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CN103781905A - 多酶纳米复合物 - Google Patents

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CN103781905A
CN103781905A CN201280043354.3A CN201280043354A CN103781905A CN 103781905 A CN103781905 A CN 103781905A CN 201280043354 A CN201280043354 A CN 201280043354A CN 103781905 A CN103781905 A CN 103781905A
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nano
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multienzyme
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CN201280043354.3A
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Y.鲁
闫明
刘阳
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University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
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Publication date
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Abstract

本发明提供具有至少两种不同酶和锚定于所述酶的至少一种的聚合网状物的纳米复合物。在一些实施方案中，所述酶的活性催化级联反应。

Description

多酶纳米复合物
相关申请的引用
本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2011年7月6日提交的名称为“ORAL DELIVERY OF ENZYMES BY NANOCAPSULES FORTARGETED METABOLISM OF ALCOHOL OR TOXIC METABOLITES”的共同待决美国临时专利申请号61/504,975和2011年8月31日提交的名称为“MULTIPLE-ENZYME NANOCOMPLEXES”的共同待决美国临时专利申请号61/529,767的权利，所述各专利申请的内容以引用的方式并入本文。
政府资助的声明
本发明是在由美国国防部国防威胁降低局颁发的授予号HDTRA1-09-1-0001下在政府资助下完成。政府享有本发明中的某些权利。
技术领域
本公开大体上涉及含有协同执行其酶功能的多种酶的纳米结构。也公开制备和使用所述结构的方法。
背景技术
酶是介导活生物体中的每一生物过程的精巧生物催化剂。在真核生物细胞中，大多数酶不在胞质液内自由扩散，而是在空间上限定在亚细胞细胞器内或连同其它蛋白质一起以酶复合物形式紧密共定位(参见例如Conrado等人,Curr Opin Biotech19,492-499,(2008)；Yan等人,J Proteomics72,4-11,(2009))。在由多种酶催化的连续反应中，所述紧密限定使中间体在各酶间的扩散最小，从而增强总体反应效率和特异性(参见例如Yan等人,J Proteomics72,4-11,(2009))。
通常在体内，在代谢过程期间产生的毒性中间体由旨在降解所述毒素且共定位在限定结构内的邻近酶迅速消除(参见例如Kristensen等人,Natl AcadSci USA102,1779-1784,(2005))。举例而言，过氧化物酶体持有具有重要代谢和分解代谢功能的多种氧化酶；毒性中间体，如过氧化氢(H2O2)(参见例如Wanders等人,Annu Rev Biochem75,295-332,(2006)；和Schrader等人,Histochem Cell Biol122,383-393,(2004))。有趣的是自然界通过在过氧化物酶体内并入催化酶(Cat)来绕过这个难题。催化酶在分解H2O2方面具有高度活性和特异性；快速消除所产生的H2O2会防止其从过氧化物酶体扩散出来且防止其对其它细胞组分的损害(参见例如Fujiwara等人,J Biol Chem275,37271-37277,(2000)；和Sheikh等人,P Natl Acad Sci USA95,2961-2966,(1998))。
尽管多酶构造通常存在于自然界中，但包括酶催化和治疗的当前酶基应用仍然局限于使用单一酶或其混合物(参见例如Leader等人,Nat Rev DrugDiscov7,21-39,(2008)；Iso等人,J Microencapsul6,165-176,(1989)；Nouaimi-Bachmann等人,Biotechnol Bioeng96,623-630,(2007)；和Mateo等人,Enzyme Microb Tech40,1451-1463,(2007))。已广泛研究并有多种酶的无机和聚合材料；然而，酶以薄膜或大粒子(直径约100μm)形式随机固定在这些材料内，从而排斥其治疗应用(参见例如Srere等人,P Natl Acad Sci USA70,2534-2538,(1973)；Mansson等人,P Natl Acad Sci---Biol80,1487-1491,(1983)；Kochschmidt等人,Eur J Biochem81,71-78,(1977)；和Sheldon等人,Adv Synth Catal349,1289-1307,(2007))。
融合蛋白技术提供一种构建多酶构造的策略(参见例如Riedel等人,MolMicrobiol28,767-775,(1998)；Shibuya等人,Biosci Biotech Bioch56,884-889,(1992)；和Mao等人,J Biol Chem270,18295-18300,(1995)。理想的是具有可设计功能的所述构造可通过审慎工程改造转染至宿主细胞中的基因组输入物来达成；然而，这个方法常导致酶特异性和活性损失或降低(参见例如Stempfer等人,Nat Biotechnol14,481-484,(1996)；和Seo等人,Appl EnvironMicrob66,2484-2490,(2000))。此外，找到适合宿主细胞及设计适合间隔子进一步在融合蛋白的构建中施加障碍(参见例如Bulow等人,Bio-Technol3,821-823,(1985))。近来，翻译后装配用于构建酶复合物；然而，所述装配过程仅依赖于酶组分之间的特异性结合且缺乏一般适用性(参见例如Mingardon等人,Appl Environ Microb73,7138-7149,(2007)；Fierobe等人,JBiol Chem276,21257-21261,(2001)；和Fierobe等人,J Biol Chem277,49621-49630,(2002))。
发明内容
本文公开的本发明提供具有可编程功能的强健人工酶纳米复合物。如以下详细论述，通过使用简单湿式化学方法，可针对广泛范围的功能性应用来产生且特定设计新型酶纳米复合物。
本公开提供含有至少两种不同酶及锚定于所述酶的至少一种的聚合物网状物的纳米复合物。所述多酶复合物使得酶能够协同执行其活性。在一些实施方案中，酶的活性催化级联反应。此外，复合物的功能可通过简单化学方法来编程。如实验性实施例中所证明，这些酶复合物(称为“酶纳米复合物(EN)”)展现催化效率增强以及稳定性增加。同时，这些酶复合物可被设计来分解特定化合物，例如在体内环境中可具有毒性的那些化合物(例如过氧化氢)。
因此，在一个实施方案中，本公开提供一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物包含至少两种不同酶及锚定于所述至少两种不同酶的至少一种的聚合网状物。在一个实施方案中，聚合网状物锚定于全部至少两种不同酶。在一个实施方案中，两种不同酶的活性催化级联反应。
在一些实施方案中，至少两种不同酶彼此共价或非共价连接。一方面，共价键联在体内可降解。另一方面，至少两种不同酶不彼此连接。在一个实施方案中，聚合网状物包含主要由至少一种单体单元组成的聚合物。在另一实施方案中，聚合网状物包含主要由至少两种不同单体单元组成的聚合物。在一些实施方案中，聚合网状物进一步包含交联剂。
在一个实施方案中，也提供一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物包含至少两种不同酶和可渗透外壳，所述外壳包含锚定于至少两种不同酶的至少一种的聚合网状物。在另一实施方案中，本公开进一步提供一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物主要由聚合网状物和至少两种不同酶组成，所述聚合网状物共价锚定于所述至少两种不同酶的至少一种且提供围绕所述至少两种不同酶的可渗透外壳。
本发明的另一实施方案是包括被设计来促进多个酶促反应的要素和构造(例如要素的特定3维构象)的多酶纳米复合物系统。本文公开的系统的工作实施方案包括在与第一底物的第一酶促反应中产生过氧化氢的第一酶、在第二酶促反应中使过氧化氢转化成水的第二酶、和被配置来形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外壳的聚合网状物。在所述系统实施方案中，聚合网状物展现足以允许第一底物从外壳外部的外部环境扩散至第一酶以便产生过氧化氢的渗透性且进一步展现足以允许过氧化氢从第一酶扩散离开且到达第二酶以便产生水的渗透性。在本发明的某些实施方案中，第一酶偶合于第二酶。在本发明的一些实施方案中，聚合网状物偶合于第一酶的多肽或第二多肽的多肽。
在一个实施方案中，也提供用于通过例如以下方式来产生本文公开的多酶纳米复合物的方法：(a)使至少两种不同酶彼此连接；(b)使通过(a)产生的所连接酶丙烯酸化；以及(c)使用至少一种单体单元和任选交联剂来原位(就地，in situ)聚合通过(b)产生的丙烯酸化的酶。一方面，方法进一步包括(d)除去键联。在本发明的某些方法实施方案中，连接包括(i)使对各酶具有特异性的配体缀合于单一核酸；(ii)实现缀合于所述核酸的所述配体结合所述酶；以及(iii)提供发生核酸杂交所处的条件。一方面，连接包括使酶缀合于可彼此杂交的单一核酸链。另一方面，(a)中的连接包括使用连接子。
附图说明
在整篇附图和申请中，酶纳米复合物(EN)表示为n(酶)，其中括号内的酶是指纳米复合物的核心内的酶。举例而言，n(Cat)是指含有催化酶(Cat)的EN。呈相同风格的n(HRP-GOx-Inv)是指含有辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和转化酶(Inv)的EN。
其它缩写包括：AOx：醇氧化酶；ssDNA：单链DNA；EDAC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺；NAS：N-羟基丁二酰亚胺酯；DLS：动态光散射；TEM：透射电子显微术。
图1是通过DNA定向装配和纳米囊封来合成三酶纳米复合物的图解说明。I.(A)转化酶(Inv)、(B)葡萄糖氧化酶(GOx)和(C)辣根过氧化酶(HRP)与含有其相应竞争性抑制剂：(a)乳糖酸、(b)葡糖胺和(c)4-二甲基氨基安替比林的抑制剂-DNA骨架的自发装配，从而导致形成三酶构造。II.通过在空间上收缩酶纳米复合物的薄网状聚合物的就地增长进行三酶构造的稳定化；III.除去DNA骨架，从而导致形成具有显著增强的稳定性和紧密邻近限定的三酶纳米复合物。所述紧密邻近构造使得它们的反应中间体能够在酶之间主动转运，从而导致反应效率显著增强。
图2包括用以显示酶纳米复合物的结构以及增强的活性和稳定性的影像和图，(a)具有均一尺寸的n(HRP-GOx)的透射电子显微(TEM)影像。(b)从分别用单一金纳米粒子标记的HRP和GOx制备的n(HRP-GOx)的TEM影像，所述TEM影像确认双酶纳米复合物构造。(c)n(HRP-GOx)以及n(HRP)与n(GOx)的具有相同蛋白质含量的混合物的荧光光谱。GOx和HRP分别用FITC和RhB预先标记。在使用Ex=450nm下记录光谱。(d)(i)n(FITC标记的GOx)(Ex=488nm，Em=510～530nm)、(ii)n(RhB标记的HRP)(Ex=532nm，Em=570～600nm)、以及用FITC标记的GOx和RhB标记的HRP合成的n(HRP-GOx)(Ex=488nm，Em=570～600nm)的共焦显微影像。(e)n(HRP-GOx)、n(HRP-GOx-Inv)以及它们的天然酶混合物对应物在65℃下的酶稳定性的比较。(f)n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)(EN)与它们的分别表示为2酶系统和3酶系统的天然酶混合物对应物(游离酶)的转换速率比较。相对于相应天然酶混合物的那些转换速率来归一化转换速率。(g)在递增聚(乙二醇)(PEG)浓度下，n(HRP-GOx)与天然HRP和GOx的具有相同酶含量的混合物在磷酸盐缓冲液(50mM，pH=7.0)中的活性比较。(h)在递增PEG浓度下，n(HRP-GOx-Inv)与天然HRP、GOx和Inv的具有相同酶含量的混合物的活性比较。用相同酶含量和PEG浓度下的游离酶混合物的活性使相对活性归一化。
图3呈现含有催化酶的酶纳米复合物的体内解毒能力。(a和b)在用n(GOx)、n(GOx)与n(Cat)的混合物、以及n(GOx-Cat)处理之后的细胞活力测定。用未处理细胞的那些细胞增殖速率使细胞增殖速率归一化。通过在37℃下孵育处理的细胞与CellTiter Blue3小时来进行细胞活力测定，其中活细胞还原CellTiter Blue，从而展现高度荧光微红色。(c和d)用PBS、n(Cat)、H2O2、n(GOx)和n(GOx-Cat)在不同部位处经皮注射的小鼠的照片以及从各注射部位获得的相应皮肤组织切片：(i)小鼠皮肤组织切片的苏木精和曙红(H&E)染色(原始放大40x)。(ii)小鼠皮肤组织切片中的细胞凋亡。通过用Cy3缀合的单克隆α-平滑肌肌动蛋白抗体(红色)鉴定的TUNEL染色(绿色)确定细胞凋亡。DAPI用于核染色(蓝色)。用萤光显微术(原始放大200x)评估和摄影免疫染色的切片。
图4呈现用以显示经口n(AOx-Cat)醇解毒剂的功效的比较图。(a)在用单独酒精、和酒精连同天然AOx、n(Cat)、n(AOx)、n(AOx)与n(Cat)的混合物、或n(AOx-Cat)一起管饲之后的小鼠血液酒精浓度(BAC)。用酒精测试试剂盒测定BAC。对于用n(AOx-Cat)处理的小鼠，相较于仅用酒精(EtOH)喂送的小鼠，BAC在3小时内显著降低(*P<0.05；**P<0.01)。各组中使用四只小鼠。(b)小鼠的相应血浆丙氨酸转氨酶(ALT)。对照组中的小鼠用正常食物喂送，其它组小鼠用含有乙醇以及PBS、天然AOx、n(Cat)、n(AOx)、n(AOx)与n(Cat)的混合物、或n(AOx-Cat)的液体饮食管饲。
图5显示用于合成n(HRP-GOx)(a)和n(HRP-GOx-Inv)(b)的DNA-抑制剂骨架。
图6显示在用抑制剂进行5’修饰之前(黑色)和之后(灰色)的DNA的MALDI-TOF质谱。(a)ssDNA-1和4-氨基安替比林(4-AAP)修饰的ssDNA-1。(b)ssDNA-2和葡糖胺修饰的ssDNA-2。(c)ssDNA-I和葡糖胺修饰的ssDNA-I。(d)ssDNA-II和4-AAP修饰的ssDNA-II。(e)ssDNA-III和乳糖酸修饰的ssDNAIII。(f)ssDNA-IV。
图7呈现(a)n(HRP-GOx)(灰色)和n(HRP-GOx-Inv)(黑色)的尺寸分布图。
图8显示用EtOH和n(AOx-Cat)处理的细胞与用天然AOx以及n(AOx)与n(Cat)的混合物处理的细胞的活力比较。
与图4类似的图9显示也在通过尾部静脉注射的动物中获得BAC降低。(a)在注射含有AOx的纳米胶囊(n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)+n(Cat)以及n(AOx-Cat))或天然AOx之后的小鼠BAC。对于用n(AOx-Cat)处理的小鼠，BAC在3小时之前显著降低(*P<0.05；**P<0.01；相较于仅用酒精(EtOH)喂送的小鼠；在EtOH喂送组中，n=4只小鼠)。(b)用EtOH和纳米胶囊处理的小鼠中的ALT。对照组中的小鼠用正常食物喂送，其它组小鼠用不同样本(PBS、天然AOx、n(Cat)、n(AOx)、n(AOx)+n(Cat)混合物以及n(AOx-Cat))注射，随后喂送含有EtOH的液体饮食。
图10.双核心酶纳米胶囊的结构表征。a.HRP-GOx双核心纳米胶囊的TEM影像。HRP与GOx两者均用1.4nm金纳米粒子单一标记。b.包括染料对的HRPGOx双核心纳米胶囊的荧光光谱。在=490～630nm之后在=450nm(FITC的相应消光波长)下记录光谱。对应于若丹明B的荧光的在=585nm(峰B)下的发射由在=585nm(峰A)下的FTIC的荧光激发。c.包括染料对的HRP-GOx双核心纳米胶囊的共焦显微术影像。HRP和GOx分别用若丹明B和FITC标记。i.双核心纳米胶囊中的GOx-FITC的荧光影像。在510～530nm下的FITC的荧光之后，通过在=450nm下的FITC的消光来记录影像。ii.双核心纳米胶囊中的HRP-RhB的荧光影像。在570～600nm下的RhB的荧光之后，通过在=540nm下的RhB的消光来记录影像。iii.双核心纳米胶囊中的HRP-RhB(FRET)的荧光影像。在570～600nm下的RhB的荧光之后，通过在=450nm下的FITC的消光来记录影像。
图11.在多核心酶纳米胶囊与游离酶系统之间的活性和稳定性比较。a.游离酶(黑色)和多核心酶纳米胶囊(红色)的相对转换速率。在游离酶(对于双酶系统而言是HRP/GOX，对于三酶系统而言是HRP/GOx/Inv)或多核心酶纳米胶囊(分别为HRP/GOx双核心酶纳米胶囊和HRP/GOx/Inv三核心酶纳米胶囊)存在下，通过各种浓度的底物(对于双酶系统而言是葡萄糖且对于三酶系统而言是蔗糖)，用ODS的氧化速率来确定各系统的转换速率。游离酶系统和多核心纳米胶囊中的酶的浓度与比率两者均精确相同。所有测定都在100mM磷酸盐缓冲液(pH=7.0)中进行b和c。双酶系统b与三酶系统c在各种浓度的PEG3000磷酸盐缓冲液(50mM，pH=7.0)中的活性比较。d.[模型]。e和f.游离酶系统和多核心酶纳米胶囊在65℃下的热去活(e.HRP/GOx，f.HRP/GOx/Inv)。
图12.a.在尿酸(1.2mg/mL，所有图片中的黑色晶体)、PBS(10μL，用于对照实验，i)单独尿酸酶(10μL，0.0013mg/mL，ii)尿酸酶和催化酶(总计10μL，UOx0.0013mg/mL，Cat0.0026mg/mL，iii)以及尿酸酶-催化酶双核心纳米胶囊(10μL，UOx0.0013mg/mL，Cat0.0026mg/mL，iv)存在下，在37℃下孵育2.5h的HeLa细胞的光学显微术影像。b.单独尿酸酶、游离尿酸酶和催化酶以及尿酸酶-催化酶双核心纳米胶囊的相对转换速率。通过尿酸氧化来测定转换速率。各系统中的所有尿酸酶浓度都相同，且游离UOx/Cat系统和UOx/Cat双核心纳米胶囊中的催化酶浓度也相同。c.由蛋白酶(胰蛋白酶)对游离UOx/Cat系统(黑色)和UOx/Cat双核心纳米胶囊(红色)的去活。d.仅有UOx的系统、游离UOx/Cat系统和UOx/Cat双核心纳米胶囊的细胞毒性。
具体实施方式
在描述组合物和方法之前，应了解本发明不限于所述特定方法、方案、细胞系、测定和试剂，因为这些可变化。也应了解本文所用的术语意图描述本发明的特定实施方案，且决不意图限制如随附权利要求书中所述的本发明的范围。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管在实施或测试本发明中可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现将描述优选方法、装置和材料。本文引用的所有技术和专利出版物均以引用的方式整体并入本文。本文中没有内容应解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公开。
当术语“约”置于数值指示之前时，所述数值指示变化(+)或(-)10%、5%或1%。当“约”在例如以mg计的某一数量之前使用时，其指示重量值可变化(+)或(-)10%、5%或1%。
定义
根据本发明且如本文所用，除非另外明确陈述，否则以下术语是用以下含义加以定义。
除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个提及物。举例而言，术语“细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“包含”意图意味组合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素。“主要由…组成”在用于定义组合物和方法时将意味排除具有为组合所必需的任何意义的其它要素。举例而言，主要由如本文定义的要素组成的组合物将不排除不会实质上影响所要求的发明的基本和新型特征的其它要素。“由…组成”将意味排除超过痕量的其它成分和所述实质性方法步骤。由这些过渡术语的各者定义的实施方案在本发明的范围内。
如本文所用，术语“纳米复合物”是指在至少一维中的尺寸在一纳米与数百纳米之间的结构。在一些实施方案中，其是指含有任选与聚合物连接的有限数目的化学和/或生物分子的结构。
如本文所用，术语“空间约束”是指如酶的粒子相对于如聚合物网状物的另一对象在空间上定位相对受限。在一些实施方案中，其是指两个或更多个粒子相对于彼此具有大致上固定位置。
如本文所用，术语“聚合网状物”或者“聚合网状结构”是指互相连接在彼此内和/或之间以形成网或网状结构的一种或多种聚合物。在一些实施方案中，聚合网状物在一个或多个位置处锚定于一个或多个粒子。
如本文所用，术语“协同”是指两种或更多种酶以协调方式起作用。一个实例是两种或更多种酶形成酶复合物，或者同时与同一底物反应以执行其活性。在另一实施方案中，一种酶首先与底物反应，从而产生产物，所述产物又是与另一酶反应的底物。
如本文所用，术语“代谢路径”是指发生在细胞内的一系列化学反应。在各路径中，通过一系列化学反应来使主要化学品改性。代谢路径的清单可从例如KEGG路径数据库(在www.genome.jp/kegg/pathway.html处可用)公开获得。此外，如本文所用，术语“代谢物”是指代谢的中间体和产物。术语代谢物通常局限于小分子。代谢物具有各种功能，包括燃料、结构、信号传导、对酶的刺激和抑制作用、其从身的催化活性(通常作为酶的辅因子)、防御以及与其它有机物(例如色素、气味剂和信息素)相互作用。初级代谢物直接涉及于正常生长、发育和繁殖中。醇为利用工业微生物学大规模生产的初级代谢物的一实例。次生代谢物不直接涉及于那些过程中，但通常具有重要生态学功能。实例包括抗生素和色素，如树脂和萜烯等。一些抗生素使用初级代谢物作为前体，所述抗生素如从初级代谢物色氨酸产生的放线菌素。
多酶纳米复合物
本公开提供显示催化效率增强及稳定性增加，且同时在必要时可降低释放可对环境有毒的中间体的多酶纳米复合物或酶纳米复合物(EN)。
本文公开的本发明具有许多实施方案。本发明的实施方案包括含有至少两种不同酶和聚合物网状物的纳米复合物。通常，聚合物网状物锚定于至少一种酶。所述多酶复合物使得酶能够协同执行其活性。如实验性实施例中所证明，这些酶复合物(称为“酶纳米复合物(EN)”)展现催化效率增强以及稳定性增加。同时，这些酶复合物可被设计来分解特定化合物，例如在体内环境中可具有毒性的那些化合物(例如过氧化氢)。在一些实施方案中，酶的活性催化级联反应。此外，复合物的功能可通过简单化学方法来编程。
本发明的实施方案包括一种包含至少两种不同酶和聚合网状物的多酶纳米复合物。通常，聚合物网状物锚定于至少两种不同酶的至少一种。在一个实施方案中，聚合网状物锚定于全部至少两种不同酶。在其它实施方案中，纳米复合物中的不同酶例如通过互补多核苷酸链锚定在一起。
在本发明的说明性实施方案中，至少两种不同酶彼此共价或非共价连接。一方面，共价键联在体内可降解。另一方面，至少两种不同酶不彼此连接。在一个实施方案中，聚合网状物包含主要由至少一种单体单元组成的聚合物。在另一实施方案中，聚合网状物包含主要由至少两种不同单体单元组成的聚合物。在一些实施方案中，聚合网状物进一步包含交联剂。
本发明的实施方案包括一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物包含至少两种不同酶和可渗透外壳，所述外壳包含锚定于至少两种不同酶的至少一种的聚合网状物。在另一实施方案中，本公开进一步提供一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物主要由聚合网状物和至少两种不同酶组成，所述聚合网状物共价锚定于所述至少两种不同酶的至少一种且提供围绕所述至少两种不同酶的可渗透外壳。
本发明的相关实施方案包括一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物包含至少两种不同酶和锚定于所述至少两种不同酶的至少一种的聚合网状物，其中所述聚合物网状物包含交联剂。在某些实施方案中，交联剂是可降解交联剂。任选地，交联剂是包括N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、1,4-双(丙烯酰基)哌嗪、乙二醇二丙烯酸酯、N,N'-(1,2-二羟基-亚乙基)双丙烯酰胺或聚(乙二醇)二丙烯酸酯的可降解交联剂。在某些实施方案中，交联剂是非可降解交联剂。任选地，交联剂是包含N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、甘油二甲基丙烯酸酯、双[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]磷酸酯或双丙烯酰基化多肽的非可降解交联剂。
本发明的另一实施方案是包括以被设计来促进某些酶促反应的方式组合在一起的要素和构造(例如要素的特定三维构象)的多酶纳米复合物系统。示例性实施方案包括多酶纳米复合物系统，所述系统包含在与第一底物的第一酶促反应中产生第一产物的第一酶、在第二酶促反应中与所述第一产物反应的第二酶、和被配置来形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外壳的聚合网状物。通常在所述系统中，聚合网状物展现足以允许第一底物从外壳外部的外部环境扩散至第一酶以便产生第一产物的渗透性。在所述系统中，聚合网状物也可展现足以允许第一产物扩散离开第一酶且到达第二酶以便发生第二酶促反应的渗透性。在常见系统实施方案中，第一酶偶合于第二酶，或聚合网状物偶合于第一酶的多肽或第二酶的多肽。
本文公开的系统的说明性工作实施方案包括在与第一底物的第一酶促反应中产生过氧化氢的第一酶、在第二酶促反应中使过氧化氢转化成水(H2O)和/或氧气(O2)的第二酶、和被配置来形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外壳的聚合网状物。在所述系统实施方案中，聚合网状物展现足以允许第一底物(例如乙醇)从外壳外部的外部环境扩散至第一酶以便产生过氧化氢的渗透性。这个实施方案中的聚合物网状物被设计来进一步展现足以允许过氧化氢扩散离开第一酶且到达第二酶以便产生水的渗透性。在本发明的某些实施方案中，第一酶偶合(偶联)于第二酶。在本发明的一些实施方案中，聚合网状物偶合于第一酶的多肽或第二酶的多肽。
在本发明的典型系统中，聚合网状物以当多酶纳米复合物安置于体内环境中时足以抑制第一酶或第二酶降解的方式囊封第一酶和第二酶。在常见实施方案中，任选例如通过使用化学连接子或系链(tether)来使第一酶和第二酶偶合在一起。在本文公开的本发明的某些工作实施方案中，第一酶和第二酶通过互补多核苷酸链偶合在一起。
广泛多种酶可用于本发明的各种实施方案中。在本文公开的一个工作实施方案中，第一酶是醇氧化酶；且第二酶是催化酶。在本文公开的另一工作实施方案中，第一酶是葡萄糖氧化酶；且第二酶是辣根过氧化酶。本发明的某些实施方案包括囊封在聚合网状物内的第三酶(例如醛脱氢酶、醇脱氢酶等)。
如上所指示，广泛多种酶可用于本发明的各种实施方案中。本发明的某些实施方案可包括可催化过氧化氢分解成水和/或氧气的催化酶。催化酶也可通过过氧化氢催化各种代谢物和毒素的氧化，所述代谢物和毒素包括甲醛、甲酸、酚、乙醛和醇。催化酶通常根据以下反应来进行此举：
H2O2+H2R→2H2O+R
可用于本发明的实施方案中的许多催化酶多肽在本领域中是熟知的；例如源于以下的催化酶多肽：人红细胞(例如SIGMA-ALDRICH产品编号C3556)、牛肝(例如SIGMA-ALDRICH产品编号C1345)、野牛肝(例如SIGMA-ALDRICH产品编号C9447)、黑曲霉(Aspergillus niger)(例如SIGMA-ALDRICH产品编号C3515)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)(例如SIGMA-ALDRICH产品编号02071)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)(例如SIGMA-ALDRICH产品编号60634)等。
本发明的某些实施方案可包括过氧化酶。过氧化酶(EC编号1.11.1.x)是通常催化以下形式的反应的酶：
ROOR'+电子供体(2e-)+2H+→ROH+R'OH
对于这些酶中的许多酶，最优底物是过氧化氢，但其它酶对如脂质过氧化物的有机氢过氧化物更具活性。过氧化酶可在其活性位点中含有血红素辅因子或者氧化还原活性半胱氨酸或硒代半胱氨酸残基。可用于本发明的实施方案中的许多过氧化酶多肽在本领域中是已知的；例如源于辣根的过氧化酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号P8375)、源于人红细胞的谷胱甘肽过氧化酶(例如SIGMA-ALDRICH产品编号G4013)等。
本发明的某些实施方案可包括醇氧化酶。典型醇氧化酶(EC1.1.3.13)催化化学反应：
伯醇+O2→醛+H2O2
在这个说明中，这个酶的两种底物是伯醇和O2，且其两种产物是醛和H2O2。可用于本发明的实施方案中的许多醇氧化酶多肽在本领域中是已知的；例如源于以下的那些：酵母(例如SIGMA-ALDRICH产品编号A6941)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)(例如SIGMA-ALDRICH目录编号A0438)、巴斯德毕赤酵母(Pichea pastoris)(例如MP BIOMEDICALS目录编号：190155)等。
本发明的某些实施方案可包括醛氧化酶。典型醛氧化酶例如通过在氧气和水存在下催化醛转化成酸和过氧化氢来自醛产生羧酸：
醛+H2O+O2<=>羧酸根+H2O2+H+
可用于本发明的实施方案中的许多醛氧化酶多肽在本领域中是已知的；例如人重组多肽(例如CYPEX产品编号CYP150、LABOME产品编号TP319221)等。
本发明的某些实施方案可包括葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶是催化葡萄糖氧化成过氧化氢和D-葡萄糖酸-δ-内酯的氧化还原酶。可用于本发明的实施方案中的许多葡萄糖氧化酶多肽在本领域中是已知的；例如源于以下的那些：黑曲霉(例如SIGMA-ALDRICH产品编号G7141)、树状指孢霉(Dactyliumdendroides)(例如SIGMA-ALDRICH产品编号G7907)等。
本发明的某些实施方案可包括例如催化蔗糖水解的转化酶。可用于本发明的实施方案中的许多转化酶多肽在本领域中是已知的；例如从如酵母的生物体纯化的转化酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号14504)等。
本发明的某些实施方案可包括尿酸氧化酶。尿酸氧化酶或尿酸酶(EC1.7.3.3)是一种催化尿酸酶促氧化成水溶性更大的尿囊素(allantoin)的过氧化物酶体肝酶。尿酸氧化酶是一种见于大多数哺乳动物中但不见于人中的内源性酶。尿酸氧化酶在人中用于控制患有急性肿瘤溶解综合征的患者在接受化学疗法之后的血清尿酸增加。拉布立酶(Rasburicase)(SR29142)作为一种在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的重组尿酸氧化酶已在处于急性肿瘤溶解综合征的风险下的儿科和成人患者的随机化试验中被证明在控制尿酸方面优于别嘌呤醇。此外，尿酸氧化酶用于治疗痛风。可用于本发明的实施方案中的许多尿酸氧化酶多肽在本领域中是已知的；例如重组形式(例如拉布立酶)以及源于以下的形式：黄曲霉(Aspergillus flavus)(例如PROSPECBIO产品编号ENZ-312)、酵母(例如WORTHINGTON BIOCHEMICAL产品编号LS003857)等。
本发明的某些实施方案可包括如乙醛脱氢酶的醛脱氢酶。乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)是催化乙醛转化成乙酸的脱氢酶。乙醛氧化成乙酸可如下加以概述：
CH3CHO+NAD++CoA→乙酰基-CoA+NADH+H+
在人中，存在许多编码这个酶活性的基因，包括ALDH1A1、ALDH2和ALDH1B1(也称为ALDH5)。这些酶是更大类别的醛脱氢酶的成员。这个类型的酶的CAS编号是[9028-91-5]。本发明的某些实施方案可包括例如催化醛氧化(脱氢)的醛脱氢酶。可用于本发明的实施方案中的许多醛脱氢酶多肽在本领域中是已知的；例如重组人醛脱氢酶多肽(例如R&D SYSTEMS产品编号5869-DH)以及从如酵母的生物体纯化的醛脱氢酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号A6338)等。
本发明的某些实施方案可包括例如在还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+至NADH)下促进醇与醛或酮之间相互转化的醇脱氢酶。可用于本发明的实施方案中的许多醇脱氢酶多肽在本领域中是已知的；例如纯化人醇脱氢酶多肽(例如ARP AMERICAN RESEARCH PRODUCTS INC.产品编号01-1746)、重组人醇脱氢酶多肽(例如MYBIOSOURCE目录编号MBS203604)以及源于以下的醇脱氢酶多肽：马科动物肝(例如SIGMA-ALDRICH产品编号05646)、酿酒酵母(例如SIGMA-ALDRICH产品编号A7011)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)(例如SIGMA-ALDRICH产品编号75449)等。
本发明的某些实施方案可包括例如催化甲酸盐氧化成碳酸氢盐的甲酸脱氢酶。可用于本发明的实施方案中的许多甲酸脱氢酶多肽在本领域中是已知的；例如重组多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号75274)以及从如酵母的生物体纯化的甲酸脱氢酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号F8649)等。
本发明的某些实施方案可包括例如以产生磷酸基团和游离葡萄糖的方式水解葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖-6-磷酸酶。可用于本发明的实施方案中的许多葡萄糖-6-磷酸酶多肽在本领域中是已知的；例如从兔肝纯化的葡萄糖-6-磷酸酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号G5758)等。
本发明的某些实施方案可包括葡萄糖苷酶，例如适用于使糖原降解成葡萄糖者(例如酸性麦芽糖酶)。可用于本发明的实施方案中的许多α-葡萄糖苷酶多肽在本领域中是已知的；例如重组人α-葡萄糖苷酶α(例如NOVUSBIOLOGICALS产品编号H00023193-P01)以及从如酵母的生物体纯化的葡萄糖苷酶多肽(例如SIGMA-ALDRICH产品编号G0660)等。
本发明的某些实施方案可包括糖原分支酶，例如适用于使葡萄糖转化成糖原者。可用于本发明的实施方案中的许多糖原分支酶多肽在本领域中是已知的；例如重组人α-葡萄糖苷酶α(例如NOVUS BIOLOGICALS产品编号H0002632-P01)以及从如大肠杆菌的生物体纯化的葡萄糖苷酶多肽(例如PROZOMIX产品编号PRO-E0406)等。
本发明的某些实施方案可包括辅酶A脱氢酶，例如适用于催化脂肪酸β-氧化的各循环中的步骤者。可用于本发明的实施方案中的许多辅酶A脱氢酶多肽在本领域中是已知的；例如重组人辅酶A脱氢酶多肽(例如MYBIOSOURCE目录编号MBS142535)等。
本发明的某些实施方案可包括有机阳离子/肉毒碱(camitine)转运体，例如适用作有机阳离子转运体和/或钠依赖性高亲和力肉碱转运体者。可用于本发明的实施方案中的许多OCTN2多肽在本领域中是已知的；例如重组人OCTN2(例如NOVUS BIOLOGICALS SLC22A5重组蛋白质产品编号H00006584-P01)等。
除以上公开的说明性酶之外，由已知基因(例如本文公开和GENBANK、UniProtKB/Swiss-Prot等中所列的那些)编码的大量多肽的任一种都可易于通过可商购重组蛋白质服务(如由GENSCRIPT提供的那些服务)来制备。
在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物或系统实施方案配置在包括容器和使用多酶纳米复合物系统的说明书的试剂盒中。任选在所述试剂盒中，系统与一种或多种适合用于经口施用的制剂中的填充剂、粘合剂或缓冲剂组合。在本发明的一些实施方案中，系统与一种或多种适合用于胃肠外施用的制剂中的填充剂、粘合剂或缓冲剂组合。
本发明的实施方案包括制品和/或试剂盒，例如含有适用于体内分解如过氧化氢的某些化合物的物质的那些制品和/或试剂盒。任选地，制品和/或试剂盒可含有适用于治疗如急性醇中毒的病理学病状的物质。在本发明的典型实施方案中，试剂盒包括至少一个通常具有标签的容器。适合容器包括例如泡罩包装、瓶、小瓶和试管。容器可由如金属(例如金属箔)、玻璃或塑料的多种材料形成。在本发明的一些实施方案中，一个或多个容器容纳一种或多种具有有效用于成像技术中的活性剂的组合物。在本发明的某些实施方案中，一个或多个容器容纳一种或多种具有有效治疗如急性醇中毒的病理学病状的活性药剂的组合物。通常，一个或多个容器上的标签指示一种或多种组合物用于治疗某一病理学病状。所述标签也可指示供体内或体外使用的用法，如本文所述的那些用法。本发明的试剂盒也可包括上述一个或多个容器和包括缓冲剂的另一容器。试剂盒可进一步包括从商业及使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
在本发明的某些实施方案中，本文公开的组合物或酶纳米复合物系统被配制成被设计来改善或治疗如醇毒性的病理学病状的药剂。举例而言，在本发明的某些实施方案中，本文公开的组合物或酶纳米复合物系统被配制成被设计来预防如醇毒性的病理学病状的药剂。药剂可通过通常用于施用药剂的常规途径施用，所述途径包括但不限于经口、肠胃外(包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、关节内和髓内)、腹膜内、经粘膜(包括经鼻)、经皮、经直肠和表面(包括经皮肤、经颊、舌下和眼内)途径。静脉内递送可通过团式注射或通过输注来进行；输注可历经小于1分钟至数小时至连续的范围内的时期进行。在某些实施方案中，治疗过程将涉及通过各途径的组合来进行施药。
药剂可通过静脉内途径与经口途径的组合来施用以治疗疼痛或另一病症。在一个实施方案中，“装载”剂量可静脉内(IV)施用以使药物浓度达到所要治疗含量，随后通过经口途径施用一个或多个维持剂量来维持所述治疗含量。药剂可以多种形式以药物组合物形式施用，所述多种形式包括但不限于液体、粉末、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、喷雾剂和气雾剂。药物组合物可包括各种药学上可接受的添加剂，包括但不限于载体、赋形剂、粘合剂、稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、稀释剂和/或补充剂。适合赋形剂和载体的实例例如描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Mack Pub.Co.;第17版New Jersey(2011)中。在一些实施方案中，药剂可以糖水溶液形式通过IV输注施用。药剂也可与促进药剂递送的另一物质缔合。举例而言，药剂可被缔合入脂质体中。脂质体又可与如IgGFc受体的靶向物质缀合。
适于经口施用的本文公开的化合物的制剂可提供为如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂的离散单位；粉末或颗粒；在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分也可提供为丸剂(bolus)，药糖剂(electuary)或糊剂。可经口使用的医药制剂包括片剂、由明胶制得的推-合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制得的密封软胶囊。可任选与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制来制备片剂。压制片剂可通过在适合机器中压制任选与粘合剂、惰性稀释剂、或润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的，呈自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分来制备。模制片剂可通过在适合机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物来制备。片剂可以任选被包覆或刻痕(scored)且可被配制以提供其中活性成分的缓慢或控制释放。所有经口施用的制剂都应具有适合所述施用的剂量。推-合胶囊可含有活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可溶解或混悬于适合液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可添加稳定剂。提供具有适合包衣的糖衣片核。为此，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适合有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣片包衣中添加染料或色素以鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可配制用于通过注射(例如通过团式注射或连续输注)进行肠胃外施用的化合物。用于注射的制剂可与添加的防腐剂一起以单位剂型例如提供在安瓿中或在多剂量容器中。组合物可采用如于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂的形式，且可含有配制剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。制剂可提供于单剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和小瓶中，且可以粉末形式或以冷冻干燥(冻干)状态储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载体，例如生理盐水或无菌无热原水。即时注射溶液及混悬液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
用于肠胃外施用的制剂包括活性化合物的水性和非水性(油性)无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；及水性和非水性无菌混悬液，其可包括混悬剂和增稠剂。适合亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂质体。水性注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬液也可含有适合稳定剂或增加化合物溶解性以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
填充剂或稀释剂的实例不加限制地包括乳糖、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、可压制糖、微晶纤维素(MCC)、粉末状纤维素、玉米淀粉、预胶凝淀粉、葡萄糖结合剂、葡聚糖、糊精、右旋糖、麦芽糖糊精、碳酸钙、磷酸氢钙、磷酸钙、硫酸钙、碳酸镁、氧化镁、泊洛沙姆(poloxamer)(诸如聚氧化乙烯)及羟丙基甲基纤维素。填充剂可具有复合溶剂分子，如在所用乳糖为乳糖单水合物的情况下。可适合与本文组合物的实施方案一起使用的崩解剂不加限制地包括淀粉乙醇酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、交联聚维酮(聚乙烯聚吡咯烷酮)、甲基纤维素、微晶纤维素、粉末状纤维素、低取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶凝淀粉和海藻酸钠。待用于本文组合物中的片剂粘合剂不加限制地包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆(carbomer)、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶(guar gum)、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、共聚维酮、甲基纤维素、液体葡萄糖、麦芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、预胶凝淀粉、海藻酸钠、淀粉、蔗糖、黃蓍和玉米蛋白(zein)。
添加如酸、碱或缓冲剂的pH调节剂也可是有益的，此会延缓或增强组合物的溶解速率，或者有助于提高组合物的化学稳定性。此外，考虑到所述制剂的类型，本文提供的制剂可包括本领域中的其它常规试剂。适合制剂依赖于所选施药途径。当适合时且如本领域中所了解，可使用任何熟知技术、载体和赋形剂；例如Remington(上文)中的技术、载体和赋形剂。药物组合物可以自身已知的方式制造，例如借助于常规混合、溶解、粒化、糖衣片制备、磨细、乳化、囊封、包埋或压制过程。
如由本发明的工作实施方案所示，紧密邻近构造赋予EN以显著增强的催化效率。这由蔗糖和葡萄糖的由转化酶(Inv)、葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化酶(HRP)介导的连续反应所证明。通过GOx介导的反应，直接添加在反应介质中或由Inv介导的蔗糖水解产生的葡萄糖被氧化，从而导致产生H2O2。产生的H2O2接着进一步通过HRP介导的反应使邻联茴香胺(o-dianisidine)氧化。本发明的构造的独特性不仅在纳米复合物内的多种酶能够在空间上彼此限定方面，而且在所述空间限定协同地(协同地（synergistically）)而非拮抗地起作用方面。
如实施例1中所示，n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)的转换速率(邻联茴香胺氧化速率)相较于其具有相同酶含量的天然酶混合物的转换速率分别提高5和15倍，从而确认催化效率增强。如本公开整篇所用，酶纳米复合物(EN)表示为n(酶)，其中括号内的酶是指纳米复合物的核心内的酶。举例而言，n(Cat)是指含有催化酶(Cat)的EN且n(HRP-GOx-Inv)是指含有辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和转化酶(Inv)的EN。
此外，在作为模拟细胞或血流内的粘稠环境的条件的35wt-%聚乙二醇(PEG，Mw约3000)存在下，相较于相应酶混合物，n(HRP-GOx)实现转换速率增加34倍。类似地，n(HRP-GOx-Inv)显示在PEG溶液中的相对转换速率增强多达24倍。
此外，也已观察到EN中的酶的稳定性显著增强。如图2e中所示，在65℃下孵育60分钟之后，n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)分别保留70%和75%的残余酶活性。在相同条件下，游离酶损失其活性超过98%。
更进一步，EN释放的中间体小于游离酶混合物。在GOx和Cat的情况下，中间体包括具有毒性且可对器官和组织造成损害的H2O2。实施例1中的体外数据显示单独GOx在与细胞一起孵育时，由于由GOx介导的葡萄糖氧化产生的H2O2而导致细胞活力损失90%。当与Cat一起共孵育时，损失降低至58%。然而，在n(GOx-Cat)存在下，所述损失显著降低至9%。也在体内观察到由皮肤损害量度的类似结果。
实施例1中也显示含有醇氧化酶(AOx)和催化酶(Cat)的酶纳米复合物n(AOx-Cat)以及所述纳米复合物作为醇解毒剂的潜力。体外实验与体内实验两者均显示n(AOx-Cat)代谢醇和减轻醇诱导的肝损害，同时使毒性副产物H2O2的释放最小的显著作用。因此，实验数据明确显示本公开的酶纳米复合物(EN)实现催化效率增强和稳定性增加，且同时在必要时可降低可对环境有毒的如H2O2的中间体的释放。因此，本公开的一个实施方案提供一种纳米复合物，所述纳米复合物包含两种或更多种包括第一酶和第二酶的酶以及锚定于所述酶的至少一种、或者至少两者或三者或四者或五者或全部的聚合网状物，其中所述酶在空间上由所述聚合网状物约束且各酶协同地与底物反应。
在一个实施方案中，协同地与底物反应意图意味酶以协调方式直接或间接与底物反应。一方面，酶依序与底物反应。在这个方面，第一酶可首先与底物反应，使其转化成一种或多种产物，如使底物与另一分子整合且使其降解成一个以上分子。第二酶接着与一种或多种产物反应。换句话说，在一个实施方案中，第一酶的产物是第二酶的底物。
或者，第一酶和第二酶可同时与底物反应。本领域中熟知的是酶可形成复合物且通过复合物执行其功能。在一些情况下，酶可仍然充当基团而不形成物理复合物，如酶和其辅因子。另一实例是许多酶同时与如DNA和RNA的核酸相互作用以实现复制、转录或翻译，而彼此不具有直接物理或功能关系。就本公开而言，涵盖所有这些酶组合。
在任何以上公开内容中，纳米复合物进一步包括第三酶、第四酶和/或第五酶等。各额外酶可执行与纳米复合物中的另一酶的连续反应，或同时与另一酶一起起作用。
在一些实施方案中，纳米复合物中的两种或更多种酶属于代谢路径。代谢路径在本领域中是已知的且在本文中进一步加以描述。代谢路径的非限制性实例包括糖酵解/葡糖异生路径、柠檬酸循环(tca循环)路径、戊糖磷酸路径、戊糖和葡糖醛酸相互转化路径、果糖和甘露糖代谢路径、半乳糖代谢路径、抗坏血酸和醛糖二酸代谢路径、淀粉和蔗糖代谢路径、氨基糖和核苷酸糖代谢路径、丙酮酸代谢路径、乙醛酸和二羧酸代谢路径、丙酸代谢路径、丁酸代谢路径、c5分支二元酸代谢路径、肌醇磷酸代谢路径、氧化磷酸化路径、光合路径、光合-触角蛋白质路径、光合生物体路径中的碳固定、原核生物路径中的碳固定路径、甲烷代谢路径、氮代谢路径、硫代谢路径、脂肪酸生物合成路径、脂肪酸延伸路径、脂肪酸代谢路径、酮体合成和降解路径、角质、软木脂和蜡生物合成新！路径、类固醇生物合成路径、初级胆汁酸生物合成路径、次级胆汁酸生物合成路径、类固醇激素生物合成路径、甘油脂质代谢路径、甘油磷酸脂质代谢路径、醚脂质代谢路径、鞘脂代谢路径、花生四烯酸代谢路径、亚麻油酸代谢路径、α-次亚麻油酸代谢路径和不饱和脂肪酸生物合成路径。
代谢路径的其它非限制性实例包括嘌呤代谢路径、嘧啶代谢路径、丙氨酸、天冬氨酸和合氨酸代谢路径、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢路径、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢路径、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解路径、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成路径、赖氨酸生物合成路径、赖氨酸降解路径、精氨酸和脯氨酸代谢路径、组氨酸代谢路径、酪氨酸代谢路径、苯丙氨酸代谢路径、色氨酸代谢路径、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成路径、β-丙氨酸代谢路径、牛磺酸和亚牛磺酸代谢路径、膦酸和亚膦酸代谢路径、硒基化合物代谢路径、氰基氨基酸代谢路径、D-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢路径、D-精氨酸和d-鸟氨酸代谢路径、D-丙氨酸代谢路径和谷胱甘肽代谢路径。
代谢路径的其它非限制性实例包括n-聚糖生物合成路径、各种类型的n-聚糖生物合成路径、粘蛋白型o-聚糖生物合成路径、其它类型的o-聚糖生物合成路径、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素路径、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素路径、糖胺聚糖生物合成-硫酸角质素路径、糖胺聚糖降解路径、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚蛋白生物合成路径、糖鞘脂生物合成-乳糖和新乳糖系列路径、糖鞘脂生物合成-红细胞系列路径、糖鞘脂生物合成-神经节系列路径、脂多糖生物合成路径、肽聚糖生物合成路径、其它聚糖降解路径、硫胺代谢路径、核黄素代谢路径、维生素B6代谢路径、烟碱酸和烟碱酰胺代谢路径、泛酸和CoA生物合成路径、生物素代谢路径、硫辛酸代谢路径、叶酸生物合成路径、通过叶酸路径产生的一碳池、视黄醇代谢路径、卟啉和叶绿素代谢路径、以及泛醌和其它类萜-醌生物合成路径。
此外，代谢路径的其它非限制性实例包括类萜骨架生物合成路径、类单萜生物合成路径、类倍半萜生物合成路径、类二萜生物合成路径、类胡萝卜素生物合成路径、油菜素类固醇(brassinosteroid)生物合成路径、昆虫激素生物合成路径、玉米素生物合成路径、柠檬烯和蒎烯降解路径、香叶醇(geraniol)降解路径、I型聚酮结构路径、12、14和16元大环内酯路径、安沙霉素(ansamycin)生物合成路径、II型聚酮骨架生物合成路径、II型聚酮产物生物合成路径、四环素生物合成路径、聚酮糖单位生物合成路径、非核糖体肽结构路径、铁载体群组非核糖体肽生物合成路径、万古霉素群组抗生素生物合成路径、类苯丙烷生物合成路径、类芪(stilbenoid)、类二芳基庚烷(diarylheptanoid)和姜醇生物合成路径、类黄酮生物合成路径、黄酮和黄酮醇生物合成路径、花青素生物合成路径、异类黄酮生物合成路径、吲哚生物碱生物合成路径、异喹啉生物碱生物合成路径、莨菪烷(tropane)、哌啶和吡啶生物碱生物合成路径、吖啶酮生物碱生物合成路径、咖啡碱代谢路径、甜菜红碱(betalain)生物合成路径、葡糖异硫氰酸生物合成路径、类苯并噁嗪生物合成路径、青霉素和头孢菌素生物合成路径、β-内酰胺抗性路径、链霉素生物合成路径、丁酰苷菌素和新霉素生物合成路径、棒酸(clavulanic acid)生物合成路径、嘌呤霉素(puromycin)生物合成路径和新生霉素生物合成路径。
此为，代谢路径的其它非限制性实例包括苯甲酸降解路径、氨基苯甲酸降解路径、氟苯甲酸降解路径、氯烷和氯烯降解路径、氯环己烷和氯苯降解路径、甲苯降解路径、二甲苯降解路径、硝基甲苯降解路径、乙苯降解路径、苯乙烯降解路径、莠去津(atrazine)降解路径、己内酰胺降解路径、DDT降解路径、双酚降解路径、二氧杂环己烯降解路径、萘降解路径、多环芳烃降解路径、通过细胞色素P450实现的生物异源物质代谢路径以及药物代谢-细胞色素P450路径。
代谢路径也可包括MAPK信号传导路径、MAPK信号传导路径-苍蝇路径、MAPK信号传导路径-酵母路径、ErbB信号传导路径、wnt信号传导路径、notch信号传导路径、刺猬信号传导路径、TGF-β信号传导路径、VEGF信号传导路径、Jak-STAT信号传导路径、钙信号传导路径、磷脂酰肌醇信号传导系统路径、mTOR信号传导路径、植物激素信号转导路径、造血细胞谱系路径、补体和凝血级联路径、toll样受体信号传导路径、NOD样受体信号传导路径、RIG-I样受体信号传导路径、细胞溶质DNA感觉路径、天然杀伤细胞介导的细胞毒性路径、抗原加工和递呈路径、T细胞受体信号传导路径、B细胞受体信号传导路径、FcεRI信号传导路径、FcγR介导的吞噬路径、白细胞经内皮迁移路径、用于产生IgA的肠免疫网络路径以及趋化因子信号传导路径。
在一特定实施方案中，两种或更多种酶包括辣根过氧化酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx)。在另一实施方案中，两种或更多种酶包括辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和转化酶(Inv)。在另一实施方案中，两种或更多种酶包括葡萄糖氧化酶(GOx)和催化酶(Cat)。在另一实施方案中，两种或更多种酶包括醇氧化酶(AOx)和催化酶(Cat)。
在一些实施方案中，如沿纳米复合物的最长轴所测量，纳米复合物的长度是约5nm至约2000nm。尺寸可视纳米复合物中的酶的尺寸和数目以及聚合物网状物的特征而变化。在一些实施方案中，纳米复合物的长度是至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、250nm、300nm、400nm或500nm。在某一实施方案中，纳米复合物的长度仅为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、250nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm1500nm或2000nm。
视复合物中的酶的尺寸、形状和数目而定，纳米复合物可具有任何形状。在一个实施方案中，纳米复合物是大致上圆形。在另一实施方案中，纳米复合物是大致上卵形、球形、圆柱样或金字塔样。
在一些实施方案中，聚合物网状物在总计至少1、2、3、4、5、7、10、15或20个位置处锚定于酶。在一个实施方案中，聚合物网状物锚定于至少两种酶。在一个实施方案中，聚合物网状物至少在2或3或4或6个位置处锚定于各酶。意图不需要纳米复合物中的每种酶都与聚合物网状物锚定以有效约束纳米复合物中的酶。举例而言，对于三种或更多种酶，当其中两者与聚合物网状物锚定时，其它酶可借助于其相对于所锚定酶的位置加以约束。所述特定约束可通过(但并不要求)酶之间的键结来增强。也意图聚合物网状物可仅锚定于纳米复合物中的一种酶且仍然借助于其它酶与锚定于聚合物网状物者的缔合实现对纳米复合物中的酶的空间约束。在一个实施方案中，聚合物网状物锚定于纳米复合物中的每种酶。
聚合物网状物可通过任何力，如但不限于共价键、氢键、离子力、疏水性键合和范德华(Van der Wall)力来锚定于酶。在某些实施方案中，锚定中涉及多种力。在一些实施方案中，并非所有锚定位置都采用相同类型的力。
出于锚定聚合物网状物的目的，在一个实施方案中，纳米复合物中的两种或更多种酶具有多个可聚合基团。可聚合基团是在某些化学条件下聚合的化学部分。聚合条件的实例包括光聚合、自由基聚合和催化剂诱导的聚合。一般而言，可聚合基团的类型并不关键，只要可聚合基团能够与用于形成纳米复合物的单体聚合即可。可聚合基团的实例包括通过光聚合或自由基聚合加以聚合的含双键部分。在一些实施方案中，可聚合基团是乙烯基、丙烯酰基、烷基丙烯酰基(即具有烷基取代基的丙烯酰基，如甲基丙烯酰基)。如本文所用，丙烯酰基(烷基丙烯酰基、甲基丙烯酰基等)包括丙烯酰基叔酯以及丙烯酰基酰胺。在一些实施方案中，可聚合基团是共价键结于酶的赖氨酸残基的丙烯酰基。
酶可含有可易于修饰的许多不同表面氨基酸。举例而言，赖氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸和色氨酸可易于使用已知方法和程序进行修饰。用于修饰蛋白质的试剂将具有至少一个可聚合基团和至少一个与蛋白质表面上的氨基酸侧链反应的反应性基团。用于与氨基酸侧链反应的反应性基团的实例包括与含有胺(如赖氨酸)和羟基(如苏氨酸或丝氨酸)的残基反应的活化酯(如酰卤或N-羟基丁二酰亚胺酯)；与含有硫醇(如半胱氨酸)的残基反应的顺丁烯二酰亚胺；以及当用某些偶合试剂活化时与含有羧酸(如谷氨酸和天冬氨酸)的残基反应的胺。以这个方式，可聚合基团共价键结于单一酶。可聚合基团可直接键结或通过连接子连接。
离子键可用于由于存在某些氨基酸的正电荷或负电荷而在一或多种酶上锚定聚合物网状物，所述氨基酸如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和赖氨酸以及被修饰以具有电荷的氨基酸。
在一些实施方案中，连接子存在于酶与可聚合基团之间。连接子是分隔可聚合基团和酶的化学部分。用作连接子的试剂将具有由连接子分隔的至少一个可聚合基团和至少一个反应性基团。反应性基团通常通过与蛋白质表面上的氨基酸侧链反应，从而使可聚合基团共价键结于单一酶(在它们之间具有连接子)来与酶反应。
在一些实施方案中，连接子可为可降解的。可降解连接子是在某些条件下裂解的化学部分。举例而言，可降解连接子可例如在某些pH值(高pH或低pH)下水解，或可被光解(即当用某些波长的光照射时)、或在某些温度下、在氧化还原条件下或以酶促方式(即通过蛋白酶)裂解。可使用任何适合可降解连接子，只要连接子具有与酶反应的反应性基团和形成纳米复合物的可聚合基团即可。可降解连接子也应在纳米复合物聚合期间稳定。可基于连接子将被裂解所处的条件选择连接子的类型。众多连接子是已知的，且将易于为一般技术人员显而易知。
这些纳米复合物中的酶比呈其天然非复合形式的酶更稳定。测定就酶活性随时间损失或酶降解或变性而言的稳定性。在一些实施方案中，纳米复合物对由蛋白酶进行的降解具有抗性。聚合物网状物使酶对蛋白酶的暴露降低。因此，在蛋白酶(例如在体内、在血清中或在细胞中)存在下，酶活性比未保护的天然酶持续更久。聚合物网状物使酶结构稳定，且防止酶聚集。因此，纳米复合物对pH和温度变化更具有抗性。举例而言，在室温或低温(即冷藏或冷冻)下，纳米复合物比天然酶具有更长储存寿命。同样，在多个冷冻/解冻循环之后，纳米复合物损失活性的可能性小于天然酶。因为酶的结构由聚合物网状物加以稳定，所以纳米复合物对有机溶剂和表面活化剂更具有抗性。
也可调整聚合物网状物以增加在有机溶剂中的溶解性。可与纳米复合物一起使用的有机溶剂和表面活化剂的实例包括尤其广泛用于化妆品(即化妆)和医药中的甲醇、乙醇、异丙醇、二甲亚砜、四氢呋喃、4-二氯苯、对二氯苯、1,4-二恶烷、1,4-二恶烷PEG、聚乙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、十二烷基硫酸钠或人参醇(oxynol)、聚山梨醇酯60、2-溴代-2-硝基丙烷-1,3-二醇、2-丁氧基-1-乙醇、烷基苯氧基、聚乙氧基乙醇。其它有机溶剂将为本领域一般技术人员显而易知。因为聚合物网状物防止聚集，所以纳米复合物在未保护的酶倾向于聚集所处的界面(即气体/液体或液体/固体)处更稳定。
在一些实施方案中，纳米复合物是两种或更多种与单体单元共聚合的酶。单体单元是与单一酶聚合且形成共聚物，从而形成纳米复合物的聚合物网状物的化学部分。在一些实施方案中，当酶携带具有双键的可聚合基团，如乙烯基、丙烯酰基、烷基丙烯酰基或甲基丙烯酰基时，单体单元也具有具有双键的可聚合基团，如乙烯基、丙烯酰基、丙烯酰胺基、烷基丙烯酰基、烷基丙烯酰胺基、甲基丙烯酰基或甲基丙烯酰胺基。酶的可聚合基团与单体单元的可聚合基团可相同或不同，只要其能够在用于形成纳米复合物的条件下形成共聚物即可。举例而言，乙烯基和丙烯酰基可在自由基聚合条件下形成共聚物。
在一些实施方案中，纳米复合物是两种或更多种与两种或更多种不同单体单元共聚合的酶。一般而言，许多不同单体单元可用于与酶形成共聚物，只要不同单体单元都能够在用于形成纳米复合物的条件下形成共聚物即可。具有不同侧链的单体单元可用于改变纳米复合物的表面特征。可通过调整不同单体单元之间的比率来控制表面特征。在一些实施方案中，单体可为中性、不带电荷、亲水性、疏水性、带正电荷或带负电荷的。在一些实施方案中，聚合物网状物总体上是中性、不带电荷、亲水性、疏水性、带正电荷或带负电荷的。可例如通过改变带电荷和不带电荷、或亲水性或疏水性单体单元之间的比率来调整纳米复合物的溶解性。在一些实施方案中，纳米复合物具有正电荷或负电荷。
在一些实施方案中，至少一种单体单元在生理pH(约7.4)下具有正电荷或负电荷。通过使用在pH=7.4下具有电荷的单体单元，可通过改变带电荷和不带电荷单体单元的比率来改变及调整纳米复合物的总体电荷。在一些实施方案中，单体单元在pH=7.4下具有正电荷。使用带正电荷单体单元使得能够形成具有正电荷的纳米复合物。可通过改变中性和带正电荷单体单元的比率来调整电荷。
在一些实施方案中，聚合物网状物进一步包括至少交联剂。交联剂是具有两个或更多个可聚合基团的化合物。一般而言，可使用任何交联化合物，只要交联剂上的可聚合基团能够在用于形成纳米复合物的条件下在酶与至少一种单体单元之间形成交联共聚物即可。交联剂的实例包括具有两个乙烯基、丙烯酰基、烷基丙烯酰基或甲基丙烯酰基的化合物。具有两个丙烯酰基的特定交联剂的实例包括N,N'-亚甲基双丙烯酰胺和甘油二甲基丙烯酸酯。
在一些实施方案中，交联剂是可降解交联剂。可降解交联剂在某些条件下裂解，从而导致纳米复合物的至少一部分聚合物网状物分解或除去。举例而言，可降解交联剂可在某一pH(高或低)下水解，可由特定酶(如酯酶或肽酶)裂解，可在暴露于某些波长后光解裂解，或在某些温度下裂解。在降低的pH下水解的交联剂的实例包括甘油二甲基丙烯酸酯，其在生理pH(约7.4)下稳定，但在较低pH(约5.5)下水解。可降解交联剂的其它实例包括US7,056,901中所述的缩醛交联剂，所述专利以引用的方式整体并入本文。
可降解交联基团的其它特定实例包括N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、1,4-双(丙烯酰基)哌嗪、乙二醇二丙烯酸酯、N,N'-(1,2-二羟基-亚乙基)双丙烯酰胺和聚(乙二醇)二丙烯酸酯。非可降解交联基团的其它实例包括N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、甘油二甲基丙烯酸酯、双[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]磷酸酯和双丙烯酰基化多肽。
在一些实施方案中，聚合物网状物是可渗透的。如本文所用，可渗透意味分子(例如乙醇)可通过聚合物网状物中的孔或洞或通过扩散穿过聚合物基质来穿过聚合物网状物。举例而言，底物、辅因子和其它化学要素可穿过聚合物网状物，从而允许纳米复合物保留内部酶活性。在本发明的一些实施方案中，聚合物基质是由所选成分和/或在被设计来产生具有影响化合物扩散穿过聚合物基质的特定渗透选择性性质的基质的所选条件下形成。
可降解交联剂可除去或减小聚合物网状物的密度且因此允许如辅因子和底物的各种对象穿过。举例而言，在降低的pH下分解的可降解交联剂可用于在纳米复合物通过胞吞作用内化至细胞中之后除去或减少聚合物涂层。熟知的是血清和晚期内体分别具有pH值7.4和5.5。因此，在pH7.4下稳定，但在pH5.5下降解的可降解交联剂将仅在纳米复合物已进入细胞中之后除去或减少聚合物涂层。以这个方式，酶被保护免遭血清中存在的蛋白酶，但底物较大的酶可仍然有效递送至细胞中。在减少聚合物涂层之后，酶活性仍然存在。然而，在减少聚合物涂层之后，酶变得易受由细胞内蛋白酶进行的降解，但这个缺点由纳米复合物在血清中的稳定性和对血清蛋白酶的抗性增加所抵消。
在某些实施方案中，纳米复合物进一步包括表面改性物。表面改性物是在形成纳米复合物之后添加至纳米复合物的表面中的化学部分。具有反应性侧链(或保护的反应性侧链)的单体单元可用于形成纳米复合物，只要反应性侧链不干扰形成纳米复合物即可。反应性侧链可(必要时在脱保护之后)与表面改性剂反应以使表面改性物共价连接于纳米复合物。表面改性剂可为小分子、聚合物、肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、多糖或抗体。表面改性物可改变纳米复合物的溶解性，改变纳米复合物的表面电荷，或对纳米复合物赋予额外功能，如发光、细胞靶向或细胞渗透。当相较于非靶细胞时，增强细胞靶向的表面改性物导致纳米复合物向靶细胞中的转导增加。当相较于缺乏细胞渗透增强剂的纳米复合物时，增强细胞渗透的表面改性物导致纳米复合物向细胞中的转导增加。一种以上表面改性物可存在于纳米复合物上。小分子表面改性物的实例包括发光化合物(如荧光素或若丹明(rhodamine))或细胞靶向化合物(如叶酸)。聚合物包括用以增加溶解性的聚乙二醇。肽可用于细胞靶向，所述肽如针对特定细胞表面特征的抗体、细胞信号传导蛋白质或生长激素。其它肽可用于增加纳米粒子(如TAT或触角同源结构域(antennepediahomeodomain))的细胞渗透。在一些实施方案中，表面改性物是抗体。
制备多酶纳米复合物的方法
本公开的多酶纳米复合物可通过首先形成多酶核心且接着在所述核心周围锚定聚合物网状物来制备。
1.制备多酶核心
临时多酶核心的制备方法说明于图1中且描述于实施例1中。所述示例性程序的其它细节可见于实施例2中。
在示例性方法中，在第一步骤时，合成DNA-抑制剂骨架。如图1中所说明，分别使各酶的竞争性抑制剂缀合于具有设计序列的单链DNA(ssDNA)；互补装配DNA分子形成连接有三种抑制剂的DNA-抑制剂骨架(参见例如Feldkamp等人,Angew Chem Int Edit45,1856-1876,(2006))。
ssDNA与抑制剂的缀合可用本领域中已知的方法实现。举例而言，缀合可发生在ssDNA的5’磷酸或5’胺C6T基团处(参见例如实施例1章节3.1中的说明)。
一旦制备ssDNA-抑制剂，DNA-抑制剂骨架即可由于ssDNA上的互补序列而自我装配。图5a说明两种ssDNA-抑制剂分子的装配。因此，两种ssDNA彼此共有互补序列。
在图5b中，在另一方面，四种ssDNA序列可将3或4种抑制剂装配在骨架上。在那里，ssDNA-I具有互补于ssDNA-II的片段的序列，所述ssDNA-II的片段又具有互补于ssDNA-III的片段的序列，所述ssDNA-III的片段又具有互补于ssDNA-IV的片段的序列，所述ssDNA-IV的片段又具有互补于ssDNA-I的片段的序列。
图5b中说明的设计策略可易于应用于通过将互补序列包括至ssDNA分子中来形成5种或6种或更多种ssDNA-抑制剂骨架。
一旦合成多抑制剂骨架，即可接着使酶结合于相应抑制剂以形成酶-抑制剂-ssDNA核心。
熟练技术人员易于了解的是可用本领域中已知的其它方法制备多酶核心。举例而言，一或多种抑制剂可被酶底物、配体或甚至识别酶的抗体取代。在另一方面，ssDNA可被锚定抑制剂、底物或抗体的聚合物置换。
因此，在一个实施方案中，也提供一种包含锚定于多种配体的聚合骨架的纳米复合物，所述配体由多种酶识别，所述酶协同地与底物反应。如本文所用的“配体”广泛意图涵盖特异性识别酶或由酶识别或结合酶的任何分子。一方面，聚合骨架是核酸，如ssDNA。因此，所述聚合骨架适用于制备多酶纳米复合物。
在另一实施方案中，聚合骨架进一步包括相应酶。
2.制备多酶纳米复合物
一旦制备多酶核心，即可接着将聚合物网状物施加于核心。聚合物网状物可共价或通过本文所述的其它力锚定于两种或更多种酶，从而用至少一种可聚合基团衍生酶；且接着使衍生化蛋白质与单体单元共聚合。
示例性两步程序可用于在酶周围形成聚合物网状物。首先，使可聚合基团连接于酶表面。接着随后官能性单体和任选交联剂在缓冲溶液中聚合使两种或更多种酶覆盖以聚合物外壳。
一旦可聚合基团连接于酶表面，即可使用单体来形成具有可调组成、结构、表面性质和官能性的聚合物涂层。室温自由基聚合技术可用于确保保留酶活性。因为这些聚合物涂层充当囊封的酶的人工膜，所以其展现适合机械强度以提供结构完整性，具有允许底物快速转运的有效转运路径，且含有特定官能性以提供底物选择性和水分保留。
纳米复合物不改变如上所指示可直接从商业来源或使用其它报道方法(例如重组方法，如由GENSCRIPT提供的那些方法)获得的酶的功能。
用于衍生或修饰酶的试剂具有以下一般性结构，其中可聚合基团是在用于形成纳米复合物的条件下与一种或多种单体和/或交联剂形成共聚物的化学部分。在一些实施方案中，可聚合基团是含双键基团，如乙烯基、丙烯酰基、烷基丙烯酰基和甲基丙烯酰基。如先前所论述，丙烯酰基(以及烷基丙烯酰基和甲基丙烯酰基)包括丙烯酰基酯与丙烯酰胺两者。
连接基团是任选的且可存在于可聚合基团与蛋白质之间。连接基团是使反应性基团与可聚合基团分开的化学部分。连接基团不限于任何特定化学结构，但不应干扰聚合反应。在一些实施方案中，连接基团是在某些条件下裂解的可降解连接基团。举例而言，缩醛、缩酮或酯可在某些pH下水解。具有这些官能团的一种或多者的连接基团可反应于pH变化(例如内体中的pH变化)而分解。
反应性基团是与氨基酸侧链反应以使可聚合基团共价连接于蛋白质的化学部分。众多反应性基团是已知的且用于与不同氨基酸侧链反应。举例而言，酰卤或活化酯(如N-羟基丁二酰亚胺酯)与胺(例如赖氨酸上的胺)或羟基(例如丝氨酸或苏氨酸上的羟基)反应。异氰酸酯与胺反应。环氧化物与胺或硫醇(例如半胱氨酸)反应。顺丁烯二酰亚胺与硫醇反应。其它官能团可在一种或多种偶合试剂(如碳化二亚胺试剂)存在下与氨基酸侧链反应。举例而言，胺可与羧酸氨基酸侧链(例如谷氨酸或天冬氨酸上的羧酸氨基酸侧链)反应。其它反应性基团将易于为本领域一般技术人员显而易知。
在以上提及的蛋白质修饰期间，为实现位点特异性控制修饰，遗传重组技术可用于在空间上限定位置中引入特定氨基酸。这个技术允许准确控制修饰的位点和密度。
用于衍生蛋白质的特定化合物的实例在本领域中是已知的，参见例如PCT申请公开号WO2010/104865，其内容以引用的方式併入本公开中。此外，这个PCT申请也公开在聚合过程期间使蛋白质丙烯酸化以及一般性制备蛋白质纳米复合物的详细方法。
在一些实施方案中，单体单元具有侧链和可聚合基团，其中可聚合基团是在用于形成纳米复合物的条件下与酶和任选交联剂形成共聚物的化学部分。可聚合基团包括先前论述的所有那些可聚合基团。酶的可聚合基团与单体单元的可聚合基团可相同或不同，只要其能够在用于形成纳米复合物的条件下形成共聚物即可。举例而言，乙烯基和丙烯酰基可在自由基聚合条件下形成共聚物。
侧链是单体单元的不参与聚合的部分。一般而言，侧链可具有任何结构，且可基于纳米复合物的所需性质加以选择。单体单元的侧链影响纳米复合物的表面性质。在一些实施方案中，侧链可为中性、中性亲水性(即水溶性但不带电荷)、疏水性、带正电荷或带负电荷的。中性侧链包括酰胺、酯、醚、羟基，其中一些视其结构而定可为亲水性或疏水性的。带正电荷侧链包括胺(包括取代的胺(如单烷基胺和二烃基胺)和四取代的铵化合物及其环状变体)、胍和杂环，如吡啶和咪唑。带负电荷侧链包括羧酸。疏水性侧链包括烷基(包括直链、支链或环状烷基)和芳基。
特定单体单元及其官能度的实例包括丙烯酰胺(中性，1)、丙烯酸2-羟乙酯(中性，1)、N-异丙基丙烯酰胺(中性，2)、丙烯酸钠(带负电荷，3)、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠(带负电荷，3)、烯丙胺(带正电荷，4)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(带正电荷，4，5)、二甲基氨基甲基丙烯酸乙酯(带正电荷，5)、(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵盐酸盐(带正电荷，5)、丙烯酸甲酯(疏水性，6)和苯乙烯(疏水性6)。括号中的数字是指官能度：1至5：亲水性表面和水分保留；2)对温度敏感；3)带负电荷表面；4)用于表面改性的反应性侧链，5)正电荷表面，6)疏水性表面。
可使用适于蛋白质和单体单元上所用的可聚合基团且在聚合期间不破坏蛋白质功能的任何方法来聚合修饰的酶和单体单元。聚合方法的实例包括含双键可聚合基团(如先前所述的那些)的光聚合和自由基聚合。在一些实施方案中，聚合是自由基聚合。
在一些实施方案中，在室温下进行聚合，但视聚合方法而定，温度可根据需要增加或降低，只要蛋白质功能在聚合期间不损失即可。当使用可降解交联剂或连接基团时，可在聚合物涂层降解之后测量纳米粒子的功能。当聚合反应发生太缓慢时或当需要高温引发聚合时，可增加反应温度。当聚合反应发生太快速时，可降低温度。
在一些实施方案中，在水或水性缓冲液中进行聚合反应。可根据需要使用其它溶剂，只要溶剂不干扰聚合反应或使蛋白质降解即可。必要时也可使用水或水性缓冲液和有机共溶剂的混合物以溶解反应组分，只要溶剂混合物不干扰反应或损害酶即可。在一些实施方案中，在缓冲液中进行聚合反应。
在一些实施方案中，共聚步骤包括至少两种不同单体单元。一般而言，许多不同单体单元可用于与酶形成共聚物，只要不同单体单元都能够在用于形成纳米复合物的条件下形成共聚物即可。具有不同侧链的单体单元可用于改变纳米复合物的表面特征。可通过调整不同单体单元之间的比率来控制表面特征。在一些实施方案中，单体可为中性、中性亲水性、疏水性、带正电荷或带负电荷的。可通过改变带电荷和不带电荷、或亲水性或疏水性单体单元之间的比率来调整纳米复合物的溶解性。
在一些实施方案中，共聚步骤进一步包括交联剂。交联剂是具有至少两个由连接基团分隔的可聚合基团的试剂。交联剂可具有两个以上可聚合基团。交联剂上的可聚合基团可相同或不同，只要交联剂上的所有可聚合基团都能够在用于形成纳米复合物的条件下与单体单元和酶形成共聚物即可。具有两个可聚合基团的交联剂具有以下一般性结构：其中可聚合基团与先前所述的那些可聚合基团相同。连接基团可具有任何结构，只要其不干扰聚合反应即可。适合连接子的实例包括烷基(包括取代的烷基)、芳基(包括取代的芳基)、酮、酰胺、酯、醚及其组合。交联剂的特定实例包括N,N'-亚甲基双丙烯酰胺和甘油二甲基丙烯酸酯以及如上所述的其它交联剂。
在一些实施方案中，连接基团是可降解的。可降解连接基团可在某些条件下裂解。可降解连接基团的结构决定为裂解连接基团所需的条件的类型。举例而言，连接基团可由于pH变化(即增加或降低)、暴露于某些光波长或反应于加热而裂解。可降解交联剂的一实例是甘油二甲基丙烯酸酯。
在一些实施方案中，产生纳米复合物的方法进一步包括将纳米复合物的表面改性的步骤。在聚合之后，单体单元的侧链存在于纳米复合物的表面上。具有反应性侧链(或保护的反应性侧链)的单体单元可用于制备纳米复合物。反应性侧链不干扰聚合，但可在纳米复合物形成之后(即在聚合完成之后)经受进一步化学改性。保护的反应性侧链可使用标准化学脱保护方法来脱保护，接着与化学改性剂反应。反应性侧链用化学试剂处理以使表面改性剂共价连接于纳米复合物的表面。表面改性物可为小分子、聚合物、肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、多糖或抗体。表面改性物可改变纳米复合物的溶解性(例如通过添加聚乙二醇或其它亲水性基团)，改变纳米复合物的表面电荷(例如通过添加带电荷的表面改性剂)，或对纳米复合物赋予额外功能，如发光、细胞靶向或细胞渗透。小分子表面改性物的实例包括发光化合物(如荧光素或若丹明)或细胞靶向化合物(如叶酸)。聚合物包括用以增加溶解性的聚乙二醇。肽和多肽可用于细胞靶向，且可包括对特定细胞表面特征具有选择性的抗体、细胞信号传导肽或激素。其它肽可用于增加纳米粒子(如TAT或触角同源结构域)的细胞渗透。在一些实施方案中，表面改性物是抗体。因为纳米复合物具有易于衍生的表面，所以可使特定抗体与纳米复合物缀合，从而提供额外靶向递送能力。
可通过改变用于形成纳米复合物的不同单体和/或交联剂的重量比来调整纳米复合物的尺寸和表面特征。举例而言，将DMAEMA(带正电荷)与AAm(中性)的重量比从0:1调谐至1:3和1:1允许合成ζ电势可从-12.8mV分别调整至8.64直至15.2mV的BSA纳米复合物。溶解性也可易于通过改变单体单元和交联剂的类型和比率来调整。增加亲水性或带电荷单体的量会增加水溶性。增加疏水性单体的量倾向于增加纳米复合物在有机溶剂或混合有机/水溶剂系统中的溶解性。
可通过改变用于制备纳米复合物的反应混合物中的交联剂的比率来调整聚合物网状物的渗透性。一般而言，较低量的交联剂导致渗透性较高。同样，可通过改变交联剂上的连接基团的长度来改变聚合物网状物的渗透性。通常，较长连接基团导致渗透性增加。
在多酶核心锚定于聚合物网状物之后，可除去ssDNA-抑制剂骨架或用于暂时维持核心的目的的任何其它种类的骨架。可利用使抑制剂从酶解离的条件或试剂来进行骨架除去，只要所述条件或试剂不破坏聚合物网状物锚定在酶处即可。所述条件和试剂的实例提供于实施例中且易于由熟练技术人员认识到。
用途
本文所述的酶纳米复合物可用于以协调方式在效率增加、稳定性增加和中间体产生降低下执行一系列酶促功能。如果一种或多种中间体具有毒性，那么酶纳米复合物也降低或消除毒性中间体的释放。酶纳米复合物的特定用途取决于什么酶封闭在复合物中。
此外，酶纳米复合物也可用于在体外或在体内以提高的稳定性和/或长期作用将酶递送至细胞中。因为纳米复合物对由蛋白酶进行的降解更具有抗性，所以蛋白质活性比当施用天然或未保护的蛋白质时具有更长久作用。因此，达成相同作用(当相较于未保护的蛋白质时)所需的酶(呈纳米复合物形式)较少，由此提高效率。
本发明的实施方案包括一种通过使细胞暴露于有效浓度的上述纳米复合物来递送酶的方法。细胞可处于培养物中(即体外)或可存在于活生物体中(即体内)。
在一些实施方案中，至少一种酶是治疗性酶。治疗性酶是可用于治疗受试者的疾病或病症的酶。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物或人。
本文所述的纳米复合物可与可用于治疗受试者的疾病或病症的酶一起使用。举例而言，本发明的纳米复合物可用于治疗过度增生性病症、癌症或肿瘤。在其它实施方案中，纳米复合物可用于化妆品中。
此外，因为所述酶纳米复合物在高温和酸性及碱性条件下比其孤立形式更稳定，所以所述酶纳米复合物必定显示极大改进的用途。
药物组合物
本文论述的纳米复合物可配制成用于诊断或治疗性治疗方法中的各种组合物。组合物(例如药物组合物)可以试剂盒形式组装。通常，本发明的药物组合物包含有效量(例如药物有效量)的本发明组合物。
本发明的组合物可配制成药物组合物，所述药物组合物包含本发明的组合物和药学上可接受的载体。就“药学上可接受的载体”而言，其意味不为在生物学上或另外不合需要的物质，即所述物质可向受试者施用而不引起任何不合需要生物作用或以有害方式与含有其的药物组合物的任何其它组分相互作用。载体将天然地加以选择以使活性成分的任何降解最小且使受试者中的如将为本领域技术人员所熟知的任何不良副作用最小。对于药学上可接受的载体和药物组合物的其它组分的论述，参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,1990。一些适合医药载体将为熟练工作者所显而易知且包括例如水(包括无菌水和/或去离子水)、适合缓冲液(如PBS)、生理食盐水、细胞培养基(如DMEM)、人工脑脊髓液等。除本发明的组合物之外，本发明的药物组合物或试剂盒也可含有其它医药。其它药剂可在治疗患者期间在任何适合时间下同时或依序施用。
本领域技术人员将了解特定制剂将部分地取决于所采用的特定药剂和所选施药途径。因此，存在本发明的组合物的广泛多种适合制剂。
本领域技术人员将了解可基于所探讨的特定应用选择、改适或开发适合或适当制剂。本发明的组合物的剂量可呈单位剂型。如本文所用的术语“单位剂型”是指适协同为用于动物(例如人)受试者的单一剂量的物理离散单元，各单元含有单独或与其它治疗剂组合的预定量的本发明药剂以及药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物，所述预定量是以足以产生所需作用的量加以计算。
本领域技术人员可易于确定适用于所用组合物的精确配方的剂量、时程和施药方法以实现药剂在个别患者中的所需有效量或有效浓度。
向动物，在本发明的情形下特别是人施用的本发明组合物的剂量应足以历经合理时段在个体中实现至少可检测量的诊断或治疗反应。用于实现所需作用的剂量将根据多种因素确定，所述因素包括所施用的特定药剂的效能、在宿主中的与药剂相关的药力学、感染个体的疾病病况的严重性、向受试者施用的其它药物等。剂量大小也将根据可伴随采用的特定药剂或其组合物的任何不良副作用的存在来确定。只要有可能，通常合乎需要的是使不良副作用最小。生物活性物质的剂量将变化；适用于各特定药剂的量将为熟练工作者所显而易知。
本发明的另一实施方案是一种适用于本文公开的任何体外或体内方法的试剂盒。该种试剂盒可包括一种或多种本发明组合物。任选地，试剂盒包括用于执行方法的说明书。本发明试剂盒的任选组分包括适合缓冲剂、药学上可接受的载体等、容器或包装材料。试剂盒的试剂可处于试剂例如以冻干形式或稳定化液体形式于其中稳定的容器中。试剂也可呈单次使用形式，例如呈单一剂量形式。
实施例
根据上文描述，将显而易知的是可对本文所述的本发明作出变化和修改以使其适于各种用途和条件。所述实施方案也在以下权利要求书的范围内。
在对本文变量的任何定义中叙述一列要素包括将那个变量定义为任何单一要素或所列要素的组合(或亚组合)。在本文中叙述实施方案包括那个实施方案呈任何单一实施方案形式或与任何其它实施方案或其部分组合。
除非上下文另外指示，否则以单数时态列出的术语也包括复数。
提供以下公开的实施例以说明本发明而非限制其范围。本发明的其它变化形式将易于为本领域一般技术人员显而易知且由随附权利要求涵盖。本文引用的所有公开、数据库和专利(例如美国专利号6,153,217；美国专利申请公开号20090060894；2012年4月13日提交的名称为REDOX RESPONSIVEPOLYMERIC NANOCAPSULES FOR PROTEIN DELIVERY的国际申请号PCT/US2012/33515)据此出于所有目的以引用的方式并入本文。
制备、表征和使用本公开的纳米复合物的方法说明于以下实施例中。根据本领域中已知或如本文说明的程序制备起始物质。提供以下实施例以便本发明可能被更充分了解。这些实施例仅具有说明性且不应解释为以任何方式限制本发明。
实施例1：设计高度强健的具有协同功能的人工酶纳米复合物(EN)
这个实施例说明高度强健的具有协同功能的人工酶纳米复合物(EN)的一般性设计。这是通过以下方式来实现的：使具有协同或互补功能的酶或可一起协同地起作用的酶装配或缀合成纳米复合物，随后在网状聚合物胶囊内囊封所述纳米复合物。
方法
合成酶纳米复合物(EN)：通过使抑制剂缀合于具有设计序列的单链DNA(ssDNA)，随后其自发装配以形成骨架来实现DNA-抑制剂骨架的合成。简言之，混合10mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)与60μL5'-磷酸化ssDNA(5nmol/μL)，随后添加50μL酶抑制剂(0.2M)或底物衍生物(溶解于0.1M咪唑MES缓冲液中)。接着通过涡旋来彻底混合混合物。在8000rpm下离心5分钟之后，使混合物保持在室温下2小时以使完全反应。接着通过在脱盐树脂上，使用EDTA-磷酸盐缓冲液(10mM磷酸钠、0.15M NaCl、10mM EDTA，pH=7.4)进行凝胶过滤来纯化所缀合的ssDNA。接着混合互补ssDNA-抑制剂分子，在37℃下孵育10分钟，且冷却至室温以形成DNA-抑制剂骨架。
为合成n(HRP-GOx)，通过与丙烯酸N-羟基丁二酰亚胺酯(NAS)在20mM碳酸钠缓冲液(pH=8.5)中反应2小时来用丙烯酰基锚定GOx和HRP。在相对于磷酸盐缓冲液(20mM，pH=7.0)透析之后，混合丙烯酰氧基化HRP、丙烯酰氧基化GOx和DNA-抑制剂骨架(1.5:1.5:1，n/n/n)且保持在室温下20分钟以形成酶-骨架复合物。接着使用丙烯酰胺(与所有酶的重量比4:1)作为单体、双甲基丙烯酰胺(与丙烯酰胺的重量比1:6)作为交联剂、以及过硫酸铵/四甲基乙二胺作为引发剂，通过就地聚合囊封复合物。囊封复合物首先通过相对于PBS透析纯化，接着加热至37℃持续10分钟且进一步使用尺寸排阻色谱(琼脂糖6B)进行纯化。使用类似方法进行n(HRP-GOx-Inv)、n(GOx-Cat)、n(AOx-Cat)、n(Cat)、n(AOx)、n(GOx)和其它酶纳米复合物的合成且细节提供于实施例2中。实施例2中也提供对EN的详细表征，包括动态光散射(DLS)、透射电子显微术(TEM)、荧光显微成像和光谱、细胞活力测定、毒性和其它相关信息。
体内研究：通过在用乙醇、天然酶和酶纳米胶囊处理之后，监测小鼠的血液酒精浓度(BAC)和血浆丙氨酸转氨酶(ALT)含量的变化来实现对醇解毒剂的体内研究。使用四组酶纳米胶囊，包括n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)与n(Cat)的混合物、以及具有相同酶含量的n(AOx-Cat)。天然AOx用于比较。来自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)的8-10周龄的雄性C57B6小鼠用于研究。使小鼠禁食8-12小时，随后用含有酶纳米胶囊和天然AOx或纳米胶囊(在65μg AOx/动物下给药)的含酒精液体饮食(AIN76A，Dyets Inc.，在6gEtOH/kg体重(w/w)下给药)管饲。对于小鼠对照组，通过管饲喂送无EtOH等热量饮食。在酒精管饲之后45、90、180和360分钟从尾部获取血液样本。使用乙醇测定试剂盒(BioVision)测定酒精喂送动物的BAC。通过使用仅用250μL PBS缓冲液管饲的对照小鼠来减去本底BAC。在酒精管饲之后6至8小时通过遵循Ji等人,Gastroenterology124:1488-99(2003)中所述的方法来测定小鼠血浆中的ALT值。所有动物都根据由当地委员会核准的实验室动物护理和使用指南加以处理。
使用雄性小鼠(C57B6)对n(GOx-Cat)的体内解毒能力进行测量。使用与甲苯噻嗪(10mg/kg)组合的氯胺酮(85mg/kg)使小鼠麻醉，所述麻醉剂是肌肉内注射至后股中。接着使用动物刮刀除去动物背部上的毛发。n(GOx)、n(Cat)和n(GOx-Cat)通过分别在0和24小时进行的2次皮肤注射以每组每次注射分散于50μl PBS缓冲液中的35μg纳米复合物的剂量递送至皮肤中。在相同动物的背部的不同位点处注射等体积的过氧化氢(H2O2)溶液(3%w/v)和PBS缓冲液分别作为阳性对照和阴性对照。在第二次注射之后24小时使动物麻醉；接着对皮肤组织碎片取样、固定且加工以进行H&E染色和使用来自Roche的就地细胞死亡检测试剂盒进行荧光TUNEL染色。用Nikon EclipseE600显微镜捕捉H&E影像且根据Ji等人,Hepatology40:442-51(2004)用Nikon PCM2000共焦激光扫描显微镜获得共焦荧光影像。
结果
如图1中所说明，分别使各酶的竞争性抑制剂缀合于具有设计序列的单链DNA；互补装配DNA分子形成连接有三种抑制剂的DNA-抑制剂骨架；抑制剂和酶的特异性结合构建三酶纳米复合物(步骤I)。
随后就地聚合使得围绕各纳米复合物生成网状聚合物薄层，从而导致形成含有三酶核心和可渗透外壳的纳米复合物(步骤II)。最后，除去DNA-抑制剂骨架产生表示为n(酶)的高度强健的EN，其中括号内的酶是指纳米复合物的核心内的酶(步骤III)。重要的是指出将酶囊封在纳米复合物内会有效使其稳定对抗非生理环境和蛋白酶攻击，此外所形成的纳米复合物可易于被官能化以获得所需表面性质和靶向能力(参见例如Yan等人,Nat Nanotechnol5,48-53,(2010))。
说明使用辣根过氧化酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx)作为模型酶成功构建EN构造。图2a显示平均直径为30±7nm的n(HRP-GOx)的透射电子显微(TEM)影像，所述平均直径由动态光散射(DLS)测量结果确认(图6)。为确认双酶构造，每个HRP和GOx分子在EN构建之前用单一1.4nm金纳米粒子标记。如图2b中所示，大多数金标记EN含有两个金纳米粒子，指示各EN实际上含有一个HRP和一个GOx分子，从而说明抑制剂与酶之间的特异性结合。
所述纳米复合物构造在空间上限定组成酶处于紧密邻近内。使用若丹明-B标记的HRP(HRP-RhB)和荧光素-异硫氰酸酯标记的GOx(GOx-FITC)作为一实例，图2c比较其混合物(等摩尔比)和具有相同酶含量的相应双酶EN的荧光光谱。因为FITC和RhB分别在495和540nm下具有激发最大值，所以混合物在450nm激发下仅展现集中在520nm下的FITC发射。比较而言，EN展现来自FITC与RhB两者(分别集中在520nm和585nm下)的强烈发射，指示从GOx-FITC至HRP-RhB的有效福斯特共振能量转移(FRET)。这个观察结果明确确认HRP和GOx在短距离(<10nm)内紧密缔合(参见例如Selvin等人,Nat Struct Biol7,730-734,(2000))。为进一步确认紧密邻近结构，图2d显示EN的荧光显微影像，其展现GOx-FITC和HRP-RhB明确共定位。在488nm下激发后，也在相同位置处记录580nm下的FRET发射，从而进一步验证紧密邻近构造。
如所观察，所述紧密邻近构造赋予EN以显著增强的催化效率。这由蔗糖和葡萄糖的由转化酶(Inv)、GOx和HRP介导的连续反应所证明。通过GOx介导的反应，直接添加在反应介质中或由Inv介导的蔗糖水解产生的葡萄糖被氧化，从而导致产生H2O2。所产生的H2O2进一步通过HRP介导的反应使邻联茴香胺氧化，此用于探测总体酶促反应效率。
图2f比较n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)的转换速率(邻联茴香胺氧化速率)与其具有相同酶含量的天然酶混合物的转换速率。相较于天然酶混合物，n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)显示在缓冲溶液中的转换速率分别增强5和15倍，从而确认催化效率增强。为模拟细胞或血流9内的粘稠环境(参见例如Ellis等人,Trends Biochem Sci26,597-604,(2001))，添加聚乙二醇(PEG，Mw～3000)至反应介质中以增加粘度(中间体在介质内的扩散阻力)。如所预期，n(HRP-GOx)系统展现相对转换速率随PEG浓度增加而增加；在35wt-%PEG存在下实现转换速率增加34倍。类似地，n(HRP-GOx-Inv)显示在PEG溶液中的相对转换速率增强多达24倍。显著提高的化学转化速率是归因于有效地使中间体的扩散最小的紧密邻近构造。除催化效率增强之外，n(HRPGOx)和n(HRP-GOx-Inv)也展现稳定性显著增强。
图2e比较n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)与其酶混合物对应物的残余酶活性。在65℃下孵育60分钟之后，n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)保留70%和75%的其原始活性，而混合物损失超过98%的活性。
能够制备活性和稳定性显著增强的EN提供一类用于生物催化、感测、治疗和其它应用的新型酶机理。举例而言，氧化酶正被用于或提议用于许多治疗应用，如治疗痛风(参见例如Sherman等人,Adv Drug Deliver Rev60,59-68,(2008)；Schelsinger等人,Nat Rev Drug Discov10,17-18,(2011)；Sundy等人,Arthritis Rheum58,2882-2891,(2008)；和Kehrer等人,Crit Rev Toxicol23,21-48,(1993))。
仍然，氧化酶介导的反应通常产生毒性H2O2，其可对器官和组织造成损害(参见例如Kehrer等人,Crit Rev Toxicol23,21-48,(1993))。幸好这个限制可使用EN技术有效解决。用n(GOx)进行示例，由于从GOx介导的葡萄糖氧化产生的H2O2，其与细胞一起孵育导致细胞活力损失90%(图3a)。归因于催化酶介导的H2O2分解，将n(Cat)添加至培养基中有效降低细胞活力损失(58%)。惊人的是n(GOx-Cat)远胜过n(GOx)与n(Cat)的混合物(具有相同酶含量)。用n(GOx-Cat)处理的细胞显示活力类似于未处理细胞的活力(91%)。图3b显示在37℃下用CellTiter Blue处理3小时之后，与n(GOx)、n(Cat)与n(GOx)的混合物以及具有相同酶含量的n(GOx-Cat)一起培养的细胞的照片。一致的是与n(GOx-Cat)一起培养的细胞显示微红荧光色比其它细胞强烈的多，指示归因于更有效H2O2消除的较高细胞活力。在不受特定科学理论或作用机制束缚下，这个观察结果与出乎意外的现象一致，所述现象是紧密邻近酶构造不仅增强总体化学转化效率，其也促进毒性中间体的有效除去以避免潜在细胞和组织损害。
为进一步确认EN的体内解毒能力，在不同注射部位处向小鼠(C57BL/6)经皮注射n(GOx)、n(Cat)和n(GOx-Cat)。作为阳性对照和阴性对照，分别将等体积的H2O2溶液(3%w/v)和PBS媒介物注射至相同小鼠的单独皮肤部位。在注射之后48小时，在H2O2处理和n(GOx)处理的部位中观察到皮肤病变。
相反，在用PBS、n(Cat)或n(GOx-Cat)注射的位点中未观察到皮肤损害(图3c)。对于进一步毒性研究，处死小鼠且将注射部位处的皮肤组织切片并用苏木精和曙红(H&E)以及TUNEL染色试剂盒染色。清楚的是H2O2施用导致皮肤的真皮中的撕裂和膨胀；n(GOx)施用导致类似组织膨胀和嗜中性粒细胞浸润(虽然程度较小)，指示归因于产生的H2O2的病理生理学反应和损伤(图3d)。在用H2O2或n(GOx)处理的皮肤组织中，细胞细胞凋亡明显，而n(Cat)或n(GOx-Cat)处理的皮肤组织中的细胞死亡最小且与PBS处理的样本的细胞死亡类似(图3d)。
这些观察结果明确说明通过将GOx和Cat紧密邻近囊封在EN内，可有效降低与施用氧化酶相关的毒性和组织损害，此为当前氧化酶相关治疗剂带来一丝光芒。
这个技术的进一步治疗意义由具有催化酶和作为潜在醇解毒剂的醇氧化酶的EN所说明。酒精消耗是人类文明的千年组成部分；然而，酒精滥用与一系列器官损伤(例如肝损害)和社会问题(例如暴力和酒驾(DUI))相关(参见例如Lee等人,Lancet2,759-761,(1979))。醇的生物代谢过程依赖于醇脱氢酶(使乙醇转化成乙醛)和乙醛脱氢酶(使乙醛转化成乙酸)的由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)介导的连续作用(参见例如Crabb等人,P Nutr Soc63,49-63,(2004))。
然而，低细胞外NAD+浓度限制所述脱氢酶用作细胞外解毒剂(参见例如Ji等人,Hepatology40,442-451,(2004))。为绕过这个限制，我们设计了一种基于n(AOx-Cat)的新型酶促机理，其中AOx是可在使用分子氧下有效介导醇氧化成乙醛的醇氧化酶。
与其它氧化酶类似，这个氧化过程也产生毒性副产物H2O2；然而，所产生的H2O2可由在EN内邻近定位的催化酶迅速消除(参见图8中的细胞活力)。同样重要的是指出囊封在n(AOx-Cat)内的AOx与Cat两者均由聚合物外壳良好保护免遭蛋白酶攻击和非生理条件，从而使其能够多方面经口和全身施用。
图4说明基于n(AOx-Cat)的经口醇解毒剂的功效。小鼠用含酒精液体饮食连同天然AOX、n(AOX)、n(Cat)、n(AOx)与n(Cat)的等比率混合物、或n(AOx-Cat)一起管饲。在酒精施用之后，所有动物都处于酒精中毒下且在20分钟内睡去；在施用之后30分钟，食用酒精饮食的小鼠中的平均血液酒精浓度(BAC)是374±25.8mg/dL。相较于仅用酒精施用的小鼠，用n(AOx-Cat)施用的小鼠的BAC在注射之后45分钟、90分钟和3小时分别降低10.1%、31.8%和36.8%(图4a)。在这些时期期间，在用n(AOx)(<8.5%)或n(AOx)与n(Cat)的混合物(<10.6%)施用的那些小鼠中仅观察到BAC略微降低。在用n(Cat)或天然AOx施用的那些小鼠中不可检测到BAC降低；天然AOx在降低BCA方面的无效性进一步确认EN的聚合物外壳在保护核心酶复合物免遭失活方面的主要作用。在酒精管饲之后6小时，动物开始醒来；施用n(AOx-Cat)的组的醒来时间比其它组的醒来时间早1-2小时。
为探测与酒精喂送和施用EN相关的肝损伤，在处理之后7小时分析血浆丙氨酸转氨酶(ALT)。所有酒精喂送动物中的ALT都显著增加。然而，相较于其它组，施用n(AOX-Cat)的小鼠具有ALT含量较低的趋势(图4b)。也在通过尾部静脉注射的动物中获得类似BAC降低结果(图9)，从而确认可多方面施用EN。
以上研究确认开发有效降低BAC和肝损伤的醇解毒剂是可行的。n(AOX-Cat)的有效性显著高于n(AOx)以及n(AOx)与n(Cat)的混合物的有效性进一步确认约束在EN内的AOx和Cat具有协同作用。实际上，醇氧化会消耗分子氧且释放H2O2。催化酶不仅消除这些毒性H2O2分子以降低肝损害；催化酶介导的H2O2分解也使分子氧再生，所述分子氧由于紧密邻近构造而可快速反馈至AOx。
这个协同作用缓和氧气的局部耗尽，从而导致醇氧化加速以及BAC更有效降低。应注意的是除产生H2O2之外，醇氧化也产生另一毒性中间体乙醛。更有效ALT降低和完全肝损伤保护依赖于有效除去乙醛。当高度活性ADOx变得可用于构建n(AOx-ADOx-Cat)三酶纳米复合物时，预期可完全保护免遭酒精诱导的肝损伤。然而，就我们所知，这似乎是明确显示使用EN达成广泛治疗应用的巨大潜力的首个醇解毒剂。
总之，这个实施例说明通过在纳米空间内装配和稳定化多种酶达成的对强健酶构造的设计。考虑到当前可用或所添加的酶库巨大，可构造用于除治疗应用以外的广泛应用的新型类别的酶机理。更重要的是尽管审慎选择构造酶分子以及获得其协同和互补作用，但这个实施例预见可产生具有超出进化的可编程功能的酶机理的新型家族。
实施例2：用于制备和使用具有协同功能的人工酶纳米复合物(EN)的说 明性方法和材料
这个实施例提供实施例1中论述的材料、方法和结果的更多细节。
1.材料
试剂和溶剂是从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购买且除非另外指示，否则不经进一步纯化即按原样使用。HeLa细胞是从美国菌种中心(ATCC)购买。杜贝卡氏改良依格培养基(DMEM)生长培养基和青霉素/链霉素是从Invitrogen(Carlsbad,CA)获得。胎牛血清(FBS)是从Lonza WalkerrsvilleInc(Walkerrsville,MD)获得。CellTitra Blue细胞活力试剂盒是从Promega(Madison,WI)购买。用于产生酶纳米复合物的N-(3-氨基丙基)乙基丙烯酰胺盐酸盐是从Polymer Science,Inc购买。单硫代-N-羟基-丁二酰亚胺基Au纳米粒子是从NanoProbe,NY购买。包括若丹明B异硫氰酸酯和荧光素异硫氰酸酯的荧光染料是从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得。包括辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶、转化酶和催化酶的酶是从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购买。雄性C57B6小鼠是从Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)购买。酒精液体饮食AIN76A是从Dyets,Inc获得。乙醇测定试剂盒是从BioVision(Mountain View,CA)购买。H&E和荧光TUNEL染色试剂盒是从Roche购买。
用于制备酶纳米复合物的单链DNA(ssDNA)是从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购买。它们的序列提供于下表1中。
Figure BDA0000473570060000411
[Phos]代表磷酸化，[ThiC6]代表硫醇C6S-S，且[AmC6T]代表胺C6。
2.仪器
用GeneSys6光谱仪(Thermo Scientific)获得紫外可见光谱。用QuantaMaster分光荧光计(Photon Technology International)获得荧光光谱。在Zetasizer Nano仪器(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)上测量酶纳米复合物的动态光散射研究结果。在以加速电压120kV操作的Philips CM120电子显微镜上获得透射电子显微镜(TEM)影像。用Fujifilm BAS-5000板读取器测量荧光强度。用Nikon TE2000S倒置荧光显微镜获得应用和摄影的质谱。
3.制备酶纳米复合物(EN)
3.1合成DNA-抑制剂骨架
通过组合使用缀合和自装配技术来实现DNA-抑制剂骨架的合成。简言之，首先使单链DNA缀合于酶可逆抑制剂(或其底物衍生物)以得到单链DNA衍生的酶抑制剂(ssDNA抑制剂)。在缀合之后，将不同种类的ssDNA抑制剂混合在一起且加热至37℃持续10分钟。在冷却至室温之后，ssDNA-抑制剂与其互补链自装配以形成DNA-抑制剂骨架。辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)和转化酶(Inv)的ssDNA抑制剂的详细合成方案显示于以下方案中和图5中。
HRP(a)、GOx(b)和Inv(c)的ssDNA抑制剂的合成图解说明。
3.2ssDNA-抑制剂的MALDI-TOF表征
ssDNA-抑制剂的成功缀合是通过藉助于MALDI-TOF光谱监测其分子量增加来证明。超纯3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)用作以下测量的基质。未缀合ssDNA用作MALDI-TOF表征的对照。在与酶抑制剂缀合之前(黑色)和之后(灰色)的所得ssDNA光谱显示于图6中。
3.3合成n(HRP-GOx-Inv)
使用与方法部分中提及的制备n(HRP-GOx)的方法类似的方法合成n(HRP-GOx-Inv)。简言之，首先使HRP、GOx和Inv与丙烯酸N-羟基丁二酰亚胺(NAS)反应，随后通过使用透析管膜(MWCO=10kDa)，相对于磷酸盐缓冲液(20mM，pH=7.2)透析进行纯化。将丙烯酰氧基化HRP、GOx、Inv和HRP/GOx/Inv DNA抑制剂骨架(1:1:1:5，n/n/n/n)一起混合以形成HRP-GOx-Inv酶复合物，且接着通过在酶复合物表面上进行就地聚合加以囊封。在通过透析除去未反应单体之后，加热样本至37℃持续10分钟，随后穿过尺寸排阻色谱(琼脂糖-6B)以除去DNA-抑制剂骨架。
3.4合成双荧光标记的n(HRP-RhB-GOx-FITC)
通过遵循由荧光染料的制造商提供的方案制备若丹明-B标记的辣根过氧化酶(HRP-RhB)和荧光素异硫氰酸酯标记的葡萄糖氧化酶(GOx-FITC)。首先将荧光染料RhB和FITC溶解于无水DMSO中以得到10mg/mL储备溶液。接着逐渐添加50μL染料溶液至2mg酶溶液(pH=8.2，碳酸钠，100mM)中且在4℃下反应过夜。标记的酶通过凝胶渗透色谱(琼脂糖-6B)纯化。管柱用磷酸盐缓冲盐水(PBS)预平衡且用相同缓冲液洗脱蛋白质。收集、缩合且在4℃下储存第一色带以供进一步使用。根据以下消光系数测定HRP-RhB和GOx-FITC的浓度和染料/蛋白质比率(D/P)：在403nm下102,000M-1cm-1(HRP)、在280nm下44,100M-1cm-1(GOx)和在555nm下108,000M-1cm-1(RhB)、在495nm下81,000M-1cm-1(FITC)。
通过使用HRP-RhB、GOx-FITC作为酶以及HRP/GOx DNA-抑制剂骨架制备n(HRP-RhB-GOx-FITC)酶纳米复合物以形成酶复合物。其详细制备程序与以上提及的n(HRP-GOx)制备程序相同。在制备之后，通过凝胶过滤(Superdex-75)进一步纯化双重荧光标记的EN。收集、缩合且在4℃下储存在555nm下具有强烈吸光度的第一条带以进行荧光表征。
3.5合成Au-纳米粒子标记的EN
使过量Au-纳米粒子(单硫代-N-羟基-丁二酰亚胺基Au纳米粒子)分别与天然HRP和GOx(3:1，n/n，Au/酶)在1xPBS缓冲液中反应1小时。通过凝胶过滤(Superdex-75)除去过量金纳米粒子。接着基于其摩尔消光系数(纳米金，在420nm下155,000M-1cm-1；HRP，在403nm下102,000M-1cm-1；GOx，在453nm下11,200M-1cm-1)通过紫外可见光谱测定Au-纳米粒子、HRP和GOx的浓度。所得Au标记的HRP/GOx MCEN含有AuNP/HRP比率0.83和AuNP/GOx比率0.95。
Au标记的HRP和GOx接着用于通过使用制备n(HRP-GOx)的相同方案来制备双重AuNP标记的EN。在制备之后，样本通过穿过尺寸排阻色谱(琼脂糖-6B)加以纯化且收集第一色带。接着在4℃下储存样本以进行透射电子显微术(TEM)观察。
3.6合成ssDNA-醇氧化酶(ssDNA-AOx)和ssDNA-催化酶(ssDNA-Cat)缀合物
将醇氧化酶(AOx)和催化酶(Cat)分别以浓度2mg/mL溶解于50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.4，0.15M NaCl)中。首先将N-丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)储备溶液制备成2mM DMSO溶液，随后通过逐渐添加25μL SPDP溶液至1mL酶中来与酶反应。在搅拌下使反应保持在4℃下4小时。在反应完成之后，通过使用50mM磷酸钠、0.15M NaCl、10mMEDTA(pH7.2)作为洗脱缓冲液进行凝胶过滤(Superdex-75)来纯化混合物。同时，ssDNA-1’和ssDNA-2’用二硫苏糖醇(DTT)还原且即刻通过凝胶过滤(Superdex-75)进行纯化。在纯化之后，接着分别在摩尔比1.2/1(ssDNA对酶)下添加还原的ssDNA-1’和ssDNA-2’至SPD-P活化的Cat和AOx溶液中。保持混合物在4℃下反应过夜以达成完全缀合，且接着添加NAS至混合物中以使可聚合位点锚定于ssDNA-酶缀合物。样本接着通过使用透析管膜(MWCO约10kDa)，相对于1xPBS透析进行纯化以除去未缀合的ssDNA。
3.7合成n(GOx-Cat)和n(AOx-Cat)
首先使ssDNA-2-葡糖胺(GOx的ssDNA抑制剂)与等量丙烯酰氧基化ssDNA-1’缀合的Cat混合(1/1，n/n)。加热混合物至37℃持续10分钟，且接着用冰浴冷却。在恢复至室温之后，进行就地聚合以将一对GOx和Cat囊封至酶纳米复合物中。
在通过相对于1xPBS透析除去未反应单体和引发剂之后，加热样本至37℃持续10分钟且即刻穿过尺寸排阻色谱以除去GOx的ssDNA抑制剂缀合物。收集且缩合洗脱的第一条带以得到n(GOx-Cat)的储备溶液。使n(GOx-Cat)储备溶液保持在4℃下以供进一步使用。
n(AOx-Cat)的制备类似于以上提及的n(GOx-Cat)的制备。在聚合之前，以等摩尔比混合丙烯酰氧基化ssDNA-1’缀合的Cat与ssDNA-2’缀合的AOx。在聚合之后，反应混合物通过穿过尺寸排阻色谱进行纯化以除去未反应单体和其它副产物。接着缩合n(AOx-Cat)且等分成65μg/管(100μL/管)以进行体外和体内测试。应注意AOx和Cat的EN也可通过直接缀合两种酶，随后使用类似囊封技术来制备。
4.合成单酶纳米复合物
使用Yan等人,Nature Nanotechnology5:48-53(2010)中报道的方法合成GOx、AOx和Cat的单酶纳米复合物(表示为n(GOx)、n(AOx)和n(Cat))。简言之，首先通过与NAS反应使酶丙烯酰氧基化，且接着通过就地聚合用聚丙烯酰胺薄层覆盖。在通过相对于1xPBS透析除去未反应单体之后，接着通过穿过尺寸排阻色谱(琼脂糖-6B)纯化单酶纳米复合物。接着收集、缩合且在4℃下储存纳米复合物以供进一步使用。
5.EN的活性测定和稳定性
5.1活性测定
通过监测邻联茴香胺(ODS)的氧化速率来评估酶复合物n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)的活性。简言之，在25℃下孵育含有0.2mM邻联茴香胺的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH=7.0)、500pM EN和特定量的底物(针对n(HRP-GOx)是葡萄糖或针对n(HRP-GOx-Inv)是蔗糖)5分钟。
在孵育期间，用紫外可见光谱仪连续记录在460nm下读取的吸光度。相对于时间绘制吸收曲线且根据曲线的线性部分计算ΔA460/分钟。用一系列适当浓度的底物重复活性测定来得到一系列催化速率以通过莱思威佛-伯克图(Lineweaver-Burk plot)获得和
Figure BDA0000473570060000452
也用游离酶混合物(游离HRP/GOx和游离HRP/GOx/Inv)作为对照实验进行类似测定。
表2.HRP/GOx和HRP/GOx/转化酶游离酶系统以及其相应EN的动力学参数
Figure BDA0000473570060000453
也在一系列浓度(0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，m/v)的聚乙二醇(PEG，Mw约3000)溶液中进行类似活性测定以模拟细胞或血流内的粘稠环境。简言之，首先添加某一量的PEG至磷酸盐缓冲液(0.1M，pH=7.0)中以得到PEG储备溶液。接着添加酶纳米复合物(或其相应游离酶混合物)和ODS且彻底混合以得到酶浓度为500pM，且ODS浓度为0.2mM的测定溶液。接着将145μL所制备的测定溶液传送至透明96孔板中。接着添加溶解于5μL PEG溶液中的一系列不同浓度的底物至具有反应溶液的各孔中。接着将板振荡30秒且再孵育5分钟。接着用板读取器读出各样本在450nm下的吸光度。
5.2热稳定性
首先在65℃下孵育n(HRP-GOx)、n(HRP-GOx-Inv)、游离HRP/GOx混合物和游离HRP/GOx/Inv混合物的溶液持续某些时期(5-60分钟)，随后在冰浴上淬灭且恢复至室温。用这些样本进行活性测定以测定EN和其相应游离酶混合物的残余活性。
6.EN的透射电子显微术(TEM)研究
通过TEM直接检查EN的形态和结构。在于加速电压120kV下操作的Philips CM120电子显微镜上进行研究。通过将2μL n(HRP-GOx)溶液滴涂于碳涂布的铜网格上来制备TEM样本。使样本小滴与网格接触45秒，接着除去过量样本。接着冲洗网格，随后用1%磷钨酸钠在pH7.0下染色。
为于TEM中更好成像，在表征之前对AuNP进行银增强处理。简言之，首先使AuNP标记的n(HRP-GOx)溶液与TEM网格接触45秒。在用去离子水冲洗之后，使网格漂浮在一滴新鲜制备的银增强试剂(Nanoprobe,NY)上1分钟。接着再次冲洗网格，随后用1%磷钨酸钠在pH7.0下染色。这个过程导致形成内部具有3～4nm银涂布的AuNP的负染色n(HRP-GOx)。
7.EN的动态光散射(DLS)研究
用配备有10mW氦氖激光器(λ=632.8nm)和热电温度控制器的Zetasizer Nano仪器(Malvern Instruments Ltd.,UK)进行DLS实验。在90°散射角下进行测量。结果(图7)显示n(HRP-GOx)和n(HRP-GOx-Inv)的EN集中流体动力学直径分别为18±5nm和37±8nm。
8.细胞和体内测试
8.1细胞活力测定
通过细胞活力测定来测定EN、酶纳米复合物混合物和游离酶混合物的解毒能力。这个研究采用n(GOx-Cat)、n(GOx)及n(GOx)与n(Cat)的混合物作为一实例。将HeLa细胞接种至96孔板(104个细胞/孔，100μL/孔)中且在暴露于纳米粒子之前于DMEM(培养基中具有正常葡萄糖含量)中培养一天。接着添加相同量(0.7mg/mL，2μL)的n(GOx)、n(GOx)与n(Cat)的混合物、及n(GOx-Cat)至孔中且在37℃下孵育5小时。在孵育之后，添加CellTiter-Blue(20μL)至各孔中且再孵育3小时。接着在150rpm下将板置放在振荡台上5分钟以彻底混合溶液。活细胞会还原CellTiter Blue且显示荧光微红色。通过用板读取器(Ex=535nm，Em=585nm)测量荧光强度来实现对细胞活力定量。
8.2分析n(GOx-Cat)在小鼠中的解毒能力
用动物刮刀除去雄性小鼠(C57B6)(8～10周龄)背部上的毛发。n(GOx-Cat)、n(GOx)或n(Cat)通过在0和24小时进行的2次皮肤注射以每次注射35μg酶(于50μlPBS缓冲液中)递送至皮肤中。在相同动物的背部山的不同位点处注射等体积的过氧化氢(H2O2)溶液(3%w/v)和PBS缓冲液作为阳性对照和阴性对照。
直接观察且用照相机记录皮肤损害。在第一次注射之后48小时将皮肤组织切片。如先前所述2加工组织以用于H&E染色来研究组织损害。也用来自Roche的就地细胞死亡检测试剂盒进行荧光TUNEL染色以测定皮肤组织中的凋亡性细胞死亡。
8.3n(AOx-Cat)的细胞毒性
使用天然AOx、n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)与n(Cat)的混合物作为对照，通过以上提及的类似活力测定来评估n(AOx-Cat)的毒性。在暴露于纳米胶囊的前一天将HeLa细胞(104个细胞/孔，100μL/孔)接种在96孔板上。首先将纳米胶囊或天然AOx(2μg)与细胞一起孵育4小时，从混合物除去，且与新鲜培养基一起孵育。添加等量乙醇(3μL)至各孔中且接着在37℃下与细胞一起再孵育5小时。在孵育之后，添加CellTiter Blue(20μL)至各孔中且孵育3小时。接着将板置放在150rpm振荡台上5分钟以彻底混合溶液。通过用板读取器(Ex=535nm，Em=585nm)测量它们的荧光强度来定量细胞活力。
8.4醇解毒剂和肝细胞毒性的体内研究
体内研究：通过在用乙醇(EtOH)和酶基醇解毒剂处理之后，监测小鼠的血液酒精浓度(BAC)和血浆丙氨酸转氨酶(ALT)含量的变化来实现对醇解毒剂的体内研究。以经口与全身两种方式进行醇解毒剂施用。对于全身性施用，使用四组纳米胶囊，即n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)+n(Cat)混合物和n(AOx-Cat)，以及用于比较的天然AOx(未纳米胶囊化)。来自Jackson Laboratory(BarHarbor,ME)的8-10周龄的雄性C57B6小鼠用于研究。
在禁食8-12小时之后，用纳米胶囊(65μg/动物)对小鼠进行尾部静脉注射。接着在注射之后1小时用在6g EtOH/kg体重(w/w)下给药的酒精液体饮食(AIN76A，Dyets,Inc.)或等热量对照物管饲小鼠。
用针对经口施用的小鼠的相同方法(详细方法描述于实施例1中)测定小鼠的BAC和ALT。所有动物都根据由当地委员会核准的实验室动物护理和使用指南加以处理。如图9中所示，用n(AOx-Cat)注射的小鼠中的BAC和ALT显著降低，此与以经口施用获得的结果一致。
实施例3：用于加速级联酶反应的多核心酶纳米胶囊(MCEN)
发生以维持地球上所有活生物体的生命的代谢涉及数百万酶促级联化学反应。其中酶以专用方式约束在亚细胞空间和空间位置中的这些复杂过程允许生物体生长和繁殖，维持其结构且对环境作出反应。尽管大多数在代谢路径中展现精巧催化特异性和效率的酶已被充分表征和探究，但在温和条件下通过多种酶级联反应的成功生物转化实证仍然稀少，因此对化学生物学、材料和化学工程领域的科学家具有高度吸引力。然而，一个未解决的障碍是当多种酶通过传统固定化方法强烈混合或通过完整基因簇克隆一起表达而不仔细考虑其协同作用时，活性和稳定性巨大降低。在如通过细胞信号锚达成的亚细胞排列、区室化聚合物囊泡、在中孔纳米结构中的共同固定化的情况下所示的线索证明几何尺寸相关邻近、专用回转控制、准确比率锁定和稳定化是成功的关键原则。然而，缺乏均质性和质量控制的多酶系统的所有现存设计仍然是不成熟的且不实用作药品、微芯片、微小电极和机器人。我们假设通过在纳米空间中限定和面对面对接若干不同酶达成单一蛋白质层面的控制，多步反应的转换速率将显著增加，同时寿命得以充分延长。
在这里我们提供一种通过将多种催化酶整合至单一小聚合物纳米胶囊中产生的高度活性多核心酶纳米胶囊(MCEN)(如图1中所示的方案1)。首先，通过混合四种预先设计的短DNA序列来直接制造抑制剂DNA骨架，其中三种短DNA分别与三种酶抑制剂(蔗糖、葡糖胺和4-二甲基氨基安替比林)精确缀合(方案1D)。接着通过孵育转化酶、葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化酶(HRP)(方案1A、1B、1C)与其相应抑制剂DNA骨架，通过“钥-锁”自装配形成酶-抑制剂复合物。通过温和就地聚合将极薄聚合物网状物涂布在酶-抑制剂复合物上以构建多核心酶纳米胶囊(MCEN)(方案1(II))。最后，通过除去抑制剂DNA骨架获得三酶纳米胶囊(方案1(III))。MCEN中的聚合物涂层充当用于囊封的酶的人工膜。因此，所述人工膜应展现适合机械模量以提供结构完整性，具有有效转运路径以允许进行快速底物转运，且含有特定官能性以提供底物选择性。然而，我们的制备具有双核心或多核心构造的纳米胶囊的方法允许在核心蛋白质之间快速转运反应中间体，此对于级联反应而言具有特别相关性。
负染色TEM影像(图10a)显示大多数HRP-GOx双核心纳米胶囊是约30nm的圆形且内部具有两个深色点。因为HRP与GOx两者分别用单一金纳米粒子标记，我们能够推测大多数纳米胶囊内部仅具有一组HRP和GOx。荧光光谱(图10b)和荧光共焦显微术(图10c)用于研究纳米胶囊中的若丹明B标记的HRP和FITC标记的GOx的FRET(荧光共振能量转移)作用，此反映两种酶之间的空间距离。在荧光光谱上，仅存在由蓝光在450nm下激发的520nm下的FITC发射峰(图10b)，从而指示在HRP上的若丹明B与GOx上的FITC之间不存在FRET作用。相反，在双核心酶纳米胶囊溶液的荧光光谱上，存在仅由蓝光在450nm下激发的两个荧光发射峰(对于FITC而言520nm且对于若丹明B而言585nm)，从而指示存在能量从FITC转移至若丹明B。因为FRET作用仅在实际上短距离(<10nm)下发生，所以我们推断HRP和GOx被包装在一个纳米胶囊中。双核心酶纳米胶囊通过共焦显微术确认与来自荧光光谱的结论类似的结论且显示在450nm下激发的黄色(图11c-iii)，其实际上是由绿色(图11c-i)与红色(图11c-ii)所混合。因此，那些结果表明各双核心纳米胶囊内部具有实际上彼此接近的单一HRP和单一GOx。
我们在多核心酶纳米胶囊与游离酶系统之间比较活性和稳定性。在这里，HRP和GOx用作双核心酶纳米胶囊系统中的级联反应酶，而转化酶、GOx和HRP是三核心酶纳米胶囊系统中使用的酶。在游离酶组合或多核心酶纳米胶囊存在下，通过各种底物(对于双酶系统而言是葡萄糖且对于三酶系统而言是蔗糖)，用ODS的氧化速率来确定各系统的转换速率。游离酶系统和多核心纳米胶囊中的酶的摩尔浓度与比率两者均精确相同。在水性缓冲溶液中，双核心和三核心酶纳米胶囊的转换速率增强超过游离酶系统分别达到460%和1500%(图11a)。因为大多数细胞质充满高粘度流体，所以也研究粘度对多核心酶纳米胶囊的转换速率的影响，所述影响是通过不同浓度的PEG3000来模拟。当PEG3000含量增加时，游离多酶系统和多核心纳米胶囊的转换速率同时降低(图11b、11c)。但当在0%-35%PEG缓冲溶液中进行活性测定时，相较于游离双酶系统，双核心酶纳米胶囊的转换速率升高4倍至34倍。与双酶系统情况类似，当PEG浓度从0%变化至35%时，三核心酶纳米胶囊系统(转化酶、GOx和HRP)在转换速率方面超过游离三酶系统增强9倍至24倍。相较于游离双酶系统和三酶系统，双核心和三核心酶纳米胶囊也呈现针对高温的高得多的稳定性。在65oC下孵育60分钟之后，双核心和三核心纳米胶囊的残余活性分别为70%和75%。在相同条件下，游离双酶系统和三酶系统仅具有小于2%的剩余活性。
尿酸酶作为一种用于痛风疗法的高度潜在酶药物能够使用氧气来氧化尿酸且产生尿酸酯和过氧化氢。因此，尿酸酶的主要限制是在低氧区域或深部组织处的尿酸以及威胁心脏的产物过氧化氢的清除效率较低。为解决这些问题，我们构造尿酸酶和催化酶双核心纳米胶囊作为高度高效且安全的痛风治疗药物候选物。仅相较于尿酸酶，尿酸酶和催化酶双核心纳米胶囊实现尿酸降解增强400%(图12c)。MTT测定显示尿酸酶导致细胞活力降低超过75%且由于从细胞培养基除去尿酸，双核心纳米胶囊使细胞活力升高至120%(图12d)。在37OC下与胰蛋白酶一起孵育90分钟之后，双核心纳米胶囊仍然具有超过75%的剩余活性，而在与胰蛋白酶一起孵育20分钟之后，天然尿酸酶的活性小于1%(图12e)。光学显微影像表示出在37℃下在有尿酸晶体而无尿酸酶(图12a(i))、仅有尿酸酶(图12a(ii))、有尿酸酶和催化酶(图12a(iii))、以及有尿酸酶和催化酶的双核心纳米胶囊(图12a(iv))存在下，孵育HeLa细胞(图12a)2.5小时。单独尿酸酶能够降解尿酸晶体但会导致细胞死亡，所述死亡由圆形和萎缩的细胞形态所指示。相较于尿酸酶和催化酶游离系统，尿酸酶和催化酶双核心纳米胶囊导致细胞培养物中的尿酸晶体充分完全清除而不对细胞活力具有任何负面作用。所有这些研究都证明尿酸酶和催化酶双核心纳米胶囊是高度潜在高效和安全的痛风治疗药物候选物。
我们已显示一种用以将多种酶囊封至一个具有显著增强的活性和稳定性的纳米胶囊中的革命性新方法。使用DNA骨架的准确多核心构造纳米胶囊允许在核心酶之间快速转运反应中间体，此对于加速级联反应特别重要。此外，审慎选择核心酶允许合成与广泛范围的级联反应相关的纳米胶囊。更通常地，这个研究将允许酶催化的非凡能力朝向广泛范围的非生理性应用被获得。
方案多核心酶纳米胶囊(MCEN)。I-三种酶(酶A-转化酶；酶B-葡萄糖氧化酶；酶C-辣根过氧化酶)和其相应抑制剂DNA骨架(抑制剂a-蔗糖；抑制剂b-葡糖胺；抑制剂c-4-二甲基氨基安替比林)的自装配；II-通过就地聚合形成的多核心酶纳米胶囊(MCEN)；III-从多核心酶纳米凝胶除去的抑制剂DNA骨架。
应了解尽管本发明已连同以上实施方案一起被描述，但上文描述和实施例意图说明而非限制本发明的范围。在本发明的范围内的其它方面、优势和修改将为本发明所属领域技术人员显而易见。
Figure IDA0000473570110000011
Figure IDA0000473570110000021

Claims (34)

1.一种多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物包含至少两种不同酶和锚定于所述至少两种不同酶的至少一种的聚合网状物。
2.根据权利要求1所述的多酶纳米复合物，其中所述聚合网状物锚定于所述至少两种不同酶的全部。
3.根据权利要求1所述的多酶纳米复合物，其中所述两种不同酶的活性催化级联反应。
4.根据权利要求1所述的多酶纳米复合物，其中所述至少两种不同酶彼此共价或非共价连接。
5.根据权利要求4所述的多酶纳米复合物，其中共价键联在体内可降解。
6.根据权利要求1所述的多酶纳米复合物，其中所述至少两种不同酶不彼此连接。
7.根据权利要求1所述的多酶纳米复合物，其中所述聚合网状物包含由至少一种单体单元组成的聚合物。
8.根据权利要求7所述的多酶纳米复合物，其中所述聚合网状物包含由至少两种不同单体单元组成的聚合物。
9.根据权利要求7或8所述的多酶纳米复合物，其中所述聚合网状物进一步包含交联剂。
10.一种包含至少两种不同酶和可渗透外壳的多酶纳米复合物，所述外壳包含锚定于所述至少两种不同酶的至少一种的聚合网状物。
11.一种主要由聚合网状物和至少两种不同酶组成的多酶纳米复合物，所述聚合网状物共价锚定于所述至少两种不同酶的至少一种且提供围绕所述至少两种不同酶的可渗透外壳。
12.一种用于产生根据权利要求1所述的多酶纳米复合物的方法，所述方法包括：(a)使所述至少两种不同酶彼此连接；(b)使通过(a)产生的所连接酶丙烯酸化；以及(c)使用至少一种单体单元和任选交联剂来原位聚合通过(b)产生的丙烯酸化的酶。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括(d)除去所述键联。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述连接包括(i)使对每个酶具有特异性的配体缀合于单一核酸；(ii)实现缀合于所述核酸的所述配体结合所述酶；以及(iii)提供发生核酸杂交所处的条件。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述连接包括使所述酶缀合于可彼此杂交的单一核酸链。
16.根据权利要求12所述的方法，其中(a)中的所述连接包括使用连接子。
17.一种多酶纳米复合物系统，所述系统包含：
第一酶，其在与第一底物的第一酶促反应中产生第一产物；
第二酶，其在第二酶促反应中与所述第一产物反应；以及
聚合网状物，其被配置来形成囊封所述第一酶和所述第二酶的外壳，其中：
所述聚合网状物展现足以允许所述第一底物从所述外壳的外部的外部环境扩散至所述第一酶以便产生所述第一产物的渗透性；
所述聚合网状物展现足以允许所述第一产物扩散离开所述第一酶且到达所述第二酶以便发生所述第二酶促反应的渗透性；且
所述第一酶偶合于所述第二酶；或
所述聚合网状物偶合于所述第一酶的多肽或所述第二酶的多肽。
18.如权利要求17所述的多酶纳米复合物系统，其中所述聚合网状物以当所述多酶纳米复合物安置于体内环境中时足以抑制所述第一酶或所述第二酶降解的方式囊封所述第一酶和所述第二酶。
19.如权利要求17所述的多酶纳米复合物系统，其中所述第一酶与所述第二酶是通过互补多核苷酸链偶合在一起。
20.如权利要求17所述的多酶纳米复合物系统，其中所述系统与一种或多种适合用于经口施用的制剂中的填充剂、粘合剂或缓冲剂组合。
21.如权利要求17所述的多酶纳米复合物系统，所述系统进一步包含囊封在所述聚合网状物内的第三酶。
22.如权利要求17所述的多酶纳米复合物系统，其中所述系统被配置在包括容器和使用所述多酶纳米复合物系统的说明书的试剂盒中。
23.一种表面改性的多酶纳米复合物，所述多酶纳米复合物包含至少两种不同酶；锚定于所述至少两种不同酶的至少一种，从而为所述纳米复合物提供表面的聚合网状物、以及一种或多种偶合于所述表面以形成所述表面改性的多酶纳米复合物的表面改性剂。
24.根据权利要求23所述的表面改性的多酶纳米复合物，其中所述一种或多种表面改性剂：
调节所述纳米复合物的溶解性；和/或
调节所述纳米复合物的表面电荷。
25.根据权利要求23所述的多酶纳米复合物，其中所述一种或多种表面改性剂有助于细胞靶向和/或细胞渗透。
26.根据权利要求23所述的多酶纳米复合物，其中所述一种或多种表面改性剂选自由以下组成的组：小分子、聚合物、肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、多糖和抗体。
27.根据权利要求23所述的多酶纳米复合物，其中所述一种或多种表面改性剂包括聚合物。
28.根据权利要求27所述的多酶纳米复合物，其中所述聚合物包含聚乙二醇。
29.根据权利要求23所述的多酶纳米复合物，其中所述表面改性的多酶纳米复合物包含多种不同表面改性物。
30.一种用于产生根据权利要求23所述的表面改性的多酶纳米复合物的方法，所述方法包括：(a)使所述至少两种不同酶彼此连接；(b)使通过(a)产生的所连接酶丙烯酸化；(c)使用至少一种单体单元和任选交联剂来原位聚合通过(b)产生的丙烯酸化的酶，从而为所述纳米复合物提供表面，以及(d)使一种或多种表面改性剂偶合于通过(c)提供的所述表面以产生所述表面改性的多酶纳米复合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述表面改性剂选自由以下组成的组：小分子、聚合物、肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、多糖和抗体。
32.一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含多种根据权利要求1、10、11、17和23中任一项所述的纳米复合物的组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少两种不同酶的至少一种用作酶补充疗法。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述两种不同酶的至少一种用于调节、增加或降低引起所述受试者的所述疾病或病症的代谢物的含量。
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