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CN103710452B - 检测外周血游离dna的试剂盒及寡核苷酸 - Google Patents

检测外周血游离dna的试剂盒及寡核苷酸 Download PDF

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CN103710452B CN201310741282.6A CN201310741282A CN103710452B CN 103710452 B CN103710452 B CN 103710452B CN 201310741282 A CN201310741282 A CN 201310741282A CN 103710452 B CN103710452 B CN 103710452B
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Abstract

本发明公开了一种检测外周血游离DNA的试剂盒和寡核苷酸，具体涉及一组检测外周血游离DNA的寡核苷酸，见序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的寡核苷酸序列，及含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。

Description

检测外周血游离DNA的试剂盒及寡核苷酸
技术领域
本发明涉及一种利用外周血游离DNA进行肿瘤筛查、疗效评估以及预后预测的试剂盒。属生物技术领域。
背景技术
早期诊断、早期治疗是提高肿瘤临床治愈率和改善预后的关键，肿瘤标志物的鉴定与应用是决定早期发现以及疗效评估的关键因素。现今使用的大多数肿瘤标志物都是代谢相关的糖蛋白，通常是通过免疫测定技术进行检测的，临床资料显示，目前临床应用的蛋白类肿瘤标志物一方面并非在所有肿瘤中均表现异常，在没有这些标志物异常的肿瘤患者中，对其治疗的有效性将无法通过简易的外周血检测进行评价，只能通过影像学手段进行检查（承受射线辐射），难以进行实时的疗效评估；另一方面常规的蛋白类肿瘤标志物的通常敏感性较低，一些肿瘤中这些标志物通常滞后于肿瘤的发生，需要进行多指标组合检测，增加的检测的时间与费用；因而在癌症早期的筛查时受到了极大限制，这样就迫切需要寻找更为敏感的标志物。
外周血游离DNA是由细胞死亡后释放到血液中细胞外DNA的总称，研究发现，许多肿瘤患者游离DNA与正常人相比有很大差异，正常人外周血中游离DNA主要来自凋亡的细胞，由细胞核DNA和线粒体DNA组成，其含量极其微弱，通常每毫升仅为纳克水平，而肿瘤患者血液循环中游离DNA水平却显著高于正常人，目前发现，外周血游离DNA含量增高是各类肿瘤生长过程中的一种普遍现象；同时在正常人中，正常细胞死亡的方式通常是凋亡，释放到外周血中的DNA片段一般较短（200bp以下），而在肿瘤患者中，肿瘤细胞常死亡主要是坏死，而坏死细胞所释放到外周血中的DNA通常表现为不同的长度，这样相对于正常人，肿瘤患者外周血游离DNA中长片段DNA的含量也将会增加；另外，在肿瘤细胞来源与正常细胞来源的DNA中，某些靶基因的表观遗传学修饰（甲基化）有显著的不同。尤其需要提及的是血浆游离DNA在体内的代谢速度非常快，半衰期仅数分钟，可实时反映患者的状况。据此可通过外周血DNA的检测对肿瘤疗效以及预后进行评估。其在对高危险个体的筛检（肿瘤早期诊断）、疾病分期也具有重要的意义，是一种方便、快捷、敏感、特异的检测手段。同时基于循环DNA检测无创伤性，避免了常规检测需要采集癌组织标本的困难，非常适合对疗效的动态观察与评估，总之，外周血游离DNA的检测正以其不可替代的优势逐渐被人们所重视，并正在成为肿瘤应用研究的焦点。
由于外周血游离DNA相对于组织样本非常微量，这样一方面需要选择基因组中高拷贝的DNA序列，另一方面也需要选择高灵敏度的检测方法。Alu序列以及LINE-1序列是基因组中高拷贝的重复序列，目前的研究显示，LINE-1仅在肿瘤细胞以及细胞应激状态下激活，而在正常细胞中处于沉默状态，这种变化主要是通常表观遗传学修饰实现的，即LINE-1的激活体现在其启动子的去甲基化，而沉默则体现在其启动子的超甲基化。所以通过对其启动子区域的甲基化水平变化的检测，可评估其激活与否。
本试剂盒通过设计LINE-1启动子区域中包含CG岛的靶序列（含有甲基化敏感的限制性内切酶的作用位点），在其两侧的高保守区域设计PCR引物，同时选取Alu序列作为内参，选择区域中不包含有上述甲基化敏感的限制性内切酶的作用位点，设计PCR引物，两种扩增产物经序列分析进行证实。这样理论上正常细胞来源的LINE-1启动子序列由于高甲基化，甲基化敏感的限制性内切酶则不能切开，表现为酶切前后PCR扩增的Ct值没有明显的差异，而肿瘤细胞来源的LINE-1启动子序列由于出现去甲基化，甲基化敏感的限制性内切酶则可以切开，表现为酶切前后PCR扩增的Ct值有明显的增加。同时由于设计的LINE-1扩增片段（256bp）与Alu（112bp）扩增片段长度差别较大，其Ct值差值可以作为评估外周血游离DNA长度变化的重要指标。另外Alu序列由于在基因组中的拷贝数很高，其浓度的变化也反映出了血浆游离DNA总浓度的变化。所以通过对以上三种指标的检测可敏感的反映出肿瘤的有关信息，对肿瘤早期预警的筛查、疗效评估以及预后预测的应用具有重大的指导意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测外周血游离DNA的寡核苷酸。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测外周血游离DNA的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一组检测外周血游离DNA的寡核苷酸，由序列表SEQID No.1至序列表SEQ ID No.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为扩增Alu基因的上游引物和下游引物，具体序列如下：
LINE-1上游引物(L1-256-U)：5’-GAGAGGAGCCAAGATGGC-3’（SEQ ID NO.1）
LINE-1下游引物(L1-256-D)：5’-TCYGTCACCCCTTTCTTTGA-3’（SEQ ID NO.2）
Alu上游引物（ALU-112-U）：5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’（SEQID NO.3）
Alu下游引物(ALU-112-D)：5’-TTTAGTAGAGACGGGGTTTCAC-3’（SEQ ID NO.4）
上述引物序列中Y代表C或T。
本发明还提供一种检测外周血游离DNA的试剂盒，包括以下试剂：
1）酶切反应液，其包括：HpaII酶，10×buffer；
2）qPCR反应液，其包括：扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物，扩增Alu基因的上游引物和下游引物，和含有SYBR Green的PCR反应液；
其中，扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，扩增Alu基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
进一步地，含有SYBR Green的PCR反应液通常使用商品化试剂，例如，2×SuperReal PreMix Plus（购自天根生化科技有限公司），或DRR041ASYBR Premix Ex Taq TM（购自TaKaRa Bio Inc）；
3）用于制备标准曲线的DNA标准品；
4）阴性对照DNA样品：酶切前后荧光定量PCR的△△Ct的变化小于临界值；
5）阳性对照DNA样品：酶切前后荧光定量PCR的△△Ct的变化大于临界值；
6）ddH2O。
本发明还提供了一种检测外周血游离DNA的试剂盒的使用方法：
1）抽提外周血游离DNA；
2）使用HpaII酶对外周血游离DNA进行酶切，同时将未酶切的外周血游离DNA作为对照组；酶切体系见表1：
表1酶切体系
酶切条件为：37℃2h。
3）进行实时荧光PCR定量扩增，其中使用的引物为序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的扩增LINE-1基因上、下游引物，和序列表SEQID No.3和SEQ ID No.4所示的扩增ALU基因的上、下游引物；该反应体系分别见表2、表3：
表2LINE-1序列qPCR反应体系
表3Alu序列qPCR反应体系
反应条件为：Pre-incubation:95℃,15min
3Step Amplification:95℃、15s；55℃、20s；72℃、20s；40循环。
4）结果判定，按照如下进行计算
(a)△Ct=∣(Ct-L1precut–Ct-Aluprecut)∣；
(b)△△Ct=∣(Ct-L1precut–Ct-Aluprecut)—(Ct-L1postcut–Ct-Alupostcut)∣；
(c)血浆游离DNA中Alu的绝对浓度：使用制备标准曲线的DNA标准品绘制标准曲线，建立Ct值与DNA浓度之间的对应关系，根据标准曲线测定血浆游离DNA中Alu的绝对浓度。
理论上在治疗期间，治疗的有效性应该表现为血浆游离DNA总量增加（坏死细胞释放DNA的量增加），治疗后随着肿瘤细胞被大量清除，DNA总量则应明显的下降，△Ct值的应该有所增加（长片段DNA数量减少），△△Ct值应有所下降（肿瘤来源的LINE-1DNA数量减少）。根据初步的统计数据分析以及结合有关指标，我们将外周血游离DNA中Alu绝对浓度的临界值设定为2.5ng/ml，小于2.5ng/ml为阴性；将△Ct的临界值设定为3.2，大于3.2为阴性；将△△Ct值临界值设定为0.8，小于0.8为阴性。
本发明相对于现有技术具有如下特点：
1、高敏感性：外周血游离DNA检测试剂盒，通过三种指标的联合评判，极大地提高了检测的灵敏度。
2、特异性：由于我们选择的靶基因LINE-1仅在肿瘤细胞中激活（细胞应激，也可导致其一过性的激活，如炎症），而在正常细胞中为沉默基因，这样在排除炎症的情况下对其进行检测增加了肿瘤的特异性。
3、直接性：常规的蛋白肿瘤标志物通常是检测代谢指标的异常，是间接指标，而外周血游离DNA是直接来自于细胞本身，是直接性指标，更加真实可信。
4、实时性：同时由于外周血游离DNA在体内的代谢很快（可在几分钟内代谢清除），这样可以对治疗效果进行实时的评价。
5、稳定性：相对于蛋白质标志物而言，DNA的稳定性较好，对样本的储存运输等条件要求相对较低。
6、预警性：基础医学研究认为肿瘤的发生的根本原因是基因组的不稳定性，LINE-1的沉默在维持基因组的稳定性方面起着非常重要的作用，所以检测LINE-1的激活对预测肿瘤发病的风险具有非常重大的意义。
附图说明
图1为用于制备标准曲线的DNA标准品的qPCR扩增曲线；
图2为DNA标准品浓度与Ct值之间对应的线性关系；
图3为一个典型的正常人外周血游离DNA酶切处理后的qPCR扩增分析图；
图4为一个典型的肿瘤患者外周血游离DNA酶切处理后的qPCR扩增分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1引物设计
LINE-1序列引物设计方法：本发明根据已报道的LINE-1序列，从不同的人外周血细胞中扩增LINE-1启动子区域序列，通过序列比对软件找出保守部分的序列，选择富含CG岛区域，采用DNAMAN软件设计引物序列；
Alu序列引物设计方法：由于Alu家族存在不同的变异，本发明对家族中不同成员进行同源性比对，找出不含甲基化敏感性内切酶作用位点的保守区域，采用DNAMAN软件设计引物序列；
引物序列如下：
LINE-1上游引物(L1-256-U)：5’-GAGAGGAGCCAAGATGGC-3’（SEQ ID NO.1）；
LINE-1下游引物(L1-256-D)：5’-TCYGTCACCCCTTTCTTTGA-3’（SEQ ID NO.2）；
Alu上游引物（ALU-112-U）：5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’（SEQID NO.3）；
Alu下游引物(ALU-112-D)：5’-TTTAGTAGAGACGGGGTTTCAC-3’（SEQ ID NO.4）；
上述引物均由北京三博远志公司合成。
实施例2用于检测肿瘤外周血游离DNA试剂盒的组成（保存于-20℃）
1）酶切反应液，其包括：HpaII酶，10×buffer（购自NEB公司）。
2）qPCR反应液，其包括：含有SYBR Green的PCR反应液，扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物，扩增Alu基因的上游引物和下游引物；
其中，扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，扩增Alu基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
3）制备标准曲线的DNA标准品；
4）阴性对照DNA样品：酶切前后荧光定量PCR的△△Ct的变化小于临界值；
5）阳性对照DNA样品：酶切前后荧光定量PCR的△△Ct的变化大于临界值；
6）ddH2O。
实施例3用于检测肿瘤外周血游离DNA试剂盒的使用方法
1.外周血游离DNA的制备
采用Qiagen公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒抽提血浆DNA，提取方法按照说明书进行。
2.DNA酶切
1）酶切预混液配制（在冰上或4度条件下进行）
酶切预混液的配制，取高压灭菌过的1.5ml离心管，加入HpaII酶1ul，10×buffer2ul，ddH2O15ul；混合均匀后短暂离心备用。
2）酶切反应：
取2个0.5ml的离心管，分别加入18ul的酶切预混液和ddH2O(未酶切对照)，然后再分别加入2ul的DNA样品，短暂离心混匀。于37℃进行孵育2h，反应结束后短暂离心，即可进行下一步的qPCR实验。若不能及时进行下游反应，应在-20℃保存。
3.实时荧光PCR定量扩增
1）配制引物工作液
将引物干粉用ddH2O溶解，配制成100uM的保存液，-20℃保存；用ddH2O稀释成10uM的引物工作液，并进行分装，避免反复冻融。
2）制备LINE-1以及Alu基因的上游和下游引物的预混液（在冰上或4度条件下进行）。
针对每一个检测样本，将LINE-1基因的引物工作液和Alu基因的引物工作液分别与含有SYBR Green的PCR反应液进行混合，短暂离心备用。
3）实时荧光PCR定量扩增
在96孔板中将预混液分别加入酶切前和酶切后DNA，封盖后在板式离心机上3000rpm，1min离心。将其放置在Roche480荧光定量PCR仪上，设置运行程序如下：
Pre-incubation:95℃,15min
3Step Amplification:95℃、15s；55℃、20s；72℃、20s；40循环。
图3、图4分别为正常人和肿瘤患者外周血游离DNA的qPCR扩增图。
4.结果判定，按照如下进行计算
(a)△Ct=∣(Ct-L1precut–Ct-Aluprecut)∣:Ct代表PCR循环次数，L1代表LINE-1，Precut代表酶切前。此值表示血浆游离DNA中长片段与短片段之间的相对量，在由肿瘤或炎症细胞来源的游离DNA中，长片段DNA数量增加，造成其与短片段之间的相对浓度接近，此值越大表示长片段相对于短片段的浓度越低。
(b)△△Ct=∣(Ct-L1precut–Ct-Aluprecut)—(Ct-L1postcut–Ct-Alupostcut)∣：Ct代表PCR循环次数，L1代表LINE-1，Precut代表酶切前，Postcut代表酶切后。由于肿瘤细胞来源与正常细胞来源的靶基因（LINE-1）甲基化不同，这样通过酶切处理将这种修饰的差异转化为PCR模板量的差异，此值越大表示表示去甲基化DNA所占的相对量越大，即肿瘤来源的游离DNA越多。
(c)血浆游离DNA中Alu的绝对浓度：使用制备标准曲线的DNA标准品绘制标准曲线，建立Ct值与DNA浓度之间的对应关系，根据标准曲线测定血浆游离DNA中Alu的绝对浓度。
5.用于制备标准曲线的DNA标准品的制备方法
取Alu基因的PCR扩增产物，在分光光度计上进行浓度检测得到DNA浓度数值，然后以此为母液进行系列稀释（10倍梯度稀释），分别得到参考浓度样品，选取4个参考浓度样品作为DNA标准品。以标准品为模板进行qPCR，利用设备中自带的软件计算DNA模板浓度与Ct值之间的关系（见图1和图2），其线性关系符合线性一次方程（Y=kx+b，其中Y为循环次数，k为斜率，x为浓度的对数，b为在Y轴上的截距）。
根据初步的统计数据分析以及结合有关指标，我们将外周血游离DNA中Alu的临界值设定为2.5ng/ml，小于2.5ng/ml为阴性；将△Ct的临界值设定为3.2，大于3.2为阴性;将△△Ct值临界值设定为0.8，小于0.8为阴性。见表4。
表4外周血游离DNA检测参数参考
cfDNA 检测项目 阴性参考值 单位
cfDNA-Alu 游离DNA内参浓度 <2.50 ng/ml
cfDNA△Ct 游离DNA△Ct >3.20 Ct
cfDNA△△Ct 游离DNA△△Ct <0.80 Ct
实施例4用于与常规肿瘤标志物检测的组合分析，提高检测的敏感性与特异性
1.材料
本实施例的检测样本由解放军总医院肿瘤中心实验室提供，共100例；
同时，为探索其与常规的蛋白肿瘤标志物的关系，选择12种常见的肿瘤标志物组合，将两种方法的检测结果进行比较；
12种蛋白肿瘤标志物分别为：CA19-9；NSE；CEA；CA242；CA72-4；β-HCG；AFP；SCC；c-PSA；CA125；CK19；CA15-3（购自上海铭源树康科技有限公司，国药准字号S20020026）。
2.方法
采用本发明所述的试剂盒对检测样本进行检测；并用12种肿瘤标志物对检测样本进行检测作为对照组。
3.结果
12种肿瘤标志物与本发明试剂盒对游离DNA检测的符合率分别为：
DNA阳性符合率（即12种肿瘤标志物任何一种出现阳性，游离DNA检测三指标中任何一种出现阳性）：80%
DNA阴性符合率：90%
实施例5用于对肿瘤疗效的评估分析
1.材料
本实施例的检测标本为治疗前与手术后7天所采集的血浆，由解放军总医院肝胆外科提供，共10对。
2.方法
采用本发明所述的试剂盒对检测样本进行检测。
3.结果，检测结果见表5：
表5肝癌患者手术前后外周血游离DNA检测数值
标本* △Ct △△Ct Alu浓度
C4 4.7 1.09 2.525
C4A 5.93 0.33 5.5
C5 5.11 0.72 4.2
C5A 5.19 0.82 2.525
C9 4.88 1.01 2.65
C9A 5.15 0.98 3.95
C11 5.43 0.6 2.2825
C11A 5.83 0.34 3.05
C21 5.28 0.62 1.425
C21A 5.16 0.86 3.775
C86 6.04 0.34 3.65
C86A 6.08 0.33 8.4
C49 5.47 0.4 21.75
C49A 6.02 0.09 6.95
C42 4.65 1.21 1.4325
C42A 5.12 1.32 3.9
C29 4.29 0.86 2.145
C29A 5.35 0.55 4.425
C32 4.56 3.04 1.5525
C32A 5.13 1.12 3.85
其中，C+数字为患者的代号；A表示同一患者手术后标本（手术后7天）；
△Ct升高表明长片段DNA与短片段DNA的相对浓度降低，由于长片段DNA主要来自于肿瘤细胞，表明在血液中肿瘤细胞释放的DNA浓度下降，即治疗有效。
△△Ct降低表明肿瘤来源的DNA浓度降低，即低甲基化的DNA量减少（肿瘤来源的L1DNA为低甲基化），表明治疗有效。
Alu浓度增高表明在治疗期间有大量的细胞死亡，这些死亡的细胞将DNA释放到血中，同时也与手术后细胞增殖加快有关，治疗有效。
实施例6用于对肿瘤发病风险性预警预测的分析
1.材料
本实施例的检测样本由杭州富国科技有限公司提供，共192例；其中包括肿瘤家族病史（乳腺癌与结直肠癌）人群24例,非肿瘤家族病史人群168例。
2.方法
采用本发明所述的肿瘤外周血游离DNA检测试剂盒对样本进行检测；比较肿瘤易感性人群与普通人群检测指标的差异。
3.结果
在有肿瘤家族史人群中，外周血游离DNA出现异常（三种指标中任何一种阳性）的例数为4人，阳性率约为16%；在无肿瘤家族史且人群中，外周血游离DNA出现异常（三种指标中任何一种阳性）的例数为15人，阳性率为9%。可见外周血游离DNA在炎症患者以及具有肿瘤家族史的人群中出现异常的比例明显增高，由于具有肿瘤家族病史的人群数目较少，所以进一步放大检测量将有助于说明两者之间的关系。肿瘤发生的早期主要表现为炎症反应，即所谓的炎-癌-链，长期不愈的炎症显然将增加肿瘤发病的风险，提示该外周血游离DNA检测试剂盒可用于肿瘤发病的预警预测。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一组检测外周血游离DNA的寡核苷酸，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增LINE-1基因的上、下游引物，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为扩增Alu基因的上、下游引物。
2.一种检测外周血游离DNA的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
1）酶切反应液，其包括： HpaII酶，10×buffer；
2）qPCR反应液，其包括：扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物，扩增Alu基因的上游引物和下游引物，和含有SYBR Green的PCR反应液；
其中，扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，扩增Alu基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
3）制备标准曲线的DNA标准品；
4）阴性对照DNA样品；
5）阳性对照DNA样品；
6）ddH2O。
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