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CN103826625A - 单胺氧化酶抑制剂及前列腺癌的治疗和诊断方法 - Google Patents

单胺氧化酶抑制剂及前列腺癌的治疗和诊断方法 Download PDF

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CN103826625A
CN103826625A CN201280046591.5A CN201280046591A CN103826625A CN 103826625 A CN103826625 A CN 103826625A CN 201280046591 A CN201280046591 A CN 201280046591A CN 103826625 A CN103826625 A CN 103826625A
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mao
cells
monoamine oxidase
mhi
cancer
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J·C·施
L·钟
H·E·周
B·J·吴
B·奥列尤克
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Original Assignee
University of Southern California USC
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Abstract

本发明公开了单胺氧化酶(MAO)驱动的上皮-间充质转化(EMT)的机制。还公开了通过抑制或遏制癌细胞中的MAO来治疗癌症的方法。本发明提供了新型MAO抑制剂，例如小分子、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、适体、诱骗剂和通过扰乱MAO的功能而治疗癌症的药物组合物。具体而言，本发明提供了通过使近红外染料783、IR-780和MHI-148与诸如氯吉兰等MAO抑制剂共价缀合而形成的一类缀合物，其包封或不包封在纳米颗粒中。本发明的其他方面包括纳米缀合物的形成方法、通过监视MAO活性的变化来监视癌症患者的治疗进展的方法、通过测定MAO活性的水平和定位来筛查有癌症风险的患者的方法或区分不同形式的癌症的方法。

Description

单胺氧化酶抑制剂及前列腺癌的治疗和诊断方法
关于联邦资助研发的声明
本发明是在由美国国家卫生研究院依第P01-CA98912、DAMD-17-03-02-0033、R01-CA122602和R01-MH39085号合同授予的政府支持下做出的。美国政府享有本发明的部分权益。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年7月26日提交的美国临时专利申请第61/511,920号中所公开发明的权益，在此通过援引将其整体内容并入本文中。
技术领域
本发明总体涉及对单胺氧化酶(MAO)的抑制及单胺氧化酶抑制剂(MAOI)，以作为治疗癌症、特别是前列腺癌的对策。本发明还涉及癌症的成像、筛查、诊断和治疗方法。另外，本发明还涉及癌症生物标志物以及进展缓慢性(indolent)和恶性(virulent)前列腺癌的鉴别方法。
背景技术
前列腺癌是所有年龄段的男性中第三常见的癌症死因，并且是75岁以上的男性中最为常见的癌症死因。前列腺癌的现有治疗手段包括：(1)激素疗法；(2)化疗；(3)放射疗法；和(4)外科手术。不过，这些疗法仅对疾病早期的患者有效。这些治疗模式还各自具有相关的不良副作用。而且，对于患有晚期去势抗性前列腺癌和转移性前列腺癌的患者而言，这些治疗手段仅部分有效。
补充疗法或组合疗法可以改善对晚期患者的疗效。例如，经受雄激素剥夺疗法(使用LH-RH激动剂的化学去势或外科手术去势)的患者受益于与抗雄激素(例如比卡鲁胺)的组合。这些激素疗法未能成功的患者通常可受益于选择性化疗(例如多西他赛和狄诺塞麦(denosumab))和额外的激素疗法，从而耗尽残余的内源性雄激素合成(例如CYP17抑制剂，阿比特龙)。尽管有所改善，但是这些额外的疗法通常仅能延长数月的寿命。
前列腺癌的预后和分期通常使用Gleason分级系统来进行评价。基于前列腺癌的显微外观来对其进行Gleason评分。Gleason评分较高的癌症更具侵略性并具有更差的预后。Gleason评分由病理医师目视检查活检样品、然后为所观察的肿瘤图样分配评分来确定。不过，Gleason系统完全依赖于人的目视检查，这容易产生误差，因而对早期检测有很大限制。
鉴于此，对于更有效的基于机制的疗法和非侵入性早期诊断技术仍存在迫切且尚未得到满足的需求，所述技术用来鉴别进展缓慢性和恶性形式的前列腺癌，从而能够避免对该疾病的过度治疗。
发明内容
简言之，本发明部分基于下述意外发现：单胺氧化酶在癌性细胞中表现出差异性表达/活性，单胺氧化酶(MAO)的抑制剂能够遏制癌细胞的体外生长和肿瘤异种移植物的体内生长。
MAO是一类催化单胺氧化的酶。MAO在体内的大多数细胞类型中与线粒体的外膜结合。在人体中，MAO有两种亚型，即MAO-A和MAO-B。这两种形式的MAO是使生物源性和膳食性胺(包括单胺类神经递质)脱氨以生成过氧化氢(H2O2)的至关重要的一对氧化性酶。在正常的生理状态和疾病状态下，MAO的两种亚型均起关键作用并具有多种功能，例如调节情绪和行为。由于MAO在神经递质失活中具有重要作用，认为MAO功能紊乱(MAO活性过大或过小)会导致多种精神异常和神经障碍。例如，体内MAO的异常高或低的水平与抑郁、精神分裂、物质滥用、注意力缺乏症、偏头痛和性成熟异常相关。因此，现已知MAO为精神异常和神经障碍的靶标。
在本发明中，出乎意料地发现，MAO-A的活性或表达的增加与人前列腺癌的进展相关。例如，已经证明，氯吉兰(clorgyline)，一种强效MAO-A抑制剂，能够遏制人前列腺癌细胞的体外生长和肿瘤异种移植物的体内生长。这一发现将MAO确定为癌症靶标。
因此，本发明的第一方面涉及一种新型MAO抑制剂，所述抑制剂选自由如下所示的化合物11～14及其盐组成的组：
Figure BDA0000481596550000031
这些化合物是市售化合物，具有新发现的MAO抑制活性。这些化合物可以从包括但不限于Aurora Screening Library、Enamine HTS Collection和/或InterchimScreening Library的商购来源购得。因此，本发明的这一方面提供了用于抑制MAO活性的组合物，其包含选自由化合物11～14组成的组的一种或多种化合物。本发明的这一方面还提供了一种抑制MAO活性的方法，所述方法通过使细胞与选自由化合物11～14组成的组的一种或多种MAO抑制剂接触来抑制MAO活性。
除了上述公开的抑制剂外，本发明还出乎意料地发现，优先被癌细胞摄取的纳米颗粒(例如近红外染料)可以用作递送载体来将药学活性剂(例如细胞毒性化合物)递送至癌细胞。例如，本发明已经成功地将近红外染料纳米颗粒(例如IR-783)缀合至例如上述MAO抑制剂等活性剂上，并证实了所得的纳米缀合物仍会优先被癌细胞摄取。
因此，本发明的第二方面涉及一种纳米缀合物，所述纳米缀合物能够优先靶向或选择性靶向癌细胞。本发明这一方面的纳米缀合物通常具有与细胞毒性化合物缀合的近红外(NIR)染料纳米颗粒。示例性NIR染料可包括共轭多烯官能团，例如IR-783、IR-780、IR-786和MHI-148(但不限于此)中可见的官能团。示例性的细胞毒性化合物可包括MAO抑制剂、多西他赛、顺铂、卡铂、奥沙利铂、多柔比星、替莫唑胺、吉西他滨、安曲霉素、喜树碱、托泊替坎、氯尼达明、丝裂霉素、伊美克、达卡巴嗪(dacarbazide)和PK-11195，但不限于此。NIR染料纳米颗粒与细胞毒性化合物的缀合可以用本领域中已知的任何合适的化学手段来实现。
在一个优选实施方式中，本发明的示例性纳米缀合物通常具有至少两个具有细胞毒性单元(例如MAO抑制剂)的官能团，所述细胞毒性单元通过包含至少一个C和两个H原子的连接基团与发光性单元(例如NIR染料纳米颗粒)结合。优选的是，至少两个包含一个不饱和双键或三键的不饱和结构通过具有1～3、1～5或1～15个原子的主链与一个杂环连接。
示例性连接基团是具有以下通式的连接基团：
Figure BDA0000481596550000041
其中，M1是O或S；并且其中，X、Y和Z中的至少两个参与了与不饱和和/或芳香族基团A和B(未示出)的成键，A和B继续连接额外的碳、氧或氮原子。X、Y和Z中的未参与与基团A或B成键的任一个都取代有氢或低级脂肪族基团，例如C1-C6烷基。
本文所用的术语“主链”是指将上述两个不饱和结构连接在一起的原子链，并未将所述链考虑在内。
例如，本发明实施方式的缀合物或纳米颗粒包封的缀合物(本文称为纳米缀合物)可以是具有下式的物质：
Figure BDA0000481596550000042
A、B或C=F、Cl、Br、I
X=NH、O、S
Y=Cl、Br、I、甲磺酰基、甲苯磺酰基
m、n=1～15。
在另一实施方式中，X和Y如上，Z选自由组成的组，其中共价连接键连接至芳香环。该化合物在本文中称为MHI-吗氯贝胺，一种MAO-A特异性可逆抑制剂。
在另一实施方式中，X和Y同上，Z是
Figure BDA0000481596550000051
其中共价键也连接至芳香环。该化合物在本文中称为MHI-苯乙肼，是MAO-A和MAO-B抑制剂。
在又一实施方式中，X和Y同上，Z是具有下式的(±)-反式-2-苯基环丙-1-胺：
Figure BDA0000481596550000052
其中共价连接位于芳香环上。该化合物在本文中称为MHI-反苯环丙胺，其是MAO-A和MAO-B抑制剂。
在又一实施方式中，X和Y同上，Z为具有下式的N-苄基-N-甲基丙-2-炔基-1-胺：
Figure BDA0000481596550000053
其中共价连接键如曲线所示与氮原子结合。该化合物在本文中称为MHI-帕吉林，是MAO-A和MAO-B抑制剂，对MAO-B优先。
在一个优选实施方式中，Y是S；X是具有下式的基团：
Figure BDA0000481596550000054
且Z为具有下式的基团：
Figure BDA0000481596550000055
该化合物在本文中称为MHI-氯吉兰，其是MAO-A特异性可逆抑制剂。
在又一实施方式中，X和Y同上，Z是选自以下基团中的一种：
Figure BDA0000481596550000061
其中共价连接键连接至芳香环。该组化合物在本文中统称为MHI-MAOI。
MHI-MAOI可以分以下两步由MHI-148和抑制剂方便地制备：利用氢化锂铝或乙硼烷还原MHI-148，然后通过例如(但不限于)光延反应使所得二醇与MAOI缀合，从而得到缀合物11D。
Figure BDA0000481596550000062
在又一实施方式中，Y和Z同上，X是具有下式的基团：
Figure BDA0000481596550000071
其中共价连接键连接至该分子的环己烯环。该组化合物在本文中统称为NIR-MAOI。
本发明的第三方面涉及一种形成NIR染料类纳米缀合物的方法，所述纳米缀合物能够优先靶向癌性细胞。本发明这一方面的方法通常包括使NIR染料纳米颗粒与细胞毒性化合物化学缀合的步骤。合适的NIR染料和细胞毒性化合物如上所述。
本发明的第四方面涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，以及使用该组合物治疗癌症的方法。本发明这一方面的组合物通常包含能够抑制MAO活性的活性剂和生理适合的载剂。在一些优选实施方式中，活性剂是本领域已知的MAO抑制剂。示例性MAO抑制剂可以包括但不限于吗氯贝胺、苯乙肼、反苯环丙胺、帕吉林和氯吉兰。有利的是，还可以使用能够使MAO的表达下调、沉默或受到抑制的核酸。示例性核酸MAO抑制剂可包括siRNA、shRNA、反义核酸或本领域公知的任何其他类型的核酸类基因沉默剂，例如诱骗剂(decoy)、核酶和适体。此类优选实施方式可以单独使用，或者与上文所述的作为癌症治疗物的药物组合物组合使用。
在一个示例性实施方式中，使用shRNA使人前列腺癌细胞中的MAO-A基因沉默或将其敲落(Knock-Down)的过程可举例如下：在48孔组织培养板上，在每孔中的250μl正常培养基中接种6×104个人前列腺癌细胞，24小时后进行病毒感染，在感染当天，细胞应当达到约50%融合。制备在100μl培养基(无FBS和抗生素)中的40μl人shMAOA慢病毒转导颗粒(5×106滴度/ml)与聚凝胺(终浓度为5μg/ml)的混合物，将其添加到细胞中，随后温育4小时至过夜。4小时至过夜后，更新培养基。随后，在感染后48小时，用2～10ng/ml嘌呤霉素处理细胞以进行持续2周的选择，并且每3～4天用补充有嘌呤霉素的培养基进行更新。稳定的MAOA-KD细胞通过针对MAOA基因表达进行蛋白质印迹和实时RT-PCR检验来验证，并将其保持在补充有同样浓度的嘌呤霉素的培养基中，以进行选择。针对人MAOA cDNA的shRNA的序列为：CCGGCGGATATTCTCTGTCACCAATCTCGAGATTGGTGACAGAGAATATCCGTTTTTG，其由Sigma-Aldrich产品(分类号：NM_000240_TRCN0000046009)改造而来。
在其他优选实施方式中，活性剂是上述NIR染料类缀合物。在另外的优选实施方式中，活性剂是选自可得自商购来源(包括但不限于Aurora Screening Library、Enamine HTS Collection和/或Interchim Screening Library)的化合物11～14中的一种。
Figure BDA0000481596550000081
本发明的第五方面涉及一种将药剂递送至癌细胞的方法。本发明这一方面的方法通常包括以下步骤：将药剂缀合至NIR染料上，并使该缀合物接触癌细胞。在一些优选实施方式中，所述药剂为细胞毒性剂。示例性细胞毒性剂可包括烷基化剂、微管形成抑制剂和芳香酶抑制剂，但并不限于此。
本发明的第六方面涉及一种抑制癌细胞中的MAO活性的方法。本发明这一方面的方法通常包括使细胞与抑制剂接触的步骤，其中，所述抑制剂选自由MAO抑制剂、NIR染料与MAO抑制剂缀合的纳米缀合物以及其组合组成的组。有利的是，可使用本领域已知或本文公开的任何MAO抑制剂，药物类或核酸类均可。
针对前列腺癌，本发明的另一发现是MAO-A与人前列腺癌的化学抗性和放射抗性相关，而MAO-B在人前列腺癌相关的基质细胞中具有独特的表达谱。如上所述，MAO是结合在线粒体上的酶，其催化单胺神经递质和膳食性胺经由氧化脱氨而降解。它们由位于X染色体上的基因编码[1,2]。MAO催化的副产物是过氧化氢，过氧化氢是活性氧物种(ROS)的一种主要来源，其能够使癌细胞易遭受DNA损伤，并促进肿瘤发生和发展[3]。前列腺癌细胞中的胞内ROS水平调节可影响前列腺癌细胞对激素疗法、化疗和放射治疗的敏感性[4]。此外，在来自上皮-基质细胞区室中的膳食来源或生理来源的生物源性胺底物的存在下，MAO会导致ROS的产生。此外，由于已知前列腺基质会驱使前列腺癌发展，因此，通过区分前列腺癌组织样本中的MAO的形式、量和物理位置，可以区分人前列腺癌的进展缓慢形式和恶性形式。简言之，本发明出乎意料地发现，MAO能够充当用来筛选、诊断和区分患者的前列腺癌形式的生物标志物。基于MAO-A和MAO-B的定位不同这一发现，还设计了既靶向前列腺癌上皮中的MAO-A又靶向前列腺癌相关基质中的MAO-B的治疗方案。
因此，本发明的第七方面涉及一种区分不同形式的前列腺癌的方法，包括：检测前列腺组织中的MAO的活性和位置分布模式；根据所述MAO的活性和位置分布模式来确定癌症形式表征。所述MAO活性可以通过例如用来测量下述前列腺活检中的MAO-A表达的实时PCR来确定。
活检样品应当在Trizol中进行均质，并分离出RNA。接下来，将1μg总RNA在25μl体积中进行逆转录，然后将2μl样品(cDNA)以1/10稀释至20μl，并将5μl该样品用作MAO-A测量用模板。将另外的2μl以1/50稀释至100μl，并将5μl该样品用作核糖体RNA对照模板。
人MAO-A特异性引物的引物序列如下：
MAO A E1F168GTG TCA GCC AAA GCA TGG AGA188
MAO A E2R281CAG TCA AGA GTT TGG CAG CAG261
113bp PCR产物
18s核糖体RNA的引物序列如下：
F1565CAG CCA CCC GAG ATT GAG CA
R1816TAG TAG CGA CGG GCG GTG TG
253bp PCR产物
PCR条件：95℃×4分钟，一个循环
95℃×30秒
60℃×30秒
72℃×30秒   40个循环。
本领域技术人员将意识到，上述实例仅是为了进行说明，还可以使用当前已知或未来发明的其他测量方法来确定MAO活性。
本发明的第八方面涉及一种筛查患者以确定癌症风险的方法，该方法包括：检测患者的MAO活性，将所述活性与参照值进行比较，并基于该比较来确定风险水平。所述MAO活性可以通过例如用来测量下述前列腺活检中的MAO-A表达的实时PCR来确定：
活检样品应当在Trizol中进行均质，并分离出RNA。接下来，将1μg总RNA在25μl体积中进行逆转录，然后将2μl样品(cDNA)以1/10稀释至20μl，并将5μl该样品用作MAO-A测量用模板。将另外的2μl以1/50稀释至100μl，并将5μl该样品用作核糖体RNA对照模板。
人MAO-A特异性引物的引物序列如下：
MAO-A E1F168GTG TCA GCC AAA GCA TGG AGA188
MAO-A E2R281CAG TCA AGA GTT TGG CAG CAG261
113bp PCR产物
18s核糖体RNA的引物序列如下：
F1565CAG CCA CCC GAG ATT GAG CA
R1816TAG TAG CGA CGG GCG GTG TG
253bp PCR产物
PCR条件：95℃×4分钟，一个循环
95℃×30秒
60℃×30秒
72℃×30秒，40个循环。
本领域技术人员将意识到，上述实例仅是为了进行说明，还可以使用当前已知或未来发明的其他测量方法来确定MAO活性。
本发明的第九方面涉及一种癌症的治疗方法。本发明这一方面的方法通常包括以下步骤：对受试对象施用能够抑制癌细胞中的MAO的药剂。可以用本发明这一方面的方法治疗的癌症类型可以包括前列腺癌、脑癌、结肠癌和侵袭性纤维瘤病，但不限于此。所述药剂可以是上述组合物、纳米缀合物或抑制剂中的任一种。在一个优选实施方式中，癌症是前列腺癌。在另一优选实施方式中，前列腺癌的治疗可以包括：与氯吉兰一起施用靶向上皮内的MAO-A的第一药学活性剂，与司立吉林(deprenyl)一起施用靶向基质内的MAO-B的第二药学活性剂。所述第一和第二药学活性剂可以是不同的试剂或相同的试剂，只要它们可有效抑制相应组织类型中的相应MAO亚型即可。
本发明的第十方面涉及一种监视用含NIR染料类纳米缀合物的组合物进行治疗的癌症患者的治疗进展的方法。本发明这一方面的方法通常包括以下步骤：获得该患者的连续NIR图像，并比较所述连续NIR图像以确定所述治疗的进展。缀合物对前列腺肿瘤生长和转移的效果可以借助于成像和IHC分析来确定。所述成像可以用例如Xenogen IVIS200仪完成。该系统使研究者可以使用实时的非侵入性成像来监视和记录体内的细胞活动和基因活性。该系统中集成了生物发光系统和荧光系统，并能够容易地在模式间进行切换。激光扫描器还提供了3D表面形貌，以进行内部源的单视角扩散层析重建。使用低温冷却的26mm见方的CCD，使背景噪声最小化，同时使灵敏度最大化。扫描通常需要1～10分钟来在4cm～25cm范围内完成5个视野选项。
本发明的第十一方面涉及一种调节细胞内ROS水平的方法。本发明这一方面的方法通常包括使细胞与MAO抑制试剂接触的步骤。合适的MAO抑制试剂可以是上述MAO抑制剂、纳米缀合物或药物组合物中的任一种。这些试剂可以单独使用，或者与线粒体定向抗氧化剂(例如硫辛酸、N-乙酰基左旋肉碱和N-乙酰基左旋半胱氨酸)组合使用。
本发明的其他方面和优势将通过以下具体描述和所附的权利要求而变得显而易见。
附图说明
图1A～1B显示出，与注射WT MCP3细胞(空心圆)的情况相比，在注射了敲落MAO-A的MCP3细胞(PTEN和p53双KO的小鼠细胞系，见实心圆)的小鼠中，肿瘤异种移植物的生长速率大大下降。在将敲落MAO-A的MCP3前列腺癌细胞(1×106个细胞)注射至小鼠中后，不存在肿瘤生长，而在注射了WT MCP3细胞的小鼠中却发现了大量的肿瘤。图1C显示出，MAO-A的表达与人和鼠的癌细胞的细胞增殖曲线相关。接种了MAO-A表达经操控的2×104个人或鼠前列腺癌细胞，并为期6天连续对细胞数量进行计数。实验分三等份进行。shMAO-A：经shRNA慢病毒感染而敲落的MAO-A。
图2示出了氯吉兰-NIR染料缀合物的合成方案以及纳米氯吉兰的制备。
图3示出了本发明的新型MAO-A抑制剂的实例。
图4A～4D显示出，宿主中的MAO-A敲除阻碍了鼠F9畸胎癌异种移植物的生长。将1×105个鼠F9畸胎癌细胞皮下注射至WT小鼠(N=9)和MAO-A KO小鼠(N=9)中。*,p<0.05;**,p<0.01。
图5A和5B示出，宿主中的MAO-A敲除抑制了鼠MCP3前列腺癌异种移植物的生长。将1×105个鼠MCP3前列腺癌细胞皮下注射至WT小鼠(N=4)和MAO-A neoKO小鼠(N=5)中。*,p<0.05;**,p<0.01。
图6A～6D示出，鼠MCP3前列腺癌细胞中的MAO-A敲除抑制了体内肿瘤异种移植物的生长。将1×106个WT和MAO-A-KD鼠MCP3前列腺癌细胞分别皮下注射至6只(WT细胞)和4只(MAO-A-KD细胞)C57BL/6小鼠中。*,p<0.05。
图7A、7B、7C和7D示出了在由取自88位患者的前列腺癌组织构成的组织微阵列(每位患者取2个组织芯(core))中的MAO-A和MAO-B的免疫组化染色。9A显示了MAO-A(基细胞蛋白)在癌细胞中表达；试样的良性和癌性区域中存在最小限度的基质反应。相反，9B显示MAO-B(间充质细胞蛋白)在正常和癌性前列腺上皮细胞中仅有最小限度的表达，但在前列腺癌相关的基质细胞中表达增加。由于已知前列腺基质细胞诱导前列腺癌的上皮生长和发展以及前列腺上皮的克隆演变，因此认为MAO-B还是用于治疗干预措施的有效基质靶标。9C显示了人骨骼中强烈的MAO-A阳性染色的前列腺癌细胞，表明了MAO-A可以是针对前列腺癌骨转移的优异靶标。9D显示出正常的前列腺上皮细胞也表达MAO-A但不表达MAO-B(未示出数据)。
图8示出了IR-783(NIR染料)-多西他赛缀合物的简要合成方案。
图9A～9E显示，发现IR-783-多西他赛可以被摄入人前列腺癌细胞(C4-2,PC-3)、胰腺癌细胞(MIA-PaCa2)和肾癌细胞中(SN12C,见图片A)；发现该NIR-多西他赛缀合物没有被摄入人正常的前列腺上皮细胞(P69)和人胎儿肾293细胞中(见图片B)。细胞毒性测定显示，该NIR-多西他赛缀合物以浓度依赖性方式在体外对一组人癌细胞系表现出生长抑制效果(见图片c)。使用人肾癌细胞(SN12C)和正常胎儿肾细胞(HFK293)作为模型，发明人观察到该染料-药物缀合物在杀死SN12C细胞方面具有像母体药物多西他赛那样等同的有效性，但对于HFK293细胞却非如此，该结果与染料-药物缀合物进入癌细胞而不进入正常细胞的推断一致。
图10示出了生成MHI-氯吉兰的示例性合成路线。
图11示出了使用以下物质处理过的C4-2B前列腺癌细胞的示例性共聚焦图像：Mitotracker Green(左上)、化合物10(右上)、DAPI(左下)和叠加(overlay)(下中)。明视野图像位于上部中间。
图12示出了MHI-氯吉兰10的示例性MAO-A抑制曲线。将化合物10与1×106个前列腺C4-2B细胞在37℃下预温育20分钟。然后，将MAO-A底物C-14血清素添加到温育溶液中，在37℃下保持20分钟。温育结束时，提取反应产物并计数放射性。将MAO-A活性表达为69.6nM所形成的产物/20分钟/mg蛋白。将不存在抑制剂(即化合物10)时的活性设为100%。
图13示出了正常(A)、Gleason型3(B)、Gleason型5(C)和骨转移性(D)的人前列腺腺癌临床样品的代表性免疫组化染色，在高等级的和骨转移性PCa中显示出了升高的MAO-A表达。放大率分别为400倍(A～C)和200倍(D)。
图14显示，MAO-A决定了人PCa肿瘤异种移植物的体内生长。左图(A～B)，基线处表现出有限的MAO-A表达的人PC-3细胞在稳定地过表达MAO-A时提高了无胸腺裸鼠(N=8)中的肿瘤异种移植物(A)和肿瘤重量(B)的增长。右图(C～D)，人ARCaPM细胞中的MAO-A的shMAO-A敲落(KD)消除了无胸腺裸鼠(N=5)中的肿瘤异种移植物的生长(C～D)。shCon和shMAO-A：WT和MAO-A-KD细胞。*,p<0.05,**,p<0.01。
图15示出了宿主MAO-A对前列腺癌生长的影响。将1×105个鼠前列腺癌TRAMPC-2细胞皮下注射至WT小鼠(N=6)和MAOA KO(N=4)小鼠中，每只小鼠3个注射点。皮下注射至MAO-A neo小鼠中的鼠前列腺癌TRAMPC-2(神经内分泌表型)显示出显著下降的PCa生长速率，由此表明宿主MAO-A在确定前列腺癌生长速率中具有关键作用。肿瘤发生率(A)和肿瘤体积(B)与肿瘤发展和肿瘤重量(C)一起确定。
图16：胫骨内注射了乱序对照/MAO-A-KD人ARCaPM或C4-2PCa细胞的小鼠中的骨组织破坏(13～19周)的代表性X射线(A)和微CT(B)。白色箭头指示溶骨损伤。
图17：MAO-A在人PCa细胞中诱导EMT。左图(A～B)，MAO-A在PC-3细胞中的过表达遏制了E-钙粘蛋白并使波形蛋白、N-钙粘蛋白和Twist1上调(A)，并增加了细胞迁移和侵袭(B)。右图(C～E)，ARCaPM细胞中的MAO-A的shRNA敲落增加了E-钙粘蛋白并使N-钙粘蛋白和Twist1下调(C)，减少了细胞迁移和侵袭(D)，并改变了细胞形态(E)。**,p<0.01。放大率为200倍。
图18：MAO-A在人PCa细胞中提高了HIF1α的表达。在PC-3细胞中，(A)MAO-A的过表达在缺氧(0.5%O2)时提高了HIF1α水平，并且(B)在响应于24小时缺氧条件时激活了HIF1α调控的VEGFA、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、Snail2和Twist1的mRNA表达。利用常氧条件下的对照PC-3细胞将所有的相对mRNA表达归一化。**,p<0.01。
图19：MAO-A增强了PC-3肿瘤异种移植物对NIR染料的摄取。(A)皮下植入了对照细胞(左侧)和过表达MAO-A的PC-3细胞(右侧)的裸鼠的代表性体内MHI-148NIR成像(腹腔内注射，10nmol/20g)。箭头指示肿瘤异种移植物。(B)肿瘤组织而非器官在体外NIR成像中显示强信号。(C)通过确定总发射量除以肿瘤重量(5小鼠)的结果来定量(A)中的肿瘤NIR强度。*,p<0.05。
图20：(A)示出了人患者的正常、3级和5级样品中的E-钙粘蛋白、波形蛋白和MAO-A的免疫组化。(B)示出了过表达MAO-A的PC-3细胞中的MAO-A、E-钙粘蛋白、波形蛋白、N-钙粘蛋白和Twist1的蛋白质印迹。(C)示出了对对照细胞和过表达MAO-A的PC-3细胞中的E-钙粘蛋白启动子的Luc测定。(D)示出了MAO-KD LNCaP细胞中的MAO-A和E-钙粘蛋白的蛋白质印迹，对MAO-A-KD LNCaP细胞中的波形蛋白和N-钙粘蛋白的实时PCR。(E)示出了对MAO-A经操纵的PC-3细胞和LNCaP细胞的迁移测定。(F)示出了对MAO-A经操纵的PC-3细胞和LNCaP细胞的侵袭测定。
图21：(A)示出了过表达MAO-A的PC-3细胞中的核HIF1α的蛋白质印迹。(B)示出了在不同时间的过表达MAO-A的PC-3细胞中的HIF1α的蛋白质印迹。(C)示出了对过表达MAO-A的PC-3细胞中的Snail2、Twist1、VEGFA、Glut1和HIF1α的实时RT-PCR。(D)不同时间时的MAO-A-KD LNCaP细胞中的HIF1α的蛋白质印迹。(E)示出了对MAO-A-KD LNCaP细胞中的Snail2、Twist1、VEGFA、Glut1和HIF1α的实时RT-PCR。
图22：(A)经MG-132处理的过表达MAO-A的PC-3细胞中的HIF1α-OH和HIF1α的蛋白质印迹。(B)对经DMOG处理的过表达MAO-A的PC-3细胞中的VEGFA和Glut1的实时PCR。(C)缺氧下的表达MAO-A的PC-3细胞中的ROS测量结果的FACS。(D)缺氧下的经NAC处理的过表达MAO-A的PC-3细胞中的HIF1α的蛋白质印迹。(E)对缺氧下的经NAC处理的过表达MAO-A的PC-3细胞中的Twist1、VEGFA和Glut1的实时RT-PCR。(F)示出了经NAC和DMOG处理的过表达MAO-A的PC-3细胞中的HIF1α的蛋白质印迹。(G)示出了过表达MAO-A的PC-3细胞在NAC处理下的示例性细胞增殖曲线。
图23：(A)示出了MAO-A经操纵的PC-3和LNCaP细胞中的VEGF的实时RT-PCR和ELISA。(B)示出了经VEGF处理的PC-3细胞中的pAkt和pFoxO1的蛋白质印迹。(C)示出了MAO-A经操纵的PC-3和LNCaP细胞中的pAkt和pFoxO1的蛋白质印迹。(D)示出了过表达MAO-A/NRP-1-KD PC-3细胞中的NRP-1、pAkt和pFoxO1的蛋白质印迹。(E)示出了过表达MAO-A的PC-3肿瘤异种移植物中的H&E、VEGF和NRP-1的免疫组化。(F)示出了对过表达MAO-A和NRP-1-KD PC-3细胞的迁移和侵袭测定。(G)示出了过表达MAO-A的PC-3细胞和NRP-1-KD PC-3细胞的示例性细胞增殖曲线。(H)示出了过表达MAO-A的PC-3细胞、经VEGF处理的PC-3细胞和NRP-1-KDPC-3细胞中的核FoxO1的蛋白质印迹。
图24：(A)对MAO-A经操纵的PC-3细胞和LNCaP细胞中的Twist1mRNA或启动子的实时RT-PCR和luc测定。(B)FoxO1经操纵的PC-3细胞中的Twist1的蛋白质印迹和实时RT-PCR。(C)示出了对PC-3细胞中的Twist1启动子和WT/H215R AAAFoxO1构建体进行的luc测定。(D)示出了不同物种的Twist1启动子中的FoxO1结合位点的表征。(E)示出了对PC-3细胞中的WT/Mut Twist1启动子和FoxO1构建体进行的luc测定。(F)示出了对过表达MAO-A的PC-3细胞中的WT/Mut Twist1启动子的luc测定。(G)示出了对过表达MAO-A的PC-3细胞中的FoxO1结合位点的ChIP测定。(H)示出了敲落与MOA-A抑制的对比。
图25：(A)示出了MAO-A-KD LNCaP、C4-2、ARCaPm和MCP3肿瘤异种移植物的肿瘤发生率、肿瘤体积和肿瘤重量。(B)示出了MAO-A-KD LNCaP和C4-2肿瘤异种移植物的MAO-A活性。(C)～(E)示出了MAO-A-KD LNCaP和C4-2肿瘤异种移植物中的H&E、MAO-A、E-钙粘蛋白、波形蛋白、HIF1α和VEGF的免疫组化。(D)示出了MAO-A-KD LNCaP和C4-2肿瘤异种移植物中的肿瘤线粒体ROS测量结果。
图26：(A)示出了人患者的3级和5级样品中的MAO-A、HIF1α、VEGFA、FoxO1、pFoxO1和Twist1的免疫组化。(B)示出了对免疫组化数据的统计学分析。
图27示出了MAO-A驱动的EMT机制的示意图。
具体实施方式
定义
除非本文另外指出，否则本文中使用的所有术语均具有对本发明所属技术领域的技术人员而言通常具有的含义。从业者可以特别参考现有的教科书来获得本领域的定义和术语。不过，要理解的是，本发明并不限于所描述的特定方法、方案和试剂，这些要素可以改变。
“治疗”是指治疗性处理和预防性或防治性措施，其目的是防治或减缓(减轻)目标病理学病况或病症。需要治疗者包括已经患有所述病症者以及易患所述病症者或要防治所述病症者。
单胺抑制剂的“治疗有效量”是足以实现特别声明的目的的量。“有效量”可以根据所声明的目的凭经验以常规方式确定。
本发明使用的“载剂”包括药学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，其对暴露在所用剂量和浓度的载剂下的细胞或哺乳动物无毒。生理可接受的载剂可以是无菌的pH缓冲水溶液。生理可接受的载剂的实例包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量多肽(小于约10个残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂。
最近的研究表明，增多的MAO-A与前列腺癌的发展相关[5]；相反，MAO-A的药理学抑制或由慢病毒shRNA介导的MAO-A沉默显著降低了前列腺癌细胞的体外生长和肿瘤异种移植物的体内生长[6-8]。另外，发明人的数据显示，通过促进E-钙粘蛋白(上皮标志物)表达的减少、波形蛋白(间充质标志物)的水平上调和前列腺癌细胞侵袭和迁移的增加，MAO-A诱导了人前列腺癌细胞中的上皮-间充质转化(EMT)。这些结果表明，MAO-A的表达可能与前列腺癌细胞的转移潜力有关。总之，该证据强力支持了MAO-A作为治疗人前列腺癌的潜在新靶标的角色。
发明人发现，敲落(KD)了单胺氧化酶A(MAO-A)的前列腺癌细胞在注射至小鼠中后并不生长。该结果与WT前列腺癌细胞截然不同(见图1)。使用共10只C57BL/6背景下的野生型(WT)小鼠。对六只小鼠注射源自C57小鼠品系的WT MCP3(PTEN/p53双敲除)前列腺癌细胞，每只小鼠4个位点，总共24个位点。对四只小鼠注射MAO-A敲落(KD)的MCP3细胞，每只小鼠4个位点，总共16个位点。在指定的日期计数肿瘤数。将肿瘤发生率定义为可检测的肿瘤总数除以注射位点总数。图1示出了注射了MAO-A敲落的MCP3细胞的小鼠肿瘤异种移植物中的肿瘤生长速率(实心圆)与WT MCP3细胞(空心圆)的比较。当对小鼠注射MAO-A敲落的MCP3(PTEN和p53双KO)前列腺癌细胞(1×106个细胞)时，不存在肿瘤生长，而在注射了WT MCP3细胞的小鼠中却发现了大量的肿瘤。
本发明的一个方面是一种通过将MAO-A抑制剂氯吉兰与NIR染料化学缀合而能够将氯吉兰递送至癌细胞和组织的方法。预期NIR染料-氯吉兰缀合物会被癌细胞而非正常细胞摄取，因而避免了该MAOI的全身性毒性。可以使用激光扫描共聚焦显微镜检来确定纳米氯吉兰在细胞(LNCaP、C4-2和ARCaPM前列腺癌细胞系)中的细胞摄取和定位。这种类型的NIR染料可以经由有机阴离子转运肽而被容易地摄入癌细胞中。图10和11显示，发现多西他赛的NIR染料(IR-783)缀合物(即，IR-783-多西他赛)被摄入人前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和肾癌细胞中，但未被摄入人前列腺上皮细胞或人胎儿肾细胞中，这表明此类NIR染料-化疗剂缀合物进入癌细胞而不进入正常细胞。
为了确定纳米氯吉兰的抑制MAO-A活性的能力，获得了前列腺癌细胞LNCaP、C4-2和ARCaPM细胞系的MAO-A抑制曲线，并将其与氯吉兰本身比较。这些细胞系具有中度～高度的MAO-A活性。确定了纳米氯吉兰的IC50值并与氯吉兰进行比较。
为了研究纳米氯吉兰和NIR染料(IR-783、IR-780和MHI-148)-氯吉兰对MAO-A和MAO-B的抑制效果，制作了小鼠中的MAO-A和MAO-B抑制曲线。确定了IC50值。
为了研究纳米氯吉兰和NIR染料-氯吉兰缀合物的定位以及其对肿瘤生长的影响，将前列腺细胞注射至小鼠中。在一个示例性实验中，将小鼠分为三组，分别注射(a)NIR染料-氯吉兰的纳米氯吉兰、(b)氯吉兰本身和(3)仅染料。对纳米氯吉兰的位置进行成像，监测肿瘤生长(尺寸、数量和重量)，并比较三组的结果。
实验结果证实了纳米氯吉兰对肿瘤生长的效果。在确定了氯吉兰纳米缀合物的有效性后，本领域技术人员将会意识到，通过常规实验方法可以容易地确定其他参数，例如抑制MAO-A活性和肿瘤生长所需的浓度。
MAO-A抑制剂(包括其NIR染料-MAOI缀合物)可以单独使用，或者与针对肿瘤生长和转移的现有治疗手段一起使用，例如(a)外科手术去势、(b)放射、(c)多西他赛和(d)阿比特龙。
另外，通过对患者施用包含有效量的氯吉兰-染料缀合物的组合物，该氯吉兰-染料缀合物可以用于前列腺癌的治疗方法和前列腺癌的诊断和进展监视方法。
氯吉兰-染料缀合物纳米颗粒(纳米氯吉兰)的设计、合成、包封以及在细胞中的测试
1.IR-783纳米颗粒染料缀合物
氯吉兰-染料缀合物的制备。发明人已经鉴定出了一类近红外(NIR)荧光七甲川青蓝染料(即IR-783(1)，见图2)作为氯吉兰缀合的候选物。该近红外染料IR-783可商购获得，并且可以经过与对硫苯胺2的一步反应而容易地转变为前体3。基于发明人对氯吉兰-MAO-A复合物的晶体结构的建模研究[9]，发明人确定，胺的氮可以用将该化合物缀合至前体3所需的连接基团来修饰，但不影响其抑制能力。图2中概述了衍生物氯吉兰酸9的制备合成工序。该合成由一系列还原胺化反应构成，从市售的炔丙基胺4和3-(2,4-二氯苯氧基)丙醛5产生9。这两个构造单元3和9的缀合可以通过成熟的合成步骤工序来完成。与IR-783相似，预期该缀合物在750nm～780nm受到激发后会在820nm～860nm具有强发射。这可以通过NIR成像容易地读出。
氯吉兰-染料缀合物在纳米颗粒中的包封。为了实现氯吉兰-染料缀合物的水溶性并增强其向肿瘤的递送，发明人将其包封于在水中可自由分散的平均尺寸为22nm的磷酸钙/硅酸钙纳米颗粒中[10]。该包封过程仅使染料的光物理性质有轻微改变。此种包封方法已经由Adair报道，是向细胞递送疏水性染料的有效手段[11]。磷酸钙是纳米颗粒包封用的优异基质，这是因为适中浓度的Ca2+离子对细胞无毒并在体内(见于人骨骼和牙齿)无毒。已经表明，磷酸钙在pH低于5.5时溶解并释放载物，但在pH为7.4时是稳定的[12]。另外，该基质的颗粒可自由分散在水性介质中。
通常，在油包水微乳液中在硅酸二钠的存在下利用氯化钙和磷酸氢二钠的水性共沉淀来制备此种纳米颗粒[11,13]。通过在沉淀时将氯吉兰-染料缀合物添加到微乳液中，来完成其在纳米颗粒中的包封。该过程将产生尺寸为22nm～30nm的纳米颗粒的胶体悬浮体形式的纳米氯吉兰。使用透射电子显微镜(TEM)分析纳米颗粒悬浮体的尺寸分布、形态和分散液的胶体状态，从而对其进行表征。
确定纳米氯吉兰对MAO-A活性的抑制。通过制作人前列腺癌细胞系LNCaP(非转移性细胞系)、C4-2和ARCaPm(两种转移性细胞系)的抑制曲线，发明人研究了纳米氯吉兰抑制MAO-A活性的能力。确定了IC50值。所有这些细胞系均具有中到高的MAO-A活性。Shih实验室常规进行了MAO-A的体内和体外抑制测定。
确定纳米氯吉兰是否靶向癌细胞的线粒体。发明人使用激光扫描共聚焦显微镜检来确定纳米氯吉兰在细胞内的细胞摄取和定位。缀合物中的近红外染料部分将用作引导基团，将缀合物引导至线粒体。已经表明，线粒体的氧化还原电位在癌细胞和正常细胞中不同。
测试了人癌细胞系(LNCaP，非转移性细胞系；C4-2和ARCaPM，两种转移性细胞系)。作为阴性对照物，使用了正常的人前列腺上皮细胞(P69和NPE)和正常的人前列腺成纤维细胞(NPF)。
可以预计，以下的研究将表明在使用纳米氯吉兰进行治疗后前列腺癌的生长将明显下降。结果由降低的肿瘤生长速率、尺寸和重量来确定。发明人预期，纳米氯吉兰将比氯吉兰本身更为有效，且副作用更少。另外，发明人确认MAO-A是前列腺癌的生物标志物，且纳米氯吉兰可用于诊断工具；此外，发明人将通过对纳米氯吉兰的摄取进行成像来跟踪治疗过程中前列腺癌的进展。
2.MHI染料纳米颗粒缀合物
MHI-氯吉兰的合成：如图10所概述，通过使染料MHI-148与氯吉兰缀合，从而经一系列合成步骤制备了MHI-氯吉兰。设计了适当长度的连接基团来使染料对氯吉兰抑制效力的负面影响最小化。
使用市售的2,4-二氯苯酚1开始制备MHI-氯吉兰。在标准条件(NaOH,H2O)下用1,3-二溴丙烷使该化合物烷基化。然后使产物2与NaN3在DMF中反应以生成叠氮化物3，叠氮化物3作为在MTBE中的溶液在不进行进一步纯化的情况下进入下一步骤。在Boc2O的存在下，使用活性炭载Pd作为催化剂，于低H2压力下对3的溶液进行氢化，从而形成氨基甲酸酯4。使用无水DMF中的NaH，利用溴丙炔使该氨基甲酸酯4烷基化，生成经Boc保护的炔5。使用DCM中的TFA，于酸性条件下移除Boc保护基团。用1-溴-3-硫代乙酰基丙烷7使产物6再次烷基化，从而形成8，但是收率较低。在甲醇-HCl中移除乙酰基保护基团，并产生中间体9。随后使用EDC和4-DMAP使该中间体与MHI-148染料结合，以产生产物MHI-氯吉兰10。使用反相HPLC纯化该产物，并通过质谱法确定其身份。
活细胞中的MHI-氯吉兰的成像：先前的研究表明，在转基因小鼠的肿瘤异种移植物和自发瘤中，近红外七甲川青蓝染料IR-783和MHI-148可以保留在癌细胞中，但不保留在正常细胞中。此外，在750nm～780nm进行激发后，这两种染料还在820nm～860nm具有强发射，这可以通过NIR成像仪器和激光扫描共聚焦显微镜容易地探测到并可视化。此处，发明人采用了Zeiss LSM510共聚焦显微镜作为成像仪器。虽然缀合物的细胞摄取不确定，但是由于结构相似性，预期MHI-氯吉兰缀合物具有与NIR染料本身相似的荧光性质。因此，用激光扫描共聚焦显微镜进行NIR成像来检查MHI-氯吉兰在人前列腺上皮癌细胞(C4-2B)中的细胞摄取。选择该细胞系是因为其具有高水平的MAO-A表达。
在初步研究中，发明人发现IR-783染料共同定位在活细胞的线粒体中。使用新合成的MHI-氯吉兰10进行了成像研究(图11)。使用线粒体特异性染料进行共染色，从而确定该化合物还显示出在C4-2B PCa细胞中的快速积累，并定位在线粒体中。
为了测试MHI-氯吉兰10的抑制活性，使用带放射性标记的底物在C4-2B细胞中进行了标准MAO A抑制测定。结果清楚地表明，本发明人设计的缀合物10抑制了MAO A活性，平均IC50值为2.18×105M(图12)。缀合物10的活性尽管小于氯吉兰本身(数据未示出)，但也足以实施目前仍在进行的体内研究。
纳米氯吉兰在体内的功能——其在小鼠中的定位和对肿瘤生长的抑制
研究纳米氯吉兰的定位以及其在小鼠中对肿瘤进展的效果。申请人将人LNCAP非转移性前列腺癌细胞(1×106个)与以下试剂一起注射至免疫缺陷裸鼠中：(1)纳米氯吉兰，其浓度是抑制几乎100%的MAO-A活性所需的浓度(使用得自Specific Aim1b的结果)；(2)氯吉兰本身(阳性对照，10mg/kg，用于100%抑制MAO-A活性)；(3)染料本身(阴性对照，与纳米氯吉兰浓度相同)。该部分研究需要共18只小鼠(每组6只)。
然后，发明人对肿瘤位置成像，每隔一天监测肿瘤生长(尺寸、数量)，持续一个月。通过NIR成像来定位肿瘤。Olenyuk实验室具有丰富的NIR成像经验，所需仪器可以在Norris癌症中心获得。如果发明人的假设是正确的，纳米氯吉兰将定位在前列腺癌中，并降低肿瘤生长。在30天结束时，牺牲小鼠，确定肿瘤(如果存在肿瘤)和正常前列腺组织中的MAO-A活性。该实验具体参见先前工作的图1。该研究证实了纳米氯吉兰可潜在地用于诊断和治疗。
研究纳米氯吉兰对小鼠前列腺癌转移的效果。将具有转移潜力的人前列腺癌细胞(人C4-2、ARCaPm(1×106个细胞))注射至小鼠中，使用相同的3组小鼠，其工序和实验与Specific Aim2a中描述的相同。确定了肿瘤生长速率、尺寸和定位。检查骨骼中是否存在肿瘤，并将其作为转移的指标。使用了总共36只小鼠(每个细胞系18只小鼠，分成3组治疗；2个转移性细胞系)。
纳米氯吉兰在单独使用时或与现有治疗手段组合时对小鼠肿瘤生长和转移的效果
晚期前列腺癌的一线治疗手段是雄激素剥夺疗法(ADT)。遗憾的是，ADT响应的持续时间有限(约18个月)，且患者最终会建立去势抗性。对具有去势抗性的PCA患者的一线治疗手段通常是使用微管抑制剂(多西他赛)的化疗。近来，FDA批准了特异性CYP17抑制剂阿比特龙来治疗多西他赛疗法无效的去势抵抗患者。本研究将评估纳米氯吉兰在单独使用时或与这些治疗方案之一组合时对肿瘤生长的效果。由于纳米氯吉兰可以通过INR成像以非侵入方式读出，因而可以容易地确定各治疗手段的预后。
人LNCAP细胞(非转移性前列腺癌细胞系)。作为另一选择，可将ARCaPm(具有转移潜力)注射入免疫缺陷裸鼠中。接着，将小鼠分为如A所示的3组。从第1天～第30天每隔一天确定肿瘤位置、大小和损伤数量。在第31天牺牲小鼠，并确定肿瘤和宿主MAO活性。
A：(第I组) 纳米氯吉兰(1mg/kg*)与雄激素剥夺疗法(去势)**
(第II组)   仅纳米氯吉兰(1mg/kg*)
(第III组)  仅去势**
B：(第I组) 多西他赛(每日，15mg/kg)
(第II组)   仅纳米氯吉兰(1mg/kg*)
(第III组) 多西他赛(15mg/kg)，纳米氯吉兰(1mg/kg*)
C：(第I组) 新药(阿比特龙，180mg/kg)，每日
(第II组)   仅纳米氯吉兰(1mg/kg*)
(第III组) 新药(阿比特龙，180mg/kg)和纳米氯吉兰(1mg/kg*)
*纳米氯吉兰的使用浓度将基于由Specific Aim1b获得的结果进行调整。
对于去势组，将使用合适的无菌或抗菌技术在异氟醚麻醉下进行转阴囊去势。使用总共108只小鼠。
用由高通量筛选获得的其他新型MAO-A抑制剂来合成纳米颗粒缀合物
可选地，可以缀合本文公开的其他新型MAO-A抑制剂以用于本发明的方法和治疗中。具体而言，以下是四种高亲和性新型MAO-A抑制剂11～14的实例。它们可以与近红外染料(例如IR-783)缀合。酚官能团(-OH)对于连接基团的附接以及随后这些分子与荧光前体3的衍生化以生成新型纳米颗粒类MAO-A抑制剂而言是可行选择。
MAO-A通过稳定H1F1α并增强VEGF介导的Twist1激活而实现前列腺癌EMT
高Gleason等级前列腺癌是侵袭性的、低分化的肿瘤，并表现出升高的MAO-A表达。发明人发现，MAO-A的一项关键功能是促进上皮-间充质转化(EMT)。EMT是以细胞粘着减少、E-钙粘蛋白表达受到抑制和细胞移动性增大为特征的细胞发展过程。对于癌症情况，EMT的促进与细胞侵袭、迁移和转移潜力的增大相关，因此，MAO-A的EMT促进作用将MAO-A的活性与癌症联系起来。更具体而言，发明人发现，MAO-A在人前列腺癌细胞中的过表达诱导了E-钙粘蛋白(上皮标志物)的减少，使波形蛋白/N-钙粘蛋白(间充质标志物)上调，并增加了细胞迁移和侵袭。反之，MAO-A的敲落阻碍了人前列腺癌细胞中的EMT。
不受缚于任何特定理论，发明人提供了以下实验观察(图20～26)，从而在机理方面说明MAO-A活性与其各种癌症促进作用之间的联系。
首先，发明人发现，MAO-A通过降低脯氨酰羟化酶(PHD)活性并提高细胞内ROS水平来增强HIF1α的稳定性。其次，发明人发现，通过用ROS清除剂(N-乙酰基半胱氨酸)处理前列腺癌细胞，MAO-A诱导的HIF1α表达有所减少，这进而减少了MAO-A增强的细胞增殖。此外，发明人还发现，MAO-A在响应于缺氧时介导了VEGF及其受体神经毡蛋白-1(NRP1)的激活，这进而刺激了Akt/FoxO1信号传导路径，并通过促进FoxO1的磷酰化及随后的核输出而降低了FoxO1的活性。发明人进一步发现，FoxO1充当Twist1的转录阻遏因子，并与Twist1启动子的近侧区中的应答元件结合。已知Twist1是多种癌症的致癌基因，并与肿瘤转移有关。图27简述了该机制。
重要的是，这种机制凸显在高Gleason等级的癌症中，与低Gleason等级的癌症相比，高Gleason等级的癌症表现出明显更多的HIF1α、VEGF和Twist1表达和更少的FoxO1核内定位。因此，MAO-A、HIF1α、VEGF和Twist1的表达水平充当了客观地区分高Gleason等级癌症和低Gleason等级癌症的生物标志。
实施例
提供以下实施例来证实并进一步说明本发明的特定实施方式和方面，其并不应理解为限制本发明的范围。尽管这些实施例是可以使用的典型代表，不过还可另外使用本领域技术人员已知的其他程序。事实上，本领域普通技术人员在本文的教导下可以容易地设想并设计出其他的实施方式，而不需要过多的实验。
实施例1：宿主中MAO-A KO实验1：WT小鼠和MAO-A KO小鼠中的鼠F9畸胎癌肿瘤异种移植物
所注射的细胞#：1×105。小鼠#：WT(N=9)和MAO-A KO(N=9)。肿瘤注射位点#：WT(2×9=18)和MAO-A KO(2×9=18)。肿瘤发生率：WT(11/18=61.1%)和MAO-A KO(3/18=16.7%)。肿瘤生长：WT>MAO-A KO(p<0.05)。肿瘤重量：WT>MAO-A KO(p<0.05)。
实施例2：宿主中MAO-A KO实验2：WT小鼠和MAO-A KO小鼠中的鼠MCP3(pten/p53双KO)前列腺肿瘤异种移植物
所注射的细胞#：1×106。小鼠#：WT(N=3)和MAO-A KO(N=3)。肿瘤注射位点#：WT(4×3=12)和MAO-A KO(4×3=12)。肿瘤发生率：WT(11/12=91.7%)和MAO-A KO(10/12=83.3%)。肿瘤生长：WT>MAO-A KO(p<0.05)。肿瘤重量：WT>MAO-A KO(p=0.25)。
实施例3：宿主中MAO-A KO实验3：WT小鼠和MAO-A KO小鼠中的鼠MCP3前列腺肿瘤异种移植物
所注射的细胞#：1×105。小鼠#：WT(N=4)和MAO-A KO(N=5)。肿瘤注射位点#：WT(3×4=12)和MAO-A KO(3×5=15)。肿瘤发生率：WT(10/12=83.3%)和MAO-A KO(0/15=0)。肿瘤生长：MAO-A KO小鼠中无MCP3肿瘤生长。
实施例4：肿瘤中MAO-A KD实验1：C57BL/6小鼠中的鼠WT和MAO-A-KDMCP3前列腺肿瘤异种移植物
所注射的细胞#：1×106。小鼠#：WT MCP3细胞所对应的小鼠(N=6)和MAO-A-KDMCP3细胞所对应的小鼠(N=4)。肿瘤注射位点#：WT MCP3细胞(4×6=24)和MAO-A-KD MCP3细胞(4×4=16)。肿瘤发生率：WT MCP3细胞(21/24=87.5%)和MAO-A-KD MCP3细胞(0/16=0)。肿瘤生长：在肿瘤中MAO-A KD后，无肿瘤生长。
实施例5：肿瘤中MAO-A KD实验2：C57BL/6小鼠中的鼠WT和MAO-A-KDMCP3前列腺肿瘤异种移植物
所注射的细胞#：1×106。小鼠#：WT MCP3细胞所对应的小鼠(N=6)和MAO-A-KD MCP3细胞所对应的小鼠(N=6)。肿瘤注射位点#：WT MCP3细胞(3×6=18)和MAO-A-KD MCP3细胞(3×6=18)。肿瘤发生率：截至7月16日，WT MCP3细胞(15/18=83.33%)和MAO-A-KD MCP3细胞(0/18=0)。
实施例6：MHI-氯吉兰的合成以及MAO-A在前列腺癌进展中的作用
总体合成：所有试剂和溶剂均从商业来源获得，除非另外指出，其均以接收时的原样使用。所有涉及潮湿敏感性试剂的反应均在氩气气氛下进行，并使用无水溶剂和火焰干燥的玻璃器具。通过注射器转移吸湿性液体，并经由橡胶隔片导入反应容器中。使用旋转蒸发器在30mmHg～150mmHg下浓缩反应产物溶液。使用试剂级溶剂在硅胶(230目～400目)上进行柱色谱。在玻璃底的预涂板(0.25mm，硅胶60，F-254，EMScience)上进行分析性薄层色谱(TLC)。在Microsorb-MV C8反相柱(250mm×4.6mm，Varian)上，使用Shimadzu LC-10A VP泵和Shimadzu SPD10A VP UV-vis可变波长检测器进行分析性HPLC。利用C8反相制备柱(Grace Davison)进行制备性HPLC纯化。制备性反相HPLC的流速为4mL/分钟。在所有情况中，使用5%～95%梯度的乙腈在0.1%三氟乙酸(TFA)中的水溶液作为洗脱液。由Barnstead水纯化系统获得水(18ΜΩ)，且所有缓冲液经0.2μm过滤。在Varian400MHz仪上于指定溶剂中收集核磁共振(NMR)谱。用相对于四甲基硅烷信号(0ppm)的低场侧化学位移(δ)(单位为百万分之一(ppm))来报告峰位置，并参考源于实验中使用的溶剂的不完全氘化的信号(CDCl3:7.26ppm，或DMSO-D6的多重峰中心线：2.50ppm)。将碳-13化学位移报告为δ值(ppm)，并参考实验中使用的溶剂的碳-13信号(CDCl3:77.0ppm，或DMSO-D6的多重峰中心线：39.51ppm)。耦合常数(J)以赫兹(Hz)报告。使用了以下缩写：单峰(s)、双重峰(d)、三重峰(t)、双重二重峰(dd)和多重峰(m)。由Agilent6520飞行时间质谱仪获得质谱。
(1)MHI-氯吉兰的合成
1-(3-溴丙氧基)-2,4-二氯苯(2)的合成：
Figure BDA0000481596550000241
将2,4-二氯苯酚1(4.1g,25mmol)、1,3-二溴丙烷(10g,50mmol)和氢氧化钠(1.0g)在水(4mL)中的溶液的混合物在回流下搅拌1.5小时。添加氢氧化钠(1.0g)在水(6mL)中的溶液，并使混合物再回流1.5小时。冷却后，使用氯仿(50mL)萃取反应混合物，并用水清洗(30mL×3)。有机层在氯酸钠上干燥，并真空蒸发。获得粗产物(10.49g)，然后用硅胶柱纯化(79.16g)。收率：10.7%(0.794g)。
1-(3-叠氮基丙氧基)-2,4-二氯苯(3)的合成：
Figure BDA0000481596550000251
在配备有搅拌棒、热点偶套管中的热电偶和带塞套的橡胶隔片塞的25mL圆底烧瓶中，在室温下向1-(3-溴丙氧基)-2,4-二氯苯(600mg,2.11mmol)在6.0mL DMF中的溶液中添加234.0mg(3.60mmol)NaN3。在N2压力下，搅拌混合物过夜。观察到米白色悬浮液的形成。用0.5mL MTBE和0.5mL水使20μL反应混合物分相，并将MTBE层用于TLC(硅胶，100%己烷)。将余下的反应混合物用MTBE和水分相。水层用MTBE清洗。MTBE层依次用水和NaHCO3清洗，然后在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。
3-(2,4-二氯苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯(4)的合成：
Figure BDA0000481596550000252
将由上一步骤获得的MTBE层转移至配备有搅拌棒和带塞套的橡胶隔片塞的500mL圆底烧瓶中。在N2气氛中，添加Boc2(571.0mg,2.616mmol)和Pd/C(518mg)。小心地将N2替换为H2。使用橡胶气囊将体系保持在正气压下。使用TLC(硅胶，100%己烷，用于探测起始材料，MTBE:己烷=1:1，用于探测产物，茚三酮染色)跟踪反应过程。在N2压力下，搅拌混合物21小时。在真空下通过玻璃微纤维和Celite545过滤反应混合物。滤液利用MTBE和水分相。水层用MTBE清洗。MTBE层依次用水、盐水和NaHCO3清洗，并用MgSO4干燥，过滤并蒸发。整理后得到粗产物(991.2mg)，用硅胶柱纯化。收率11.4%(77.3mg)。
3-(2,4-二氯苯氧基)丙基(丙-2-炔基)氨基甲酸叔丁酯(5)的合成：
Figure BDA0000481596550000261
在配备有搅拌棒和带塞套的橡胶隔片塞的20mL小瓶中，在冰浴冷却下于Ar压力下向3-(2,4-二氯苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯(77.3mg,0.24mmol)在0.8mL DMF中的溶液中加入NaH(11.9mg,0.30mmol)。全程都将反应混合物保持在Ar气氛中。添加溴丙炔的甲苯(44.5mg,0.30mmol)溶液。在室温搅拌反应混合物。接下来，将一小部分反应混合物(10μL～15μL)用350μL MTBE和350μL水分相，MTBE层用于TLC(硅胶，己烷:MTBE=1:1)。将余下的反应混合物用20mL MTBE和20mL水分相。水层使用20mL MTBE清洗。MTBE层依次用水、盐水和NaHCO3清洗，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。粗产物用硅胶柱纯化(1.23g)。收率：27.4%(23.7mg)。
2,2,2-三氟乙酸N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔-1-铵(6)的合成：
Figure BDA0000481596550000262
在配备有搅拌棒的20mL小瓶中，在室温下向3-(2,4-二氯苯氧基)丙基(丙-2-炔基)氨基甲酸叔丁酯(23.7mg,66.1μmol)在600μl DMF中的溶液中添加600μL TFA，同时进行搅拌。在0.5小时内，TLC(MTBE:己烷=1:1，茚三酮染色)指示了反应完成。蒸出挥发物。将残余物与ACN共蒸发3次，然后在不进行进一步纯化的情况下用于下一步。
通过NMR和LC-MS来证实产物的结构。
S-3-溴丙基硫代乙酸酯(7)的合成：
组装配备有玻璃套管中的热电偶、磁力搅拌器、具有氩气入口(中颈)的韦氏分馏柱和带塞套的橡胶隔片塞的250mL三颈圆底烧瓶，并使用热风枪在Ar流下干燥。在Ar下用插管添加约110mL～120mL的无水DMF。将AcSK(11.68g,102.3mmol)分份添加到烧瓶中，同时用冰-MeOH浴冷却。反应在约-10℃下进行7小时。在通过添加165mL水淬灭反应后，移除冰-MeOH浴。将反应混合物用300mL MTBE和700mL水分相。水层用200mL MTBE清洗。MTBE层依次用水、盐水和NaHCO3清洗，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。收率：98.7%(19.1g)。
S-3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基)氨基)丙基硫代乙酸酯(8)的合成：
Figure BDA0000481596550000271
在配备有搅拌棒的5mL小瓶中，向2,2,2-三氟乙酸N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔-1-铵(2.14mg,0.05mmol)在100μL ACN中的溶液中添加12.1mg(0.09mmol)K2CO3和142.4mg(0.720mmol)S-3-溴丙基硫代乙酸酯。搅拌混合物，同时在油浴中加热至50℃。进行TLC(硅胶，MTBE:己烷=9:1，用来探测起始材料，MTBE:己烷=1:9，用来探测硫代乙酸酯试剂的消耗)跟踪反应过程。在配备有搅拌棒的20mL小瓶中，向2,2,2-三氟乙酸N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔-1-铵(17.1mg,0.05mmol)在800μL ACN中的溶液中添加120.0mg(0.870mmol)K2CO3和95.2mg(0.48mmol)S-3-溴丙基硫代乙酸酯。搅拌混合物，同时在50℃的油浴中加热5小时。将上述两个反应的反应混合物合并，过滤并蒸发。获得粗产物(168.4mg)，并与己烷共蒸发3次以除去ACN。使用硅胶柱(1.25g)纯化粗产物。收率：14%(2.6mg)。
通过NMR和LC-MS来证实产物的结构。
3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基)氨基)丙烷-1-硫醇(9)的合成：
Figure BDA0000481596550000272
将S-3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基)氨基)丙基硫代乙酸酯(1.17mg,3.10μmol)在200μl ACN中的溶液添加到配备有搅拌棒的20mL小瓶中，进行蒸发，然后与MeOH共蒸发3次以除去ACN。将MeOH/HCl(200μl)添加到小瓶中，然后用85℃油浴将小瓶加热6小时。对反应混合物进行蒸发，并依次与MeOH共蒸发3次、与ACN共蒸发3次，然后在不进行进一步纯化的情况下用于下一步。
MHI148-氯吉兰缀合物(10)的合成：
Figure BDA0000481596550000281
将MHI-148(4.7mg,6.2mmol)和EDC(1.5mg～2.4mg,7.8mmol～12mmol)添加到配备有搅拌棒的20mL小瓶中，随后添加1.5mg DMAP(12mmol)。添加ACN(400μl)以配成溶液。室温下，将前一步骤的反应混合物逐滴转移至具有200μl ACN的小瓶中。通过HPLC(GRACE Davison Apollo C85u柱，250mm×10mm)纯化反应混合物。
对MAOA在PCa进展中的作用的机理研究
发明人的初步数据表明MAO-A与前列腺癌(PCa)的骨转移密切相关，并第一次证实，相比于正常和低Gleason等级癌性上皮组织，PCa骨转移物中的MAO-A蛋白表达升高(图13)。
对人骨转移性PC-3和ARCaPM PCa细胞中的MAO-A表达水平的操纵改变了小鼠的肿瘤生长。过表达野生型MAO-A的PC-3细胞提高了其生长，而具有特异性慢病毒shRNA介导的沉默的ARCaPM细胞则完全终止了这种侵袭性和骨转移性PCa肿瘤在小鼠中的生长(图14)。这些结果开拓了MAO-A作为PCa肿瘤治疗的理想治疗剂的可行性，其对骨转移和内脏器官转移有高偏好。
发明人利用鼠前列腺癌TRAMPC-2(神经内分泌表型，皮下注射入MAOA neo小鼠中)进行的实验显示出PCa的生长速率显著降低(图15)，由此表明宿主MAOA在决定前列腺癌生长速率方面起重要作用。
特别是在骨骼微环境中，MAO-A在两种去势抗性的人PCa细胞系(ARCaPM和C4-2)中的敲落也显著降低了癌症诱导的因溶骨损伤所致的局部骨质破坏(图16)。
在机理上，发现MAO-A通过促进E-钙粘蛋白(上皮标志物)表达的减少、波形蛋白-N-钙粘蛋白(间充质标志物)的上调和PC-3细胞中的迁移和侵袭的增加而诱导人PCa细胞的上皮-间充质转化(EMT)(图17A～17B)；相反，MAOA的敲落则阻碍了人ARCaPM细胞的EMT(图17C～17E)。EMT程序的激活可以将PCa细胞的局部生长和远途传播引导至骨骼和软组织。这些数据表明MAO-A的表达及其下游信号传导轴可能与转移性PCa及其相关EMT表型的发展高度相关。
发明人还观察到，MAO-A的过表达提高了缺氧诱导性因子1α(HIF1α)的表达，并且，选出的已知会促进PCa发展和转移的HIF1α靶基因(例如VEGF和EMT促进性基因(Snail2和Twist1))也受PCa细胞中的MAO-A的影响(图18)。通过HIF1α依赖性相关基因的上调，缺氧增加了肿瘤的血管形成和存活响应以及侵袭和转移。已经表明，通常伴随有水平升高的活性氧物种的慢性缺氧(多种实体瘤的特性)影响转移过程的从最初的EMT到最终的器官趋向性定殖的各个步骤。因此，该数据对MAO-A在介导人PCa向骨和其他软组织转移中的作用还提供了重要的机理启示。
最近鉴定出的一类具有近红外(NIR)发射最大值的荧光七甲川青蓝染料(例如MHI-148染料)是无毒的，并且具有作为肿瘤特异性靶向和成像模式的双重功能。这些染料(部分经缺氧介导)特异性地保留在癌细胞中而非正常细胞中，并且保留在转基因小鼠的肿瘤异种移植物和自发瘤中。发明人已经示出了MHI-148NIR染料在过表达MAO-A的PC-3肿瘤异种移植物中的摄取得到增强(图19)。这样便能够开发和验证具有获得性协同肿瘤靶向能力的新型PCa寻向性MAO-A抑制剂，其可作为具有最小周身性宿主毒性的新的PCa治疗剂。
尽管本发明已经描述了特定的示例性实施方式和实施例，但是，应理解的是，本文公开的实施方式仅出于说明目的，本领域技术人员可以做出各种改进和变化，而不脱离所附权利要求所阐述的本发明的实质和范围。
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Claims (25)

1.一种用于抑制单胺氧化酶A的活性的药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下化合物及其盐组成的组的一种或多种化合物：
2.一种用于治疗前列腺癌的药物组合物，所述药物组合物包含：
药学活性剂，所述药学活性剂能够抑制单胺氧化酶活性或遏制单胺氧化酶在细胞中的表达；和
生理可接受的载剂。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述药学活性剂是选自由以下化合物及其盐组成的组的一种：
Figure FDA0000481596540000012
4.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述药学活性剂是近红外染料纳米缀合物，所述纳米缀合物包含与单胺氧化酶抑制剂共价缀合的纳米颗粒染料，其中，所述单胺氧化酶抑制剂和近红外染料可以经由或不经由连接基团连接。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述纳米颗粒染料选自由IR-783、IR-780、IR-786和MHI-148组成的组。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述单胺氧化酶抑制剂选自由以下化合物组成的组：
Figure FDA0000481596540000021
7.如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述单胺氧化酶抑制剂经由具有下式的连接基团与近红外染料共价连接：
其中，M1是O或S；
其中，X、Y和Z中的至少两个参与了与基团A和B的成键，所述基团A和B可以是不饱和基团和/或芳香族基团，所述基团A和B可以进一步连接至额外的碳、氧或氮原子；并且
其中，X、Y和Z中的未与基团A或B成键的任一个都取代有氢或具有1～6个碳原子的低级脂肪族基团。
8.如权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物具有以下式：
Figure FDA0000481596540000031
A、B或C=F、Cl、Br、I，
X=NH、O、S，
Y=Cl、Br、I、甲磺酰基、甲苯磺酰基，
m、n=1～15。
9.如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述药学活性剂选自由MHI-吗氯贝胺、MHI-苯乙肼、MHI-反苯环丙胺、MHI-帕吉林、MHI-氯吉兰、MHI-MAOI和NIR-MAOI组成的组。
10.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述药学活性剂是核酸类基因沉默剂，所述基因沉默剂对单胺氧化酶基因表达的沉默或下调具有特异性。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述基因沉默剂是靶向MAO-A和/或MAO-B的信使RNA的siRNA、shRNA或反义寡核苷酸。
12.一种将细胞毒性剂递送至癌细胞的方法，所述方法包括：
将所述细胞毒性剂缀合至被癌细胞优先摄取的纳米颗粒染料上，以形成纳米缀合物；和
使所述纳米缀合物接触所述癌细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述纳米颗粒染料是选自由IR-783、IR-780和MHI-148组成的组的一种。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述细胞毒性剂是选自由单胺氧化酶抑制剂、烷基化剂、微管形成抑制剂和芳香酶抑制剂组成的组的一种。
15.一种形成纳米缀合物的方法，所述纳米缀合物用于将药剂靶向性递送至癌细胞，所述方法包括：
使纳米颗粒染料与所述药剂共价缀合，
其中，所述药剂选自由单胺氧化酶抑制剂、烷基化剂、微管形成抑制剂和芳香酶抑制剂组成的组。
16.一种在细胞内抑制单胺氧化酶或减少活性氧物种的方法，所述方法包括：
使所述细胞与权利要求1所述的组合物接触。
17.一种治疗有治疗需要的受试对象的前列腺癌的方法，所述方法包括：
对所述受试对象施用药学活性剂，
其中，所述药学活性剂是能够抑制或下调所述受试对象的癌细胞内的单胺氧化酶的试剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述药学活性剂选自由MHI-吗氯贝胺、MHI-苯乙肼、MHI-反苯环丙胺、MHI-帕吉林、MHI-氯吉兰、MHI-MAOI、NIR-MAOI和对单胺氧化酶有特异性的基因沉默剂组成的组。
19.一种筛查受试对象以确定癌症风险的方法，所述方法包括：
测定从所述受试对象的潜在癌症部位获取的样品中的单胺氧化酶活性或表达水平；和
将所述单胺氧化酶活性或表达水平与参照值进行比较，
其中，比所述参照值高的活性或表达水平表示所述受试对象具有风险。
20.一种诊断或区分受试对象的前列腺癌的不同形式的方法，所述方法包括：
确定所述受试对象的单胺氧化酶活性、表达和位置分布模式；和
基于所述分布模式来诊断癌症的形式。
21.一种监视患者的癌症治疗进展的方法，所述方法包括：
连续测定所述患者的单胺氧化酶的活性或表达；和
比较所述连续测定的结果，
其中，单胺氧化酶的活性或表达随时间的下降表示正面的治疗进展。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述患者是前列腺癌患者，并且正在使用包含纳米缀合物的药物组合物进行治疗，所述纳米缀合物具有与单胺氧化酶抑制单元缀合的光发射单元。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述光发射单元是近红外纳米颗粒染料。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述测定步骤通过获取所述患者的癌症部位的近红外图像来进行。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述图像是激光共聚焦显微镜图像。
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