CN103571819A - 一种能快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方法。它是将含伊维菌素的细胞外液灌入快速加药管中，再将含两性霉素的细胞内液灌入微电极中，然后利用含含两性霉素的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速加药管口，打开快速加药管，使细胞在含伊维菌素的细胞外液中抚育，使细胞在电生理测试状态下Ra值降至10，再停止抚育。本发明能够快速高效的溶解两性霉素B于细胞内液，并结合伊维菌素快速增加细胞膜通透性从而在膜片钳实验中快速破膜形成高阻封接进行实验。
Description
技术领域：
本发明属于生物领域，具体涉及一种能快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方法。
背景技术：
膜片钳技术的基本方法是用玻璃微电极（尖端直径在微米级）贴附在细胞表面，施加负压使电极与细胞之间形成高阻封接（即109欧米量级的紧密封接）。在实验中，向玻璃电极内液中加入特定的抗生素，如两性霉素B，可以使细胞膜穿孔，细胞内液和电极内液连通，这样记录到的玻璃电极内和细胞所处浴液之间的电势差即为细胞的膜电位，这就是穿孔膜片钳。穿孔全细胞膜片钳有效的避免了洗脱作用，并且胞质渗漏极为缓慢，可长时间稳定记录；同时具有对细胞损伤小的优点。抗生素穿孔形成的孔道，分子直径大于0.8nm的离子和分子不能通过，而所有离子都可通过，这些孔道没有电压依赖性，同时使得记录过程不受电极钳制电位的影响。
两性霉素B是一种具有抑菌或杀菌作用的抗霉菌剂。主要是通过作用于细胞膜上的麦角甾醇而改变细胞膜通透性。虽然穿孔膜片钳具有这么多优点，但是两性霉素B基本不溶于水溶液，因此对穿孔膜片钳实验带了一定难度。也使得穿孔膜片钳实验很少使用。
伊维菌素(IVERMECTIN)是一种新型广谱、高效、低毒的抗寄生虫药，这个大环类脂类药物可以有效的插入细胞膜增加细胞膜的通透性，但长时间作用会导致细胞溶解。
发明内容：
本发明的目的是提供一种快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方法。
本发明的快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方法，其特征在于，将含伊维菌素的细胞外液灌入快速加药管中，再将含两性霉素的细胞内液灌入微电极中，然后利用含含两性霉素的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速加药管口，打开快速加药管，使细胞在含伊维菌素的细胞外液中抚育，使细胞在电生理测试状态下Ra值降至10，再停止抚育；
所述的含两性霉素的细胞内液是通过以下方法制备的：先将两性霉素B溶解于DMSO中，配制成20mg/mL两性霉素B的DMSO溶液，然后将两性霉素B的DMSO溶液、100mmol/L的SDS溶液和常规细胞内液按照体积比50：15：1000的比例混合均匀，由此得到含1mg/mL两性霉素B的细胞内液，即为含两性霉素B的细胞内液；
所述的含伊维菌素的细胞外液是将伊维菌素溶于常规细胞外液中，使伊维菌素终浓度为2mM/L，由此得到含伊维菌素的细胞外液。
依此方法得到的细胞可以在3min内快速溶解细胞膜，同时电极内部的两性霉素B继续与细胞膜中的麦角甾醇相互作用维持细胞膜长期处于稳定的通透状态，可以在1-2h内记录到稳定的电流结果。并且不会因为细胞膜在记录过程中反复的闭合造成记录中断。
所述的常规细胞内液为含有130mM CsMeth,24mM CsCl,10mM HEPES,1mM CaCl2,1mM MgCl2，溶剂为水。
所述的常规细胞外液为含有154mM NaCl,10mM D-glucose，10mM HEPES，1mMCaCl2，1mM MgCl2，溶剂为水。
所述的含两性霉素B的细胞内液优选通过以下方法配制：
将每0.01g的两性霉素B溶解于500mL DMSO，置于涡旋振荡器上以3200rpm转速震荡2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频率超声5min，最终配制成20mg/mL两性霉素B的DMSO溶液，再按每吸取50μL两性霉素B的DMSO溶液、15μL100mmol/L的SDS溶液溶于1mL的常规细胞内液中，置于涡旋振荡器上震荡1min，然后以40KHz的频率超声10min，最后在以500rpm的转速离心30s发现无悬浮颗粒沉降，因为悬浮颗粒的存在可能堵塞玻璃电极微米级的开口导致电流回路不畅，记录数据不稳定，由此得到含两性霉素B的细胞内液。
两性霉素B对细胞膜通透性的影响具有浓度依赖性，如何最大限度的让两性霉素B溶解于细胞内液的同时结合伊维菌素快速增加细胞膜的通透性，达到最短时间且最佳的穿透效果以此解决穿孔膜片钳应用的主要问题。本发明解决两性霉素B在细胞内液中的溶解度，使其较好的溶解于细胞内液中，在整个实验过程中两性霉素B处于水溶解状态，同时结合伊维菌素增加细胞膜通透特性，实验开始前孵育细胞辅助两性霉素B一起在短时间内破膜。破膜后停止抚育，同时在两性霉素B的帮助下稳定细胞膜处于稳定通透状态，从而使细胞能够在1-2h内处于稳定的电流记录状态。
因此本发明能够快速高效的溶解两性霉素B于细胞内液，并结合伊维菌素快速增加细胞膜通透性从而在膜片钳实验中快速破膜形成高阻封接进行实验。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
将0.01g的两性霉素B溶解于500mL DMSO，置于vortex-genie 2T涡旋振荡器上以3200rpm转速震荡2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频率超声5min，最终配制成20mg/mL两性霉素B的DMSO溶液。吸取50μL两性霉素B的DMSO溶液、15μL100mmol/L的SDS溶液溶于1mL常规细胞内液（含130mM CsMeth,24mM CsCl,10mM HEPES,1mMCaCl2,1mM MgCl2，溶剂为水）中，置于涡旋振荡器上震荡1min，然后以40KHz的频率超声10min，最后再以500rpm的转速离心30s发现无悬浮颗粒沉降，因为悬浮颗粒的存在可能堵塞玻璃电极微米级的开口导致电流回路不畅，记录数据不稳定，由此得到含1mg/mL两性霉素B的细胞内液，即为含两性霉素B的细胞内液。
然后将伊维菌素溶于常规细胞外液（含有154mM NaCl,10mM D-glucose，10mMHEPES，1mM CaCl2，1mM MgCl2，溶剂为水）中，使伊维菌素的浓度为2mM/L，由此得到含伊维菌素的细胞外液。
将10ml本实施例的含伊维菌素的细胞外液灌入快速加药管中，再将含两性霉素B的细胞内液灌入微电极中，然后利用含含两性霉素B的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速加药管口（含伊维菌素的细胞外液的加药管口），打开快速加药管。细胞在含伊维菌素的细胞外液中抚育2min后细胞在电生理测试状态下Ra值降至10，停止抚育。依此方法得到的细胞可以在3min内快速溶解细胞膜，同时电极内部的两性霉素B继续与细胞膜中的麦角甾醇相互作用维持细胞膜长期处于稳定的通透状态，可以在1-2h内记录到稳定的电流结果，不会因为细胞膜在记录过程中反复的闭合造成记录中断。
Claims (4)
1.一种快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方法，其特征在于，将含伊维菌素的细胞外液灌入快速加药管中，再将含两性霉素的细胞内液灌入微电极中，然后利用含含两性霉素的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速加药管口，打开快速加药管，使细胞在含伊维菌素的细胞外液中抚育，使细胞在电生理测试状态下Ra值降至10，再停止抚育；
所述的含两性霉素的细胞内液是通过以下方法制备的：先将两性霉素B溶解于DMSO中，配制成20mg/mL两性霉素B的DMSO溶液，然后将两性霉素B的DMSO溶液、100mmol/L的SDS溶液和常规细胞内液按照体积比50：15：1000的比例混合均匀，由此得到含1mg/mL两性霉素B的细胞内液，即为含两性霉素B的细胞内液；
所述的含伊维菌素的细胞外液是将伊维菌素溶于常规细胞外液中，使伊维菌素终浓度为2mM/L，由此得到含伊维菌素的细胞外液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含两性霉素B的细胞内液通过以下方法配制：将每0.01g的两性霉素B溶解于500mL DMSO，置于涡旋振荡器上以3200rpm转速震荡2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频率超声5min，最终配制成20mg/mL两性霉素B的DMSO溶液，再按每吸取50μL两性霉素B的DMSO溶液、15μL100mmol/L的SDS溶液溶于1mL的常规细胞内液中，置于涡旋振荡器上震荡1min，然后以40KHz的频率超声10min，最后在以500rpm的转速离心30s发现无悬浮颗粒沉降，由此得到含两性霉素B的细胞内液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的常规细胞内液为含有130mMCsMeth，24mM CsCl，10mM HEPES，1mM CaCl2，1mM MgCl2，溶剂为水。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的常规细胞外液为含有154mM NaCl,10mM D-glucose，10mM HEPES，1mM CaCl2，1mM MgCl2，溶剂为水。
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Also Published As
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