别经双酶切；再将其分别克隆至表达载体pETDuet-1的不同多克隆抗位点，重组质粒测序确认后，分别转化至表达大肠杆菌菌株，构建相应的重组菌株；
所述基因工程菌的进一步发酵包括如下步骤：
将以上所述的大肠杆菌菌株接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD600=0.8的新鲜培养液，加入过滤灭菌的氨苄青霉素溶液至终浓度为0.1mg/mL，37℃800rpm培养；培养2hr后补料， 通过浓氨水/盐酸调节pH7.0±0.1，当培养液的OD600达到25时，将罐温降至25℃，加入终浓度为1mmol/L IPTG，继续控制各培养条件诱导14hr，最后离心收获菌体。
本发明的有益效果主要体现在：采用重组羰酰还原酶、葡萄糖脱氢酶应用于本底物进行还原，产率高，产品光学纯度高，反应时间短，制备成本低。
具体实施方式
本发明揭示了一种以羰酰还原酶及其辅酶一步还原合成(S)-3-羟基吡咯烷及其衍生物，其制备过程如下反应式进行：
上式中，P为CO2R、Si(R)3或苄基，其中R为取代的C1-6烷基、苄基或芴基，其取代基任选被Ar、Het或C1-6烷基取代。
所述制备方法如下：将一摩尔的化合物I溶于500ml～2000ml的缓冲溶液中，在上述溶液中加入重量为化合物I的0.1～20%的基因重组羰酰还原酶、基因重组葡萄糖脱氢酶和辅酶，保持体系在15～45℃，优先在25～40℃；pH6.0～7.5，优选pH6.5～7.0，搅拌16-72小时，停止反应，用1000ml左右的有机溶剂萃取3次，合并有机相，干燥剂干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物II。通常化合物II手性纯度大于98%，可用于药物的制备。
所述缓冲溶液中可加入500ml-1000ml的有机溶剂，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、叔丁醇、已丙醇、四氢呋喃、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丁酯及甲苯。
所述的缓冲溶液为无机硫酸及无机磷酸盐或三乙醇胺盐酸缓冲盐。
所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾。
所述的化合物I中的P选自为叔丁氧羰基、苄氧羰基和芴氧羰基，优选为叔丁氧羰基。
重组羰酰还原酶及重组葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌高效共表达，其可以是液体溶液、冻干粉，也可以是固定化的酶或细胞。
所述的羰酰还原酶是体外进化，利用纯化的酶或用于其表达的大肠杆菌工程菌直接催化。其利用一种木兰假丝酵母Candida Mangoliae羰酰还原酶的变体，和野生型相比有34个氨基酸差别。
羰酰还原酶的序列优化，在野生型基础上围绕着增加活性、热稳定性和有机溶剂稳定性进行。主要采用以结构为基础的半定向进化和高通量筛选。最终所得的序列和野生型相比有34个氨基酸的差异。大多数突变集中在酶表面和亚基接触位点。基因序列按照大肠杆菌偏好的密码子修改，并消除可能影响表达的二级结构。优化后的羰酰还原酶在大肠杆菌（E.coli）中高效表达，酶活性是野生型的300倍以上，而且稳定性也显著增加。
所述的葡萄糖脱氢酶为体外进化，利用一种细菌Burkholderia sp.葡萄糖脱氢酶变体高效还原NADP+辅酶，和野生型相比有3个氨基酸差别。其基因序列按照大肠杆菌偏好的密码子修改，并消除可能影响表达的二级结构，该序列在E.coli高效表达。
优化后的羰酰还原酶高活性变体和葡萄糖脱氢酶在E.coli共表达 后，经过粗纯化，可高效催化3-氧代-吡咯烷的还原。
所述重组羰酰还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ.ID NO:1所示，所述重组葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如序列表SEQ.ID NO:2所示。
以下分别以重组羰酰还原酶及重组葡萄糖脱氢酶详细叙述其在大肠杆菌中的表达及活性测定。
实施例一：羰酰还原酶在E.coli中的表达及活性测定
全基因合成的重组羰酰还原酶编码基因经Nco I和Hind III双酶切后，克隆至表达载体pETDuet-1（厂家：Novagen产品编号：71146-3）的多克隆位点1，重组质粒经测序确认后，转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中，构建的重组菌株命名为pETDuet-KRED-BL21(DE3)。在氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含有相应抗生素的LB培养基中，37度充分培养，至OD600=0.6，3％比例接种到含氨苄青霉素的LB培养基。在细菌生长至OD600=0.7，将温度降至25度，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导过夜（16h）。离心收获菌体，-20℃冻存。SDS-PAGE检测表明，该羰酰还原酶约35.2KDa，目标蛋白表达量可至菌体总蛋白的65%。
将上述收获的E.coli菌泥，以100mM磷酸钠缓冲液（+150mM氯化钠，pH7.0）重悬至10g/L，以细胞超声破碎仪冰水浴超声10min（800W，工作1sec停3sec），离心（12,000rpm,4℃,10min），菌体裂解液上清即为粗酶液。粗酶的酶活测定体系如下：100mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）、5mM N-Boc-3-氧代吡咯烷、1mM NADPH（或NADH），30℃于340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟氧化1微摩尔NADPH（或NADH）所需要的酶量为一个羰酰还原酶酶活单位IU。蛋白含量采用Bradford法进行测定。结果显示该羰酰还原酶酶活约为13.8IU/mg。
实施例二：葡萄糖脱氢酶在E.coli中的表达及活性测定
全基因合成的葡萄糖脱氢酶编码基因经Nde I和Xho I双酶切后，克隆至表达载体pETDuet-1的多克隆位点2，重组质粒经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)中，构建的重组菌株命名为pETDuet-GDH-BL21(DE3)。在氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含相应抗生素的LB培养基中，37度充分培养，至OD600=0.6，3％比例接种到含氨苄青霉素的LB培养基。在细菌生长至OD600=0.7，将温度降至25度，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导过夜。离心收获菌体，-20℃冻存。SDS-PAGE检测表明，该葡萄糖脱氢酶约27.8KDa，目标蛋白表达量可至菌体总蛋白的60%。
将上述收获的E.coli菌泥，以100mM磷酸钠缓冲液（+150mM氯化钠，pH7.0）重悬至10g/L，以细胞超声破碎仪冰水浴超声10min（800W，工作1sec停3sec），离心（12,000rpm，4℃，10min），菌体裂解液上清即为粗酶液。粗酶的酶活测定体系如下：100mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）、250mM葡萄糖、1mM NADP+（或NAD+），30℃于340nm处测定吸光值的增加。酶活定义为每分钟还原生成1微摩尔NADPH（或NADH）所需要的酶量为一个葡萄糖脱氢酶酶活单位IU。蛋白含量采用Bradford法进行测定。结果显示该葡萄糖脱氢酶酶活约为30IU/mg。
实施例三：羰酰还原酶和葡萄糖脱氢酶在E.coli中的共表达
将葡萄糖脱氢酶编码基因经Nde I和Xho I双酶切后，克隆至实施例一所述的重组质粒pETDuet1-(MCS1)的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)中，构建的重组菌株命名为pETDuet-KRED-GDH-BL21(DE3)。在氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含相应抗生素的LB培养基中，37度充分培养，至OD600=0.6，3％比例接种到含氨苄青霉素的LB培养基。在细菌生长至OD600=0.7，将温度降至25度，加入1mmol/L IPTG诱导过夜。离心收获菌体， -20℃冻存。SDS-PAGE检测表明，羰酰还原酶与葡萄糖脱氢酶的表达量相当，总量可至菌体总蛋白的70%。
实施例四：重组羰酰还原酶的发酵和粗酶液制备
于100L发酵罐中加入以下物料：1Kg蛋白胨、0.5Kg酵母粉和0.5Kg氯化钠，pH自然。121℃灭菌20min。冷却至37℃时，接入1L以LB培养基（含氨苄青霉素）培养至OD600=0.8的新鲜pETDuet-KRED-BL21(DE3)培养液，加入过滤灭菌的氨苄青霉素溶液至终浓度为0.1mg/mL，37℃800rpm培养。培养2hr后补料，补料培养基为500g/L甘油、100g/L蛋白胨和50g/L酵母粉的溶液15L，浓氨水/盐酸调节pH7.0±0.1。当培养液的OD600达到25时，将罐温降至25℃，加入终浓度为1mmol/L IPTG，控制各培养条件诱导14hr。诱导结束后管式离心机最大转速离心收获菌体，湿重3.34Kg，4℃暂存备用。
将上述的3.34Kg湿重pETDuet-KRED-BL21(DE3)按1：5（v/v）重悬于100mM磷酸钠（+150mM氯化钠，pH7.0）缓冲液中，4℃低温保护下高压均质2遍：800bar+600bar各一遍。向上述裂解中加入聚乙烯亚胺至终浓度0.5%（w/v），4℃搅拌30min，离心机10,000rpm离心20min，保留上清液即为重组羰酰还原酶粗酶液，4℃避光保存。羰基还原酶酶活的测定按实施例一所述方法测定，为60.5IU/mL，蛋白浓度以Bradford法测定，粗酶蛋白浓度24.5mg/mL。
实施例五：重组葡萄糖脱氢酶的发酵和粗酶液制备。
于100L发酵罐中加入以下物料：1Kg蛋白胨、0.5Kg酵母粉和0.5Kg氯化钠，pH自然。121℃灭菌20min。冷却至37℃时，接入1L以LB培养基（含氨苄青霉素）培养至OD600=0.8的新鲜pETDuet-GDH-BL21(DE3)培养液，加入过滤灭菌的氨苄青霉素溶液至终浓度为0.1mg/mL，37℃800rpm培养。培养2hr后补料，补料 培养基为500g/L甘油、100g/L蛋白胨和50g/L酵母粉的溶液15L，浓氨水/盐酸调节pH7.0±0.1。当培养液的OD600达到25时，将罐温降至25℃，加入终浓度为1mmol/L IPTG，控制各培养条件诱导14hr。诱导结束后管式离心机最大转速离心收获菌体，湿重3.52Kg，4℃暂存备用。
将上述的3.52Kg湿重pETDuet-KRED-BL21(DE3)按1：5（v/v）重悬于100mM磷酸钠（+150mM氯化钠，pH7.0）缓冲液中，4℃低温保护下高压均质2遍：800bar+600bar各一遍。向上述裂解中加入聚乙烯亚胺至终浓度0.5%（w/v），4℃搅拌30min，离心机10,000rpm离心20min，保留上清液即为重组葡萄糖脱氢酶粗酶液，4℃避光保存。葡萄糖脱氢酶酶活的测定按实施例二所述方法测定，为720IU/mL，蛋白浓度以Bradford法测定，粗酶蛋白浓度31.2mg/mL。
实施例六：N-Boc-3-羟基吡咯烷的手性分析方法。
ee（手性HPLC）：Chiralpak IC150mm×4.6mm手性色谱柱；流动相：正己烷（90%）/IPA（10%）；流速：0.6mL/min；波长：210nm；保留时间：N-Boc-(S)-3-羟基吡咯烷15.78min，N-Boc-(R)-3-羟基吡咯烷18.66min。
实施例七：N-Boc-(S)-3-羟基吡咯烷的酶法转化合成。
N-Boc-(S)-3-羟基吡咯烷的合成按下反应式进行：
于一个250mL三颈瓶中，依次加入100mL、0.2mol/LNaH2PO4·Na2HPO4（pH7.0）缓冲溶液、化合物Ⅰ（10g）、葡萄糖（15 g）和50mL乙酸丁酯，磁力搅拌10min使混合均匀，再加入羰酰还原酶（10mL）、葡萄糖脱氢酶（5mL）和辅酶（NADP+，0.01g），于30摄氏度下搅拌16小时，控制pH6.5～7.0，高效液相色谱测定显示反应结束。过滤除酶后加入100mL乙酸乙酯，重复萃取三次，有机相干燥后旋干，得到9.4克化合物Ⅱ（N-Boc-(S)-3-羟基吡咯烷），按实施例五方法检测，其光学纯度ee值>99.5%，摩尔产率93.0%。
实施例七：利用羰酰还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达的E.coli细胞转化生产N-Boc-(S)-3-羟基吡咯烷。
于一个250mL三颈瓶中，依次加入100mL、0.2mol/LNaH2PO4·Na2HPO4（pH7.0）缓冲溶液、化合物Ⅰ（10g）、葡萄糖（15g）和50mL乙酸丁酯，磁力搅拌10min使混合均匀，再加入0.8g利用实施例三所述表达得到的羰酰还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达的E.coli细胞（pETDuet-KRED-GDH-BL21(DE3)），和辅酶（NADP+，0.01g），30摄氏度下搅拌16小时，控制pH6.5～7.0，高效液相色谱测定显示反应结束。过滤除酶和细胞碎片后，加入100mL乙酸乙酯，重复萃取三次，有机相干燥后旋干，得到8.9克化合物Ⅱ（N-Boc-(S)-3-羟基吡咯烷），光学纯度ee值>99.5%，摩尔产率88.0%。
本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
Claims (4)
1.酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法，所述反应过程如下所示：
其特征在于：P为CO2R、Si(R)3或苄基，其中R为取代的C1-6烷基、苄基或芴基，其取代基任选被Ar、Het或C1-6烷基取代，所述反应条件为pH6.0-7.5，以共表达重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶及辅酶为催化剂，所述重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶催化剂为液体溶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞，所述重组羰酰还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ.ID NO:1所示，所述重组葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如序列表SEQ.ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法，其特征在于：所述反应条件为pH6.5-7.0，所述重组羰酰还原酶和重组葡萄糖脱氢酶在基因工程菌中高效共表达。
3.根据权利要求1所述的酶法还原合成（S）-3-羟基吡咯烷及其衍生物的方法，其特征在于：所述基因工程菌为具有重组载体pETDuet-1的大肠杆菌。
4.一种发酵培养如权利要求3所示的基因工程菌的方法，其特征在于：包括构建基因工程菌及基因工程菌的进一步发酵，所述基因工程菌的构建包括以下步骤：
对全基因合成的重组羰酰还原酶编码基因与葡萄糖脱氢酶编码基因分别经双酶切；再将其分别克隆至表达载体pETDuet-1的不同多克隆抗位点，重组质粒测序确认后，分别转化至表达大肠杆菌菌株，构建相应的重组菌株；
所述基因工程菌的进一步发酵包括如下步骤：
将以上所述的大肠杆菌菌株接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD600=0.8的新鲜培养液，加入过滤灭菌的氨苄青霉素溶液至终浓度为0.1mg/mL，37℃800rpm培养；培养2hr后补料，通过浓氨水/盐酸调节pH7.0±0.1，当培养液的OD600达到25时，将罐温降至25℃，加入终浓度为1mmol/L IPTG，继续控制各培养条件诱导14hr，最后离心收获菌体。
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Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
| WO1999042590A1 (de) * | 1998-02-18 | 1999-08-26 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von trifluor-3(r)-hydroxybuttersäurederivaten |
| CN1238808A (zh) * | 1996-11-26 | 1999-12-15 | 钟渊化学工业株式会社 | 制备光学活性的n－苄基－3－吡咯烷醇的方法 |
| WO2006061137A1 (de) * | 2004-12-09 | 2006-06-15 | Wacker Chemie Ag | Gdh-mutante mit verbesserter chemischer stabilität |
| CN101372699A (zh) * | 2008-09-02 | 2009-02-25 | 南京工业大学 | 一种羰酰还原酶在生产(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用 |
| CN101613672A (zh) * | 2009-08-04 | 2009-12-30 | 南京工业大学 | 一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法 |
| CN102206686A (zh) * | 2011-04-19 | 2011-10-05 | 华东理工大学 | 生物催化不对称还原制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯的方法 |
-
2014
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1238808A (zh) * | 1996-11-26 | 1999-12-15 | 钟渊化学工业株式会社 | 制备光学活性的n－苄基－3－吡咯烷醇的方法 |
| WO1999042590A1 (de) * | 1998-02-18 | 1999-08-26 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von trifluor-3(r)-hydroxybuttersäurederivaten |
| WO2006061137A1 (de) * | 2004-12-09 | 2006-06-15 | Wacker Chemie Ag | Gdh-mutante mit verbesserter chemischer stabilität |
| CN101372699A (zh) * | 2008-09-02 | 2009-02-25 | 南京工业大学 | 一种羰酰还原酶在生产(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用 |
| CN101613672A (zh) * | 2009-08-04 | 2009-12-30 | 南京工业大学 | 一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法 |
| CN102206686A (zh) * | 2011-04-19 | 2011-10-05 | 华东理工大学 | 生物催化不对称还原制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯的方法 |
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