CN103906836A

CN103906836A - 性能增强和温度抗性蛋白酶变体

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Publication number: CN103906836A
Application number: CN201280052803.0A
Authority: CN
Inventors: H·赫尔穆特; M·默克尔; B·劳夫斯; S·威兰; T·奥康奈尔; S·通德拉; T·韦伯
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-07-02
Also published as: EP2771459A1; JP2015502141A; DE102011118021A1; US20140227764A1; WO2013060621A1; PL2771459T3; DK2771459T3; US20170037343A1; US20210207063A1; EP2771459B1; CN108384772A; KR102026497B1; US10975335B2; ES2752449T3; IN2014CN03937A; JP6498440B2; KR20140085570A

Abstract

包含全长与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列并且具有根据SEQ ID NO.1编号的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合的蛋白酶，其展现出非常好的清洁性能，特别是对于含血污迹，以及非常好的温度稳定性。

Description

性能增强和温度抗性蛋白酶变体

本发明是酶技术领域。本发明特别涉及蛋白酶及其制备，其氨基酸序列已经修饰，特别是针对洗涤剂和清洗剂的用途；涉及所有具有相应修饰的足够类似的蛋白酶；以及涉及编码它们的氨基酸。本发明还涉及这些蛋白酶的方法和用途以及涉及试剂，特别是含有它们的洗涤剂和清洗剂。

蛋白酶属于所有酶中技术上最重要的。对于洗涤剂和清洗剂，它们是建立最久的酶，特别是含在所有现代高性能洗涤剂和清洗剂中。它们引起要清洗的材料上含蛋白污迹的分解。继而在这些之中，枯草杆菌蛋白酶类型(枯草杆菌酶(subtilases)、枯草杆菌肽酶，EC3.4.21.62)的蛋白酶是特别重要的，其由于催化有效的氨基酸而被分类为丝氨酸蛋白酶。它们作为非特异性内肽酶，水解位于肽或蛋白内的任何酰胺键。它们的最佳pH通常在显著的碱性范围。已有此家族的综述，例如，R.Bott和C.Betzel编辑的"Subtilisin enzymes"pp.75-95中R.Siezen的文章"Subtilases:subtilisin-likeproteases",New York,1996。枯草杆菌酶由微生物自然形成；其中，要特别提到的枯草杆菌酶中最重要的组是由芽孢杆菌(Bacillus)物种形成和分泌的枯草杆菌蛋白酶。

偏好用于洗涤剂和清洗剂中的枯草杆菌蛋白酶类型蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶BPN'和Carlsberg，蛋白酶PB92，枯草杆菌蛋白酶147和309，来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)特别是来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶DY以及如下酶(然而，清楚起见，严格意义上是枯草杆菌酶而不再是枯草杆菌蛋白酶)：热酶(thermitase)、蛋白酶K、蛋白酶TW3及TW7、以及与初始蛋白酶相比包含修饰的氨基酸序列的前述蛋白酶的变体。蛋白酶可以使用本领域已知的方法以可控或随机方式被修饰，并由此被优化，例如用于洗涤剂和清洗剂。这些包括点诱变、缺失或插入诱变、或与其他蛋白或蛋白部分融合。现有技术中已知的大部分蛋白酶的相应优化变体因而是已知的。

国际专利申请WO95/23221和WO92/21760公开了适宜用于洗涤剂或清洗剂的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶的变体。国际专利申请WO2011/032988进一步公开了同样含有来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶的变体的洗涤剂和清洗剂。这些文件中公开的蛋白酶变体可于来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶计数位置的3、4、99和199处(在另外的位置之外)被修饰，并且可在前述位置处包含例如氨基酸3T、4I、99D、99E或199I。然而，如下文所述的这些修饰的组合在这些文件中却并未提到。

现在令人吃惊地发现，包含若干个这些修饰的组合的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶类型的蛋白酶或者与其足够类似的蛋白酶(基于序列相同性)特别适宜用于洗涤剂或清洗剂中并且特别有利于洗涤性能和/或稳定性的改善。

本发明的主题是蛋白酶，其包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

本发明的另一主题是制备蛋白酶的方法，包括向在全长上与SEQ IDNO.1所示氨基酸序列至少70％相同的起始蛋白酶中引入根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

因此，用于本专利申请目的的"蛋白酶"既涵盖了前述的蛋白酶也涵盖了根据本发明方法制备的蛋白酶。因而所有涉及蛋白酶的陈述均是指作为物质的蛋白酶和相应的方法，特别是制备所述蛋白酶的方法。

分别与本发明的蛋白酶以及制备本发明蛋白酶的方法相关，作为本发明另外的主题的有编码所述蛋白酶的核酸，含有本发明的蛋白酶或核酸的非人类宿主细胞，以及包含本发明蛋白酶的试剂，特别是洗涤剂和清洗剂、洗涤和清洗方法及由本发明蛋白酶所定义的用途。

在包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的蛋白酶中，本发明的位置99的修饰即R99E或R99D修饰与位置3、4和199中至少两个的修饰即S3T、V4I或V199I的组合优选给在洗涤剂和清洗剂中修饰的蛋白酶带来对至少一种蛋白酶敏感性污迹的改善的性能。本发明的蛋白酶因此使得可以对织物和/或硬表面例如盘子上的至少一种、优选若干种蛋白酶敏感污迹有改善的去除。本发明蛋白酶的优选实施方案展现出对含血污迹特别优越的清洁性能，例如针对如下污迹：棉上血迹：可得自Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialen AG[Swissfederal materials and testing agency test materials],St.Gallen,Switzerland的产品编号111；

棉上奶迹/炭黑：(wfk-Cleaning Technology Institute e.V.,Krefeld,Germany)；

棉上血-奶/墨水：可得自CFT(Center For Testmaterials)B.V.,Vlaardingen,Netherlands的产品编号C-05。

本发明优选的实施方案因此提供了污迹特异性蛋白酶，其清洁性能特异性地对于一种或若干种污迹是优越的。本发明蛋白酶的优选实施方案对于含血污迹的污迹针对性(stain focus)因而得到了改善。

本发明蛋白酶的优选实施方案甚至在10℃至60℃之间、15℃至50℃之间和20℃至40℃之间的低温已经实现了该优越的清洁性能。本发明的蛋白酶的另外的优选实施方案在广泛的温度范围实现了此种改善的清洁性能，例如15℃至90℃之间，优选20℃至60℃之间。

另外，本发明蛋白酶的优选实施方案在洗涤剂或清洗剂中具有特别的稳定性，例如对于表面活性剂和/或漂白剂和/或对于温度影响，特别是对于高温和低温，例如50至65℃之间，特别是60℃，和/或对于酸性或碱性条件和/或对于pH的变化和/或对于变性剂或氧化剂和/或对于蛋白水解分解和/或对于氧化还原条件的变化。因而本发明特别优选的实施方案提供了具有改善的性能和/或更具温度稳定性的蛋白酶变体。本发明另外的特别优选的实施方案提供了具有改善的性能和更具温度稳定性的蛋白酶变体。因此，本发明蛋白酶的这些优越的实施方案使得可以在广泛温度范围对蛋白酶敏感性污迹有改善的洗涤结果。

对于开始提到的国际专利申请WO95/23221、WO92/21760和WO2011/032988，本发明因而是序列修饰组合的特别优越的选择，其结果是获得特别高性能和/或温度稳定的用于洗涤剂或清洗剂的蛋白酶变体。

"清洁性能"在本发明的上下文中被理解为对一种或多种、特别是衣服或盘子上的污迹的减轻性能。在本发明的上下文中，包含所述蛋白酶的洗涤剂或清洗剂以及由所述试剂构成的洗涤槽或清洗槽和所述蛋白酶本身都具有相应的清洁性能。该酶的清洁性能因而有助于所述试剂以及由所述试剂构成的洗涤槽或清洗槽的清洁性能。所述清洁性能优选如下文所述确定。

本发明的蛋白酶，特别是洗涤剂或清洗剂中的，展现蛋白水解活性，即其能够水解多肽或蛋白的肽键。本发明的蛋白酶因而是催化肽键水解的酶，由此能够切割肽或蛋白质。本发明的蛋白酶另外优选是成熟蛋白酶，即不具有信号肽和/或前肽的催化活性分子。除非另外指明，在每种情况中所示序列也是指成熟酶。

在本发明另外的实施方案中，所述蛋白酶包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列，并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

在本发明另外的实施方案中，所述蛋白酶包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列，并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

特别优选的本发明的蛋白酶是：

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E与氨基酸取代S3T和V4I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQ IDNO.1具有氨基酸取代S3T、V4I和R99E的蛋白酶。

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E与氨基酸取代S3T和V199I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQID NO.1具有氨基酸取代S3T、R99E和V199I的蛋白酶。

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E与氨基酸取代V4I和V199I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQID NO.1具有氨基酸取代V4I、R99E和V199I的蛋白酶。

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99D与氨基酸取代S3T和V4I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQ IDNO.1具有氨基酸取代S3T、V4I和R99D的蛋白酶。

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99D与氨基酸取代S3T和V199I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQID NO.1具有氨基酸取代S3T、R99D和V199I的蛋白酶。

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99D与氨基酸取代V4I和V199I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQID NO.1具有氨基酸取代V4I、R99D和V199I的蛋白酶。

本发明蛋白酶另外的特别优选的实施方案值得注意的是它们包含氨基酸取代R99E或R99D与三个另外的氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合。就此而言，如下的特定蛋白酶是特别优选的：

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQ ID NO.1具有氨基酸取代S3T、V4I、R99E和V199I的蛋白酶。此种蛋白酶在SEQ ID NO.2中示出。

包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同的氨基酸序列并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合的蛋白酶，特别是根据SEQ ID NO.1具有氨基酸取代S3T、V4I、R99D和V199I的蛋白酶。此种蛋白酶在SEQ ID NO.3中示出。

另外的特别优选的蛋白酶是上文所述蛋白酶，其还包含根据SEQ IDNO.1计数在位置211的氨基酸亮氨酸(L)。

核酸序列或氨基酸序列的相同性通过序列比较的手段确定。此序列比较是基于BLAST算法，其是现有技术中已建立的并且是常用的(参见例如Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,&Lipman,D.J.(1990)"Basiclocal alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403-410，和Altschul,Stephan F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Hheng Zhang,WebbMiller,and David J.Lipman(1997):"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs,"Nucleic Acids Res.,25,pp.3389-3402)，并且其在原则上是通过将核酸序列或氨基酸序列中相似的连续核苷酸或氨基酸互相关联来实现的。相关位置的列表关联称作"比对"。现有技术中另外可用的算法是FASTA算法。序列比较(比对)特别是多序列比较用计算机程序来进行。常用的有Clustal系列(参见例如Chenna et al.(2003):Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.Nucleic AcidResearch31,3497-3500)、T-Coffee(参见例如Notredame et al.(2000):T-Coffee:A novel method for multiple sequence alignments.J.Mol.Biol.302,205-217)或者基于这些程序以及算法的程序。在本专利申请中，所有的序列比较(比对)是用计算机程序Vector

Suite10.3(Invitrogen Corporation,1600Faraday Avenue,Carlsbad,California,USA)来进行的，其中使用预设的缺省参数，其用于序列比较的AlignX模块是基于ClustalW。

此种比较也使得显示出与所比较的另一个序列的类似性。这通常表示为百分比相同性，即在比对中相同位置处、或彼此相对应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的比例。在涉及氨基酸序列时，更广泛理解的术语"同源性"也虑及了保守氨基酸替换，即具有类似化学活性的氨基酸，因为这些氨基酸通常在蛋白中发挥类似的化学活性。所比较序列的类似性因而也可以表示为"百分比同源性"或"百分比相似性"。相同性和/或同源性的表示可以针对整个多肽或基因，或者仅针对个别区域。各种核酸序列或氨基酸序列的同源或相同区域因此是通过序列中匹配的方式来定义的。此类区域常具有相同功能。它们可以很小，并且可以仅包含几个核苷酸或氨基酸。此种小区域常常发挥对于蛋白的整体活性很关键的功能。因而只针对个别、任选很小的区域进行序列匹配是有用的。然而，除非另外指明，本申请中相同性或同源性的表示针对各核酸序列或氨基酸序列的全长。

在发明另外优选的实施方案中，所述蛋白酶特征在于其清洁性能至少相应于包含相应于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白酶的清洁性能，和/或至少相应于包含相应于SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白酶的清洁性能，所述清洁性能在洗涤体系中确定，所述洗涤体系含有每升洗涤槽4.5至7.0克之间的剂量比率的洗涤剂以及所述蛋白酶，要比较的蛋白酶以相同浓度(基于活性蛋白)使用，并且针对棉上血迹、特别针对棉迹上的血，可得自Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG,St.Gallen,Switzerland的产品编号111，通过测量所洗涤织物的洁白度来确定所述清洁性能，洗涤过程在40℃温度进行至少70分钟，并且水具有15.5至16.5°之间的水硬度(德国硬度)。基于活性蛋白，用于此洗涤体系所规定的洗涤剂中蛋白酶浓度为0.001至0.1wt％，优选0.01至0.06wt％。

用于此种洗涤体系的优选的液体洗涤剂具有如下组成(所有表示为重量百分比)：0.3至0.5％的黄原胶(xanthan)，0.2至0.4％的消泡剂，6至7％甘油，0.3至0.5％的乙醇，4至7％的FAEOS(脂肪醇醚硫酸盐)，24至28％的非离子表面活性剂，1％的硼酸，1至2％的柠檬酸钠(二水化物)，2至4％的苏打，14至16％的椰子脂肪酸，0.5％的HEDP(1-羟基乙烷-(1,1-双膦酸))，0至0.4％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，0至0.05％的光学增亮剂，0至0.001％的染料，其余为去离子水。液体洗涤剂的剂量比率优选为每升洗涤槽4.5至6.0克之间，例如每升洗涤槽4.7、4.9或5.9克。洗涤优选在pH8至pH10.5之间的pH范围进行，优选pH8至pH9之间。

用于此种洗涤体系的优选粉末洗涤剂具有如下组成(所有表示为重量百分比)：10％的线性烷基苯磺酸盐(钠盐)，1.5％的C12至C18的脂肪醇硫酸盐(钠盐)，2.0％的具有7EO的C12至C18脂肪醇，20％的碳酸钠，6.5％的碳酸氢钠，4.0％的无定形硅酸钠，17％的碳酸钠过氧水合物，4.0％的TAED，3.0％的聚丙烯酸酯，1.0％的羧甲基纤维素，1.0％的膦酸盐，27％的硫酸钠；其余：泡沫抑制剂，光学增亮剂，香味剂。粉末洗涤剂的剂量比率优选为每升洗涤槽4.5至7.0克，例如以及特别优选每升洗涤槽4.7克，或每升洗涤槽5.5、5.9或6.7克。洗涤优选在pH9至pH11之间的pH范围进行。

在本发明的上下文中，使用上述固体洗涤剂来确定40℃时清洁性能，洗涤操作优选进行70分钟。

洁白度，也即污迹的减轻，作为洗涤性能的指示，优选使用光学测量方法，优选光度计确定。适宜于此的仪器例如Minolta CM508d光谱仪。用于测量的仪器通常事先通过白标准、优选与部件一起提供的白标准来校准。

确定蛋白酶活性的方法是酶技术领域内的技术人员熟悉的，并且是他或她能够常规应用的。此类方法例如在Tenside,Vol.7(1970),pp.125-132中公开。或者，可以通过从suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺底物(AAPF)释放对硝基苯胺(pNA)生色团的方式定量确定蛋白酶活性。蛋白酶切割该底物并释放pNA。pNA的释放引起410nm处消光的提高，其随着时间的变化是酶活性的指示(参见Del Mar et al.,1979)。在25℃温度、于pH8.6、和410nm波长进行测量。测量时间为5min，并且测量间隔20s至60s。蛋白酶活性通常表示为蛋白酶单位(PU)。适宜的蛋白酶活性例如为每毫升洗涤槽2.25、5或10PU。然而蛋白酶活性不等于零。

可以借助已知方法确定蛋白浓度,例如BCA法(二辛可酸；2,2'-二喹啉基-4,4'-二羧酸)或双缩脲法(A.G.Gornall,C.S.Bardawill and M.M.David,J.Biol.Chem.,177(1948),pp.751-766)。就此而言，可以通过使用适宜的不可逆抑制剂(对于蛋白酶，例如苯甲基磺酰氟(PMSF))滴定活性中心来确定活性蛋白浓度，以及确定残余活性(参见M.Bender et al.,J.Am.Chem.Soc.88,24(1966),pp.5890-5913)。

通过与抗血清或特异性抗体反应，可将蛋白组合为免疫学相关蛋白的组。此组的成员值得注意的是它们包含由抗体识别的相同抗原决定簇。它们因而在结构上彼此类似从而由抗血清或特异性抗体所检测。本发明的另一主题因而由蛋白酶构成，其特征在于包含至少一个以及更优选两个、三个、或四个匹配本发明蛋白酶的抗原决定簇。由于其免疫学匹配，此类蛋白酶结构上与本发明的蛋白酶如此类似，从而也假定有类似的功能。

除上文所解释的氨基酸修饰之外，本发明的蛋白酶可包含另外的氨基酸修饰，特别是氨基酸取代、插入或缺失。此类蛋白酶进一步通过例如靶向的遗传修饰，也即通过诱变法，以及对具体目的或者针对具体特性进行优化(例如，针对其催化活性、稳定性等)来开发。另外，本发明的核酸可被引入重组制品并由此用于产生全新的蛋白酶或其它多肽。

目标是向已知的分子引入靶向的突变，如取代、插入、或缺失，以便例如改善本发明酶的清洁性能。为此，特别地，可修饰所述分子的表面电荷和/或等电点，以及由此修饰其与底物的相互作用。例如，可以修饰酶的净电荷以便由此影响底物结合，特别是用于洗涤剂和清洗剂中。作为选择地或额外地，可以通过一或多个相应突变增强所述蛋白酶的稳定性，以及由此改善其清洁性能。个别突变，例如个别取代的优越特性可彼此补充。已经针对具体特性，例如就表面活性剂和/或漂白剂和/或其它成分而言的稳定性优化的蛋白酶可因而在发明的上下文中被进一步改良。

如下规定用于描述与一个氨基酸位置精确相关的取代(氨基酸替换):首先，天然存在的氨基酸以国际通用的单字母编码表示；其后跟随相关的序列位置，最后是插入的氨基酸。在相同多肽链内的多个替换彼此由斜线分开。对于插入，额外的氨基酸按其序列位置命名。对于缺失，失去的氨基酸由符号代替，例如星号或破折号。例如，"A95G"描述了用甘氨酸取代位置95处的丙氨酸；"A95AG"描述了在位置95处的氨基酸丙氨酸之后插入甘氨酸；而"A95*"描述了位置95处丙氨酸的缺失。此命名法是酶技术领域内的技术人员已知的。

本发明另外的主题因而是蛋白酶，其特征在于，其以上文所述的蛋白酶作为起始分子，通过单个或多个保守氨基酸取代而得，所述蛋白酶依然含有如上文所述的根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。术语"保守氨基酸取代"意指一个氨基酸残基替换(取代)另一个氨基酸残基，此替换例如非极性氨基酸残基替换为另一非极性氨基酸残基不会导致所替换氨基酸位置处的极性或电荷变化。保守氨基酸取代在本发明的上下文中涵盖了例如G＝A＝S、I＝V＝L＝M、D＝E、N＝Q、K＝R、Y＝F、S＝T、G＝A＝I＝V＝L＝M＝Y＝F＝W＝P＝S＝T。

作为选择地或者额外地，蛋白酶特征在于其以本发明的蛋白酶作为起始分子，通过片段化或者缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上与起始分子匹配的氨基酸序列，如上文所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合依然存在。

因而可以例如缺失酶的末端处或环中的个别氨基酸，而结果并不损失或缩减蛋白水解活性。另外，例如，也可通过此类片段化或者缺失诱变、插入诱变、或取代诱变降低相关酶的变应原性，由此改善其整体可用性。有利的是，所述酶即使在诱变后仍保留其蛋白水解活性，也即其蛋白水解活性至少相应于起始酶的蛋白水解活性。取代也可展现出优越的效果。个别的和多个连续相连的氨基酸均可替换为其它氨基酸。

作为选择地或者额外地，蛋白酶的特征在于其以本发明的蛋白酶作为起始分子，通过在比对中与根据SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关的位置的一或多个氨基酸取代而得，该蛋白酶依然包含如上文所述的根据SEQ ID NO.1计数的本发明的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。本文通过本发明蛋白酶氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶氨基酸序列的比对来定义另外的氨基酸位置。位置的关联进一步针对成熟蛋白。特别地，在本发明蛋白酶氨基酸序列包含比根据SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶多的氨基酸残基时，利用此种关联。从来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶氨基酸序列中的前述位置着手，本发明蛋白酶中的修饰位置是那些实际上在比对中与那些位置关联的位置。

来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶用于序列修饰，特别是取代的有利位置转移至本发明蛋白酶的同源位置，优选是重要的，并赋予该蛋白酶有利的功能特性，因此与在与SEQ ID NO.1的比对中，根据SEQ ID NO.1计数的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联。位于来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶野生型分子中前述位置的氨基酸残基如下:S36、N42、A47、T56、G61、T69、E87、A96、A101、I102、S104、N114、H118、A120、S130、S139、T141、S142、S154、S157、A188、V193、G205、L211、A224、K229、S236、N237、N242、H243、N255、以及T268。

例如取代61A、154D、154E、A188P或V193M是特别有利的，在某种程度上，本发明的蛋白酶中相应同源位置并未由这些优选氨基酸天然占据。

可通过比较实验来提供要修饰的氨基酸正确关联也即具体而言它们的功能相应性的进一步确认，所述比较实验中，在彼此比较的两个蛋白酶中以相同方式修饰比对基础上两个彼此关联的位置，并观测这二者的酶活性是否以相同方式被修饰。例如，如果根据SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶特定位置处的氨基酸替换伴随有酶参数的改变，例如KM值的提升，并且如果在本发明的蛋白酶变体(其氨基酸替换通过引入同样氨基酸的方式实现)中观测到该酶参数的相应改变，例如因此同样的KM值的提升，这被视为确认了此正确的关联。

所有前述因素也均适用于本发明用于制备蛋白酶的方法。本发明的方法因而还包括一或多个如下的方法步骤:

(a)引入单个或多个保守氨基酸取代，其中该蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合；

(b)通过片段化或者通过缺失诱变、插入诱变、或取代诱变修饰氨基酸序列，由此使得该蛋白酶包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上与起始分子匹配的氨基酸序列，起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合依然存在；

(c)向一或多个在比对中与根据SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的位置引入单个或多个氨基酸取代，其中该蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

所有陈述也均适用于本发明的方法。

在本发明另外的实施方案中，蛋白酶以及根据本发明的方法制备的蛋白酶依然在其全长与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或98.8％相同。所述蛋白酶以及根据本发明的方法制备的蛋白酶包含氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

本发明另一主题是经额外稳定化的上文所述的蛋白酶，特别是通过一或多个突变，例如取代，或者通过偶合至聚合物。这是因为在储存的情况下和/或在使用中，例如在洗涤过程中，稳定性的提高会使酶活性持续更久并因而使清洁性能改善。原则上所有现有技术中描述的和/或适当的稳定化可能性都是适宜的。优选通过酶本身的突变实现那些稳定化结果，因为此种稳定化在酶回收之后不需要进一步操作步骤。适宜于此的序列修饰的实例在上文描述。其它适宜的序列修饰是现有技术已知的。例如，也可通过将一或多个酪氨酸残基替换为其它氨基酸来稳定蛋白酶。

用于稳定化的其它可能性有，例如:

-修饰金属离子的结合，特别是钙结合位点，例如通过将参与钙结合的一或多个氨基酸替换为一或多个带负电的氨基酸和/或通过向两个氨基酸精氨酸和甘氨酸的至少一个序列引入序列修饰；

-通过在蛋白表面上或表面处的氨基酸序列中产生改变的突变，针对变性剂如表面活性剂的影响提供保护；

-将位于接近N端的氨基酸替换为预期会通过非共价相互作用与分子的其余部分接触并由此有助于保持球状结构的氨基酸。

优选的实施方案是其中所述酶以若干方式稳定化，因为多个稳定化突变具有加合或协同效应。

本发明另一主题是上文所述的蛋白酶，其特征在于其包含至少一个化学修饰。具有此种修饰的蛋白酶称为衍生物，也即该蛋白酶经衍生化。

对于本申请的目的，"衍生物"因而被理解为其纯氨基酸链经化学修饰的蛋白质。可以例如由表达蛋白的宿主细胞在体内来进行此种衍生化操作。在此情况下要特别强调的是低分子量化合物的连接，如脂质或寡糖的连接。然而，衍生化也可以在体外进行，例如通过氨基酸侧链的化学变换或者通过将不同的化合物共价结合至蛋白。例如可以将胺连接至酶的羧基以便改变等电点。一种此类的其它化合物也可以是例如通过双功能化合物连接至本发明蛋白的另外的蛋白。"衍生化"同样被理解为共价结合至大分子载体，或者也作为非共价包涵体进入适宜的大分子笼状结构。衍生化可例如影响底物特异性或结合底物的强度，或者如果连上的物质是抑制剂则可以带来酶活性的暂时阻断。这可对例如储存期限有用。此种修饰可进一步影响稳定性或酶活性。它们另外还可以用于降低蛋白的变应原性和/或免疫原性，并由此例如提高其皮肤相容性。例如，连接至大分子化合物，例如聚乙二醇，可改善蛋白的稳定性和/或皮肤相容性。

本发明蛋白的"衍生物"也可以广义地理解为所述蛋白的制品。基于例如从生产微生物的培养物中的回收、加工、或制备，可将蛋白与各种其他物质关联。蛋白还可以已经具有例如为了增强其货架稳定性，有意加至其的其它物质。本发明蛋白的所有制品因而也与本发明相符。这也不依赖于其是否实际上在特定制品中展现此种酶活性。这是因为可能期望其在储存期间具有很少的活性或没有活性，并且仅在使用时发挥其酶功能。这可以例如通过相应附加物质来控制。就此而言，蛋白酶和蛋白酶抑制剂一起的制品有特定的可能性。

对于上文所述的所有蛋白酶以及蛋白酶变体和/或衍生物，在本发明的上下文中是特别优选的是其活性至少相应于根据SEQ ID NO.2和/或SEQID NO.3的蛋白酶的活性、和/或其清洁性能至少相应于根据SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3的蛋白酶的清洁性能的那些，所述清洁性能如上文所述在洗涤体系中确定。

本发明的另一主题是编码本发明蛋白酶的核酸，以及含有此种核酸的载体，特别是克隆载体或表达载体。

这些可以是DNA分子或RNA分子。它们可以作为单个链存在、作为互补于所述单个链的单个链存在，或者作为双链存在。特别是对于DNA分子，在每种情况都要以所有三种可能的阅读框来考虑两个互补链的序列。还要考虑的是不同的密码子，也即碱基三联体，可以编码相同的氨基酸，因而特定的氨基酸序列可由多个不同的核酸所编码。作为遗传密码简并性的结果，可编码上述蛋白酶之一的所有核酸序列均涵盖于本发明的主题中。本领域技术人员能够无疑义地确定这些核酸序列，因为尽管有遗传密码的简并性，给定的氨基酸会与各个密码子相关联。本领域技术人员因而能够从氨基酸序列着手，容易地确定编码该氨基酸序列的核酸。另外，在涉及本发明的核酸时，一或多个密码子可由同义密码子置换。此方面特别是指本发明酶的异源表达。例如，每个生物体，如生产株的宿主细胞，具有特定的密码子选择。"密码子选择"理解为由各个生物体将遗传密码翻译成氨基酸。如果位于核酸上的密码子遇到了在生物体中数目相对小的装载的tRNA分子，会发生蛋白合成的瓶颈。虽然编码相同的氨基酸，但结果是密码子在生物体中的翻译效率低于编码相同氨基酸的同义密码子。因为存在较大数目的用于所述同义密码子的tRNA分子，后者在生物体中可以更有效地被翻译。

通过目前通常已知的方法，例如化学合成或聚合酶连反应(PCR)与分子生物学和/或蛋白化学的标准方法组合，本领域技术人员能够在已知DNA序列和/或氨基酸序列的基础上制备相应的核酸直至完整的基因。此类方法是从例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T,2001,Molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition,Cold Spring Laboratory Press可知的。

"载体"对于本发明的目的理解为由核酸构成的元件，其含有本发明的核酸作为特征核酸区域。它们使得所述核酸能够被建立为在物种或细胞系中历经多个世代或细胞分化的稳定遗传元件。特别是在用于细菌中时，载体是特定的质粒，也即环状遗传元件。在本发明的上下文中，本发明的核酸被克隆至载体中。所述载体中包括有例如其来源为细菌质粒、病毒、或噬菌体的那些，或者具有广泛不同来源的元件的主要为合成的载体或质粒。使用在每种情况中存在的另外的遗传元件，载体能够将其本身建立为相关宿主细胞中历经多个世代的稳定单元。它们可以作为分离的单元存在于染色体外，或者可以整合至染色体中或整合至染色体DNA中。

表达载体包含能够在含有其的宿主细胞优选微生物、特别优选细菌中复制的核酸序列，并在其中表达所含的核酸。表达特别受到调节转录的一或多个启动子的影响。原则上可通过原本位于要表达的核酸之前的天然启动子来进行表达，但也可以通过配备于表达载体上的宿主细胞启动子进行表达，或者也可以通过另外的生物体或另外宿主细胞的修饰的、或完全不同的载体来进行表达。在本发明的情况中，可使用至少一种用于本发明核酸表达的启动子并用于其表达。表达载体还可以进一步是可调节的，例如通过改变培养条件或者当含有其的宿主细胞达到特定的细胞密度的时候，或者通过加入特定物质，特别是基因表达的激活剂。此种物质的一个实例是半乳糖衍生物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，其用作细菌乳糖操纵子(lac操纵子)的激活剂。与表达载体不同，在克隆载体中含有的核酸不表达。

本发明另外的主题是含有本发明的核酸或本发明的载体、或者含有本发明蛋白酶的非人宿主细胞，特别是将蛋白酶分泌至包围宿主细胞的培养基中的宿主细胞。本发明的核酸或本发明的载体优选被转化至微生物中，其继而代表本发明的宿主细胞。或者，个别成分，即本发明核酸的核酸部分或片段也可以这样的方式被引入宿主细胞中，所述方式中所得的宿主细胞含有本发明的核酸或本发明的载体。此过程特别适宜于当宿主细胞已经含有本发明核酸或本发明载体的一或多个组分时，并继而相应补加其它组分。细胞转化方法是现有技术中已建立的并且是本领域技术人员充分已知的。原则上所有细胞也即原核或真核细胞均适宜作为宿主细胞。优选那些可以用遗传有利的模式进行操作例如对于使用核酸或载体的转化及其稳定建立物的细胞，例如单细胞真菌或细菌。另外，优选的宿主细胞值得注意的是在微生物学和生物技术而言易于操纵的。这例如是指易于培养性、高生长率、对发酵培养基而言低需求、和外源蛋白的良好生产和分泌率。本发明优选的宿主细胞将(转基因)表达的蛋白分泌至包围该宿主细胞的培养基中。在制备之后，所述蛋白酶还可以进一步由产生其的细胞来修饰，例如通过加入糖分子、甲酰化、胺化等。此种翻译后修饰能功能性地影响蛋白酶。

另外的优选实施方案表示为这样的宿主细胞，其活性可以在可用的遗传调节元件的基础上进行调节，所述遗传调节元件例如在载体上也可以是推测存在于那些细胞中。例如可通过可控的加入作为激活剂的化合物、通过改变培养条件、或者当达到特定的细胞密度时刺激它们表达。这使得本发明蛋白的经济生产成为可能。此种化合物的一个实例是前述的IPTG。

优选的宿主细胞是原核或细菌细胞。细菌以其短的世代时间和就培养条件而言的低需求著称。作为结果，可以建立经济的培养方法或制备方法。另外，本领域技术人员在发酵技术中使用细菌方面具有丰富的经验。革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌可以适宜于特定的生产情况，这是基于在个别情况中需要实验确定的各种原因，如营养来源、产物形成率、时间要求等。

在革兰氏阴性菌，如例如大肠杆菌(Escherichia coli)中，多种蛋白被分泌至周质间隙，也即分泌至包裹细胞的两层膜之间的区室中。这对于特定的应用而言是有利的。革兰氏阴性菌还可以进一步被改造，从而其将表达的蛋白不仅释放至周质间隙，也将其释放至包围细菌的培养基中。另一方面，革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌或放线菌、或放线菌目(actinomycetals)的其它代表不具有外层膜，从而所分泌的蛋白立即递送至培养基中，一般来说是包围细菌的营养培养基，所表达的蛋白可从该培养基中纯化。它们可直接从培养基中分离、或者进一步加工。另外，革兰氏阳性菌与大部分技术上重要的酶的源生物体相关或者相同，并且通常它们本身就形成相当的酶，从而其具有类似的密码子选择，并且它们的蛋白合成器当然是受相应引导的。

本发明的宿主细胞可以就其对培养条件的要求而进行修饰，可以包含其它的或另外的选择标记，或者还可以表达其它的或另外的蛋白。它们可以特别是转基因表达多个蛋白或酶的那些宿主细胞。

本发明原则上可应用于所有微生物，特别是应用于所有可发酵微生物，特别优选芽孢杆菌属微生物，并且其结果是可使用此类微生物来制备本发明的蛋白。此类微生物即代表了用于本发明目的的宿主细胞。

在本发明另外的实施方案中，宿主细胞特征在于其是细菌，优选是选自如下组的一种:埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)，更优选选自如下组的一种:大肠杆菌、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、球芽孢杆菌(Bacillusglobigii)、吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。

然而，宿主细胞还可以是真核细胞，其特征在于其具有细胞核。本发明另外的主题因而代表了其特征在于具有细胞核的宿主细胞。与原核细胞不同，真核细胞能够对形成的蛋白进行翻译后修饰。其实例有真菌如放线菌(Actinomycetes)或酵母如酵母菌属(Saccharomyces)或克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)。例如，这在蛋白要经历与其合成相关联的由此类体系使之成为可能的特定修饰时可以是特别有利的。在真核体系进行的，特别是与蛋白合成关联的修饰中，例如有低分子量化合物如膜锚或寡糖的结合。可以期望进行此种寡糖修饰，例如为了降低所表达蛋白的变应原性。与此类细胞天然形成的酶如纤维素酶或脂肪酶共表达也可以是有利的。嗜热真菌表达体系例如可进一步特别适宜于温度抗性蛋白或变体的表达。

本发明的宿主细胞例如在非连续或连续体系中以通常的方式培养和发酵。在前者的情况中，用宿主细胞接种适宜的营养培养基，且在要经实验确定的时间段之后从培养基收获产物。连续发酵值得注意的是流平衡的实现，其中在相对较长的时间段中，部分细胞死亡但是也有部分更新，且所形成蛋白可同时从培养基中移走。

本发明的宿主细胞优选用于制备本发明的蛋白酶。本发明另外的主题因此是用于制备蛋白酶的方法，包括

a)培养本发明的宿主细胞

b)从培养基或从宿主细胞分离蛋白酶。

本发明的此主题优选包括发酵方法。发酵方法是现有技术已知的并且代表了实际工业规模的生产步骤，一般伴随纯化所制备产物例如本发明的蛋白酶的适宜方法。基于制备本发明蛋白酶的相应方法的所有发酵方法相应地代表了本发明此主题的实施方案。

特别适宜的发酵方法其特征在于发酵是通过流入策略来进行的。在此背景中，补加连续培养期间所消耗的培养基组分。由此可实现细胞密度和细胞量二者以及干物质和/或原则上感兴趣蛋白酶活性的相当大的提高。另外，也可以对发酵操作进行配置，从而使不期望的代谢产物被滤除、或者通过加入缓冲液或各自适合的平衡离子来中和。

可以从发酵培养基收获已经制备的蛋白酶。此种发酵方法对于从宿主细胞分离蛋白酶是优选的，也即从细胞团块(干物质)分离产物制品，但是要求可以使用适宜的宿主细胞、或者一或多种适宜的分泌标记物以及机制和/或转运体系，从而宿主细胞将蛋白酶分泌至发酵培养基中。或者，从宿主细胞分离蛋白酶可在无分泌的情况下进行，也即将其从细胞团块中纯化，例如通过使用硫酸铵或乙醇沉淀、或者通过色谱纯化。

所有上述情形均可以与用于制备本发明蛋白酶的方法组合。

本发明另外的主题是特征在于含有如上文所述的本发明的蛋白酶的试剂。所述试剂优选是洗涤剂或清洗剂。因为本发明的蛋白酶展现出有利的清洁性能，特别是对于含血污迹有效，所述试剂适宜于以及特别有利于去除此类污迹。

包括在本发明此主题中的有所有可想到类型的洗涤剂或清洗剂，既有浓缩物也有不稀释而使用的试剂，在洗涤机中以商业规模使用，或者用于手洗以及清洁。其中包括有例如用于织物、毯、或天然纤维的洗涤剂，对其使用术语"洗涤剂"。其中还包括有例如用于自动洗碗机的洗碗剂，或者手工洗碗剂，或者用于硬表面如金属、玻璃、瓷、陶、瓦片、石、涂层表面、塑料、木、或皮革的清洁剂，对其使用术语"清洁剂"，也即在手工和自动洗碗剂之外，例如还有洗涤剂、玻璃清洁剂、洁厕剂等。在本发明的上下文中的洗涤剂和清洗剂中，在手工或自动织物洗洁的情形中还包括有配在实际的洗涤剂中的洗涤佐剂，以便实现进一步的效果。在本发明的上下文中的洗涤剂和清洗剂中还包括有织物前处理和后处理试剂，也即在实际洗洁之前，例如为了使顽固污迹松弛，与所洗涤的物品接触的那些试剂，以及在实际织物洗洁之后的步骤中赋予所洗涤物品另外所期望特性如舒适的感觉、无褶皱、或低静电的那些试剂。织物柔软剂被分类属于后者的试剂。

本发明的洗涤剂或清洗剂，其可呈现为特别的粉末状固体、再压缩的颗粒形式、均质溶液或悬液，可在本发明蛋白酶之外还含有此类物质中通常的所有已知成分，在所述试剂中优选存在至少一种另外的成分。本发明的物质可特别含有表面活性剂、增洁剂(去污增洁剂)、过氧化物、或漂白活性剂。它们还可以含有与水混溶的有机溶剂、另外的酶、多价螯合剂、电解质、pH调节剂、和/或另外的佐剂如光学增亮剂、抗灰白试剂(anti-grayagent)、泡沫调节剂、及染料和香味剂，以及其组合。

本发明的蛋白酶与一或多种另外的试剂成分的组合是特别有利的，因为在本发明优选的配置中，此种试剂由于协同的结果而展现出改善的清洁性能。可以特别通过将本发明的蛋白酶与表面活性剂和/或增洁剂(去污增洁剂)和/或过氧化物和/或漂白活性剂组合来实现此种协同。

本发明有利的试剂成分在国际专利申请WO2009/121725中公开，其中始自第5页，倒数第二段并终于第13页第二段之后。明确提到此公开，并且其中公开的内容援引加入本专利申请。

本发明的试剂有利地每g试剂含有2μg至20mg量、优选5μg至17.5mg、特别优选20μg至15mg以及特别优选50μg至10mg的蛋白酶。另外，所述试剂中含有的蛋白酶、和/或所述试剂的其它成分可以用在室温时或无水时对所述酶不可渗的物质来包裹，该物质在所述试剂的使用条件下变得与所述酶可渗。本发明的此种实施方案因而特征在于用在室温时或无水时对所述蛋白酶不可渗的物质来包裹。另外，所述洗涤剂或清洗剂本身也可包装在容器中，优选空气可渗容器，其在快使用前或洗涤操作期间从所述容器释放。

在本发明另外的实施方案中，所述试剂的特征在于其

(a)以固体形式存在，特别是作为具有300g/l至1200g/l，特别是500g/l至900g/l的散重的可倾倒粉末，或

(b)以膏状或以液体形式存在，和/或

(c)作为单组分体系存在，或

(d)被再分为多个组分。

本发明的这些实施方案涵盖本发明试剂的所有固体、粉末、液体、胶状、或膏状施用形式，其任选还可由多个相构成并可以压缩的或未压缩的形式存在。所述试剂可以作为可倾倒粉末存在，特别是具有300g/l至1200g/l的散重，特别是500g/l至900g/l，或600g/l至850g/。所述试剂的固体施用形式中还包括挤出物、粒状物、片剂、或袋装。另外，所述试剂还可以是液体、胶状、或膏状，例如非水液体洗涤剂或非水膏状物的形式或者是水性液体洗涤剂或含水膏状物的形式。所述试剂还可以以一组分体系存在。此类试剂由一个相构成。或者，试剂也可以由多个相构成。此种试剂因而被再分为多个组分。

本发明的洗涤剂或清洗剂可唯一地含有蛋白酶。或者，它们可以还以对所述试剂有效性有用的浓度而含有另外的水解酶或其它酶。因而本发明另外的实施方案为还包含一或多种另外的酶的试剂。在本发明的试剂中能表现催化活性的所有酶优选都可用作另外的酶，特别是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、单宁酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶、过水解酶、氧化酶、氧化还原酶、或脂肪酶，以及其混合物。在每种情况中，所述试剂含有的另外的酶有利的量为1x10^-8至5重量％(基于活性蛋白)。更优选地，本发明试剂中含有的每种另外的酶的量为1x10^-7至3wt％、0.00001至1wt％、0.00005至0.5wt％、0.0001至0.1wt％、以及特别优选0.0001至0.05wt％(基于活性蛋白)。特别优选地，所述酶展现出针对特定污迹或污点的协同清洁性能，也即所述试剂组合物中含有的酶在其清洁性能上彼此互相辅助。特别优选的是，此种协同性存在于本发明所含的蛋白酶和本发明试剂的另外的酶之间，其中特别是存在于前文所述的蛋白酶与淀粉酶和/或脂肪酶和/或甘露聚糖酶和/或纤维素酶和/或果胶酶之间。协同效应可以不仅在不同的酶之间产生，还可以在一或多种酶与本发明试剂的其它成分之间产生。

本发明另外的主题是用于清洗织物或硬表面的方法，其特征在于在至少一个方法步骤中使用本发明的试剂；或者至少在一个方法步骤中本发明的蛋白酶具有催化活性，特别是以这样的方式，其中每次应用所述蛋白酶使用的量为40μg至4g、优选50μg至3g、特别优选100μg至2g、以及特别优选200μg至1g。

其中包括的有手工和自动的方法，优选自动的方法。用于清洗织物的方法一般值得注意的是，在多个方法步骤中，将具有清洁活性的各种物质应用至要清洗的材料上并在接触时间后被洗掉，或者用洗涤剂或所述试剂的溶液或稀释物以另外的方式来处理要清洗的材料。这同样相应适用于清洗织物外所有材料的方法，特别是硬表面。可以通过利用本发明的洗涤剂或清洗剂或本发明的蛋白酶在至少一个方法步骤中对所有可能的洗涤或清洗方法进行补充，并代表了本发明的实施方案。针对本发明的蛋白酶或含有其的试剂所描述的所有情形、主题和实施方案也适用于本发明的此主题。因而，在此节点清楚提到了相应节点的公开，且说明此公开也适用于本发明的此方法。

因为本发明的蛋白酶已经天然具有水解活性，并且即使在不具有清洁能力的介质例如纯缓冲液中也展现出来，此方法的个别和/或唯一步骤可以在于使本发明的蛋白酶，预期为具有清洁活性的唯一组分，优选在缓冲溶液或在水中与污迹接触。这代表了本发明此主题的另外的实施方案。

本发明此主题的另外的实施方案还表示为用于处理织物原料或用于织物护理的方法，其中本发明的蛋白酶在至少一个方法步骤中是有活性的。其中优选的是用于织物原料、纤维、或具有天然成分的织物的方法，特别是具有羊毛或丝绸的那些。

本发明另外的主题是本发明试剂用于清洁织物或硬表面的用途，或者本发明的蛋白酶用于清洁织物或硬表面的用途，特别是以这样的方式，其中所述蛋白酶的使用量是40μg至4g，优选50μg至3g，特别优选100μg至2g，以及特别优选200μg至1g。

针对本发明的蛋白酶和含有其的试剂所描述的所有情形、主题、和实施方案也适用于本发明的此主题。因而在此节点清楚提到了相应节点的公开，且说明此公开也适用于本发明的此用途。

实施例

所有的分子生物学操作步骤遵从标准方法，如例如手册Fritsch,Sambrook,and Maniatis,"Molecular cloning:a laboratory manual,"Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York,1989或相当的相关著作中所述的那些。酶和试剂盒根据各厂商的说明来使用。

实施例1

由包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白酶出发，使用PHUSIONSite-Directed Mutagenesis Kit(Finnzyme,F541)，通过在编码所述蛋白酶的核酸中的定点诱变制备了本发明的蛋白酶变体。其中，修饰了指定位置氨基酸的密码子，从而相对于氨基酸序列产生了如所示的氨基酸替换。通过用相应的表达载体转化枯草芽孢杆菌DB104(Kawamura and Doi(1984),J.Bacteriol.,Vol.160(1),pp.442-444)以及随后培养表达所述蛋白酶变体的转化体，以本领域通常的方式进行了蛋白酶变体的表达。

蛋白酶变体1:蛋白酶，其具有这样的序列，所述序列是具有根据SEQID NO.1计数的氨基酸取代S3T、V4I、R99E、V199I的SEQ ID NO.1的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)；

蛋白酶变体2:蛋白酶，其具有这样的序列，所述序列是具有根据SEQID NO.1计数的氨基酸取代S3T、V4I、R99D、V199I的SEQ ID NO.1的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2:确定本发明的蛋白酶在用于商业常规液体洗涤剂时的清洁性能

标准化的污损的织物被用于此实施例。使用了如下的污迹:

A.棉上的血迹:可得自

Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialen AG,St.Gallen,Switzerland的产品编号111,

B.棉上的奶/炭黑(wfk-Cleaning Technology Institute e.V.,Krefeld,Germany),

C.棉上的血-奶/墨水:可得自CFT(Center For Testmaterials)B.V.,Vlaardingen,Netherlands的产品编号C-05。

使用此测试材料，研究了各种洗涤剂制品的清洁性能。为此，在20℃或40℃的温度将多个批次洗涤了70分钟。剂量比率为每升洗涤槽(washingbath)4.7g的洗涤剂。使用具有德国硬度16度的自来水进行洗涤。

使用如下组成的基准洗涤剂制品作为对照洗涤剂(所有均表示为重量百分比):0.3％至0.5％的黄原胶，0.2％至0.4％的消泡剂，6％至7％的甘油，0.3％至0.5％的乙醇，4％至7％的FAEOS(脂肪醇醚硫酸盐)，24％至28％的非离子表面活性剂，1％的硼酸，1％至2％的柠檬酸钠(二水)，2％至4％的苏打，14％至16％的椰子脂肪酸，0.5％的HEDP(1-羟基乙烷-(1,1-二膦酸))，0％至0.4％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，0％至0.05％的光学增亮剂，0％至0.001％的染料，其余为去离子水。

所述基准洗涤剂制品中以相同的活性蛋白基础(0.03wt％活性材料)加入了如下的蛋白酶，用于各系列的实验。来自实施例1的蛋白酶变体1(批次1)被用作本发明的蛋白酶。使用的参照为国际专利申请WO03/057713的图2以及SEQ ID NO.3中所公开的蛋白酶(批次2)。此参照蛋白酶在液体洗涤剂和清洗剂中展现出非常好的清洁性能。

洗涤后，测量了所洗涤织物的洁白度。在Minolta CM508d光度计(D65照射，10°)上进行测量。之前已经用与仪器一起提供的白标准校准了该仪器。所得的结果是用本发明的蛋白酶获得的去除单位(remission unit)与用参照蛋白酶获得的去除单位之间的差异(ΔREM＝批次1去除单位-批次2去除单位)。正值因而表明本发明的蛋白酶与参照蛋白酶相比改善的洁白度。结果总结于下表1中。

表1:用液体洗涤剂在20℃和40℃的洗涤结果

温度	污迹	ΔREM
			20℃	A	3.7
	B	5.9
			40℃	A	6.2
	C	3.3

显然，本发明的蛋白酶展现出改善了的清洁性能，特别是对于含血污迹。

实施例3:确定本发明蛋白酶的温度稳定性

以10至20μg/ml的浓度在0.1M的甘氨酸/NaOH缓冲液中于60℃和pH10.0温育如下所示的蛋白酶。以60分钟时间段的规律间隔取样，置于冰上，并使用活性测试进行了测量，通过对硝基苯胺(pNA)生色团从底物中的释放确定残余蛋白水解活性。底物是suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺底物(suc-AAPF-pNA)。蛋白酶裂解底物并释放pNA。pNA的释放引起410nm处消光的增加，其时间进程是酶活性的指示(参见Del Mar et al.,1979)。基于所确定的残余活性值计算半衰期。获得了如下的半衰期(t1/2):

测量的半衰期

显然本发明的蛋白酶展现出显著改善的温度稳定性。

本发明的蛋白酶因此展现了改善的清洁性能以及有利地是温度稳定的。

实施例4:在60℃的洗涤温度用于商业常用液体洗涤剂时确定本发明蛋白酶的清洁性能

标准化的污损的织物用于此实施例。使用如下污迹:

a)来自

Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialen AG,St.Gallen,Switzerland的污迹:EMPA117(聚酯/棉上的血/奶/墨水),EMPA112(棉上的可可)

b)来自wfk-Cleaning Technology Institute e.V.,Krefeld,Germany的污迹:10EG(棉上的蛋黄),10N(棉上的全蛋/色素)

c)来自CFT(Center For Testmaterials)B.V.,Vlaardingen,Netherlands的污迹:CS-01(棉上的血迹),C-05(棉上的血/奶/墨水),CS-44(棉上的巧克力饮品),CS-37(棉上的全蛋与色素),C-10(棉上的色素/油/奶),CS-06(棉上的具有天然黑的沙拉酱),CS-08(棉上的草)。

使用此测试材料，研究了各种洗涤剂制品的洗涤性能。除了在较高的温度，具体而言60℃，进行洗涤，其余如实施例2所述进行实验。来自实施例1的蛋白酶变体1(此后称作批次1)被用作本发明的蛋白酶。已经在液体洗涤剂和清洗剂中展现出非常好清洁性能的如下蛋白酶被用作参照:

批次2:根据WO95/23221的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶的变体F49；

批次3:根据WO92/21760的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶的变体(在位置3、4和199处修饰)；

批次4:蛋白酶，其具有这样的序列，所述序列是具有根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E的SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

批次4作为标准。下表3中所示的值代表对所有污迹的清洁性能值的和，作为与根据批次4的标准的差异。因而负值表示与标准相比对所有污迹较差的清洁性能；正值表示与标准相比对所有污迹改善的清洁性能。

表3:

批次	1	2	3	4
					清洁性能	+10.2	-20.9	-24.0	0

显然本发明的蛋白酶在60℃也展现了显著改善的清洁性能。

Claims

1.一种蛋白酶，其包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外的氨基酸取代的组合。

2.一种蛋白酶，特征在于其可由权利要求1的蛋白酶作为起始分子，通过单个或多个保守氨基酸取代而得，其中所述蛋白酶包含根据SEQ IDNO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合，

和/或

其可由权利要求1的蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合依然存在，

和/或

其可由权利要求1的蛋白酶作为起始分子，通过在比对中与SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的位置的一或多个氨基酸取代而得，其中该蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

3.用于制备蛋白酶的方法，包括将根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合引入到在全长上与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少70％相同的起始分子中。

4.权利要求3的方法，还包括一或多个如下方法步骤:

(a)引入单个或多个保守氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据SEQID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合；

(b)通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变修饰氨基酸序列，修饰的方式是，所述蛋白酶包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265、或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合依然存在；

(c)向一或多个在比对中与SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255、和268相关联的位置引入单个或多个氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

5.编码权利要求1或2的蛋白酶或者编码根据权利要求3或4的方法获得的蛋白酶的核酸。

6.含有权利要求5的核酸的载体，特别是克隆载体或表达载体。

7.非人宿主细胞，其含有权利要求5的核酸或权利要求6的载体，或者含有权利要求1或2的蛋白酶，或者含有根据权利要求3或4的方法所获得蛋白酶，特别是将蛋白酶分泌至包围所述宿主细胞的培养基中的宿主细胞。

8.制备蛋白酶的方法，包括

a)培养权利要求7的宿主细胞，

b)从培养基或者从宿主细胞分离蛋白酶。

9.试剂,特别是洗涤剂或清洗剂，特征在于其含有权利要求1或2的蛋白酶或者根据权利要求3或4的方法获得的蛋白酶中的至少一种，特别是以每g所述试剂2μg至20mg的量含有所述蛋白酶，

和/或其含有权利要求1或2的蛋白酶或者根据权利要求3或4的方法获得的蛋白酶中的至少一种，并且所述试剂中的蛋白酶被在室温或在无水时对所述蛋白酶不可渗的物质所包裹。

10.用于清洁织物或硬表面的方法，特征在于在至少一个方法步骤中使用权利要求9的试剂；或者在至少一个方法步骤中，权利要求1或2的蛋白酶或者权利要求3或4的方法获得的蛋白酶是有催化活性的，特别是以每次使用40μg至4g的量使用所述蛋白酶。