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CN103698525B - 一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原ⅰ检测试剂盒 - Google Patents

一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原ⅰ检测试剂盒 Download PDF

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CN103698525B CN201410010750.7A CN201410010750A CN103698525B CN 103698525 B CN103698525 B CN 103698525B CN 201410010750 A CN201410010750 A CN 201410010750A CN 103698525 B CN103698525 B CN 103698525B
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Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，特别是一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法血清胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒。本发明所述试剂盒组成包含：（1）胃蛋白酶原Ⅰ校准品；（2）预置乳糜消除剂的试剂1；（3）含抗人胃蛋白酶原Ⅰ单抗和多抗包被胶乳颗粒的试剂2。本法试剂盒通过胶乳凝集作用放大样本中待测物质与试剂中特异性抗体的结合反应，在给定的波长下，反应形成的浊度与待测物质的含量成相关，以此计算待测物质的含量。本发明所述试剂盒用于检测人血清中胃蛋白酶原Ⅰ的含量，灵敏度高、特异性好，可消除样本中的乳糜干扰，操作简便快捷，实用性强，适用范围广泛。

Description

一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒
技术领域
本发明属医学检验技术领域，涉及一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法的血清胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒。
背景技术
胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体，是胃粘膜分泌的一种门冬氨酸蛋白酶前体，是分子量42000Da的单链多肽，在胃内转变为具有活性的胃蛋白酶。
根据生化性质、免疫原性、细胞来源及组织内分布，胃蛋白酶原可分成胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）两个亚群：其中1～5组分免疫原性近似，称为PGⅠ(PGA)，主要由胃底腺的主细胞和颈粘液细胞分泌；6～7组分被称为PGⅡ(PGC)，除由上述两种细胞分泌外，幽门腺的黏液细胞、贲门腺以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ，胃粘膜合成的PGⅡ约为总量的25％。
正常情况下，胃粘膜产生的胃蛋白酶原大部分进入胃腔，遇酸后肽链分解活化为胃蛋白酶，发挥其消化蛋白质的作用；小部分胃蛋白酶原则透过胃粘膜毛细血管进入血循环。血清胃蛋白酶原浓度可反映胃粘膜的分泌水平，不同胃蛋白酶原浓度水平也可反映不同部位胃粘膜的功能和形态变化。
胃蛋白酶原的检测已列入日本老年保健法，应用该项目进行大面积的人群普查使得日本胃癌的早诊率提高到90%，在日韩被称为胃底腺粘膜的“血清学活检”。
目前检测血清胃蛋白酶原含量的方法主要有酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、化学发光法和胶乳免疫比浊法等。
ELISA方法精确、定量，具有很高的敏感性，但操作程序繁琐，耗时长，不能适应大规模体检筛查或急诊的需要；RIA方法灵敏度高，特异性强，但放射免疫反应是竞争性的反应，测得的值是相对量而非绝对量，且存在辐射和放射性污染；化学发光法精确度高，检测速度快，但成本高昂，对配套设施要求高，无法应用于广大中、基层的医院和医疗卫生机构；胶乳免疫比浊法具有操作简便快速、自动化、定量准确、敏感度高等优点，可满足门、急诊和大规模体检筛查等需要。
现有胶乳免疫比浊试剂，由于其检测原理是测定反应形成的免疫复合物的浊度，因此极易受到乳糜干扰的影响。目前应对这个问题的方法，主要是使用专门的乳糜消除剂对样本进行预处理。而在大规模的人群普查、健康体检筛查和临床病人检验时，经常会遇到大量的乳糜、溶血等浑浊样本，此时通过购置样本处理剂，对这些样本进行单独处理，将会极大地增加操作人员的工作量，提高运营成本，也为临床检验的组织安排带来难题。
因此，研制一种能够消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒，显得十分必要。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术缺陷，提供了一种检测人体血清中胃蛋白酶原Ⅰ含量的试剂盒，不需要再对乳糜样本进行单独处理，节约了人力、资源，使用简单、快速，灵敏度高，不仅能够适应大规模人群普查的需求，也能满足日常临床快速、高通量检查的要求，适合产业化，便于临床推广。本发明采取的技术方案是一种胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒，其组成包括：
试剂1，是一种为试剂盒提供适当反应环境、消除乳糜干扰、使抗原保持天然构象、并控制反应达到终点的时间和速率的试剂，包含电解质、乳糜消除剂、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；
试剂2，是一种含有抗人胃蛋白酶原Ⅰ抗体包被胶乳颗粒的均一的乳白色液体，包含抗人胃蛋白酶原Ⅰ抗体包被胶乳颗粒、防腐剂及缓冲液；
校准品，是添加不同浓度胃蛋白酶原Ⅰ抗原的人血清基质缓冲液，用来与样本比较进行结果计算，包含电解质、防腐剂、稳定剂、胃蛋白酶原Ⅰ抗原、人血清及缓冲液。
所述电解质选自无机盐，优选氯化钠、氯化钾、氯化镁或硫酸镁。
所述乳糜消除剂，选自脂肪酶或1～5%的聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁试剂。
所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠。
所述稳定剂选自牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白(Fish skingelatin)、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。
所述表面活性剂选自吐温系列、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列。
所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin系列。
所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES-NaOH缓冲液、MOPSO缓冲液。
所述抗体为单克隆抗体与多克隆抗体的混合，单克隆抗体反应的特异性更强，但灵敏度受限，而添加少量的多克隆抗体则能够提高反应的灵敏度。抗体种类选自IgG抗体或IgY抗体，抗体来源选自兔抗人、山羊抗人、绵羊抗人、鼠抗人、鸡抗人、鸭抗人。
所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳，直径范围为150～250nm。胶乳颗粒的表面修饰有功能团，通过该功能团再与抗体相结合，则可以减轻空间构型对共价键形成的阻碍，使得抗体更易交联到胶乳颗粒上，抗体的活性更高，能够显著提高分析灵敏度。修饰的功能团可以选择羧基、氨基、羟基、酰肼、氯甲基的一种。
本发明所用的包被抗体到胶乳颗粒表面的方法为化学交联法，该方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的，所述的化学交联剂选择碳化亚胺（EDAC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）、酰肼、异氰酸酯中的一种，所述的交联缓冲液选自不同氨基的缓冲液，MES、MOPSO、MOPS、HEPES缓冲液，pH在6.0～8.0之间。
所述胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂1中的缓冲液，要求其缓冲能力为调节pH在7.0～9.0之间，可以选择上述缓冲液其中一种，浓度范围为10～100mmol/L。乳糜消除剂要求有较强的乳糜清除能力和一定的反应惰性，可以选择上述乳糜消除剂其中一种，优选脂肪酶，浓度范围5～50KU/L。电解质选自无机盐类，可以维持溶液渗透压，有利于保持溶液中蛋白质的稳定性，可以选择上述电解质其中一种，优选氯化钠，浓度范围为1％～5％。促凝剂可以加快免疫反应速度，缩短检测时间，可以选择上述促凝剂其中一种，优选PEG-6000，浓度范围为2%～6%。稳定剂可以提供良好稳定反应环境，使抗原保持天然构象，可以选择上述稳定剂其中一种，优选BSA，浓度范围是0.5%～5%。表面活性剂能够在试剂2加入到反应体系时，迅速吸附到胶乳颗粒的表面，降低胶乳颗粒表面张力，使胶乳颗粒不易聚集，有效地提高胶乳颗粒在溶液中的分散性和稳定性，可以选择上述表面活性剂其中一种，优选吐温20，浓度范围为0.1%～1.0%。再选择添加上述防腐剂其中一种，浓度范围为0.05%～0.1%。
所述胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂2中的缓冲液，要求其缓冲能力为调节pH在7.0～9.0之间，可以选择上述缓冲液其中一种，浓度范围为10～100mmol/L。抗人胃蛋白酶原Ⅰ抗体，其中单抗/多抗的比值范围在5～10，抗体种类选自IgG、IgY抗体，抗体来源可以选择上述抗体其中一种，优选鸭抗人IgY抗体。胶乳颗粒表面修饰有功能团，可以选择上述修饰的功能团其中一种，优选修饰羧基。化学交联剂选择上述化学交联剂其中一种，优选EDAC，交联缓冲液选择上述交联缓冲液其中一种，优选HEPES缓冲液，其致敏的抗体胶乳颗粒浓度范围为0.5～5mg/ml。再选择添加上述防腐剂其中一种，浓度范围为0.05%～0.1%。
所述胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒校准品，包括含量在0～200ng/ml之间的PGⅠ，其中PGⅠ校准品水平1为不含PGⅠ的人血清基质缓冲液，PGⅠ校准品水平2、3、4为添加不同PGⅠ含量的人血清基质缓冲液。缓冲液可以选择上述缓冲液其中一种，浓度范围为10～100mmol/L,pH为6.5～8.5，人血清比例为5%。所添加的PGⅠ选择来源于自人体体液提取、纯化而得的天然PGⅠ，或自胃癌细胞株培养、纯化而得的PGⅠ，其纯度≥95％；所添加的电解质选择上述电解质其中一种，优选氯化钠，浓度范围为1%～5%；所添加的稳定剂选择上述稳定剂其中一种，浓度范围为0.5～5%；再选择添加上述防腐剂其中一种，浓度范围为0.01%～0.1%。
本发明中所述的百分比浓度，如未进行特殊说明，均为质量体积百分比浓度，即100ml溶液中所含溶质的克数。
本发明试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人血清中胃蛋白酶原Ⅰ含量。其原理是：被测样本中的胃蛋白酶原Ⅰ与包被在胶乳颗粒上的抗人胃蛋白酶原Ⅰ单克隆和多克隆抗体发生抗原抗体反应，形成的抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物交织成网状并发生凝集，导致浊度上升，保持反应体系中抗体过量时，检测此浊度在700nm波长处的吸光度，对照校准曲线即可求出样本中胃蛋白酶原Ⅰ的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、抗乳糜干扰能力强，不需要对样本进行预处理，节约了人力、资源，能够应用于大规模的体检筛查和人群普查，有利于项目的广泛开展；2、本发明试剂盒的灵敏度更高，检测低浓度样本的测值更加准确；3、本发明试剂盒与酶联免疫法（ELISA）对临床样本进行对比检测的数据分析，相关性良好，临床意义显著；4、检测手段简单，对医疗设施要求不高，能应用于各种全自动、半自动生化分析仪。
附图说明
图1为采用本发明实施例1制备的4个不同梯度，浓度分别为0、40、80、160ng/ml的胃蛋白酶原Ⅰ校准品，在日立7080全自动生化分析仪上，绘制出本发明PGⅠ校准品的标准曲线。其中X轴表示胃蛋白酶原Ⅰ的含量（ng/ml）；Y轴表示吸光度。
具体实施方式
实施例1
一、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的制备
试剂1的制备：在50mmol/L、pH7.5的甘氨酸-NaOH缓冲液中，添加20KU/L的脂肪酶、1.2％氯化钠、0.3％吐温20、5％PEG-6000、0.5％BSA、0.05％Proclin300，搅拌均匀调节pH至8.0，即得到消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂1。
试剂2的制备：
（1）抗体交联：将0.5mg单抗/多抗比值为5:1的混合鸭抗人胃蛋白酶原ⅠIgY抗体用5ml20mmol/L的HEPES-NaOH缓冲液稀释后，加入表面修饰羧基、直径150nm的聚苯乙烯胶乳溶液，再加入1.5mg EDAC，在37℃条件下反应8h，加入0.5ml100mmol/L的Tris-HCl缓冲液搅拌1h后终止反应；
（2）胶乳清洗：离心去除上清以清除多余的抗体、交联剂及交联反应的副产物等，底部沉淀即为包被好的胶乳。用20ml50mmol/L、pH8.0的甘氨酸-NaOH缓冲液洗涤3次；
（3）胶乳悬浮：将20ml同样的甘氨酸-NaOH缓冲液加入到上述沉淀，超声波处理5min，混匀得均一的乳白色胶乳悬浮液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为2mg/ml，再添加0.05%的Proclin300，即得到消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂2。
胃蛋白酶原Ⅰ校准品的制备：在pH6.8、含有20mmol/L Tris-HCl缓冲物的预处理人血清基质缓冲液中，人血清比例为5%，分别加入浓度为0、40、80、160ng/ml自人体体液提取、纯化而得的，纯度≥95％的胃蛋白酶原Ⅰ抗原，搅拌均匀，作为胃蛋白酶原Ⅰ多点校准品。此外，预处理的人血清基质缓冲液中还包含2.5％氯化钠、0.8％EDTA、0.02％Proclin300。
二、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法
检测方法及实验参数如下：
分析方法：两点终点法；
试剂的用量：试剂1和试剂2用量分别为160μl和30μl；
样本的用量：6μl；
检测波长：700nm。
检测步骤：160μl试剂1加入6μl样本，于37℃5min后加入30μl试剂2后开始读点，反应5min后读取另一点，得到吸光度的差值。
绘制本实施例制备的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒校准品的标准曲线：
采用本实施例制备的4种不同含量，分别为0、40、80、160ng/ml的胃蛋白酶原Ⅰ校准品，在日立7080全自动生化分析仪上，按照上述检测步骤测得本发明PGⅠ校准品的标准曲线（如图1所示）。图1中曲线上的每个点代表一个含量的校准品。其中X轴表示胃蛋白
酶原Ⅰ的含量（ng/ml）；Y轴表示吸光度。
取待测样本，同样按照上述检测步骤检测样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中胃蛋白酶原Ⅰ的含量。如果样本中胃蛋白酶原Ⅰ的浓度超出校准曲线范围，为了保证检测的准确性，需要对样本进行适当稀释后再进行检测。
三、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的抗乳糜干扰能力
按照如下的操作方法检测胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的抗乳糜干扰性能：
（1）收集较低范围的测值相近的无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的人血清样本，进行混合，对该混合人血清样本进行测定，得到其胃蛋白酶原Ⅰ的值为10.4ng/ml；
（2）按照下表1、表2所示，在混合人血清中添加不同浓度梯度的乳糜干扰物；
（3）分别使用某厂家免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒（本试验中，简称试剂盒A）和本实施例制备的PGⅠ检测试剂盒（本试验中，简称试剂盒B），对添加了不同乳糜单位浓度的血清样本进行对照测定，重复3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10%以内视为无干扰，偏差范围超过±10%视为干扰。
表1试剂盒A检测添加不同浓度乳糜干扰物血清样本的结果
表2试剂盒B检测添加不同浓度乳糜干扰物血清样本的结果
表1结果显示，随乳糜浊度从0到8000的范围变化，试剂盒A的检测值偏差也随之增大，当乳糜浊度单位大于2000时，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均大于10%，判定为存在干扰。
表2结果显示，随乳糜浊度从0到8000的范围变化，试剂盒B的检测值偏差的变化较小，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均在±10%以内，判定为不存在干扰。
本试验显示了相比现有的免疫比浊方法试剂盒，本发明所述的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒明显提高了对乳糜的抗干扰能力。
四、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的灵敏度
按照如下的操作方法检测胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的灵敏度：
（1）确定一个试剂可以检测准确的较低浓度值来与水空白比较，本试验选用2.1ng/ml的样本；
（2）检测20次水，记录吸光度数值，计算平均值（X水）和标准偏差(SD)；
（3）检测20次浓度为2.1ng/ml的样本，记录吸光度数值，计算平均值（X2.1）和标准偏差（SD）；
（4）水的吸光度平均值加上3SD作为最低检测限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和2.1ng/ml样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度即灵敏度。公式为2.1×（X水+3SD）/X2.1。
本实施例中制备的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒（本试验中，简称“本发明试剂盒”）和对照试剂盒（某厂家免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒）的灵敏度试验的数据结果如表3所示。
下表中，△A表示吸光度的差值。
表3本发明试剂盒与对照试剂盒灵敏度对比数据
本发明试剂盒的灵敏度=2.1×（31.7+3×2.1）/867.9=0.09ng/ml。
对照试剂盒的灵敏度=2.1×（20.2+3×9.6)/479.6=0.21ng/ml。
结果显示本发明试剂盒的灵敏度可达0.09ng/ml，优于对照试剂盒。
本发明试剂盒通过把一定比例的PGⅠ单克隆抗体和多克隆抗体用化学交联法结合到羧基修饰的胶乳颗粒上，一方面使抗原抗体结合反应更加迅速、牢固，另一方面通过胶乳凝集作用放大了反应的检测级数，从而实现试剂盒的灵敏度提高。由上述表3的结果可知，本发明试剂盒的灵敏度高于对照试剂盒的灵敏度，可见本发明试剂盒实现了灵敏度提高的效果。
五、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒与酶免方法检测试剂盒的相关性
使用本实施例制备的PGⅠ检测试剂盒（本试验中，简称“本发明PGⅠ试剂盒”）和本公司胶乳免疫比浊法PGⅡ检测试剂盒（本试验中，简称“本公司PGⅡ试剂盒”），采用日立7080全自动生化分析仪，对50份无乳糜、溶血、黄疸、浑浊现象的新鲜人血清进行检测，和对照试剂（北京某厂家的酶联免疫法胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ检测试剂盒，简称“酶免试剂盒”）的检测结果进行相关性分析。本发明PGⅠ试剂盒按照上述“二、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法”进行检测，本公司PGⅡ试剂盒按照说明书进行检测，酶免试剂盒按照其说明书进行检测，测定结果如表4所示。
下表中，酶免方法试剂盒的参考范围是：PGⅠ(70-200ng/ml)；PGⅡ(0-15ng/ml)；PGⅠ/PGⅡ>7.5；本公司胶乳免疫比浊方法试剂盒的参考范围是：PGⅠ(70-240ng/ml)；PGⅡ(0-20ng/ml)；PGⅠ/PGⅡ>3。
表4本发明试剂盒与酶免方法试剂盒临床比对数据
由上表统计结果可以看出，在这50例新鲜病人血清中，共出现35例阴性结果和15例阳性结果，酶免方法试剂盒和本发明试剂盒在结果判断上是一一对应的,并且两个单项结果及其比值都存在临床许可范围内的吻合。两种方法的原理和参考范围虽然有一定的区别，但是从临床应用的角度来判断，二者的相关性良好，临床意义显著。
此外，以上的试验是采用日立公司制造的7080型号全自动生化分析仪进行的，但本发明试剂的应用不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪，并且本领域的技术人员可以根据情况对测定参数作适当调整。
实施例2
一、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的制备
试剂1的制备：在20mmol/L、pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，添加5KU/L的脂肪酶、4.5％氯化钾、0.6％聚氧乙烯苯基醚、2％PEG-6000、2.5％EDTA、0.08％叠氮钠，搅拌均匀调节pH至7.2，即得到消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂1。
试剂2的制备：
（1）抗体交联：将0.5mg单抗/多抗比值为6.5:1的混合兔抗人胃蛋白酶原ⅠIgG抗体用5ml10mmol/L的MOPSO-HCl缓冲液稀释后，加入表面修饰氨基、直径200nm的聚苯乙烯胶乳溶液，再加入2.0mg NHS，在37℃条件下反应8h，加入0.5ml80mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液搅拌1h后终止反应；
（2）胶乳清洗：离心去除上清以清除多余的抗体、交联剂及交联反应的副产物等，底部沉淀即为包被好的胶乳。用20ml20mmol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤3次；
（3）胶乳悬浮：将80ml同样的Tris-HCl缓冲液加入到上述沉淀，超声波处理5min，混匀得均一的乳白色胶乳悬浮液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为0.5mg/ml，再添加0.08%的叠氮钠，即得到消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂2。
校准品的制备：在pH7.8、含有100mmol/L HEPES-NaOH缓冲物的预处理人血清基质缓冲液中，人血清比例为5%，分别加入浓度为0、40、80、160ng/ml自人体体液提取、纯化而得的,纯度≥95％的胃蛋白酶原Ⅰ抗原，搅拌均匀，作为胃蛋白酶原Ⅰ多点校准品。此外，预处理的人血清基质缓冲液中还包含5％氯化钾、2％BSA、0.05％叠氮钠。
本实施例中制备的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法，同实施例1中“消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法”。
二、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的抗乳糜干扰能力
按照如下的操作方法检测胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的抗乳糜干扰性能：
（1）收集较低范围的测值相近的无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的人血清样本，进行混合，对该混合人血清样本进行测定，得到其胃蛋白酶原Ⅰ的值为10.4ng/ml；
（2）按照下表5、表6所示，在混合人血清中添加不同浓度梯度的乳糜干扰物；
（3）分别使用某厂家免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒（本试验中，简称试剂盒A）和本实施例制备的PGⅠ检测试剂盒（本试验中，简称试剂盒B），对添加了不同乳糜单位浓度的血清样本进行对照测定，重复3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10%以内视为无干扰，偏差范围超过±10%视为干扰。
表5试剂盒A检测添加不同浓度乳糜干扰物血清样本的结果
表6试剂盒B检测添加不同浓度乳糜干扰物血清样本的结果
表5结果显示，随乳糜浊度从0到8000的范围变化，试剂盒A的检测值偏差也随之增大，当乳糜浊度单位大于2000时，检测值与未添加干扰时测定值的偏差均大于10%，判定为存在干扰。
表6结果显示，随乳糜浊度从0到8000的范围变化，试剂盒B的检测值偏差的变化较小，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均在±10%以内，判定为不存在干扰。
本试验显示了相比现有的免疫比浊方法试剂盒，本发明所述的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒明显提高了对乳糜的抗干扰能力。
三、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的灵敏度
按照如下的操作方法检测胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的灵敏度：
（1）确定一个试剂可以检测准确的较低浓度值来与水空白比较，本试验选用2.1ng/ml的样本；
（2）检测20次水，记录吸光度数值，计算平均值（X水）和标准偏差(SD)；
（3）检测20次浓度为2.1ng/ml的样本，记录吸光度数值，计算平均值（X2.1）和标准偏差（SD）；
（4）水的吸光度平均值加上3SD作为最低检测限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和2.1ng/ml样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度即灵敏度。公式为2.1×（X水+3SD）/X2.1。
本实施例中制备的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒（本试验中，简称“本发明试剂盒”）和对照试剂盒（某厂家免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒）的灵敏度试验的数据结果如表7所示。
下表中，△A表示吸光度的差值。
表7本发明试剂盒与对照试剂盒灵敏度比对数据
本发明试剂盒的灵敏度=2.1×（31.15+3×2.8）/857.2=0.10ng/ml。
对照试剂盒的灵敏度=2.1×（20.55+3×10.0)/473.85=0.22ng/ml。
结果显示本发明试剂盒的灵敏度可达0.10ng/ml，优于对照试剂盒。
本发明试剂盒通过把一定比例的PGⅠ单克隆抗体和多克隆抗体用化学交联法结合到羧基修饰的胶乳颗粒上，一方面使抗原抗体结合反应更加迅速、牢固，另一方面通过胶乳凝集作用放大了反应的检测级数，从而实现试剂盒的灵敏度提高。由上述表7的结果可知，本发明试剂盒的灵敏度高于对照试剂盒的灵敏度，可见本发明试剂盒实现了灵敏度提高的效果。
四、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒与酶免方法检测试剂盒的相关性
使用本实施例制备的PGⅠ检测试剂盒（本试验中，简称“本发明PGⅠ试剂盒”）和本公司胶乳免疫比浊法PGⅡ检测试剂盒（本试验中，简称“本公司PGⅡ试剂盒”），采用日立7080全自动生化分析仪，对50份无乳糜、溶血、黄疸、浑浊现象的新鲜人血清进行检测，和对照试剂盒（北京某厂家的酶联免疫法胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ检测试剂盒，简称“酶免试剂盒”）的检测结果进行相关性分析。本发明PGⅠ试剂盒按照上述“胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法”进行检测，本公司PGⅡ试剂盒按照说明书进行检测，酶免试剂盒按照其说明书进行检测，检测结果如表8所示。
下表中，酶免方法试剂盒的参考范围是：PGⅠ(70-200ng/ml)；PGⅡ(0-15ng/ml)；PGⅠ/PGⅡ>7.5；本公司胶乳免疫比浊方法试剂盒的参考范围是：PGⅠ(70-240ng/ml)；PGⅡ(0-20ng/ml)；PGⅠ/PGⅡ>3。
表8本发明试剂盒与酶免方法试剂盒临床比对数据
由上表统计结果可以看出，在这50例新鲜病人血清中，共出现30例阴性结果和20例阳性结果，酶免试剂盒和本发明试剂盒在结果判断上是一一对应的,并且两个单项结果及其比值都存在临床许可范围内的吻合。两种方法的原理和参考范围虽然有一定的区别，但是从临床应用的角度来判断，二者的相关性良好，临床意义显著。
实施例3
一、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的制备
试剂1的制备：在80mmol/L、pH8.5的磷酸盐缓冲液中，添加4%的聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁、2.5％硫酸镁、1％吐温80、6％PEG-8000、5％山梨醇、0.1％Proclin300，即得到消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂1。
试剂2的制备：
（1）抗体交联：将0.5mg单抗/多抗比值为9:1的混合鸡抗人胃蛋白酶原ⅠIgY抗体用5ml50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释后，加入表面修饰氯甲基、直径250nm的聚苯乙烯胶乳溶液，再加入1.5mg EDAC，在37℃条件下反应8h，加入0.5ml80mmol/L的Tris-HCl缓冲液搅拌1h后终止反应；
（2）胶乳清洗：离心去除上清以清除多余的抗体、交联剂及交联反应的副产物等，底部沉淀即为包被好的胶乳。用20ml80mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次；
（3）胶乳悬浮：将10ml同样的Tris-HCl缓冲液加入到上述沉淀，超声波处理5min，混匀得均一的乳白色胶乳悬浮液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为4mg/ml，再添加0.1%的Proclin300，即得到消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒试剂2。
校准品的制备：在pH8.4、含有50mmol/L磷酸盐缓冲物的预处理人血清基质缓冲液中，人血清比例为5%，分别加入浓度为0、40、80、160ng/ml自胃癌细胞株培养、纯化而得的，纯度≥95％的胃蛋白酶原Ⅰ抗原，搅拌均匀，作为胃蛋白酶原Ⅰ多点校准品。此外，预处理的人血清基质缓冲液中还包含1％硫酸镁、4.5％山梨醇、0.1％Proclin300。
本实施例中制备的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法，同实施例1中“消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法”。
二、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的抗乳糜干扰能力
按照如下的操作方法检测胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的抗乳糜干扰性能：
（1）收集较低范围的测值相近的无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的人血清样本，进行混合，对该混合人血清样本进行测定，得到其胃蛋白酶原Ⅰ的值为10.4ng/ml；
（2）按照下表9、表10所示，在混合人血清中添加不同浓度梯度的乳糜干扰物；
（3）分别使用某厂家免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒（本试验中，简称试剂盒A）和本实施例制备的PGⅠ检测试剂盒（本试验中，简称试剂盒B），对添加了不同乳糜单位浓度的血清样本进行对照测定，重复3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10%以内视为无干扰，偏差范围超过±10%视为干扰。
表9试剂盒A测定添加不同浓度乳糜干扰物血清样本的结果
表10试剂盒B测定添加不同浓度乳糜干扰物血清样本的结果
表9结果显示，随乳糜浊度从0到8000的范围变化，试剂盒A的检测值偏差也随之增大，当乳糜浊度单位大于2000时，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均大于10%，判定为存在干扰。
表10结果显示，随乳糜浊度从0到8000的范围变化，试剂盒B的检测值偏差的变化较小，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均在±10%以内，判定为不存在干扰。
本试验显示了相比现有的免疫比浊方法试剂盒，本发明所述的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒明显提高了对乳糜的抗干扰能力。
三、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的灵敏度
按照如下的操作方法检测胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒的灵敏度：
（1）确定一个试剂可以检测准确的较低浓度值来与水空白比较，本试验选用2.1ng/ml的样本；
（2）检测20次水，记录吸光度数值，计算平均值（X水）和标准偏差(SD)；
（3）检测20次浓度为2.1ng/ml的样本，记录吸光度数值，计算平均值（X2.1）和标准偏差（SD）；
（4）水的吸光度平均值加上3SD作为最低检测限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和2.1ng/ml样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度即灵敏度。公式为2.1×（X水+3SD）/X2.1。
本实施例中制备的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒（本试验中，简称“本发明试剂盒”）和对照试剂盒（某厂家免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒）的灵敏度试验的数据结果如表11所示。
下表中，△A表示吸光度的差值。
表11本发明试剂盒与对照试剂盒灵敏度对比数据
本发明试剂盒的灵敏度=2.4×（31.85+3×2.0）/869.35=0.10ng/ml。
对照试剂盒的灵敏度=2.4×（20.3+3×9.8)/489.3=0.24ng/ml。
结果显示本发明试剂盒的灵敏度可达0.09ng/ml，优于对照试剂盒。
本发明试剂盒通过把一定比例的PGⅠ单克隆抗体和多克隆抗体用化学交联法结合到羧基修饰的胶乳颗粒上，一方面使抗原抗体结合反应更加迅速、牢固，另一方面通过胶乳凝集作用放大了反应的检测级数，从而实现试剂盒的灵敏度提高。由上述表11的结果可知，本发明试剂盒的灵敏度高于对照试剂盒的灵敏度，可见本发明试剂盒实现了灵敏度提高的效果。
四、消除乳糜干扰的胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒与酶免方法检测试剂盒的相关性
使用本实施例制备的PGⅠ检测试剂盒（本试验中，简称“本发明PGⅠ试剂盒”）和本公司胶乳免疫比浊法PGⅡ检测试剂盒（本试验中，简称“本公司PGⅡ试剂盒”），采用日立7080全自动生化分析仪，对50份无乳糜、溶血、黄疸、浑浊现象的新鲜人血清进行测定，和对照试剂盒（北京某厂家的酶联免疫法胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ检测试剂盒，简称“酶免试剂盒”）的检测结果进行相关性分析。本发明PGⅠ试剂盒按照上述“胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂盒检测样本的方法”进行测定，本公司PGⅡ试剂盒按照说明书进行检测，酶免试剂盒按照其说明书进行检测，检测结果如表12所示。
下表中，酶免方法试剂盒的参考范围是：PGⅠ(70-200ng/ml)；PGⅡ(0-15ng/ml)；PGⅠ/PGⅡ>7.5；本发明胶乳免疫比浊方法试剂盒的参考范围是：PGⅠ(70-240ng/ml)；PGⅡ(0-20ng/ml)；PGⅠ/PGⅡ>3。
表12本发明试剂盒与酶免方法试剂盒临床比对数据
由上表统计结果可以看出，在这50例新鲜病人血清中，共出现33例阴性结果和17例阳性结果，酶免试剂和本发明试剂在结果判断上是一一对应的,并且两个单项结果及其比值都存在临床许可范围内的吻合。两种方法的原理和参考范围虽然有一定的区别，但是从临床应用的角度来判断，二者的相关性良好，临床意义显著。
以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种胶乳免疫比浊法检测血清胃蛋白酶原I的检测试剂盒，其特征在于，包含试剂1、试剂2和多点胃蛋白酶原I校准品，其中：
所述试剂1包括电解质、乳糜消除剂、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；
所述试剂2包含抗人胃蛋白酶原I抗体包被的胶乳颗粒、防腐剂及缓冲液；
所述校准品包含电解质、防腐剂、稳定剂、不同浓度的胃蛋白酶原I抗原、人血清及缓冲液；
所述电解质为氯化钾或硫酸镁，浓度为1％-5％；
所述乳糜消除剂为1-5％聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁试剂；
所述促凝剂为PEG8000，浓度为2％-6％；
所述稳定剂为山梨醇，浓度为5％；
所述表面活性剂为吐温80，浓度为1％；
所述防腐剂为Proclin300，浓度为0.1％；
所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES-NaOH缓冲液；所述试剂1中，缓冲液缓冲能力为调节pH在7.0-9.0之间，浓度范围为10-100mmol/L；所述试剂2中，缓冲液缓冲能力为调节pH在7.0-9.0之间，浓度范围为10-100mmol/L；所述校准品中，缓冲液的浓度范围为10-100mmol/L，pH为6.5-8.5；
所述抗人胃蛋白酶原I抗体为单克隆抗体与多克隆抗体的混合，其中单抗/多抗的比值范围为5～10，抗体种类选自鸭抗人或鸡抗人IgY抗体；
所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳，直径为250nm，胶乳颗粒的表面修饰有功能团，修饰的功能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基；抗人胃蛋白酶原I抗体通过化学交联法包被到胶乳颗粒表面，化学交联剂选择碳化亚胺(EDAC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、酰肼、异氰酸酯中的一种；交联缓冲液选自MES、MOPSO、MOPS、HEPES缓冲液，pH在6.0-8.0之间，致敏的抗体胶乳颗粒浓度为0.5-5mg/mL；
所述校准品采用多点定标，校准品中，胃蛋白酶原I抗原来源于自人体体液提取、纯化而得的天然胃蛋白酶原I抗原，或自胃癌细胞株培养、纯化而得的胃蛋白酶原I抗原，其纯度≥95％，浓度为0-200ng/mL；添加人血清比例为5％；缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH为8.4，浓度为50mmol/L；电解质为硫酸镁，浓度为1％；稳定剂为山梨醇，浓度为4.5％；防腐剂为Proclin300，浓度为0.1％。
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