CN103656684A - 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，减毒鼠伤寒沙门氏菌对胰腺癌细胞具有肿瘤靶向性及显著的抑制效应，并且由其与质粒所构建的基因工程菌同样具有肿瘤靶向性，且带有克隆有L-methioninase基因的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以在肿瘤组织持续表达L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓慢，因此均可以用于制备治疗胰腺癌的药物。

Description

减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用。

背景技术

胰腺癌是一种发病隐匿、进展快、预后差、恶性程度高的消化系统肿瘤。中国胰腺癌的发病率和死亡率呈现出逐年升高的趋势，男性和女性胰腺癌患者的死亡率在所有恶性肿瘤中分别排第六位和第七位。据报道，胰腺癌患者的相对5年生存率仅5.5%。目前，胰腺癌的治疗主要包括外科治疗、辅助治疗、姑息及支持治疗几个方面。由于胰腺位于胃后方，位置隐蔽，所以胰腺肿瘤往往受到忽视。目前全球来说，能够及时发现并且可以手术的早期胰腺癌患者只占10%到15%，绝大多数胰腺癌患者一旦确诊就是晚期。因此，胰腺癌的治疗现状非常严峻，即使手术治疗五年生存率也很低下，而非手术治疗，如放化疗治疗的晚期胰腺癌病人生存率约5.8个月，中位生存时间仅6个月。吉西他滨作为胰腺癌治疗标准疗法的历史已经超过15年了，虽然很多药物进行过很多次临床试验，但是只有很少药物的疗效能够赶超吉西他滨。临床专家尝试用氟尿嘧啶、草酸铂和开普拓的联合治疗，患者生存时间也没超过一年。而且，这类化学药物不可避免地会对患者产生严重的毒副作用，影响生活质量。因此，科学家和临床专家们一直在积极探索更为安全有效的治疗方案。随着细菌以及病毒的靶向性和基因工程技术的发展，20世纪90年代中期以来，细菌治疗肿瘤的研究急速增多。研究人员发现鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内能够定向并有效地杀死肿瘤细胞。

沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。VNP20009为msbB、pur I基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株，遗传稳定，对抗生素敏感。msbB基因为脂质酰化为内毒素所必需，其缺失使类脂质A末端不能酰化，降低了毒性；pur I基因参与嘌呤代谢，其缺失使细菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009还降低了自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），从而降低炎性反应。因此，它的低致病性提高了用于临床治疗的安全性。VNP20009已被广泛用于癌症研究，它可作用于多种小鼠实体瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌。VNP20009作为肿瘤基因治疗载体的一个主要优点是它能够高度靶向聚集于肿瘤部位。研究人员在多种实体肿瘤的小鼠模型中发现，VNP20009在肿瘤内的数量较肝脏等主要器官内高200～l000倍。VNP20009能在肿瘤组织缺氧坏死区优先聚集并繁殖，相同时间内肿瘤组织内细菌的扩增代次显著高于正常组织,使得减毒沙门菌成为新型抗瘤制剂和肿瘤靶向治疗的载体成为可能。沙门菌导致肿瘤生长减慢可能机制包括：肿瘤生长所需要的营养物质为细菌所消耗，细菌所产生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭肿瘤生长必需氨基酸；细菌向胞外微环境分泌的局部毒素或者产生的肿瘤坏死因子α，都可影响肿瘤血管形成；此外，在细菌生长部位的非特异性炎症反应可潜在激活抗肿瘤T细胞。但尚未发现VNP20009对胰腺癌细胞的抗肿瘤活性。

肿瘤细胞为了维持其高增殖率，需要足够的营养，除糖之外，对甲硫氨酸（Methionine，Met）、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究证实Met依赖性是绝大多数肿瘤细胞的共同特征，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等，而正常细胞不存在Met依赖性。一些体内体外实验相继证实，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延缓肿瘤细胞的增殖。但是若膳食中Met长期缺乏或不足，将会引起机体营养不良、代谢障碍，还可因DNA长期处于低甲基化状态加剧癌变。那么，通过甲硫氨酸酶（L-methioninase）特异性地将Met分解，从而降低体内甲硫氨酸水平，则能更加有效地抑制肿瘤细胞生长或使之消退。动物实验已证明经腹膜内注射甲硫氨酸酶可以抑制裸鼠的吉田肉瘤和肺肿瘤的增长。临床试验选四个分别患有乳腺癌、肺癌、肾癌和淋巴瘤的患者每24h静脉注射一次甲硫氨酸酶，发现甲硫氨酸酶可以明显减少血浆中甲硫氨酸含量。但是，由于哺乳动物本身不表达甲硫氨酸酶，所以外源性给与的方式有一定的副作用，往往引起机体的免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的生物药物上的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明提出了减毒鼠伤寒沙门氏菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

本发明同时提出一种基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，所述基因工程菌为携带质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

其中，所述质粒为pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。所述质粒通过电转化转移至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中。所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。

本发明还提出一种基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，所述基因工程菌为携带质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，且其中所述质粒上克隆有L-methioninase基因。

其中，所述的质粒为pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。所述基因工程菌的构建方法为：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。

最为优选，在构建基因工程菌的过程中，当选用pSVSPORT质粒时，将L-methioninase基因通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，然后将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中得到基因工程菌。

上述的减毒鼠伤寒沙门氏菌和基因工程菌的给药方式优选为瘤内注射。

有益效果：减毒鼠伤寒沙门氏菌对胰腺癌细胞具有肿瘤靶向性及显著的抑制效应，同时，其与质粒构建的基因工程菌同样具有肿瘤靶向性，且带有克隆有L-methioninase基因的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以在肿瘤组织持续表达L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓慢，因此可以用于制备治疗胰腺癌的药物。

附图说明

图1是质粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鉴定1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2是Western blot鉴定methioninase表达结果图。

图3是检测沙门氏菌中methioninase活性结果图。

图4是注射沙门菌对裸鼠体重的影响结果图。

图5是给与沙门菌后肿瘤体积变化曲线图。

图6是给予沙门菌3周后肿瘤的大小结果图。

图7是给予沙门菌4周后肿瘤组织HE染色结果图。

图8是两侧种瘤，单侧给药后肿瘤组织中沙门菌含量结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：基因工程菌的构建。

（1）构建表达L-methioninase基因的质粒。

先合成L-methioninase（GenBank：L43133.1）基因亚克隆至pUC57质粒（金斯瑞公司），接着通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒（invitrogen），得到pSVSPORT-L-methioninase表达质粒。具体构建过程如下：

将pSVSPORT质粒用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为：2μg质粒DNA，3μL10×buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH₂O补足体积至30μL，37℃温浴3h。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.1kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。

通过全基因合成得到L-methioninase编码区域DNA片段亚克隆至pUC57质粒（金斯瑞公司），用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为：3μg质粒DNA，3μL10×buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH₂O补足体积至30μL，37℃温浴3h。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.2kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。

将pSVSPORT（Kpn I/Hind III）和L-methioninase编码区域DNA片段（Kpn I/HindIII）连接，连接反应中加入2μL载体、6μL插入片段、1μL T4DNA连接酶，16℃温浴16h。

将连接产物转化到E.coli DH5α（Takara）的感受态细胞中。取一管50μL的DH5α感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μL上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30min；42℃热击60s，后冰上静置2min；加入500μL无抗性的LB液体培养基，37℃震荡培养1h；4000rpm离心5min，吸走，保留100μL左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37℃温箱培养16h。

克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养16h，提取质粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鉴定，阳性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的两条DNA条带，如图1所示。再通过测序进一步确定阳性克隆的序列完全正确。

（2）构建携带质粒的VNP20009菌和携带克隆有L-methioninase的基因的质粒的VNP20009菌。

将pSVSPORT和pSVSPORT-L-methioninase表达质粒分别电转化至VNP20009菌株（YS1646，ATCC号202165），分别命名为VNP20009-V和VNP20009-M。具体构建过程如下：

将感受态细菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入预冷电转杯，向其中加入2μL质粒，轻弹混匀，于冰上孵育1min。将电转杯放入电转仪，条件设置为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。电击完立刻加入1mL SOC培养基，轻轻混匀。37℃震荡培养1h；4000rpm离心5min，吸走，保留100μL左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB-O培养基平板上。然后将平板置于37℃温箱培养16h。VNP20009-V和VNP20009-M用LB-O培养后，提取质粒，酶切鉴定正确。

取1×10⁸沙门菌用蛋白裂解液提取蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳，再稳压冰浴电转至PVDF膜，BSA室温封闭1h后，TBST漂洗3×5min，加入兔抗L-methioninase抗体（1：1000），4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗（1：10000），室温孵育1h，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。结果如图2所示，在分子量约43kD处有特异性条带，说明VNP20009-M与VNP20009、VNP20009-V相比，L-methioninase表达量显著提高。

将L-甲硫氨酸和吡哆醛分别与VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M菌体混合，37℃孵育10min后用50%三氯乙酸终止，离心取上清，与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物（MBTH）充分混匀，50℃孵育30min后，测定320nm处的吸光值，以每分钟催化转化1μmolα-酮丁酸的酶量定义为1个酶活性单位。结果显示（图3），沙门菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009和VNP20009-V高10倍。

实施例2：VNP20009及其基因工程菌的抗肿瘤效果。

1、用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养CFPAC-1胰腺癌细胞，以细胞数2×10⁶个皮下接种于裸鼠右侧腋下。每隔2～3天，观察小鼠状态，用游标卡尺测量肿瘤大小（体积=0.52×长×宽²）。待肿瘤体积达到0.1～0.2cm³时，将荷瘤裸鼠随机分组：PBS组、VNP20009组、VNP20009-V组和VNP20009-M组。

2、用LB-O培养VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M，当OD≈0.6时，收集菌体，然后用PBS重悬，以2×10⁶CFU/只的剂量，采用瘤内注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。6天以后，以相同剂量第二次给药。给药后，观察裸鼠的活动、进食、体重。结果如图4所示，注射细菌后，小鼠体重未受影响。而且裸鼠的进食、粪便也无异常，说明VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M对裸鼠无明显毒性。

3、每隔2-3d，测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积，绘制裸鼠肿瘤体积变化曲线（图5）。给药后3周，对照组和实验组随机取3只，剥离裸鼠肿瘤，称重，拍照（图6）。同时取肿瘤组织用4%福尔马林固定过夜，经石蜡包埋切片，用苏木素-伊红（HE）染色。结果如图5所示，给予沙门菌VNP20009后，肿瘤生长缓慢，体积和重量约为PBS组的1/3。给予沙门菌VNP20009-V后，肿瘤生长缓慢，体积和重量约为PBS组的1/3。给予沙门菌VNP20009-M，肿瘤体积和重量同样约为PBS组的1/3。病理切片（图7）显示，注射VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M后的肿瘤组织，比PBS组有大面积的组织坏死。这些结果说明沙门菌VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M对于该胰腺癌肿瘤均具有显著的抑制效应。

4、操作方法同上述1和2，在裸鼠两侧腋下分别接种CFPAC-1胰腺癌细胞，只对左侧肿瘤给药。给药1周后，分别取出两侧肿瘤，加PBS研磨匀浆，梯度稀释后用LB-O平板培养过夜。结果如图8所示，组织匀浆菌落计数定量结果，左侧肿瘤组织中菌量为2.5×10⁶CFU/g，而右侧肿瘤组织同样可以检出细菌，含量3×10⁵CFU/g，仅仅比左侧低10倍左右，说明VNP20009对于该胰腺癌肿瘤有良好的靶向性。上述结果表明，本发明所采用的减毒鼠伤寒沙门氏菌不仅有良好的抗肿瘤效果，并且能特异的到达远端肿瘤部位。

本发明表明减毒鼠伤寒沙门氏菌对胰腺癌细胞具有肿瘤靶向性及显著的抑制效应，同时，其与质粒构建的基因工程菌同样具有肿瘤靶向性，且带有克隆有L-methioninase基因的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以在肿瘤组织持续表达L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓慢，因此可以用于制备治疗胰腺癌的药物。上述质粒并不局限于pSVSPORT质粒，pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒以及克隆有L-methioninase基因的上述质粒同样具有类似效果。

Claims (10)

1.减毒鼠伤寒沙门氏菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

2.一种基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，所述基因工程菌为携带质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述质粒为pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述质粒通过电转化转移至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中。

5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。

6.一种基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，所述基因工程菌为携带质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中所述质粒上克隆有L-methioninase基因。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的质粒为pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法为：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。

10.根据权利要求1或2或6所述的应用，其特征在于，给药方式为瘤内注射。

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