CN103675299A

CN103675299A - 一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法

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Publication number: CN103675299A
Application number: CN201310724601.2A
Authority: CN
Inventors: 杨杰; 王泉龙; 朱晓敏; 刘颖冰
Original assignee: SHANGHAI BEIJIA BIOCHEMICAL REAGENT CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BEIJIA BIOCHEMICAL REAGENT CO Ltd
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明提供了一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括两种试剂，Ⅰ试剂由磷酸盐缓冲液组成，Ⅱ试剂是兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体交联在胶乳颗粒上构成的悬浊液。解决了现有技术采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定纤维连接蛋白浓度步骤复杂，准确性不高、重复性差问题。本发明还提供采用上述试剂盒检测人尿液中纤维连接蛋白浓度的方法，本发明的试剂盒和方法用于测定尿液中纤维连接蛋白浓度步骤简单，准确度高、重复性好，用于自动化分析仪。

Description

一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种检测试剂盒，特别是一种采用增强胶乳免疫比浊法检测人尿液中纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白（FN）浓度的试剂盒及其方法。

背景技术

纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白（Fibronectin，简称FN），有两条相类似的多肽链亚基组成，亚基的分子量为220-250KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度，其缺点为操作繁琐、工作强度大、保持时间长，一般需8-48小时、其定量的精确度差。

因尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度低，所以国内外至今未见有用本试剂盒及方法的报导。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法，所述的这种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法要解决现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定尿纤维连接蛋白（FN）浓度过程复杂，准确性不高的技术问题。

本发明提供了一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括两种试剂，Ⅰ试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-NA₂）和曲拉通100（TX-100）组成，在所述的Ⅰ试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L，所述的PEG6000-8000的质量百分比浓度为50g/L，所述的EDTA-NA₂的质量百分比浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，Ⅱ试剂是兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体交联在胶乳颗粒上构成的悬浊液。

进一步的，所述的II试剂是利用碳二亚胺反应将兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或纯化后的鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体IgG共价结合到胶乳颗粒上。

具体的，胶乳颗粒的直径为60－160nm，材料为聚苯乙烯。

具体的，上述的曲拉通100的纯度为100％。

进一步的，所述的兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清的效价为1:64。

本发明还提供了一种检测人尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度的方法,采用上述的试剂盒，包括一个将尿样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将尿样本采用生化分析仪测定的步骤中，将尿样品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A=样本A2-样本A1；还包括一个将尿校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将尿校准采用生化分析仪测定的步骤中，将尿校准品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A=校准A2-校准A1；

结果计算：

上述测定的参数为（增强乳胶免疫比浊法）：温度37℃,主波长546nm或600nm、副波长700nm，尿样本或校准品3-4μl,R₁：240μl,R₂：60μl，反应时间为10分钟。

本发明的兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体可以在市场购买，也可以通过常规的免疫方法制备，化学试剂由市场购备。

本发明是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆或多克隆纤维连接蛋白单（FN）抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，增加了溶液中反应浊度，即透光度减少，吸光度增加反应人尿液中纤维连接蛋白单（FN）的浓度。

本发明的试剂盒和方法是采用增强胶乳免疫比浊法的测定原理，即利用纤维连接蛋白（FN）抗原和特异性抗体（兔抗人纤维连接蛋白（FN）抗血清）相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浑浊，其浊度高低，即透光度减少、吸光度增加反映人尿液样本中纤维连接蛋白（FN）的浓度，尿纤维连接蛋白（FN）的浓度可由校准品所作的剂量反应曲线算出。

采用本发明的试剂盒和方法测得的尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度可以作为科研和教学及临床使用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的试剂盒和方法用于测定尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度的过程简单方便，准确性高。同时，本发明还可以用于泌尿系统的肿瘤早期筛查。

附图说明

图1是由尿校准品所作的纤维连接蛋白（FN）浓度和吸光度的剂量反应曲线图。

具体实施方式

实施例1

本发明提供了一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括两种试剂，Ⅰ试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-NA₂）和曲拉通100（TX-100）组成，在所述的Ⅰ试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L，所述的PEG6000的质量百分比浓度为50g/L，所述的EDTA-NA₂的质量百分比浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，Ⅱ试剂是兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体交联在胶乳颗粒上构成的悬浊液。

具体的，胶乳颗粒的直径为60－160nm，材料为聚苯乙烯。

具体的，上述的曲拉通100的纯度为100％。

实施例2

2.1适用仪器

半自动、全自动生化分析仪。

2.2分析方法

免疫透射比浊法。

2.3性能要求

2.3.1试剂外观

R1：无色澄清透明液体；

R2：乳白色混悬液。

2.3.2试剂空白吸光度(A)

吸光度(A)：R₁+R₂≤2600A（在温度37℃；主波长546nm、600nm（副波长700nm））。

2.3.3精密度

2.3.3.1批内精密度

CV≤10%。

2.3.4批间精密度

相对极差≤10%。

2.3.5准确度

不准确度：±10%的范围以内。

2.3.6分析灵敏度

吸光度（A）>2600A。

2.3.7线性

在20mg/L-100mg/L范围内，相关系数（γ）≥0.9900。

2.3.8稳定性

试剂在2℃-8℃避光贮存至有效期末前后两个月，进行检测，其质量符合上项的规定。

实施例3 实验方法

3.1检测条件

3.1.1生化分析仪（以下简称仪器）

日立7060自动生化分析仪。

3.1.2工作环境温度

室温15-32℃。

室内湿度45-85%RH。

3.1.3主要测定参数及操作步骤

温度37℃；主波长600nm（副波长700nm），尿样本或尿校准品3μl；R₁：240μl；R₂：60μl，反应时间10分钟。

方法类型：二点终点法。

尿样本或尿校准品加试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点(A1)，加入试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点(A2)，样本A=A2-A1。

结果计算：

3.1.4校准品

本标准中所用校准品为本公司生产的标准品。

3.2试剂外观

光下目测试剂盒，R1：无色澄清透明液体；R2：混悬液。

3.3试剂空白吸光度值

取R₁240μl，加蒸馏水3μl，置37℃孵育5min后，加入R₂60μl，置37℃孵育5min后，在7060自动生化分析仪上，用600nm波长，测定其吸光度值应符合实施例1中1.3.2项的规定。

3.4精密度

3.4.1批内精密度试验方法

在仪器正常工作条件下，用同一批试剂，连续测试（约100mg/L）样本20次，计算其测量值的平均值

和标准差(SD)，再按以下公式计算变异系数(CV%)的值，其结果应符合实施例1中1.3.3.1项的规定。

n

SD={∑（Xi-X）²/（N-1）}^1/2

I=1

CV = SD / \overset{&OverBar;}{X} \times 100 %

式中：SD—标准偏差；

CV—变异系数；

—n次测定值的均值；

Xi—第i次的测定值；

n—测量次数。

3.4.2批间精密度试验方法

在仪器正常工作条件下，取三个批号试剂，每个批号取一套。分别测定（约200mg/L）样本各3次。然后计算每批测定结果的均值

和三批试剂测定结果的总均值

按照下列公式求出三个批号试剂的测定均值的相对极差(%)，其结果应符合实施例1中1.3.4项的规定。

式中：

为

中最大值，

为中最小值。

3.5准确度

在仪器正常工作条件下，试剂用本公司生产的标准品经定标后，测定已知浓度的样本，重复测定10次，其测量结果的均值的相对偏差应符合实施例1中1.3.5项的规定。

RE%=绝对偏差/TV×100%

绝对偏差=检测结果均值-标准品靶值

式中：TV—测定标准品的靶值

3.6分析灵敏度

R₁试剂240μl，加入20mg/L样本3μl，置37℃孵育5min后，加入R₂60μl，置37℃孵育5min后，在7060自动生化分析仪上，用600nm，主波长（副波长700nm），测吸光度，其结果应符合实施例1中1.3.6项的规定。

3.7线性试验

样本或校准品：选用按实施例3配制的1^#、2^#、3^#、4^#、和5^#各测试浓度样本或校准品。

测定步骤：在仪器正常工作条件下，经定标后，用试剂测定以上五个浓度样本或校准品，每一浓度样本或校准品分别测定3次，取均值为实测值Yi。

计算：按以下公式计算相关系数γ，其结果应符合实施例1中1.3.7项的规定。

γ = (nΣ X_{i} Y_{i} - Σ X_{i} \cdot Σ Y_{i}) / \sqrt \overset{&OverBar;}{[nΣ {X_{i}}^{2} - {(Σ X_{i})}^{2}] [nΣ {Y_{i}}^{2} - {(Σ Y_{i})}^{2}]}

式中：γ—相关系数

Xi—i^#样本的理论值

Yi—i^#样本的实测值

i—不同浓度测试样本的编号

5.8稳定性

取在规定贮存条件下保存至有效期末前后二个月内的试剂进行检测，其结果应符合实施例1中1.3.8项的规定。

实施例4 试剂的配制

取一含量约为100mg/L的尿样本，为样本5^#，将样本5^#按下表方法用生理盐水或纯水配制成5个测试样本。（此样本现用现配）

	1^#	2^#	3^#	4^#	5^#
						校准品	—	2μl	4μl	6μl	3μl
生理盐水	3μl	8μl	6μl	4μl	—
						稀释后取样量	—	3μl	3μl	3μl	—
浓度（mg/L）	0	20	40	60	100

样本或校准品加试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点(A1)，加入试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点(A2)，样本A=A2-A1。

结果计算：

通过上述样品的测定，得到了图1所示的尿液纤维连接蛋白（FN）浓度和吸光度的剂量反应曲线图。（图1是根据主波长600nm的OD值所做的曲线，副波长700nm的仅供参考用。）

通过图1，测定了100例正常人的尿液，纤维连接蛋白（FN）在尿液中正常参考值：20mg/L以下，说明采用本发明的试剂盒和方法测定的尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度还是准确的和可靠的。

100例正常人人尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度（mg/L）

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											数值	6mg	2mg	3mg	11mg	7mg	8mg	2mg	1mg	5mg	12mg
编号	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
											数值	13mg	7mg	4mg	5mg	12mg	16mg	3mg	5mg	12mg	14mg
编号	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
											数值	19mg	15mg	11mg	15mg	17mg	16mg	12mg	9mg	8mg	13mg
编号	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
											数值	12mg	7mg	5mg	6mg	11mg	12mg	17mg	19mg	15mg	15mg
编号	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50
											数值	7mg	8mg	3mg	8mg	7mg	9mg	11mg	13mg	4mg	7mg
编号	51	52	53	54	55	56	57	58	59	60
											数值	15mg	6mg	8mg	11mg	12mg	15mg	8mg	7mg	11mg	12mg
编号	61	62	63	64	65	66	67	68	69	70
											数值	4mg	3mg	6mg	7mg	9mg	13mg	15mg	11mg	8mg	9mg
编号	71	72	73	74	75	76	77	78	79	80
											数值	6mg	5mg	12mg	8mg	11mg	9mg	15mg	10mg	8mg	9mg
编号	81	82	83	84	85	86	87	88	89	90
											数值	13mg	12mg	9mg	5mg	4mg	6mg	8mg	11mg	13mg	9mg
编号	91	92	93	94	95	96	97	98	99	100
											数值	15mg	11mg	7mg	8mg	11mg	6mg	15mg	13mg	12mg	7mg

Claims

1.一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括两种试剂，其特征在于：Ⅰ试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000、EDTA-NA₂和TX-100组成，在所述的Ⅰ试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L，所述的PEG6000-8000的质量百分比浓度为50g/L，所述的EDTA-NA₂的质量百分比浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，Ⅱ试剂是兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体交联在胶乳颗粒上构成的悬浊液。

2.如权利要求1所述的一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：所述的II试剂是利用碳二亚胺反应将兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或纯化后的鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体IgG共价结合到胶乳颗粒上。

3.如权利要求1所述的一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：所述的兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清的效价为1:64。

4.采用权利要求1的试剂盒检测尿液中纤维连接蛋白浓度的方法,其特征在于：包括一个将尿样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将尿样本采用生化分析仪测定的步骤中，将尿样品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A=样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤中，将校准品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A=校准A2-校准A1；

上述测定的参数为：温度37℃,主波长546nm或600nm、副波长700nm，样本或校准品3-4μl,R₁：240μl,R₂：60μl，反应时间为10分钟。