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CN103816562B - 一种战争创伤快速止血产品及其制备方法 - Google Patents

一种战争创伤快速止血产品及其制备方法 Download PDF

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CN103816562B CN201410035698.0A CN201410035698A CN103816562B CN 103816562 B CN103816562 B CN 103816562B CN 201410035698 A CN201410035698 A CN 201410035698A CN 103816562 B CN103816562 B CN 103816562B
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Abstract

本发明公开了一种战争创伤快速止血产品及其制备方法和应用，该产品包含添加了所述的微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)的基质，其中所述谷氨酰胺转胺酶的氨基酸序列具有如SEQ？ID？NO：3所述的基因编码的蛋白序列，或具有如SEQ？ID？NO：4所述的蛋白序列。更具体地，该止血产品选自止血剂、止血装置、止血急救包或常见的止血制品，并且所述基质为人体可吸收的流体或半固体形态，或可塑性的胶状或胶体形态。其含有微生物谷氨酰胺转胺酶和明胶。本发明具有快速止血、使用方便、防器官黏连、促进伤口愈合、毒副作用低、吸收完全等优势，除了用于战争止血外，还可广泛用于消防、安全事故等野外环境的创伤快速止血。

Description

一种战争创伤快速止血产品及其制备方法
技术领域
本发明属于用于野外创伤的快速止血产品，具体涉及一种含有微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)的止血组合物及其制备方法和应用，该产品可用于战争、消防、安全事故等野外环境的创伤快速止血。
背景技术
失血过多是和平时期平民因创伤而死亡的主要因素之一，控制出血(或流血)是急救和创伤治疗的重要步骤。在作战等野外环境中，如战争、消防、安全事故等，由于现场抢救措施有限、时间紧迫、条件简陋，使得流血过多而引起死亡的事件时有发生。根据一项最新的统计数据表明，美军在反恐作战的阵亡官兵中，有90％死在送往医院的途中，而将近1／4在受伤5～10分钟之内就因失血过多而不治身亡。据统计，战争中周围主干血管伤占全部血管损伤的95％以上，止血技术已成为目前战伤救治中最重要的环节，所以在战争中及时止血对于降低阵亡率起关键作用。另外，交通事故大等安全事故中大出血也常常引起死亡，在我国每年仅因交通事故而导致至少10万人死亡，在安全事故中，至少有20％人员因大量失血(超过自身血液总量20％以上)而导致死亡。因此，及时研制适应于我国战争或安全事故创伤等实际需要的快速止血产品尤为重要。
目前，国际上认为理想的用于战争或意外事故的急救止血产品有8项标准，即：(1)快速止血；(2)随时可用，不需提前准备或混合；(3)简单易用，不需专业医护人员的参与；(4)重量轻而持久耐用；(5)至少2年的贮存期和宽温度范围贮存能力(-10℃至55℃)；(6)无毒副作用，没有伤害或传播病毒性疾病的风险；(7)成本低廉；(8)对伤口副作用小，便于伤口快速愈合。目前市售产品包括以下几种：
(一)沸石类
沸石是自然界中一种矿物质，多分布于矿物质沉淀或湖底火山灰沉积地带。以铝酸盐聚合物和硅酸盐为原料，通过控制反应类型和结晶温度，可制造出与天然沸石类似的人工沸石。天然或人工沸石结晶体经脱水、消毒后，成为一种强力吸收剂，可选择性吸收多种气体和液体，也可吸收血液中的水分。根据该原理，中国人民解放军军事医学院研制开发了一种速效止血粉，它是研制开发的以沸石主要为成分的止血产品，具有止血效果较好，成本低等优势。然而，沸石类止血材料有一些不足之处：一是止血过程中释放热量，使局部温度升高，瞬间温度接近60～70℃，容易造成创伤处烧伤；二止血后清除困难，给患者造成身心痛苦，有可能造成二次出血，加重身心痛苦；三是沸石密度大，携带不便。但由于目前没有更好地替代品，故仍然成为目前应用于战争或野外事故自救的止血产品
(二)Quickclot
美军在阿富汗战争以及伊拉克战争中使用了Quickclot来对战伤伤口进行止血，效果较好，显著提高了伤员的存活率。该材料是由硅氧化物、铝、钠、镁及少量石英组成的一种人工合成惰性颗粒状矿物质，具有分子筛和吸附水分的功效，使用时将其覆盖在出血伤口上，迅速吸收血块中的水分，加速凝血过程，使血痂提早形成。但是，和沸石类似，该材料在也存在发热、清楚困难等不足。
(三)纤维蛋白胶类
2000年Rorbert(RorbertLW.Tissueadhesiveforbattlefieldhemorrhagecontrol[C]ADB209674,2000：1?14.)研制出一种战伤止血敷料，它由三层组成：最里层是撒有纤维蛋白胶干粉的有机硅膜，中间一层为聚氨酯泡沫材料，外层为医用压敏胶，目的是可以用来对动脉破裂进行止血。但该类材料不足之处是可能带来人体或动物血源性疾病感染、结构复杂，造价高，使用不便、止血速度慢，以及对大血管止血效果差等。
另外，有些纤维蛋白胶在使用时需临时加入抑肽酶(例如：Tisseel和Beriplast均配有牛抑肽酶，而Crosseal配有氨甲环酸)以减缓凝血过程中纤维蛋白的溶解。2008年曾有关于抑肽酶使心脏手术死亡率增加的报道(FergussonDA,HebertPC,MazerCD,FremesS，MacAdamsC,MurkinJM,eta1.Acomparisonofaprotininandlysineanaloguesinhighriskcardiacsurgery[J].NEnglJMed,2008,358：23192331.)，其后Bayer医药公司回收了其在各医院药房的抑肽酶制剂(商品名：Trasylo1)。
(四)氧化纤维素类
氧化纤维素(商品名：Oxycel)是纤维素衍生物的一种，由纤维素经一氧化氮氧化而成。而氧化再生纤维素(又称速即纱，中国称：可溶性止血纱布，商品名：Surgicel)，是一种再生氧化纤维编织纱块，属于羧甲基纤维素类止血材料，是纤维素经氧化处理成为纤维素酸的薄纱状或棉布状可吸收止血材料。其止血机制是具有酸性的羧基与血红蛋白中Fe3+结合，形成棕色胶块，封闭毛细血管末端而止血，同时在密切接触伤口后，可使血液中的凝血成分聚集在网眼纱布上，但并不依赖生理性凝血机制(JamborovaG.PospisilovaN,SemeckyV，HysplerR,TichaA,PospechovaK,eta1.Microdispersedoxidizedcelluloseasanovelpotentialsubstancewithhypolipidemicproperties[J].Nutrition,2008,24：11741181.)。可溶性止血纱布在密切接触伤口后，可使血液凝血成分聚集在其周围，在2～8min完成止血，目前常用于手术创面出血以及渗血不易停止的部位，如骨面渗血等。有证据表明Surgicel于接触创面一天内便开始被机体吸收，吸收速率随用量和局部血供以及局部组织的性质而定，一股为4～8周。该产品具有组织相容性好，柔软而菲薄，易于包、敷、填塞等优点。不足之处是止血时间较长，对出血迅猛者效果较差，不适合单独作为伤口止血材料(周激.介绍一种新型长方形急救包[J].人民军医，2002，45(1)：61.)。另外，Surgicel能降低损伤组织周围pH值，这种高酸性环境有一定的抗菌能力，然而高酸性环境同时能增强损伤组织周围炎症反应，使伤口愈合延迟(KrízovP，MsovL,SuttnarJ,SalajP，DyrJE,HomolaJ,eta1.Theinfluenceofintrinsiccoagulationpathwayonbloodplateletsactivationbyoxidizedcellulose[J].BiomedMaterResA,2007,82：274280.)。
(五)止血明胶类
止血明胶经猪或牛等动物皮提取并纯化而成，其多孔结构可吸收重于自身45倍的血液，在吸收血液后体积膨胀封闭血管裂口或创面，并激活血小板，促进血凝块形成，达到止血目的。止血明胶虽然来源于动物组织，但没有抗原性，无组织反应，留在体内经酶作用4～6周后可被人体消化吸收。与上述氧化再生纤维素不同的是，止血明胶不会影响创伤周围组织的pH值，因此更适合与其他止血材料联合使用(IgaiH,YamamotoY，ChangSS,YamamotoM,TabataY，YokomiseH.Trachealcartilageregenerationbyslowreleaseofbasicfibroblastgrowthfactorfromagelatinsponge[J].JThoracCardiovascSurg,2007,134：170175.)。但明胶止血需要机体凝血因子的参与，对于有凝血障碍的患者效果欠佳(MartinowiteU,SpotniteWD.Fibrintissueadnesives[J].ThrombHaemost,1997,78：661.)，同时因其吸收血液后膨胀可能压迫伤口周围组织，故不适用于靠近神经或空间狭小的手术部位。由Baxter公司研发的FloSeal将牛明胶基质与凝血酶制剂进行了组合，明胶颗粒通过体积膨胀对伤口进行填塞压迫止血，凝血酶加速血凝块形成。但如前文所述，这两种成分发挥止血作用均依赖机体凝血机制。另外，FloSeal中的凝血酶来自人类血浆，目前已经证实通过两步蒸汽加热法处理可以有效降低血浆中的病毒载量，但制造商承认目前尚没有能够彻底清除人类血浆制品中病毒传染性的加工工艺(ErethMH,SchaffM,EricsonEF，WetjenNM,NuttallGA,OliverWCJrComparativesafetyandefficacyoftopicalhemostaticagentsinaratneurosurgicalmodel[J].Neurosurgery，2008,63：369372.)，说明该类产品存在转播疾病的风险。
综上所述，国际上用于战争或安全事故的急救止血产品分为三大类(前两种为化学材料类)：
表1
由表1可知，目前还缺少能完全符合以上标准的急救止血产品。
综上所述，理想的战争或急救止血产品，其应当至少具有以下共性，即：止血快速、伤口不黏连，易愈合、成本低廉、易被体内吸收、不易传播疾病和后遗症少等。但是目前尚没有达到或接近达到上述标准的止血剂。对此，近年来，人们不断进行新型止血材料的研发。
谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转胺酶，Transglutaminase，简称TGase)，又称转谷氨酰胺转胺酶或γ-谷氨酰胺酰基转移酶，由331个氨基组成，催化酰基转移反应，能催化蛋白质分子内或分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，从而改善蛋白质的结构和功能特性。由于其卓越的交联特性，被誉为“21世纪超级粘合剂”。在食品、医药、纺织、化妆品等领域展现出广泛前景(崔艳华等，《生物技术通报》，2009年第一期)
TGase广泛存在于动、植物和微生物机体组织。最近的研究发现，不同来源的TGase在氨基酸序列、分子量大小、酶的理化性质具有差异。动物来源的TGase分子量不等，需要钙离子激活，酶活性中心为半胱氨酸残基位点。动物来源的TGase以豚鼠肝脏的TGase(GTG)研究最为深入，该酶的分子量为90kD，其酶促反应需要钙离子激活。对底物特异性强，同时由于该酶含有17个半胱氨酸残基致使其热稳定性差。在50℃下，10分钟后，酶活性仅为残留40％。钙离子对植物来源的TGase活性影响因物种而异。从动物组织中提取的TGase来源少，成本高，分离程序复杂，不易推广应用。
TGase在植物组织中扮演何种角色仍不十分清楚，Kang等从大豆叶片中提取TGase进行了研究。但是分离纯化工艺复杂，酶的得率较低。目前，尚未有植物来源TGase用于商业化生产。
但是，微生物来源的TGase(mTG)与动物来源的TGase具有不同的酶特性，mTG分子量在23～45kD之间，多数为40kD左右，为动物来源TGase分子量的一半左右。重要的是，mTG具有较强的热稳定性，且在相对较宽的pH范围内均具有较高活性。同时，mTG的酶活性不依赖于钙离子，所以有广泛的底物特异性的酰基供体，这一点与动植物来源的TGase完全不同。同时，mTG较GTG相比，在高压条件下具有更为显著的稳定性。上述特性使mTG有更为广阔的应用范围。
微生物来源的TGase属于胞外酶，可直接分泌到培养基中.分离纯化较动植物来源的TGase容易，并且微生物发酵原料廉价、产酶周期短，最适合进行大规模工业化生产，因此备受研究者的青睐。
研究发现TGase可以催化相邻纤维蛋白分子之间的谷酰胺和赖氨酸形成ε-(Y谷氨酰胺)-赖氨酸共价键，从而形成相邻纤维蛋白分子之间的交联。谷氨酰胺转胺酶和凝血因子XIIIa(FXIIIa)同属于谷氨酰胺转胺酶超家族，功能与后者极为相似，能够催化酰基转移反应，使得蛋白质分子内或分子间形成交联，从而改变蛋白质的结构和功能，该反应存在于很多生物学过程，包括血凝过程、伤口愈合、表皮角质化、红细胞膜的硬化。中国专利“谷氨酰胺转胺酶的用途”(CN2008100475880)报道了谷氨酰胺转胺酶可作为皮肤创伤愈合促进剂或其活性成分，其中包含0.1-100U／ml或0.1-100％干重的谷氨酰胺转胺酶作为皮肤创伤愈合促进剂的活性成分。然而，该研究仅仅在于将谷氨酰胺转胺酶作为辅剂(即促进剂)用于伤口愈合，其既没有涉及快速止血的用途，也没有研究该酶如何实现伤口不黏连的效果，同时所述的0.1-100U／ml或0.1-100％干重的方案过于宽泛，缺乏具体有效的数据而最终没有被授权。因此，其相关研究仍然停留在TG酶如何减少创伤愈合时间的方面(谈丹，微生物谷氨酰胺转胺酶对大鼠创伤愈合作用研究，《中国生物工程杂志》，2007年第27卷第9期；张念荣，谷氨酰氨转氨酶的特性及其应用研究进展，《西部皮革》，2012年第34卷第14期)。
中国专利申请CN2007800512154及其同族专利申请WO2008076407公开了一种明胶-转谷酰胺酶止血辅料和密封材料，其包含明胶和无毒性转谷酰胺酶的交联材料，可用于治疗创伤组织。然而，该发明使用是常规的微生物源转谷氨酰胺转胺酶(USA，CHICAGO，批号L-04207)，该酶不但价格昂贵，且最佳反应温度一股在50℃-55℃左右，在常温(25℃)时酶活只有最佳反应温度的20％左右，从而严重影响了涉及谷氨酰胺转胺酶的活性(参见其实施例1)。
对于这种现象，国内研究者崔艳华等(谷氨酰胺转胺酶研究进展，《生物技术通报》，2009年第1期)的论文表明，“来源于不同微生物的mTG在酶学上存在差异，即使是来自不同的菌种甚至来自同一菌种不同菌株的TG酶之间在等电点、最适PH、最适温度、热稳定性等方面存在这或大或小的差别，这些差别会直接影响着酶的应用。”“例如，芽孢杆菌属TG酶与链霉菌属的TG酶基因同源性较低，并且酶学活性也存在差异。S.mobaraensismTG的酶活最适温度为50℃，而来自B.subtilis的mTG最适温度为60℃。”
由于对于战争止血类产品来说，酶的稳定性十分重要，特别是对于常温保存的产品来说更是如此。但上述研究的mTG的最佳反应温度一股在50℃-55℃左右，在常温(25℃)时酶活只有最佳反应温度的20％左右，即使是在体温(37℃)左右，酶活也只有最佳酶活的一半左右(BuettnerK，HertelTC，PietzschM,AminoAcids.2012Feb；42(2-3)：987-96.；MarxCK，HertelTC，PietzschM,JBiotechno1.2008Sep10；136(3-4)：156-62.)。此外这些酶的热稳定性比较差，60℃10分钟可以导致mTG酶活损失80％左右(MarxCK，HertelTC，PietzschM,JBiotechno1.2008Sep10；136(3-4)：156-62.)。针对上述特点，德国的科学家对此进行了研究，并取得了一定的成果，发现了高温下热稳定性好的酶(如上述文献，以及欧洲专利WO2008020075A1、WO2010101256A1；美国专利US20120021459A1)，但是这些酶的最佳酶反应温度依然在50℃左右，这远远制约了谷氨酰胺转胺酶作为医用产品的应用。
为解决这一问题，本发明人的在先中国专利申请CN2012101922407首次提出利用不具有酶活的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原，并结合适量激活酶以及明胶，取得良好的伤口止血效果。然而，该研究所使用的激活酶为分散酶，这是一种非特异性的金属蛋白酶，虽然其能够分散组织、分类细胞，但部分分散酶会伤害细胞，并且在培养时不稳定，甚至可能引入支原体污染，且其价格昂贵，同时在使用前需要将分散酶和谷氨酰胺转胺酶酶原进行水溶液混合，不能将二者预先混合并与制成相关医用产品，这极大地影响了谷氨酰胺转胺酶酶原的医疗用途。
另外，本发明人在先前的另一个中国专利申请CN2012102021709提出利用改造现有野生酶获得高活性突变酶，其涉及了3个位点突变得到的重组酶(以下简称3突变酶)。尽管该突变酶具有一定的止血效果，但总体效果特别是防粘连效果有待改进，并且止血速度(即酶的活性)还有待提高，因此一定程度上影响了谷氨酰胺转胺酶酶原的战争急救用途，致使其仅适用于日常创伤等微、小量止血的用途。
基于微生物谷氨酰胺转胺酶良好止血效果和无副作用的特点，目前需要提供一种以微生物谷氨酰胺转胺酶为主要活性成分的快速止血材料以及复合止血产品，其应当具有快速止血、避免器官或组织粘连、易吸收、不易传播疾病、成本低廉的医用止血材料，以填补国内战争或事故现场快速止血类似产品的空白需要。
发明内容
综上所述，现有技术问题在于如何提供一种含有新的微生物谷氨酰胺转胺酶、用于战争或其他创伤的快速止血产品，其中该酶应当具有不同于现有技术结构且性能更加优异，同时所述战争或其他创伤的快速止血产品也应当具有不同于现有技术的产品结构。
因此，本发明思路在于克服现有谷氨酰胺转胺酶常温下活性不足，或是需要辅助剂激活(即激活酶)的缺点，提供一种以新型谷氨酰胺转胺酶为主要活性成分、用于战争或其他创伤止血的快速止血材料以及复合止血产品。这种新的微生物谷氨酰胺转胺酶，其结构不同于已经报道的任何一种具有新性能的突变体，同时能满足在最佳活性温度向较低温度偏离以及具有较好的热稳定性。高温处理显示，该mTG在70℃处理后仍然体现了很高的残余酶活。反应温度显示，该酶的最佳活性温度为40℃(更接近人体温度)，比野生型mTG低，同时常温和37℃时的比酶活比野生型mTG高。
包括前面所述的文献报道的具有热稳定性的mTG主要突变位点是2位的丝氨酸突变为酪氨酸，或者23位的丝氨酸突变为缬氨酸或酪氨酸，或者24位的酪氨酸突变为天冬酰胺，或者294位的赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；或者101位的丝氨酸突变为脯氨酸，或者250位的甘氨酸突变为精氨酸，或者157位的甘氨酸突变为丝氨酸。这些突变的谷氨酰胺转胺酶没有3个以上氨基酸突变组合，并且不具有较好的热稳定性。
因此，本发明第一个目的是提供一种新的微生物谷氨酰胺转胺酶mTG，该mTG与野生型mTG相比发生了四个位点的氨基酸突变，突变分别为第23位丝氨酸变为丙氨酸、73位甘氨酸变为酪氨酸、317位赖氨酸变为谷氨酰胺以及325位赖氨酸变为谷氨酰胺(即S23A、G73Y、K317Q、K325Q)，这四个突变位点(以下简称四突变)均不同于现有文献报道的突变位点。在一个实施方案中，所述谷氨酰胺转胺酶mTG具有如SEQIDNO：4所述的序列。在另一实施方案中，所述谷氨酰胺转胺酶mTG具有如SEQIDNO：3所述的基因编码的蛋白序列。
在一个具体实施方案中，所述的谷氨酰胺转胺酶mTG，其中该酶电泳纯度为至少90％以上，比活性大于25U／毫克，优选地，纯度为95％以上，且比活性大于25U／毫克；其中该酶的最适反应温度在25-45℃之间。
本发明第二个目的在于提供一种编码上述突变酶的基因序列。在一个实施方案中，所述序列选自如SEQIDNO：3所述的基因。
本发明第三个目的在于克服现有谷氨酰胺转胺酶常温下活性不足，或是需要辅助剂激活(即激活酶)的缺点，提供一种包含该谷氨酰胺转胺酶为主要活性基质的战争或事故现场快速止血产品(例如用于战争其他创伤环境下伤员的器官或组织止血)，该止血产品包含添加了微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)的基质，其中所述谷氨酰胺转胺酶的氨基酸序列具有如SEQIDNO：3所述的基因编码的蛋白序列，或具有如SEQIDNO：4所述的蛋白序列。
在一个实施方案中，所述基质为人体可吸收的固体、半固体、粉末或流体，或可塑性的胶状或胶体形态。在一个具体实施方案中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的电泳纯度为至少90％以上，比活性大于25U／毫克。优选地，纯度为95％以上，且比活性大于25U／毫克。
在一个实施方案中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的形态包括但不限于固体、半固体或流体、可塑性的胶状或胶体、粉末等形态。
在一个实施方案中，所述止血产品中除了微生物谷氨酰胺转胺酶，还含有其他辅料，所述辅料包括但不限于矿质粉、蛋白粉等。在一个具体实施方案中，所述止血产品是军用止血产品。
在另一实施方案中，所述止血产品是止血剂(包括但不限于粉末止血制品、固体状止血制品、流体或半流体止血制品、液体止血制品)、止血装置、止血急救包或急救箱或常见的止血制品。
在一个具体实施方案中，所述流体或半固体形态的基质或材料包括液体纤维蛋白密封材料或胶类，诸如角蛋白、胶原蛋白、流体明胶等。其中，液体纤维蛋白密封材料或胶类已经作为出血控制的手术室辅助材料而被使用了许多年(J.L.Garza等人(1990).J.Trauma.30：512-513;H.B.Kram等人(1990).J.Trauma.30：884-887)，而且临床上已经将单一供体纤维蛋白密封材料广泛地用于各种手术情况中。在另一具体实施方案中，所述液体纤维蛋白密封材料或胶类包括溶解液，所述溶解液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液PH范围从7.0至9.0。
在另一具体实施方案中，所述可塑性的胶状或胶体形态的包括氧化纤维素、氧化再生纤维素、壳聚糖、角蛋白、胶原蛋白、明胶海绵，在更具体的实施方案中，可塑性的胶状或胶体形态的材料可以是明胶海绵，其可作为粘合材料，与微生物谷氨酰胺转胺酶模拟纤维蛋白-凝血酶止血级联反应实现止血，并且可以按需要被没有困难地除去(T.Chen,Biomacromolecules.2003年11月-12月；4(6)：1558-63；)。
在一个实施方案中，所述基质选自蛋白质物质，诸如可吸收纤维蛋白胶、角蛋白、胶原蛋白或明胶，或者糖类物质，诸如氧化纤维素、氧化再生纤维素、壳聚糖、蛋白多糖(例如聚-N-乙酰葡萄糖胺)、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物。在一个具体实施方案中，所述基质包括各种来源的医用明胶以及液体纤维蛋白密封材料或胶，诸如角蛋白、胶原蛋白，一股的从动物来源、重组来源或其组合生产来源的。在更具体的实施方案中，可吸收基质是明胶。优选地，动物来源的优选鱼和哺乳动物的明胶。更优选地，哺乳动物选自猪和牛的明胶。本实验优选哺乳动物的A型高分子量明胶，或是20％～60％脯氨酸羟化的明胶。
在一个优选的实施方案中，将粉末状微生物谷氨酰胺转胺酶(mT6)溶于磷酸盐缓冲液中，形成微生物谷氨酰胺转胺酶溶液；将羟化明胶粉末溶于磷酸盐缓冲液中，形成羟化明胶溶液；将所述微生物谷氨酰胺转胺酶(mT6)溶液与羟化明胶溶液混合，即可制备得到包含上述转氨酶和20％～60％脯氨酸羟化的明胶的流体组合物。在一个更优选的实施方案中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶浓度在所述组合物中为1U／g～180U／g范围内；所述羟化明胶溶液浓度在15％w／v～40％w／v范围内。在另一个更优选的实施方案中，所述羟化明胶溶液与微生物谷氨酰胺转胺酶溶液的体积比为10：1～1：10。这里所述止血产品的原材料形状是：(i)粉末、颗粒或其他固体形式的明胶；(ii)粉末、颗粒或其他固体形式的转谷氨酰胺转胺酶。
本发明第四个目的是提供一种战争创伤止血用的止血装置，包括上述实施方案中任一项所述的酶、组合物或止血产品。所述酶、组合物或止血产品的形态包括但不限于固体、半固体、流体、液体、气体(如喷雾剂)等形态，可以做成纱布状、海绵状等各种根据需要而产生的形态。
在一个实施方案中，所述止血装置是止血带或止血纱布，包括以棉纱或可溶性止血纱布为本体的止血带或止血纱布外层，和用于接触和包扎伤口的内层，其中所述内层中含有所述谷氨酰胺转胺酶的基质粉末或药芯。在一个具体实施方案中，所述内层表明富有保护薄膜或贴膜。
在另一个具体实施方案中，所述止血带或止血纱布的制备方法如下：
该段内容改成制备酶粉末内容称1-6g微生物谷氨酰胺转胺酶溶于240ml50mMHEPES缓冲液(PH=7)，配制成酶活为50-300u／ml的mT6酶溶液。另外，也可选择有助于保持谷氨酰胺转胺酶活性且有利于发挥止血效果的常规辅料，如明胶等。
在棉纱或可溶性止血纱布的内层一面涂有医用胶粘剂，
将含有上述酶的基质粉末喷洒在具有粘性的内层上，形成止血带或止血纱布药芯层；
在药芯层外面设置保护薄膜或粘膜，制成所述止血装置。
在另一实施方案中，所述止血装置是快速止血的喷雾装置，包括加压的喷雾或泡沫、明胶和谷氨酰胺转胺酶组分的混合物。在一个具体实施方案中，上述止血装置包括转谷氨酰胺转胺酶成分、明胶、泡沫或喷雾的一部分的混合物。使用这些方法的止血辅料成分混合物的施用可选择地例如通过分开储存混合物组分并在施用前即时混合它们；例如可选择地通过以无活性形式一起储存组分和在施用前即时活化它们来完成。无活性形式的止血辅料组分可选择地被提供为冷冻溶液、需要重新构成的冻干的粉末、需要重新构成的喷雾干燥的粉末和／或任何其他适合的形式的无活性密封材料混合物中的一种或多种。
在其他的实施方案中，所述止血装置还可以是含有上述明胶和谷氨酰胺转胺酶组分的止血急救包、急救箱等。在其他实施方案中，所述止血装置是军用止血装置。
本发明第五个目的是提供一种制备用于战争或事故现场创伤的快速止血产品的方法，该产品包含添加了微生物谷氨酰胺转胺酶的基质，其中所述谷氨酰胺转胺酶的氨基酸序列如SEQIDN0：4所示。
步骤包括：
(1)制备能表达所述微生物谷氨酰胺转胺酶的重组微生物，并进行重组表达；
(2)收集并纯化具有所述活性的谷氨酰胺转胺酶，并配置成活性溶液；
(3)通过常规方法，将所述谷氨酰胺转胺酶的活性溶液添加在人体可吸收基质中；
(4)将所述基质进行常规处理，即得到上述用于战争或事故现场创伤的快速止血产品。
在一个实施方案中，将粉末状微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)溶于磷酸盐缓冲液中，形成微生物谷氨酰胺转胺酶溶液；将粉末状羟化明胶溶于磷酸盐缓冲液中，形成羟化明胶溶液；将所述微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)溶液与羟化明胶溶液混合，即可制备得到包含上述转氨酶和20％～60％脯氨酸羟化的明胶的流体组合物。在一个更优选的实施方案中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶浓度在所述组合物中为1U／g～180U／g范围内；所述羟化明胶溶液浓度在15％w／v～40％w／v范围内。在另一个更优选的实施方案中，所述羟化明胶溶液与微生物谷氨酰胺转胺酶溶液的体积比为10：1～1：10。
可选择地，本发明组合物可以进一步包括形成仿生的血块达到止血的目的。
技术术语
本文所用的“战争创伤”或“事故创伤”是指在战争或事故现场中，受到枪弹、意外事故对伤员的任何组织进行的任何损害，其导致循环系统的大量血液损失、甚至肢体缺失等。组织可以是体内组织(例如器官或血管)，或者是体外组织(例如头部、四肢等)。血液的损失可以是体内的(例如从破裂的器官)，或者是体外的(例如从裂伤、划伤、割伤等)。创伤可以在软组织(例如器官)中，或者在硬组织(例如骨)中。该创伤未及时处理，应当或可能会导致危害生命。因此，本发明的用于战争或事故现场创伤快速止血产品不是用于日常创伤(微创伤)的止血产品，如创可贴等贴剂，也不是用于临床手术抢救类的止血产品，如医用止血包、止血胶条、止血钳等。
本文所用的“野外创伤”是指战争创伤、安全事故等野外现场创伤，如交通事故、矿井事故、生产事故等。如果没有特别说明，战争类创伤也包括了交通事故、矿井事故、生产事故等创伤，但战争类创伤或野外创伤并不包括日常生活类微小创伤或临床手术创伤类。
本文所用的“止血产品”和止血剂指含有本发明谷氨酰胺转胺酶(mTG)的、且能用于“战争创伤”或“事故创伤”的快速止血制品，例如：止血剂(包括粉状止血制品、固体状止血制品、流体或半流体止血制品、液体止血制品)、止血装置、止血急救包或急救箱以及现有的止血制品。在通常的战场或现场使用中，所述非装置类的止血产品也可称为止血剂。
本文所用的“可吸收性基质或材料”是指自发和／或经由哺乳动物身体分解为组分的材料，所述组分以不显著干扰创伤愈合和／或组织再生的方式被消耗或消除，并且不会导致任何显著的代谢紊乱。例如，可吸收性材料可是蛋白质物质，诸如纤维蛋白、角蛋白、胶原蛋白，或者糖类物质，诸如藻酸盐、甲壳质、纤维素、蛋白多糖(例如聚-N-乙酰葡萄糖胺)、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物或乙醇酸／乳酸共聚物。例如可吸收性材料可是糖类物质。其中，基于以上改进的可吸收性材料的止血敷料，其包括包含可吸收性物质的多个层，例如参见PCT／US03／28100，美国专利申请第0060155234号。
本文所用的“非可吸收性材料”是指不能被患者身体分解为无毒性、或不干扰创伤愈合和／或组织再生、或不会导致任何显著的代谢紊乱的材料，如无菌绷带、无菌纱布、矿物质类止血粉(硅氧化物粉、钾铁含氧酸盐类粉等)等。
有益效果
本发明以微生物谷氨酰胺转胺酶和明胶为有效物质，与现有技术比较，本发明有益效果包括，含有微生物谷氨酰胺转胺酶和明胶的止血产品可增强战争创伤伤口恢复效果，止血效果明显。其次，本发明使用的原料微生物谷氨酰胺转胺酶，是在不改变传统微生物谷氨酰胺转胺酶的功能和原有的低毒性的情况下，通过一定的技术改良微生物谷氨酰胺转胺酶的耐热性，获得了在常温下具有较好稳定性的微生物谷氨酰胺转胺酶。另外，本止血产品具有快速止血、防伤口黏连等作用，以及低副作用、对伤口有良好的治愈作用、作用起效快，吸收良好等优点。尤其是，在战争或事故创伤环境中，本发明产品在止血过程中不发热、施加后无需清除，组织相容性和吸收性良好，克服了前面所述发热、难以清除、不能吸收等缺点。本产品使用过程中放热反应不明显，不会对人体造成灼伤，并且可以被吸收进入体内不产生负作用，避免了其他类止血剂产品后期清除而带来的二次伤害。另外，本发明能够单人即可完成止血剂的混合操作，使用方便，适应了战争和事故创伤中特殊条件的需要。
附图说明
图1表示实施例3中突变体mTG基因的凝胶电泳检测图；
图2表示实施例5中mTG蛋白的质谱分析结果；
图3表示实施例6中本发明突变mTG蛋白的精细纯化后的电泳图，其中4泳道为纯化的蛋白；
图4表示实施例7中在不同温度下野生型mTG蛋白、三位点突变mTG蛋白以及本发明突变mTG蛋白的比活性测定；
图5表示本发明的新型止血产品和空白对照组分别对大鼠股动脉出血的止血效果。其中：图5A表示对照组对大鼠股动脉出血的止血效果，其中图5A-1表示暴露大鼠股动脉，5A-2表示剪开股动脉以后重度流血；图B表示本发明的新型止血产品对大鼠股动脉出血的止血效果，其中图5B-1表示表示暴露大鼠股动脉，5B-2表示剪开股动脉以后重度流血，5B-3表示施加本发明止血产品3分钟以后流血止住，5B-4表示施加本发明5分钟以后用镊子检测止血产品与伤口的粘合性；
图6表示本发明的新型止血产品和空白对照组分别对大鼠股动脉的止血量的统计；
图7-A表示在大鼠股动脉破裂即施加上本发明的新型止血产品，图7-B施加21天后大鼠腿部的伤口缝合外观恢复情况，图7-C表示解剖开大鼠腿部以后大鼠腿部肌肉的恢复情况；
图8-A(放大图B)为皮下浅层正常组织染色图。图C(放大图D)表示在皮下浅层，实验组施加止血组合物第7天后，组合物与肌肉组织相容性组织染色的组织染色图。
图9表示实验组施加止血组合物第21天后，组合物与肌肉组织相容性组织染色，图A(放大图B)为皮下浅层，图C(放大图D)为皮下深层，箭头所指为组合物。
图10表示实施例9中本发明的新型止血产品(含有微生物谷氨酰胺转胺酶和明胶)和空白对照组分别对大鼠肝脏的止血量的统计；
图11表示本发明所述止血组合物(含有微生物谷氨酰胺转胺酶和明胶)和空白对照组分别对大鼠肝脏出血模型的止血以及防渗出效果示意图，其中：
图11A和11C分别显示处理前暴露的对照组和实验组的肝脏；
图11B和11D分别显示制造对照组和实验组的肝脏伤口后自然流血10秒钟的止血情况；
图11E和11F分别显示对照组施加本发明组合物后2分30秒、5分钟的止血情况；
图11G和11H表示用手动方式检验本发明组合物的粘合性；
图12表示本发明的组合物在大鼠肝脏出血模型中的吸收情况，分图1-5分别表示在实验组B(施加本发明的新型止血产品)和对照组A(强生公司：可吸收止血明胶海绵，商品名SurgifloTM)处理前、施加2分30秒、5天、20天后大鼠肝脏损伤的恢复情况。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1酶活测定
1)测酶活试剂配制
A液(0.5L)：将0.015mol(5.06g)底物Na-CBZ-Gln-Gly、0.05mol(3.475g)盐酸羟胺、0.005mol(1.536g)还原型谷胱甘肽加入400ml蒸馏水于烧杯中，用磁力搅拌器搅拌20分钟后，加入0.1mol(12.11g)Tris，用6mol／L(或lmol／L)盐酸调pH至6.0，将溶液移至500ml容量瓶中，用蒸馏水洗涤烧杯3次倒入容量瓶中，定容至500ml。
B液：3mol／LHCl、12％三氯乙酸(W／V)、5％三氯化铁(W／V，溶于0.1mol／L盐酸，再过滤)按1：1：1的体积比混合。
2)酶活测定
实验组：取0.2ml待测样品，加2mlA液37℃温育10分钟，再加2mlB液。对照组：取0.2ml待测样品，加2mlB液37℃温育10分钟，再加2mlA液。于525nm测定吸光值。
实施例2野生菌株的诱变
野生型mTG菌株为茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)(如美国ATCC的菌株ATCC编号29032或者美国ATCC的菌株ATCC编号27441，或者中国微生物保存中心的菌株如CGMCC编号4.1719及CGMCC编号4.5591)。
培养基配置：高氏一号培养基：可溶性淀粉20g／L，KNO31g／L，MgSO4·7H2O0.5g／L，K2HPO4·3H2O0.5g／L，NaCl0.5g／L，FeSO4·7H2O0.01g／L，琼脂20g／L，pH7.2-7.4。发酵培养基：甘油20g／L，酵母膏6g／L，鱼粉蛋白胨25g／L，MgSO4·7H2O2g／L，K2HPO4·3H2O2g／L，pH7.4。
向高氏一号培养基中加入10ml冷无菌水，用接种针充分刮取表面菌丝，打散孢子，无菌滤纸过滤。
操作在红灯或避光条件下进行，提前0.5小时开紫外灯，使光源稳定。取浓度约为107个孢子／mL的孢子悬浮液3mL置于直径为6厘米灭菌平皿中，利用磁力搅拌子搅拌，在紫外灯功率15W条件下，不同辐照距离，紫外辐照不同的时间进行诱变。避光1小时后，暗环境中将不同稀释度的孢子悬液涂布于高氏培养基上，30℃培养7天。挑取单菌落，在发酵培养基中培养24小时，分别测定37℃时候选菌株和野生菌株的酶活。
实施例3突变体mTG基因的获取
基因组抽提：将实施例2中液体培养的酶活性最高的突变菌株的新鲜菌丝体接种于新鲜培养基，培养24小时左右；离心收集10ml菌体；新鲜菌体于研钵(-20℃预冷)中，反复液氮研磨至细粉状，迅速平均分装至2个1.5mL离心管中；加TE缓冲液550μL，加65℃预热的20％SDS溶液30μL，漩涡振荡5秒钟，加20mg／mL蛋白酶K20μL，轻轻混匀，37℃保温1小时；加等体积Tris饱和酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)抽提，轻微颠倒混匀，10000rpm离心10分钟；小心吸取上清至新离心管中，加等体积氯仿／异戊醇(24：1)抽提，10000rpm，离心5分钟；吸取上清液与等体积异丙醇(4℃预冷)混匀，然后10000rpm离心5分钟，弃上清。沉淀用1mL70％乙醇(4℃预冷)洗涤(颠倒、离心1分钟)，自然风干，加入40uLTE溶解，-20℃保存备用。
引物设计：设计了一对引物可以通过聚合酶链式反应获取mTG基因的全序列，该序列选自：SEQNO：1：ctcaacgaaagcgctccggccgcttc
SEQNO：2：cgctcacatcacggccagccctgc
PCR反应体系及反应条件：将上述获得的基因组DNA和引物混合，按如下条件进行PCR反应：Taq酶反应液(2倍浓度)25μL、引物Pf(2.5mmol／mL)2μL、引物Pr(2.5mmol／mL)2μL、DNA2μL及无菌水。94℃变性1分钟、55℃退火30秒、72℃2分钟，一共40个循环。
电泳检测PCR纯度，结果如图1所示，左边泳道是分子量标准DNA，右边泳道为PCR片段电泳结果。PCR片段大小在1000bp与2000bp之间，与理论值1058bp一致。
实施例4突变mTG基因的测序
向实施例3中的PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置5分钟。12000rmp离心10分钟，弃尽上清；用70％的乙醇洗沉淀一次。干燥，用50μL无菌水溶解沉淀。按如下体系反应：无菌水溶解的PCR产物1μL、pUC19-T载体(Takara公司)0.5μL、连接酶0.5μL、缓冲液(10倍浓度)5μL及无菌水43μL，混匀，16℃反应20分钟。将上述反应后的产物取5μL，加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara公司)，4℃反应30分钟，42℃反应90秒，加入LB培养基，37℃培养1小时，将菌液涂布与LB平板上。待菌落形成后，送测序公司测序。与野生型mTG基因相比较，检测突变位点。
经过常规方法进行测序，发现该突变基因的序列如SEQIDNO：3所示，由此推测其对应的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO4所示。
实施例5mTG蛋白的一般纯化
发酵培养基和菌株同实施例2，将茂源链霉菌孢子接种到装有30mL发酵培养基的，培养28小时。在4℃离心机中12000rmp离心30分钟，去除菌体和固体杂质，获得20mL培养基上清。加入40mL无水乙醇，4℃放置1小时。4℃离心机中12000rmp离心30分钟，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于安瓿瓶，冷冻干燥机中冻干2天，即得到初步提纯的野生型mTG蛋白。
将突变的茂源链霉菌孢子接种到装有30mL发酵培养基的250ml三角瓶中，培养24小时。其他操作步骤同上，纯化得到突变mTG蛋白。
纯化的蛋白质利用质谱分析其结构是否与理论推断一致。最终质谱分析结果如图2所示显示：其质谱分子量显示为37934.9Da，与基因测序的推断的分子结构符合。说明蛋白质序列确为SEQNO4。经过比对，相对于野生型序列，该SEQIDNO；4有4个位点发生突变，分别为第23位丝氨酸变为丙氨酸、73位甘氨酸变为酪氨酸、317位赖氨酸变为谷氨酰胺以及325位赖氨酸变为谷氨酰胺(即S23A、G73Y、K317Q、K325Q)。
实施例6本发明突变mTG蛋白的精细纯化
将实施例5中得到的蛋白利用离子交换柱进行蛋白精细纯化。填料为DEAE-Sephrosefastflow(GEhealthcare)，平衡液为0.05M的tris／HCl缓冲液，pH9.0，洗脱液为0-1mol／L的NaCl50mM的tris／HCl，pH9.0。线性洗脱16个柱体积，收集各个组分，电泳检测，得到纯度较好的mTG蛋白。将该组分脱盐后冻干。实验结果显示该蛋白大小与预期37.9kDa的分子量大小一致，而且纯度很高，电泳只有单一的条带，纯度大于99％(如图3所示)。第4泳道为纯化的蛋白。由此，实施例6的结果也进一步印证了实施例5中所分析的蛋白质序列确为SEQNO4。
实施例7不同温度下突变mTG蛋白的比活性测定
将纯化得到的野生型mTG蛋白和本发明突变mTG蛋白分别在25℃、37℃、45℃、55℃、75℃下测定酶活。测定酶活所用方法同实施例1所述。测活使用的溶液在反应前分别在对应的温度下预热2分钟。实验结果显示(如图4所示)，在不同反应温度下，本发明突变mTG的比酶活表现出了与野生型mTG完全不同的走势。本发明突变mTG最佳反应温度在45℃左右，而野生型mTG最佳反应温度在55℃左右，本发明mTG最佳反应温度明显低于野生型mTG。而且，在25℃-75℃下，本发明mTG比酶活均显著高于野生型。在37℃时本发明mTG比酶活达到了80U／毫克，比野生型mTG酶活高了100％以上，比在先专利CN2012102021709的3位点突变也提高了50％。此外，在55℃以上的高温条件下野生型mTG活性急剧下降而本发明mTG仍保留较高酶活。65℃-75℃时本发明mTG仍保留较高酶活，而此时野生型mTG几乎已经失活。可见，比野生型mTG和3位点突变酶相比较，本发明突变mTG具有显著良好的酶活力以及耐热稳定性，酶活力与止血效果正相关，提示本发明所述的4突变mTG止血效果优于野生型mTG和3位点突变酶，且其使用环境更加宽泛，对于战争或事故创伤现场环境具有更好的适应性。
实施例8基因工程方法制备本发明mTG
为了保证在没有茂源链霉菌突变菌株的前提下也可以获得突变基因，本实施例利用人工合成的方法获得mTG突变体。
将上述突变的基因序列在商业化的生物公司(如上海生物工程公司、英骏生物技术公司等)合成全基因序列，并将其克隆到商业化大肠杆菌表达载体pET-32a(如默克生物公司或者其它生物公司；任何其它表达载体如pET-32b或其它的合适载体均可)的EcoRV位点中，形成一个可以表达目的基因的表达载体。按照常规的技术转化到大肠杆菌BL21中，得到可以表达该蛋白的基因工程菌。将该基因工程菌接种到20mlLB培养基中，在37℃200转每分钟培养16个小时后按照培养基体积的1／1000加入溶度为1mol／L乳糖溶液，继续培养4个小时，收集菌体。
在200w的功率下用超声破碎仪破碎菌体；10000rmp离心5分钟弃去上清，将沉淀重悬于含8mol／L尿素的溶液中，吹打3次；10000rmp离心5分钟，收集上清按如下所述纯化。
利用QIAGEN公司的Ni-NTASpin试剂盒，按照其中所述的方法进行纯化。具体方法完全按照其说明书进行，最终获得了含有突变的mTG的融合蛋白。
向融合蛋白溶液中按照融合蛋白的质量加入1／10质量的分散酶。37℃作用30分钟后，
按照实施例6的方法纯化，获得本发明mTG蛋白。
实施例9：大鼠股动脉止血实验
这一实施案例提供了本发明产品模拟战场环境下对体外大出血快速止血的实施案例。
本发明所指含谷氨酰胺转胺酶的止血材料冻干粉配比为：谷氨酰胺转胺酶5400U；羟化明胶25g；山梨醇5g。制备方法为：称25g羟化明胶加水加热搅拌使其完全溶解；称5g山梨醇，加入上述溶液中，搅拌使其完全溶解；再用0.22μtm滤膜过滤除菌，放置至室温加注射用水定容至100ml。无菌过滤加入5400U谷氨酰胺转胺酶，混合均匀后，置于冻干机进行冷冻干燥。干燥结束后粉粹成粉末，将该止血组合物包装制成成品。
实验选用SD大鼠14只，随机分为空白对照组和实验组(mTG-明胶)，每组7只。
使用外科手术刀切开了大鼠的股动脉。重度流血约10秒钟之后，在施用前即时使用纱布除去蓄积的血液。当施用止血组合物之前，将止血组合物准备好。施加组合物以后，股动脉依然在小于3分钟内完全停止了流血。5分钟后，使用摄子手动检测止血产品。分别观察纱布止血和新型止血产品止血的实验效果，拍照记录。并且统计流血量。
实验结果见图5A(对照组)和图5B(实验组)，其中图5A-1表示暴露大鼠股动脉，5A-2表示剪开股动脉以后重度流血；图B表示本发明的新型止血产品对大鼠股动脉出血的止血效果，其中图5B-1表示表示暴露大鼠股动脉，5B-2表示剪开股动脉以后重度流血，5B-3表示施加本发明止血产品3分钟以后流血止住，5B-4表示施加本发明5分钟以后用镊子检测止血产品与伤口的粘合性。
因此，图5A表明：大鼠股动脉剪开后股动脉流血严重，用纱布按压3分钟仍然不能止血。说明股动脉流血用纱布止血不成功。
相反，图5B表明：大鼠股动脉剪开自然流血10秒钟以后，施加止血产品，可以观察到在小于3分钟的时候股动脉的流血已经被止血产品止住，在5分钟的时候用镊子检测止血产品与大鼠腿部肌肉的粘附情况和止血产品的粘性，发现止血产品粘性良好，并且止血产品和大鼠腿部肌肉的粘附情况良好，不易脱落。
在实施以上方案的同时，收集各实验组的血流，采用电子天平称量并统计3分钟内大鼠股动脉的流血量。结果如图6所示：大鼠股动脉流血用新型止血产品在三分钟内成功止血，上述实验结果说明本发明止血产品的快速止血性能良好。
实施例10:新型止血产品的组织相容性研究
本发明所指含谷氨酰胺转胺酶的止血材料冻干粉配比为：谷氨酰胺转胺酶5400U；羟化明胶25g；山梨醇5g。制备方法为：称25g羟化明胶加水加热搅拌使其完全溶解；称5g山梨醇，加入上述溶液中，搅拌使其完全溶解；再用0.22μtm滤膜过滤除菌，放置至室温加注射用水定容至100ml。无菌过滤加入5400U谷氨酰胺转胺酶，混合均匀后，置于冻干机进行冷冻干燥。干燥结束后粉粹成粉末，将该止血组合物包装制成成品。
实验选用15只大鼠。随机分为5只为空白对照组，10只为实验组(mTG-明胶)。
其中10只实验组，使用外科手术刀切开了大鼠的股动脉。重度流血约10秒钟之后，在施用前即时使用纱布除去蓄积的血液。当施用止血组合物之前，将止血组合物准备好。施加组合物以后，股动脉依然在小于3分钟内完全停止了流血。5分钟后，使用摄子手动检测止血产品。之后为大鼠缝合，分笼饲养。分别在第7天和21天的时候取实验部位的大腿部肌肉进行组织切片。每次取5只大鼠。实验结果如图7所示表明：在刚施加上组合物和施加组合物21天后大鼠腿部的伤口恢复情况和肌肉的变化情况。
实验结果表明，大鼠腿部在施加新型止血产品21天后伤口已经恢复，解剖开以后观察止血产品对比与刚施加的时候已经消失，并且腿部肌肉相比于正常组织没有明显差别。说明新型止血产品可吸收情况良好，没有对大鼠造成不良影响。
然后，其中5只对照组，第一天取5只大鼠肌肉做切片，作为空白对照，得到正常的肌肉组织切片。
其中组织切片的实验步骤如下：
1、取材与固定：
从大鼠大腿部位取下组织块(一股厚度不超过0.5厘米)投入预先配好的固定液10％福尔马林中。
2、脱水透明：
一股用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明。
3、浸蜡包埋：
将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。
4、切片与贴片：
将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片。切下的薄片放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
5、脱蜡染色：
用HE染色
HE染色过程是：
①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
⑤入酒精伊红染色液染色2-3分钟。
6、脱水透明：
染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
7、封固：
中性色树胶进行封片。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。
实验结果如图8-9所示，其中图8-A(放大图B)为皮下浅层正常组织染色图。图C，(放大图D)表示在皮下浅层，实验组施加止血组合物第7天后，组合物与肌肉组织相容性组织染色的组织染色图。结果显示，在第7天的组织切片观察到止血组合物(箭头所指)已经开始吸收有进入肌肉组织内部.
图9表示实验组施加止血组合物第21天后，组合物与肌肉组织相容性组织染色，图A(放大图B)为皮下浅层，图C(放大图D)为皮下深层，箭头所指为组合物，在第21天的时候止血产品已经进入肌肉组织内部降解。
结果还显示，21天后，和正常对照组图8A(放大图B)的肌肉组织切片相比，大鼠皮下浅层肌肉组织组织切片图9A(放大图B)没有明显差异。说明施加止血产品以后在21天的时间里，止血产品的组织相容性和吸收性良好。
以上实验结果表明：本发明新型止血产品的组织相容性和可吸收性良好。
实施例11本发明所述止血产品对SD大鼠股动脉创伤出血止血效果和局部温度变化的对比
这一实施案例提供了本发明与传统军用止血剂对伤员止血效果和局部温度变化对比的实施案例。
本发明所指含谷氨酰胺转胺酶的止血材料冻干粉配比为：谷氨酰胺转胺酶5400U；羟化明胶25g；山梨醇5g。制备方法为：称25g羟化明胶加水加热搅拌使其完全溶解；称5g山梨醇，加入上述溶液中，搅拌使其完全溶解；再用0.22μm滤膜过滤除菌，放置至室温加注射用水定容至100ml。无菌过滤加入5400U谷氨酰胺转胺酶，混合均匀后，置于冻干机进行冷冻干燥。干燥结束后粉粹成粉末，将该止血组合物包装制成成品。
实验选用SD大鼠21只，随机分为空白对照组、沸石粉对照组和实验组(mTG-明胶)，每组7只。购买的SD大鼠在实验动物房适应1周后开始进行实验，建立血管断裂创伤模型。呼吸麻醉剂麻醉大鼠；仰位固定在手术台上，消毒，在右侧股前上部作3cm纵行切口，充分暴露并游离股动脉约1.5cm，股静脉约1.5cm,置测温仪于血管、肌肉间。用手术刀切断股动脉、股静脉，立即对出血创面撒上止血材料(每个出血创面均使用25g受试材料：阴性对照淀粉、阳性对照沸石颗粒、本发明止血粉)进行止血，按压2min后，观察记录各组动物创面的止血效果。统计学处理：采用卡方检验比较止血效果差异的显著性；显著性水平a=0.05。
表2、对SD大鼠股动静脉断裂出血止血效果和局部温度变化
组别 大鼠 止血数量 平均止血时间(min) 止血有效率 局部温度
阴性对照 7 0 0％ 37℃
沸石粉对照 7 7 2 100％ 60～70℃
本发明 7 7 2.5 80％ 37～50℃
与阴性对照组比较，**P<0.01
实验结果显示：本发明止血剂和阳性对照沸石粉撒在股动静脉断裂出血部位并按压股动脉创面3min后，能有效止血。阴性对照淀粉撒在出血部位并按压股动脉创面3min后不能有效止血，不再应用其他干预措施治疗的SD大鼠全部死亡。阳性对照沸石颗粒使局部温度升高，但本发明止血剂使局部温度升高的作用远弱于沸石颗粒，局部温度不超过50℃。实验结果表明本发明止血剂虽然止血速度略低于沸石粉止血速度，但仍然具有强效速效的止血作用，足以符合战争快速止血要求。并且本发明止血剂使局部温度升高作用弱于沸石，不造成局部组织热损伤，其综合效果优于传统沸石类止血剂。
实施例12：本发明的组合物在大鼠肝脏出血模型中的止血以及防止伤口渗出实验
这一实施例提供了根据本发明产品(微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)-明胶组合物)模拟战环境下对人体内部脏器的快速止血效果。
实验选用300g±20g的SD大鼠14只，随机分为对照组和实验(mTG-明胶)组，每组7只。
本发明中使用微生物谷氨酰胺转胺酶比活为：1-50U／毫克
本发明所指含谷氨酰胺转胺酶的止血材料冻干粉配比为：谷氨酰胺转胺酶5400U；羟化明胶25g；山梨醇5g。制备方法为：称25g羟化明胶加水加热搅拌使其完全溶解；称5g山梨醇，加入上述溶液中，搅拌使其完全溶解；再用0.22μm滤膜过滤除菌，放置至室温加注射用水定容至100ml。无菌过滤加入5400U谷氨酰胺转胺酶，混合均匀后，置于冻干机进行冷冻干燥。干燥结束后粉粹成粉末，将该止血组合物包装制成成品。
对于对照组来说，不加入任何止血产品(或止血剂，下同)，只是用以观察自然止血时间。
开始实验前使成年大鼠处于全身麻醉状态，在整个试验期间，检测并维持大鼠的生命体征。
对于实验和对照的施用来说，常规手术开腹腔，暴露肝脏后，使用外科手术刀在肝脏左叶制造1厘米长、0.5厘米深的矢状切口。活跃流血约10秒钟之后，在mTG-明胶溶液施用前及时使用纱布除去蓄积的血液。
将实验溶液施用于肝脏左叶上的切口。施用后大约两分钟凝胶形成并且施用后在小于约2.5分钟内流血被完全停止。5分钟后，用力摇动组织并且使用镊子横过创伤部位施加拉力，但是凝胶依然完好并且创伤闭合。
使用电子天平称量并统计2.5分钟内大鼠肝脏的流血量，结果如图10所示，实验结果数据表明，本发明的组合物在2分30秒时可抑制大鼠肝脏93％的出血量，可以迅速的达到止血效果(**，P<0.01)。
图11表示本发明所述止血组合物和空白对照组分别对大鼠肝脏出血模型的止血以及防渗出效果示意图，其中图11A和11C分别显示处理前暴露的对照组和实验组的肝脏，如图11B和11D分别显示制造对照组和实验组的肝脏伤口后活跃流血10秒钟的情况。图11E表示对照组施加本发明组合物后2分30秒的情况，图11F表示施加本发明组合物后5分钟的情况，图11G和11H表示用手动方式检验本发明组合物的粘合性。
对于对照组来说，不采取止血措施情况下2分30秒不能自然止血。对于实验组来说，肝脏伤口在加入止血组合物2分30秒后会迅速止血。如图11E所示，本发明组合物粘合性非常强，将伤口粘合，流血停止。5分钟后，如图11G和11H所示，用镊子检测到组合物粘结强度完全可以堵塞伤口，防止血液或者其他体液渗出，不会让伤口再次出血。而且，镊子可以将止血产品和肝脏一起提起来，这时也不流血，显示本发明所述止血产品极强的止血和抗震动效果，这对于患者的康复是很有利的。如果mTG溶液储藏在4℃，拿出后即进行实验，伤口在加入组合物后在3分钟后也会止血，将伤口粘合，流血停止。
实施例13：本发明的组合物在大鼠肝脏出血模型中的吸收情况
这一实施例提供了根据本发明产品(微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)-明胶组合物)模拟战场环境下体内止血后自然吸收的情况。
实验选用300g±20g的SD大鼠14只，分为对照组(强生公司：可吸收止血明胶海绵，商品名SurgifloTM)和实验(mTG-明胶)组，每组7只。
本发明所指含谷氨酰胺转胺酶的止血材料冻干粉配比为：谷氨酰胺转胺酶5400U；羟化明胶25g；山梨醇5g。制备方法为：称25g羟化明胶加水加热搅拌使其完全溶解；称5g山梨醇，加入上述溶液中，搅拌使其完全溶解；再用0.22μm滤膜过滤除菌，放置至室温加注射用水定容至100ml。无菌过滤加入5400U谷氨酰胺转胺酶，混合均匀后，置于冻干机进行冷冻干燥。干燥结束后粉粹成粉末，将该止血组合物包装制成成品。
对照组A：对照组使用国际商品化用止血产品(强生公司产品，可吸收止血明胶海绵，商品名SurgifloTM)，并观察吸收情况。
动物状态：成年大鼠处于全身麻醉状态，在整个试验期间，检测并维持大鼠的生命体征。
实验步骤：用手术剪打开大鼠腹腔，暴露肝脏，使用手术刀在肝脏左叶制造1厘米长、0.5厘米深的矢状切口，活跃流血约10秒钟之后，用纱布除去表面蓄积的血液。
将实验溶液施用于肝脏左叶上的切口，施用大约两分钟凝胶形成，约2.5分钟内流血完全停止。5分钟后，用力摇动组织并且使用镊子横过创伤部位施加拉力，凝胶依然完整，并且创伤部位保持闭合。实现止血目的后，肝脏伤口不需缝合，常规缝合腹腔。分别在5天、10天、20天后，处死实验动物，观察肝脏伤口处止血组合物的吸收情况。
实验结果如图12所示，实验组B的结果表明施加本发明止血组合物20天后尚未完全吸收，但是随伤口愈合，止血组合物逐渐被吸收，吸收程度与国际商品化止血产品组相差不大。

Claims (18)

1.一种微生物谷氨酰胺转氨酶mTG，其特征在于该mTG与野生型mTG相比发生了四个位点的氨基酸突变，即S23A、G73Y、K317Q、K325Q。
2.权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶mTG，其中该酶具有如SEQIDNO：3所述的基因编码的蛋白序列；或者，具有如SEQIDNO：4所述的蛋白序列。
3.用于编码权利要求1或2所述酶的基因序列。
4.一种用于战争或事故现场创伤的快速止血产品，其特征在于，包含添加了所述的微生物谷氨酰胺转氨酶mTG的基质，其中所述谷氨酰胺转氨酶的序列具有如权利要求3所述的基因编码的蛋白序列，或具有如权利要求1或2所述的蛋白序列。
5.如权利要求4所述的止血产品，其特征在于，其中止血产品选自止血剂、止血装置、止血急救包或常见的止血制品，并且所述基质为人体可吸收的流体、半固体、粉末或可塑性的胶状或胶体形态。
6.如权利要求5所述的止血产品，其特征在于，所述流体或半固体形态的基质或材料包括液体纤维蛋白密封材料或胶类。
7.如权利要求6所述的止血产品，其中所述液体纤维蛋白密封材料或胶类选自角蛋白、胶原蛋白或流体明胶。
8.如权利要求6所述的止血产品，其特征在于，所述液体纤维蛋白密封材料或胶类包括溶解液，所述溶解液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液PH范围从7.0至9.0。
9.如权利要求5所述的止血产品，其特征在于，所述可塑性的胶状或胶体形态包括氧化纤维素、氧化再生纤维素、壳聚糖、角蛋白、胶原蛋白、明胶海绵。
10.如权利要求4-6之任一项所述的止血产品，其特征在于，所述基质选自可吸收纤维蛋白胶、角蛋白、胶原蛋白或各种来源的医用明胶以及液体纤维蛋白密封材料或胶，或者选自氧化纤维素、氧化再生纤维素、壳聚糖、蛋白多糖、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物。
11.如权利要求10所述的止血产品，其中所述蛋白多糖是聚-N-乙酰葡萄糖胺。
12.如权利要求10所述的止血产品，其特征在于，所述基质是明胶。
13.如权利要求12所述的止血产品，其特征在于，所述基质选自哺乳动物的A型高分子量明胶，或是含有20％～60％的脯氨酸被羟化的明胶。
14.如权利要求5所述的止血产品，其特征在于，所述止血产品的原材料形状是：(i)粉末、颗粒或其他固体形式的明胶；(ii)粉末、颗粒或其他固体形式的转谷氨酰胺转氨酶。
15.如权利要求5所述的止血产品，其特征在于，所述止血产品是止血带或止血纱布，包括以棉纱或可溶性止血纱布为本体的止血带或止血纱布外层，和用于接触和包扎伤口的内层，其中所述内层中含有所述谷氨酰胺转氨酶的基质粉末或药芯。
16.如权利要求5所述的的止血产品，其特征在于，所述止血产品是快速止血的喷雾装置，包括加压的喷雾或泡沫、明胶和转谷氨酰胺转氨酶组分的混合物。
17.如权利要求12-14所述的止血产品，其特征在于，所述止血产品是含有上述明胶和谷氨酰胺转氨酶组分的止血急救包、急救箱的军用止血产品。
18.制备权利要求4-17任一项所述用于战争或事故现场创伤的快速止血产品方法，包括以下步骤：
(1)制备能表达所述微生物谷氨酰胺转氨酶的重组微生物，并进行重组表达；
(2)收集并纯化具有所述活性的谷氨酰胺转氨酶，并配置成活性溶液；
(3)通过常规方法，将所述谷氨酰胺转氨酶的活性溶液添加在人体可吸收基质中；
(4)将所述基质进行常规处理，即得到上述用于战争或事故现场创伤的快速止血产品。
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