CN103675261A - 荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开一种荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，具体为：氨基修饰的荧光微球与活泼酯化的生物素偶联，将链霉亲和素与上述偶联物以1000:1的比例混合反应后，得到荧光微球与生物素-链霉亲和素的偶联物，最后将生物素化的克伦特罗单克隆抗体加入到荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物溶液中反应即可得到目标产物。本发明得到的荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物能有效应用于克伦特罗荧光微球试纸条中，相应地提高了试纸条的特异性、灵敏度，从而能快速准确地定性且定量检测动物性食品中克伦特罗的残留量。
Description
技术领域
本发明属于食品安全中β2-受体激动剂残留检测领域，具体涉及一种用荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的偶联物及其制备方法。
背景技术
克伦特罗(clenbuterol)作为一种β2-受体激动剂能起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，常以其盐酸盐的形式使用，在临床上能用于人和动物哮喘类病症的治疗。但用超过治疗剂量的盐酸克伦特罗长期给动物饲喂时，它在动物体内具有营养再分配作用，能显著提高瘦肉率及减少脂肪率，故很多不法分子常将盐酸克伦特罗作为饲料添加剂用于动物饲养中，从而使肉品瘦肉率增加、提早上市、降低成本。盐酸克伦特罗的滥用势必会在畜产品中残留，而给人类的健康带来相当大的威胁。
免疫层析技术由于具有快速、准确、方便的优点，在盐酸克伦特罗及其替代物的检测应用上已得到很大的推广，它是以抗原抗体间的特异性反应为基础，通过标记物对某种物质进行定性或定量检测的研究手段。目前，常用于免疫层析技术检测盐酸克伦特罗的标记物有胶体金、荧光微球等，这些标记物保持了克伦特罗单克隆抗体的活性，而标记物的活性不受影响，当它与相应抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，直接对目标物质进行定性甚至定量分析。
目前，标记物与抗体之间大多是通过共价键或物理吸附的方式直接偶联，特别是β-受体激动剂抗体的标记。该种偶联方式有偶联时间短、操作简单的优点，但这种偶联方式，由于抗体任意与标记物结合使一些抗原结合位点被屏蔽，即所谓的空间位阻，导致抗体标记效率和标记物的分散性降低。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，该方法减少了抗体与荧光微球相连的空间位阻，提高了标记效率高，制得的偶联物能表现出良好的胶体稳定性和结合性能。
为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：
荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法：(1)氨基修饰的荧光微球与活泼酯化的生物素在PBS溶液中偶联反应2 h得到荧光微球-生物素偶联物，再离心、洗涤除去未结合的生物素；(2)将链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合轻摇反应2 h后，离心、用PBS溶液洗涤移除未偶联的链霉亲和素，得到荧光微球-生物素-链霉亲和素偶联物；(3)将生物素化的克伦特罗单克隆抗体加入到荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物溶液中轻摇反应1 h后，洗涤、离心以除去未偶联上的生物素化克伦特罗单克隆抗体，即得到荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体即荧光微球-生物素-链霉亲和素-生物素化克伦特罗单克隆抗体；所述活泼酯化的生物素为将生物素-PEG5000复合物溶于DMF溶液中，加入二环己基碳亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺后室温搅拌反应24 h，然后离心弃沉淀，得到活泼酯化的生物素；所述氨基修饰的荧光微球的制备方法：10 mg荧光微球洗净后超声溶解于1 mL蒸馏水中，加入20 μL冰乙酸和20 μL(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超声溶解后，磁力搅拌3～4 h，用10 mM pH5.5的MES缓冲液洗涤并重悬；所述荧光微球粒径为175 nm。
所述生物素化克伦特罗单克隆抗体的的制备方法：用1 mL DMSO溶液溶解生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯NHSB配制成浓度为1 mg/mL的溶液，取120 μL加入到1mL克伦特罗单克隆抗体溶液中，在室温下持续搅拌，保温2~4 h；然后加入9.6 μL 1 mol/L的NH4Cl 溶液在室温下搅拌10 min，用PBS溶液在4℃下充分透析除去游离的生物素；将透析完后的样品上1 ml 的分子筛柱，以PBS溶液缓慢洗脱，抗体在1~3 ml 之间洗下，再在收集到的目标产物中加入叠氮钠及1.0 g/L的BSA溶液，在4 ℃下避光保存备用。
所述链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合反应的投料摩尔比为1000:1。
所述荧光微球标记生物素化克伦特罗单克隆抗体与荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物的投料摩尔比为1:1000。
本发明的有益效果是：
1、标记效率高：与传统的荧光微球直接偶联抗体相比，生物素-链霉亲和素作为偶联臂使荧光微球与克伦特罗单克隆抗体之间结合的空间位阻效应减小，而且一个荧光微球-PEG5000-生物素-链霉亲和素能与生物素化抗体1:4的偶联，从而使标记效率得到了相应地提高。
2、分散性和可溶性好：与荧光微球结合的生物素是用亲水性的PEG5000修饰的复合物，亲水性的PEG5000的嵌入提高了荧光微球-抗体偶联物的在复溶液中的可溶性，而且因为较长的偶联臂，偶联物能很好的分散在溶液中，基本不会发生絮凝沉淀，表现出良好的胶体稳定性。
3、结合性强：PEG5000-生物素-链霉亲和素偶联臂与克伦特罗单克隆抗体上的生物素结合后，保证了荧光微球表面的抗体结合位点定向分布，增强了荧光微球-克伦特罗单克隆抗体偶联物与目标被检物质的结合性能，这点主要体现在提高的荧光微球试纸条的灵敏度和稳定性。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解：
图1本发明制得的荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体。
具体实施方式
本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
生物素-PEG5000复合物购于上海炎怡生物有限公司；
荧光微球购于德国Merck公司，粒径为175 nm。
实施例1：本发明中荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物的制备方法
1、氨基修饰的荧光微球的制备方法
10 mg荧光微球洗净后超声溶解于1 mL蒸馏水中，加入20 μL冰乙酸和20 μL(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超声溶解后，磁力搅拌3～4 h，用10 mM的MES缓冲液(pH5.5)洗涤并重悬。
、活泼酯化的生物素的制备方法
准确称取4.5 mg生物素-PEG5000复合物溶于2 mL的DMF溶液中，加入20.5 mg二环己基碳亚胺和10.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺后，室温磁力搅拌反应24 h，然后以4000 rpm离心5 min，弃沉淀，得到活泼酯化的生物素，备用。
3、荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，其特征在于：所述生物素化克伦特罗单克隆抗体的的制备方法：用1 mL DMSO溶液溶解生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHSB)配制成浓度为1 mg/mL的溶液，取120μL加入到1mL浓度为1.7 mg/mL的克伦特罗单克隆抗体溶液中，在室温下持续搅拌，保温2~4h；然后加入9.6 μL的NH4Cl (1 mol/L)溶液在室温下搅拌10 min，用PBS溶液在4 ℃下充分透析除去游离的生物素；将透析完后的样品上1 ml 的分子筛柱，以PBS溶液缓慢洗脱，抗体在1~3 ml 之间洗下，再在收集到的目标产物中加入叠氮钠及1.0 g/L的BSA溶液，在4 ℃下避光保存备用。
4、以5 mL体系标记35 μg/mg(抗体/微球)的免疫微球，具体方法：2.0 mg氨基修饰的荧光微球与3.5 mg活泼酯化的生物素在5 mL的PBS溶液(pH 7.4左右)中偶联反应2 h，再离心、洗涤除去未结合的生物素，得到荧光微球-生物素偶联物；将上述制得的荧光微球-生物素偶联物加入到10 mg/mL链霉亲和素溶液中，所述链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合反应的投料摩尔比为1000:1，保证终体积为5 mL，轻摇反应2 h后，离心、用PBS缓冲溶液洗涤移除未偶联的链霉亲和素，得到荧光微球-生物素-链霉亲和素偶联物；再将相应标记量的生物素化的克伦特罗单克隆抗体(稀释10倍并缓慢加入)加入到上述偶联物溶液至终浓度为35 μg/mg，轻摇反应1 h后，洗涤、离心以除去未偶联上的生物素化抗体，即得到荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物，用500 μL复溶液复溶。
上述制得的新型偶联物与传统的荧光微球-抗体偶联物相比，在电镜下观察分散性明显更好，在4 ℃条件下放置6个月后，仍很透明，不会发生絮凝沉淀现象，表现出良好的胶体稳定性。其较强的结合能力则通过下面实施例中的荧光微球试纸条灵敏度提高得到体现。
实施例2：荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物在荧光微球试纸条上的应用
1、荧光微球免疫层析试纸条的制备
荧光微球垫的制备：用0.01 M的PNPB(其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)复溶实施例1制得的偶联物至起始体积后，用BIODOT Dispensing System，按照4 μL/cm的量喷涂至玻璃纤维膜上，25 ℃真空干燥1～2 h，放于干燥环境备用。
克伦特罗-BSA偶联物和驴抗鼠二抗包被到NC膜上：分别用0.01 M的PBS缓冲液调节包被物浓度为0.4 mg/mL和0.4 mg/mL，喷膜量为0.74 μL/cm，检测线包被克伦特罗-BSA偶联物，质控线包被驴抗鼠二抗，两区位置相隔6 mm，质控线距NC膜顶端10 mm，检测线距NC膜底端9 mm，37℃烘干处理过夜后，于室温干燥的环境下保存备用。
荧光微球免疫层析试纸条的制备：在底板上依次搭连地粘贴滤纸、样本垫、荧光微球垫、NC膜和吸水纸，粘贴好的试纸条板用切割机裁切成试纸条，并组装到准备好的试纸条盒中，装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环境下至少可保存一年。
、荧光微球试纸条定量检测猪肉中的克伦特罗
样品前处理：取2.5 g猪肉样品于50 mL离心管中，加入5 mL蒸馏水在沸水中加热提取15 min，取出全部上清于新的10 mL离心管中，加入1 mL正已烷轻摇后静置1 min，移除上面脂肪层，下层清液备用。
检测步骤：(1)把阴性样本和添加系列浓度(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、15 ng/mL)的样本提取液加入试纸条样本孔中，反应10 min后，将检测试纸条放入荧光微球读取仪检测窗口；
(2)荧光微球在LED灯源激发下，发出强烈的荧光；
(3)发射的荧光经CCD扫描系统汇聚后，经过光电聚集管，送入光电倍增管，光信号得到增强，在经过信号转换元件，经过软件处理后，荧光的强弱以数值的高低输入出来。
(4)实验过程中，以系列浓度测出其对应的荧光强度的数值，从而根据这一系列数值和克伦特罗标准品对应浓度建立一条标准曲线。最后根据检测样本的输出数值，计算出检测样本中克伦特罗的含量。
(5)吸取100 μL提取液，进行检测，最后根据检测样本的数据输出的数值分别为4.08，查标准曲线图得出检测样本中克伦特罗的残留量为0。
实施例3：用荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物制备的荧光微球试纸条上检测猪肝中的克伦特罗残留量
样品前处理方法、试纸条制作同实施例2。
定性、定量检测方法同实施例2，以添加系列浓度(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、15 ng/mL)和对应的荧光强度值绘制标准曲线。吸取100 μL提取液加入样本孔中，10 min后用读取仪进行检测，根据检测样本的数据输出的数值分别为3.67，查标准曲线图得出检测样本中克伦特罗的残留量0.8 ng/mL。
实施例4：用荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物制备的荧光微球试纸条上检测饲料中的克伦特罗残留量
样品前处理：称取0.5 g饲料样品，加入1 mL样品提取液(pH7.0 50 mmol/L Tris-HCl)，在试管中搅拌1 min，静置10 min后，取上层清液作待测样品。
试纸条制作同实施例2。
定性、定量检测方法同实施例2，以添加系列浓度(0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、7、10、15 ng/mL)和对应的荧光强度值绘制标准曲线。吸取100 μL提取液加入样本孔中，10 min后用读取仪进行检测，根据检测样本的数据输出的数值分别为4.03，查标准曲线图得出检测样本中克伦特罗的残留量为0。
实施例5：用荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的新型偶联物制备的荧光微球试纸条上检测猪尿中的克伦特罗残留量
尿样可直接进行检测，不需前处理。定性、定量检测方法同实施例2，以添加系列浓度(0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10 ng/mL)和对应的荧光强度值绘制标准曲线。吸取100 μL尿样加入样本孔中，10 min后用读取仪进行检测，根据检测样本的数据输出的数值分别为2.79，查标准曲线图得出检测样本中克伦特罗的残留量为1.46 ng /mL。
Claims (4)
1.荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，其特征在于：(1)氨基修饰的荧光微球与活泼酯化的生物素在PBS溶液中偶联反应2 h得到荧光微球-生物素偶联物，再离心、洗涤除去未结合的生物素；(2)将链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合轻摇反应2 h后，离心、用PBS溶液洗涤移除未偶联的链霉亲和素，得到荧光微球-生物素-链霉亲和素偶联物；(3)将生物素化的克伦特罗单克隆抗体加入到荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物溶液中轻摇反应1 h后，洗涤、离心以除去未偶联上的生物素化克伦特罗单克隆抗体，即得到荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体即荧光微球-生物素-链霉亲和素-生物素化克伦特罗单克隆抗体；
所述活泼酯化的生物素为将生物素-PEG5000复合物溶于DMF溶液中，加入二环己基碳亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺后室温搅拌反应24 h，然后离心弃沉淀，得到活泼酯化的生物素；所述氨基修饰的荧光微球的制备方法：10 mg荧光微球洗净后超声溶解于1 mL蒸馏水中，加入20 μL冰乙酸和20 μL(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超声溶解后，磁力搅拌3～4 h，用10 mM pH5.5的MES缓冲液洗涤并重悬；所述荧光微球粒径为175 nm。
2.根据权利要求1所述的荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，其特征在于：所述生物素化克伦特罗单克隆抗体的的制备方法：用1 mL DMSO溶液溶解生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯NHSB配制成浓度为1 mg/mL的溶液，取120 μL加入到1mL浓度为1.7 mg/mL克伦特罗单克隆抗体溶液中，在室温下持续搅拌，保温2~4 h；然后加入9.6 μL 1 mol/L的NH4Cl 溶液在室温下搅拌10 min，用PBS溶液在4℃下充分透析除去游离的生物素；将透析完后的样品上1 ml 的分子筛柱，以PBS溶液缓慢洗脱，抗体在1~3 ml 之间洗下，再在收集到的目标产物中加入叠氮钠及1.0 g/L的BSA溶液，在4 ℃下避光保存备用。
3.根据权利要求1所述的荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，其特征在于：所述链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合反应的投料摩尔比为1000:1。
4.根据权利要求1所述的荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，其特征在于：所述荧光微球标记生物素化克伦特罗单克隆抗体与荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物的投料摩尔比为1:1000。
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