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CN103616509B - 检测猪乙型脑炎病毒的eⅲ-间接elisa抗体检测试剂盒及应用 - Google Patents

检测猪乙型脑炎病毒的eⅲ-间接elisa抗体检测试剂盒及应用 Download PDF

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CN103616509B
CN103616509B CN201310627844.4A CN201310627844A CN103616509B CN 103616509 B CN103616509 B CN 103616509B CN 201310627844 A CN201310627844 A CN 201310627844A CN 103616509 B CN103616509 B CN 103616509B
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South China Agricultural University
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Abstract

本发明公开一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。本发明试剂盒包括如下组成：以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清。本发明使用的包被抗原易于稳定、大量获得，纯化方法简单易于实现，重组蛋白的浓度易于测定和控制，有利于工业化大量生产。本发明试剂盒用于检测猪乙型脑炎病毒抗体，与现有技术中ELISA试剂盒的检测符合率为90%。本发明试剂盒便于操作，灵敏度高，特异性好，使用成本低，重复性好，适合推广应用，为临床上快速检测JEV抗体提供了可靠手段。

Description

检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。
背景技术
日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）属于黄病毒科黄病毒属，其所导致的日本乙型脑炎是一种中枢神经系统性人畜共患的急性传染病。据估计，每年全球大约有50000人感染JEV，大约有15000例死亡，死亡率30%左右；同时JEV是严重危害养猪业的重要病毒之一，给养猪业造成巨大的经济损失，极大的限制肉产品的出口创汇。2008年我国农业部将猪日本乙型脑炎病归于二类动物疫病。
该病于19世纪70年代在日本首次报道，并于1924年首次分离到日本乙型脑炎病毒。中国是在1938～1940年间采用血清学和病毒分离的方法确诊了日本乙型脑炎病例，于1949年在北京首次分离到该病毒。自20世纪90年代以来，该病的流行区域有所扩大，目前该病的分布区北起俄罗斯西伯利亚、日本北海道，南到澳大利亚，东到美国关岛，西到印度西海岸。亚洲是JE发病人数最多的地区，我国又占了其中的大多数。
目前常用于检测乙脑病毒的方法包括病原的分离鉴定、RT-PCR和血清学方法。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；RT-PCR技术需要特殊的仪器设备（如PCR仪和凝胶成像系统等）和专业人员进行相关的操作；酶免疫分析法是血清学方法中最常用的方法之一，而酶免疫分析法将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂进行免疫测试，具有很高的灵敏度和特异性，但是，免疫分析法的灵敏度、特异性取决于抗原的选择。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作方法简单的特点。
本发明的另一目的在于提供所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，具体包括如下组成：
以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清。
所述的纯化的JEV-EⅢ蛋白通过以下步骤制备得到：
（1）从猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，42℃反转录1h后，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，通过引物P1和P2进行PCR；将得到的PCR产物和载体pET-32a分别通过BamH I和HindIII进行双酶切；再将双酶切后的PCR产物和pET-32a连接，得到重组质粒pET-32a-JEV-EIII；
P1：5'-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3'；
P2：5'-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3'；
其中，CGC或CCC为保护碱基，GGATCC为BamHⅠ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点，TTA是终止密码子TAA的反向互补序列；
（2）将重组质粒pET-32a-JEV-EIII转化入大肠杆菌中，将检测为阳性的重组菌株，通过IPTG进行诱导表达；
（3）收集表达后的菌液，使用His-TRAPTM FF Crude柱进行纯化，得到纯化的JEV-EⅢ蛋白；
步骤（1）中所述的反转录的反应体系为：总RNA12μL、dNTPs2μL、随机引物1μL、RRI2μL、AMV1μL，加ddH2O至总体积为20μL；
步骤（1）中所述的PCR的反应体系为：10×Buffer5μL，浓度为2mM的dNTPs5μL，浓度为25mM的MgSO44μL，引物P11.5μL，引物P21.5μL，cDNA2μL，KOD酶1μL，加ddH2O至50μL；
步骤（1）中所述的PCR的反应条件为：94℃预变性2min；94℃热变性15s、55℃30s、68℃1min，共30个循环；68℃8min终延伸；
所述的以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将纯化的JEV-EⅢ蛋白用包被缓冲液稀释到4.7μg/mL，100μL每孔加到酶标板，4℃过夜；取过夜包被好的酶标板，200μL/孔洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；200μL/孔封闭液，37℃温育2.5h，取封闭好的酶标板，200μL/孔洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；得到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板；
所述的包被缓冲液优选为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；
所述的pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液优选通过如下步骤制备得到：将碳酸钠1.5g和碳酸氢钠2.93g溶解于600mL ddH2O，调pH值至9.6，ddH2O定容至1000mL，即得包被缓冲液；
所述的封闭液优选为用洗涤液配制的质量体积比（g/mL）0.5%的大豆卵磷脂溶液；
所述的酶标板优选为JET公司产品；
所述的洗涤液通过如下步骤制备得到：将3.579g Na2HPO4·12H2O、1.56gNaH2PO4·2H2O、NaCl29.215g和600mL ddH2O充分溶解，加入0.5mL吐温-20，用10mol/L HCl溶液调pH值至7.4，ddH2O定容至1000mL；
所述的血清稀释液优选为用洗涤液配制的质量体积比（g/mL）0.5%的大豆卵磷脂溶液；
所述的兔抗猪酶标二抗优选为辣根过氧化物酶（HRP）-兔抗猪IgG二抗；
所述的底物显色液优选为TMB显色液；
所述的终止液为2M硫酸；
所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的应用，包含以下步骤：
（1）将待检样品用血清稀释液稀释，然后按100μL/孔的量加到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板中，同时也将JEV阳性血清和JEV阴性血清分别按100μL/孔的量加到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板中作为对照，37℃温育40min；
（2）用洗涤液进行洗板3次，200μL/孔，每次3min；
（3）将兔抗猪酶标二抗用洗涤液稀释，每个反应孔加100μL，37℃温育55min；
（4）用洗涤液进行洗板4次，200μL/孔，每次3min；
（5）避光条件下每个反应孔加100μL底物显色液，室温避光显色20min；
（6）每个反应孔加50μL终止液终止反应；
（7）在450nm单波长下测OD值；
（8）结果判读：OD450nm(样本)≥0.255判为阳性；OD450nm介于0.231～0.255（OD450nm(样本)+2SD）判为可疑，OD450nm(样本)＜0.231判为阴性。
步骤（1）中所述的将待检样品用血清稀释液稀释优选为将待检样品用血清稀释液按体积比1:160倍稀释；
步骤（3）中所述的将兔抗猪酶标二抗用洗涤液稀释优选为将兔抗猪酶标二抗用洗涤液按体积比1:5000倍稀释。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
（1）本发明选用的包被抗原是猪乙型脑炎病毒EⅢ蛋白，E蛋白是JEV重要的结构蛋白质，属糖蛋白，具有血细胞凝集素活性，介导病毒与宿主细胞的粘附和膜融合，是重要的毒力因子；而且E蛋白具有很强的免疫原性，可诱导机体产生病毒中和抗体，逃避宿主免疫监督系统的攻击。E蛋白的外功能区由3个结构域组成，3个结构域间相互联系，行使着E蛋白的各种功能。其中E蛋白结构域Ⅲ呈稳定的免疫球蛋白样的折叠，具有与宿主细胞表面受体结合的作用，介导病毒与宿主细胞的粘附，是猪流行性乙型脑炎病毒的抗原活性中心，其上含有JEV特异性的抗原表位，其主要的中和表位位于结构域Ⅲ外表面的残基上，该区域是受体结合的区域，相比直接选用E蛋白特异性更强，避免了非抗原物质与血清中其他抗体的结合。抗体与E蛋白结构域Ⅲ结合后能最有效地阻断病毒与细胞的联系。
（2）本发明试剂盒应用的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ蛋白，在选择材料上具有新意，猪在受到JEV感染时最先产生的是针对E蛋白的抗体，而EⅢ蛋白是猪流行性乙型脑炎病毒E蛋白的抗原活性中心，保证了本试剂盒具有高度的特异性。
（3）目前在检测猪流行性乙型脑炎病毒抗体方面，主要有用E蛋白包被的ELISA试剂盒、全病毒包被的间接血凝与血凝抑制实验和乳胶凝集实验。由于病毒需要由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得。本发明使用的包被抗原为猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ基因的原核表达产物，其优点在于重组EⅢ蛋白易于稳定、大量获得，纯化方法简单易于实现（应用His-bind亲和层析柱进行纯化），重组蛋白的浓度易于测定和控制，有利于工业化大量生产。虽然E蛋白也是通过原核表达的方法获得，但是E蛋白是全蛋白携带有许多非抗原本身的物质，增加了检出非特异性抗体的几率。
（4）本发明试剂盒用于检测猪乙型脑炎病毒抗体，检测方法经特异性、敏感性、重复性等指标的检验后，将其用于血清样品的检验，与现有技术中ELISA试剂盒的检测符合率为90%。本发明试剂盒便于操作，灵敏度高，特异性好，使用成本低，重复性好，适合推广应用，为临床上快速检测JEV抗体提供了可靠的手段。
（5）本试剂盒所使用抗原蛋白包被量较少，所用蛋白浓度仅为4.7μg/mL，而灵敏度较高。
附图说明
图1为JEV-EⅢ基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1和2分别为以P1、P2为引物的RT-PCR扩增产物。
图2为pET-32a-JEV-EⅢ重组质粒的双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M1为DNA Marker DL2000，泳道1和2为分别重组质粒pET-32a-JEV-EⅢ用BamH I和Hind III进行双酶切后的产物，泳道M2为DNA Marker DL10000。
图3为重组pET-32a-JEV-EⅢ载体在大肠杆菌表达菌液中的菌体经过裂解得到的产物的SDS-PAGE图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1为未诱导的pET-32a空载体，泳道2为诱导的pET-32a空载体，泳道3为未诱导的重组质粒pET-32a-JEV-EⅢ，泳道4为诱导的重组质粒pET-32a-JEV-EⅢ。
图4为重组pET-32a-JEV-EⅢ载体在不同诱导时间得到的菌液中的菌体经过裂解得到的产物的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1～7为依次诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h。
图5为重组质粒不同IPTG浓度诱导的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1～7是IPTG浓度依次为0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM和5mM。
图6为重组蛋白的SDS-PAGE图和Western Blotting的结果图；其中，图A为重组蛋白的SDS-PAGE图，图B为与图A对应的Western Blotting的结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1和2分别为重组蛋白。
图7为蛋白纯化条件咪唑结合缓冲液浓度优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1为30mM，泳道2为40mM，泳道3为50mM。
图8为蛋白纯化条件用30mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，咪唑洗脱缓冲液浓度优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1为200mM，泳道2为100mM，泳道3为500mM。
图9为蛋白纯化条件用30mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，100mM咪唑洗脱缓冲液洗脱体积优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa，泳道1～9分别为5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL。
图10为纯化后重组蛋白的SDS-PAGE图和Western Blotting的结果图；泳道M为蛋白Marker116KDa；其中，图A为纯化后重组蛋白的SDS-PAGE图，图B为与图A对应的Western Blotting的结果图；泳道M为蛋Marker116KDa，泳道1和2分别为纯化后重组蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
I、材料
以下实施例中所用KOD酶为TOYOBO公司产品；
JEV-EⅢ蛋白是在BL21（DE3)大肠杆菌中表达纯化的浓度为4.7μg/mL的蛋白；
酶标板为JET公司产品；
洗涤液通过如下步骤制备得到：将3.579g Na2HPO4·12H2O、1.56gNaH2PO4·2H2O、29.215g NaCl和600mL ddH2O充分溶解，加入0.5mL吐温-20，用10mol/L HCl溶液调pH值至7.4，ddH2O定容至1000mL；
包被缓冲液（pH9.60.05mol/L的碳酸盐缓冲液）：碳酸钠1.5g、碳酸氢钠2.93g溶解于600mL ddH2O，调pH值至9.6，ddH2O定容至1000mL；
血清稀释液为质量体积比（g/mL）0.5%的大豆卵磷脂溶液，溶剂为洗涤液；
封闭液为质量体积比（g/mL）0.5%的大豆卵磷脂溶液，溶剂为洗涤液；
辣根过氧化物酶（HRP）-兔抗猪IgG二抗为广州威佳公司产品；
TMB显色液为广州UCANDO生物公司产品；
终止液为2M硫酸；
JEV阳性血清、JEV阴性血清参照IDEXX公司ELISA试剂盒中的JEV阴性血清和JEV阳性猪血清；
限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶、DNA Marker、蛋白Marker、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21感受态细胞等均购于TaKaRa公司；
原核表达载体pET-32a购于Novagen公司；
RNA抽提试剂盒、PCR回收试剂盒均购于OMEGA公司。
以下生物材料已在文献“猪乙型脑炎病毒3种灭活疫苗的制备及免疫效果比较，华南农业大学学报，2011,32（02）:85-88”公开：猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株。
Ⅱ具体制备过程
一、纯化的JEV-EⅢ蛋白的制备，包含以下步骤：
（1）引物设计和合成：根据GenBank中猪乙型脑炎病毒（GZ0409-31株）（KF297916.1）的基因序列设计引物，分别在上游和下游引入BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶识别位点。上述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。
P1：5'-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3'；
P2：5'-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3'；
其中，CGC或CCC为保护碱基，GGATCC为BamHⅠ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点，TTA是终止密码子TAA的反向互补序列；
（2）目标片段基因扩增：参照RNA抽提试剂盒（购自OMEGA公司）从猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，反转录的反应体系为：总RNA12μL，dNTPs2μL，随机引物1μL，RRI2μL，AMV1μL，加ddH2O至总体积为20μL；42℃反转录1h后，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，应用上述引物进行PCR扩增，反应体系（50μL）：10×Buffer5μL，dNTPs（2mM）5μL，MgSO4（25mM）4μL，引物P11.5μL，引物P21.5μL，cDNA2μL，KOD酶1μL，加ddH2O至50μL。反应条件为：94℃预变性2min；（94℃15s，55℃30s，68℃1min）×30个循环；68℃，8min，4℃保存。PCR结束后，取扩增产物5μL在质量体积比1%的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。电泳结果如图1所示。
（3）重组表达载体的构建：用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶分别对PCR扩增产物和质粒pET-32a（Novagen公司）进行双酶切，双酶切的反应体系为：BamHⅠ和HindⅢ各1μL，10×K buffer2μL，PCR扩增产物或质粒pET-32a1μg，加ddH2O至20μL。用质量体积比1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，参照PCR回收试剂盒（购自OMEGA公司），按试剂盒说明书进行回收双酶切产物，二者回收产物以摩尔比10:1比例用T4DNA连接酶（Takara，按说明书操作）于16℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（TaKaRa公司）中，并接种于含100mg/L Amp+的营养琼脂培养皿（胰蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、氯化钠2.0g、琼脂粉3.0g，溶解于200mL ddH2O中，pH值调至7.4，121℃高压灭菌15min，培养基温度降50℃左右时添加Amp+母液使其终浓度为100mg/L，混匀后倾倒于玻璃平皿，4℃保存备用。）中，37℃恒温倒置培养12～16h，随机挑选单克隆菌落，把用引物P1和P2经菌落PCR鉴定正确的阳性克隆抽提质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，结果如图2所示，酶切后获得的片段与目的片段大小相同；挑取酶切检测为阳性的克隆于含100mg/L Amp+的LB肉汤培养基（胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、氯化钠1.0g，溶解于100mL ddH2O中，pH值调至7.4，121℃高压灭菌15min，培养基温度降至常温后加入Amp+母液使其终浓度为100mg/L，4℃保存备用。）中进行增菌，吸取菌液委托上海立菲公司进行测序，得到的序列与目的基因序列完全一致，以明确目标基因以正确的读码框插入表达载体。获得阳性重组质粒，将其命名为pET-32a-JEV-EⅢ。
（4）重组质粒诱导表达以及条件优化
重组蛋白的诱导表达：将测序鉴定正确的重组质粒pET-32a-JEV-EⅢ转化至大肠杆菌BL21感受态细胞（TaKaRa公司），挑取阳性重组载体菌落，接种于新鲜的LB肉汤（Amp+终浓度为100mg/L）培养基中，于37℃、200r/min培养过夜，得到活化的菌液；次日，将活化的菌液按照体积比1:50接种于新鲜的LB肉汤（Amp+终浓度为100mg/L）培养基中，当OD600=0.4～0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，于37℃诱导表达3h收集菌液，取1mL菌液离心收集菌体，加入100μLddH2O重悬和同体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，在水中煮沸裂解10min，进行SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶为3%，其中先进行80V30min，后用120V35min的电压条件）试验。同时设立空载体pET-32a转化菌和重组质粒pET-32a-JEV-EⅢ未诱导菌为对照。结果如图3所示。
不同诱导时间重组蛋白表达情况按照上述方法接种活化的菌液，诱导剂IPTG的终浓度为0.5mM，诱导时间分别为0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h。收集不同时间段的菌液，进行SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶为3%，其中先进行80V30min，后用120V40min的电压条件）分析，结果如图4所示，结果显示最佳诱导时间为3h。
不同诱导剂IPTG浓度重组蛋白表达情况按照上述方法接种活化的菌液，诱导剂IPTG的终浓度为0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM和5mM，37℃诱导，诱导时间为上述优化的最佳时间。分别收集菌液，进行SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶为3%，其中先进行80V30min，后用120V40min的电压条件）分析，结果如图5所示，结果显示最佳诱导IPTG浓度为2mM。
重组蛋白大量表达：挑重组表达菌株BL21-pET32a-JEV-EⅢ阳性菌落，接种于1L LB（Amp＋终浓度为100mg/L）培养基中，按上述优化的诱导条件进行诱导表达，离心收集菌体，按每100mL菌液离心后收集的菌体加入5mL钠盐缓冲液（Na2HPO4·12H2O1.7895g，NaH2PO4·2H2O0.78g，NaCl14.6075g，定容至500mL，调节pH至7.4。），重悬菌体沉淀，超声破碎离心，分为上清和沉淀（包涵体）。包涵体用5mL8M尿素钠盐缓冲液（尿素与上述钠盐缓冲液混合得到的尿素钠盐缓冲液）进行溶解，4℃过夜溶解。溶解后4℃、8000r/min离心15min，取上清；再将上清进行梯度透析复性；作为过柱纯化的预处理样品。
采用上述预处理样品，Western Blotting检测重组蛋白的抗原性（如图6所示）。结果显示重组蛋白具有抗原性。
（5）重组蛋白的纯化以及鉴定
纯化条件的优化：按照His-TRAPTM FF Crude（购于GE Healthcare公司）说明书的操作步骤进行纯化，分别采用30mM、40mM、50mM咪唑结合缓冲液各5mL体积平衡纯化柱；平衡之后，加入1mL预处理样品，吸附完预处理样品后，分别用10mL同上浓度的咪唑结合缓冲液冲洗纯化柱，流速1mL/min，采用1.5mL EP管收集每次冲洗下的液体；再分别采用100mM、200mM、500mM咪唑洗脱缓冲液各5mL进行梯度洗脱，流速1mL/min，1.5mL EP管收集各浓度咪唑洗脱缓冲液。用SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶为3%，其中先进行80V30min，后用120V40min的电压条件）对收集样品检测，确定最适的咪唑结合缓冲液浓度（如图7所示）、最适的咪唑洗脱缓冲液浓度（如图8所示）、最适的咪唑洗脱缓冲液体积（如图9所示）。结果显示1mL样品用5mL30mM咪唑结合缓冲液结合，7mL100mM的咪唑洗脱缓冲液洗脱纯化效果最好。
将纯化后的重组蛋白样品处理后，进行SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶为3%，其中先进行80V30min，后用120V40min的电压条件）检测，观察电泳效果（见图10A所示）以及纯化蛋白的Westernbloting检测（见图10B所示），结果显示纯化的JEV-EⅢ蛋白具有抗原性。
二、重组蛋白包被板的制备
（1）抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的的选择
通过方阵滴定方法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，结果如表1；从表1可以看出，用包被缓冲液进行稀释抗原，用血清稀释液进行稀释血清，随着抗原浓度的减少和血清稀释度的增大，P/N值不断降低。当重组蛋白1:80稀释，即重组抗原最佳包被浓度为4.7μg/mL，对照血清1:160稀释时，P/N最大。其中，包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，血清稀释液为用洗涤液配制的质量体积比（g/mL）0.5%的大豆卵磷脂溶液。
表1
（2）封闭液及浓度选择
分别用不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉（脱乳）、大豆卵磷脂（LHP）对已包被抗原的酶标板进行封闭，结果如表2所示；从表2可以看出P/N值基本随着封闭液浓度降低而减少，遂选择质量体积比（g/mL）0.5%大豆卵磷脂溶液（洗涤液配制）作为封闭液。
表2
（3）封闭时间优化
按照最佳包被浓度抗原包被酶标板后，用质量体积比（g/mL）0.5%大豆卵磷脂溶液（洗涤液配制）封闭酶标板，37℃条件下分别采用0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h封闭时间进行封闭，试验结果如表3所示；从表3可以看出，在封闭时间为2.5h时，P/N值最大，因此确定最佳封闭时间为2.5h。
表3
综上所述，重组蛋白包被板的制备步骤如下：将纯化的JEV-EⅢ蛋白用包被缓冲液稀释到4.7μg/mL，100μL每孔加到酶标板，4℃过夜。取过夜包被好的酶标板，200μL/孔洗涤液洗板3次，每次3min。200μL/孔质量体积比（g/mL）0.5%大豆卵磷脂溶液（洗涤液配制）进行封闭，37℃温育2.5h，取封闭好的酶标板，200μL/孔洗涤液洗板3次，每次3min；得到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被蛋白的酶标板。
三、检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的应用，各条件的优化步骤包括如下：
（1）一抗温育时间优化
使用上述以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板，一抗（猪乙脑标准血清：JEV阳性血清和JEV阴性血清）在37℃分别温育不同时间，从表4可以看出，在一抗温育时间为40min时，P/N值最大，因此确定最佳一抗温育时间为40min。
表4
一抗工作时间 P N P/N
10min 0.225 0.155 1.448
15min 0.252 0.167 1.513
20min 0.275 0.165 1.669
25min 0.334 0.171 1.955
30min 0.361 0.175 2.062
35min 0.363 0.172 2.114
40min 0.406 0.182 2.230
45min 0.388 0.182 2.131
50min 0.373 0.178 2.093
55min 0.376 0.182 2.067
60min 0.377 0.181 2.077
65min 0.365 0.180 2.030
（2）二抗浓度选择
使用上述以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板，在最适条件下温育一抗，将按照表5中的不同比例稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗包被酶标板，试验结果如表5所示；从表5中可以看出，HRP-兔抗猪IgG二抗稀释浓度1:5000稀释时，P/N值最大，因此将1:5000确定为重组蛋白的HRP-兔抗猪IgG二抗的最佳工作浓度。
表5
酶标二抗最佳工作浓度 P N P/N
1:5000 0.979 0.190 5.164
1:8000 0.652 0.181 3.613
1:10000 0.359 0.179 2.011
1:20000 0.230 0.117 1.970
1:30000 0.216 0.110 1.958
1:40000 0.163 0.095 1.711
1:50000 0.133 0.081 1.654
1:60000 0.127 0.078 1.622
1:70000 0.107 0.078 1.368
1:80000 0.098 0.076 1.294
1:90000 0.091 0.074 1.229
1:100000 0.092 0.074 1.246
（3）二抗时间优化
使用上述以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板，在最适的条件下温育一抗，按照1:5000例稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗包被酶标板，在37℃条件下，HRP-兔抗猪IgG二抗作用时间分别采用如表6中不同的时间温育，试验结果如表6，从中可以看出，HRP-兔抗猪IgG二抗孵育时间55min时，P/N值最大，因此确定HRP-兔抗猪IgG二抗温育时间为55min。
表6
酶标二抗工作时间 P N P/N
10min 0.303 0.211 1.435
15min 0.318 0.181 1.759
20min 0.288 0.159 1.814
25min 0.298 0.146 2.038
30min 0.274 0.128 2.142
35min 0.326 0.149 2.188
40min 0.308 0.137 2.241
45min 0.325 0.126 2.583
50min 0.348 0.125 2.781
55min 0.314 0.094 3.330
60min 0.287 0.107 2.678
65min 0.279 0.112 2.487
（4）显色时间优化
使用上述以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板，在最适的条件下温育一抗和HRP-兔抗猪IgG二抗后，加入底物显色液TMB后分别作用如表7中所示不同时间，试验结果如表7所示，从表7可见，20min时，P/N值最大，因此确定底物显色液的最佳反应时间为室温反应20min。
表7
TMB作用时间 P N P/N
10min 0.320 0.158 2.024
15min 0.341 0.171 1.993
20min 0.420 0.131 3.221
25min 0.329 0.131 2.513
30min 0.310 0.134 2.313
35min 0.297 0.129 2.305
40min 0.292 0.133 2.187
45min 0.277 0.147 1.878
50min 0.278 0.144 1.930
55min 0.273 0.147 1.865
60min 0.292 0.158 1.847
65min 0.283 0.155 1.830
（5）临界值界定与敏感性试验
利用购买的试剂盒（美国IDEXX公司试剂盒）鉴定JEV为阴性的20份猪血清（广东省）进行检测，试验结果如表8所示，对结果进行统计学分析，得出平均值x=0.183，标准差SD=0.024，从而计算出x+3SD=0.255为临界值，将OD450nm(样本)≥0.255判为阳性；介于0.255～0.231（OD450nm(样本)+2SD）判为可疑，OD450nm(样本)＜0.231判为阴性。与此同时将JEV为阳性的猪血清（广东省）进行倍比稀释，可见将其稀释至6400倍时其OD450值（表9中的P值与OD450值一一对应）为0.307（见表9），大于0.255阳性判定值。
表8
表9
血清稀释倍数 P N P/N
1：100 2.458 0.228 10.78
1：200 2.031 0.225 9.024
1：400 1.868 0.209 8.938
1：800 1.324 0.212 6.245
1：1600 0.901 0.210 4.293
1：3200 0.510 0.127 4.012
1：6400 0.307 0.130 2.362
1：12800 0.209 0.121 1.723
1：25600 0.152 0.118 1.284
1：51200 0.146 0.118 1.237
1：102400 0.146 0.114 1.281
1：204800 0.153 0.162 0.944
（6）特异性试验
用本试验建立的JEV-EⅢ蛋白ELISA方法检测猪瘟、乙脑、伪狂犬、口蹄疫、布鲁氏菌、放线杆菌、腹泻、传染性胃肠炎阳性血清（以上血清均来自广东省农科院兽医研究所）。结果显示如表10所示，除乙脑阳性血清外，其余血清的OD450nm值均低于0.231，判定为阴性血清，表明建立的ELISA试剂盒特异性比较好。
表10
标准血清 OD450 结果判定
猪瘟 0.068 —
乙脑 2.659 +
伪狂犬 0.154 —
口蹄疫 0.175 —
布鲁氏菌 0.145 —
放线杆菌 0.082 —
圆环病毒 0.037 —
腹泻 0.077 —
传染性胃肠炎 0.213 —
（7）重复性试验
①批内重复性试验
用同一批次包被的酶标板对8份已知背景的血清（7份阳性血清和1份阴性血清样品，以上血清均来自广东省农科院兽医研究所）做批内重复试验，每份血清作12个平行，结果如表11所示，从表中可以看出批内变异系数在1.83%～5.50%，都在10%以内，说明该检测方法具有较好的批内重复性。
表11批内重复性试验结果
②批间重复试
用同批蛋白在8个不同时间包被的酶标板对8份已知背景的血清（7份阳性血清和1份阴性，以上血清均来自广东省农科院兽医研究所）做批间重复试验，每份血清作12个平行，结果如表12所示，从表中可以看出批间变异系数在3.86%～9.08%之间，都在10%以内，说明该检测方法具有较好的批间重复性。
表12
（8）临床血清样品检测
应用本试验组装的试剂盒检测自广东地区猪场的224份猪血清样本，并与某ELISA试剂盒（猪乙型脑炎病毒抗体检测试剂盒，购自北京方程生物科技有限公司）结果比较，结果显示两者符合率90.7%。
表13
综上所述，检测猪流行性乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒的应用，包含以下步骤：
（1）将待检样品（待测猪血清，广东省农科院动物卫生研究所）用血清稀释液按体积比1:160倍稀释，然后将100μL/孔的量加到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板中，同时也将JEV阳性血清和JEV阴性血清分别按100μL/孔的量加到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板中，37℃温育40min；
（2）用洗涤液洗板3次，200μL/孔，每次3min；
（3）将辣根过氧化物酶（HRP）-兔抗猪IgG二抗用洗涤液按体积比1:5000倍稀释，每个反应孔加100μL，37℃温育55min；
（4）用洗涤液洗板4次，200μL/孔，每次3min；
（5）避光条件下每个反应孔加100μLTMB显色液，室温避光显色20min；
（6）每个反应孔加50μL终止液终止反应；
（7）在450nm单波长下测OD值；
（8）结果判读：OD450nm(样本)≥0.255判为阳性；OD450nm介于0.231～0.255（OD450nm(样本)+2SD）判为可疑，OD450nm(样本)＜0.231判为阴性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于包括如下组成：
以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清；
所述的以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将纯化的JEV-EⅢ蛋白用包被缓冲液稀释到4.7μg/mL，100μL每孔加到酶标板，4℃过夜；取过夜包被好的酶标板，200μL/孔洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；200μL/孔封闭液，37℃温育2.5h，取封闭好的酶标板，200μL/孔洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；得到以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板；
所述的封闭液为用洗涤液配制的质量体积比0.5％的大豆卵磷脂溶液。
2.根据权利要求1所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：
所述的纯化的JEV-EⅢ蛋白通过以下步骤制备得到：
(1)从猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，42℃反转录1h后，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，通过引物P1和P2进行PCR；将得到的PCR产物和载体pET-32a分别通过BamH I和HindIII进行双酶切；再将双酶切后的PCR产物和pET-32a连接，得到重组质粒pET-32a-JEV-EIII；
P1：5'-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3'；
P2：5'-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3'；
(2)将重组质粒pET-32a-JEV-EIII转化入大肠杆菌中，将检测为阳性的重组菌株，通过IPTG进行诱导表达；
(3)收集表达后的菌液，使用His-TRAPTM FF Crude柱进行纯化，得到纯化的JEV-EⅢ蛋白。
3.根据权利要求2所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中所述的反转录的反应体系为：总RNA 12μL、dNTPs 2μL、随机引物1μL、RRI 2μL、AMV 1μL，加ddH2O至总体积为20μL。
4.根据权利要求2所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中所述的PCR的反应体系为：10×Buffer 5μL，浓度为2mM的dNTPs 5μL，浓度为25mM的MgSO44μL，引物P11.5μL，引物P21.5μL，cDNA 2μL，KOD酶1μL，加ddH2O至50μL；
步骤(1)中所述的PCR的反应条件为：94℃预变性2min；94℃热变性15s、55℃30s、68℃1min，共30个循环；68℃8min终延伸。
5.根据权利要求1所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：
所述的包被缓冲液为pH 9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的血清稀释液为用洗涤液配制的质量体积比0.5％的大豆卵磷脂溶液。
7.根据权利要求1所述的检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的酶标板为JET公司产品；
所述的洗涤液通过如下步骤制备得到：将3.579g Na2HPO4·12H2O、1.56gNaH2PO4·2H2O、NaCl 29.215g和600mL ddH2O充分溶解，加入0.5mL吐温-20，用10mol/L HCl溶液调pH值至7.4，ddH2O定容至1000mL；
所述的兔抗猪酶标二抗为辣根过氧化物酶-兔抗猪IgG二抗；
所述的底物显色液为TMB显色液；
所述的终止液为2M硫酸。
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